專利名稱：紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑的穩(wěn)定的微粒制劑的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明通常涉及在高溫下長期穩(wěn)定的藥物制劑。紅細(xì)胞生成素(EPO)為多效的糖蛋白激素，其主要由腎產(chǎn)生。EPO刺激骨髓產(chǎn)生紅細(xì)胞，并在骨髓外發(fā)揮組織保護(hù)效應(yīng)，例如神經(jīng)保護(hù)作用。EPO通過結(jié)合細(xì)胞表面受體而發(fā)揮生物效應(yīng)。EPO受體激動(dòng)劑(ERAs)為一類可活化EPO受體的重組體分子。在ERA類中的重組體分子可能或不可能包含自然人EPO(hEPO)的同源性序列。在ERA類中包含天然hEPO同源性序列的產(chǎn)物的實(shí)例顯示在下面的表1中。
表1 ERA產(chǎn)品已經(jīng)表明可用于治療慢性腎衰竭引起的貧血、與癌癥化療和外科手術(shù)有關(guān)的貧血，和AZT治療ADDS繼發(fā)的貧血。目前市售的ERA產(chǎn)品為通過皮下或肌肉注射給藥患者，每周給藥三次(EPREX、ERYPO和PROCRIT)或每周一次(ARANESP)。如果ERAs可以制劑為經(jīng)由緩釋遞送平臺(delivery platforms)例如泵植入物和貯存注射液遞送，或非侵入性遞送平臺例如透皮貼劑遞送，則可消除這些頻繁注射的需要。通常，緩釋遞送平臺需要這樣的制劑當(dāng)將其在高溫例如37℃或更高溫度下長期貯存，例如貯存幾周或幾個(gè)月時(shí)，其是穩(wěn)定的。目前市售的某些ERA產(chǎn)品為液體，需要在2至8℃貯存，在室溫和高溫下不穩(wěn)定。ERAs易于聚集，其可損害生物活性和引起不想要的副作用例如免疫原性。從上述可知，存在這樣的ERA制劑的需要當(dāng)將其在高溫例如37℃或更高溫度下長期貯存，例如貯存幾周或幾個(gè)月時(shí)，其是穩(wěn)定的。
發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種微粒制劑，其包含紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑、緩沖劑和糖，其中緩沖劑和糖穩(wěn)定了紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑防止其聚集。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑、緩沖劑和糖的微粒制劑，所述緩沖劑選自檸檬酸鹽和組氨酸，其中在40℃和1月內(nèi)，微粒制劑具有的總可溶性聚集體小于3％。根據(jù)下述說明書，本發(fā)明的其它特點(diǎn)和益處將變得顯而易見。
附圖簡述

圖1A顯示了pH對EPO溶液穩(wěn)定性的效果。圖1B顯示了緩沖劑類型對EPO溶液穩(wěn)定性的效果。圖1C顯示了NaCl對EPO溶液穩(wěn)定性的效果。圖1D顯示了表面活性劑對EPO溶液穩(wěn)定性的效果。圖1E顯示了金屬絡(luò)合體對EPO溶液穩(wěn)定性的效果。圖1F顯示了精氨酸對EPO溶液穩(wěn)定性的效果。圖1G顯示了蔗糖對EPO溶液穩(wěn)定性的效果。圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的檸檬酸鹽緩沖的凍干制劑在40℃下初期、8天和4周，和在37℃下3個(gè)月的EPO負(fù)載量。圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的檸檬酸鹽緩沖的凍干制劑在40℃下初期、8天和4周，和在37℃下3個(gè)月的總可溶性聚集體。圖4圖解了蔗糖與EPO比率、表面活性劑濃度和緩沖劑濃度對根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的檸檬酸鹽緩沖的凍干制劑的總可溶性聚集體的效果。圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的組氨酸緩沖的凍干制劑在40℃下初期、8天和4周，和在37℃下3個(gè)月的EPO負(fù)載量。圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的組氨酸緩沖的凍干制劑在40℃下初期、8天和4周，和在37℃下3個(gè)月的總可溶性聚集體。
發(fā)明詳述本發(fā)明現(xiàn)在將參照幾個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，如在附圖中圖解的來詳細(xì)闡述，在下述說明書中，列出許多特定的詳述是為了使對本發(fā)明有徹底的理解。然而，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在沒有某些或所有這些特定詳述下，也可以實(shí)施本發(fā)明。在其它的情況下，沒有詳細(xì)描述熟知的特征和/或制備方法是為了避免使本發(fā)明不明確的多余內(nèi)容。參照附圖和下述談?wù)?，可更透徹地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供在高溫下長期穩(wěn)定的微粒制劑。例如，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的微粒制劑為在40℃下物理和化學(xué)穩(wěn)定至少1個(gè)月，在37℃物理和化學(xué)穩(wěn)定至少3個(gè)月(遞送條件)。如果形成可接受百分?jǐn)?shù)的降解產(chǎn)物，所述降解產(chǎn)物為通過化學(xué)途徑例如脫酰胺基作用(通常水解作用)或氧化作用產(chǎn)生，則可認(rèn)為微粒制劑是化學(xué)穩(wěn)定的。例如，如果在遞送條件下3個(gè)月后，形成小于35％，優(yōu)選地僅為大約20％的分解產(chǎn)物，則可認(rèn)為制劑是化學(xué)穩(wěn)定的。如果形成可接受百分?jǐn)?shù)的聚集體(例如二聚體及其他較高的分子量產(chǎn)物)，則可認(rèn)為微粒制劑是物理穩(wěn)定的。例如，如果在遞送條件下3個(gè)月后，形成小于15％，優(yōu)選地僅為10％，更優(yōu)選地小于3％的聚集體，則可認(rèn)為制劑是物理穩(wěn)定的。因?yàn)楦邷叵碌姆€(wěn)定性可作為較低溫度下穩(wěn)定性的加速方法，也期望根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的微粒制劑在低溫，例如室溫和冷凍溫度下是穩(wěn)定的。所述微粒制劑包括穩(wěn)定的ERA，采用緩沖劑和包括糖的穩(wěn)定劑來防止聚集。所述微粒制劑可以通過本領(lǐng)域可得的從組分混合物形成微粒的冷凍干燥、噴霧干燥或其它方法來制備。噴霧干燥制劑也具有優(yōu)于凍干制劑的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵摲椒焖偾揖哂歇M窄分布的小粒徑，因此，不需要進(jìn)一步的研磨方法。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的微粒制劑具有低水分含量，典型地小于5％重量。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的微粒制劑可懸浮在適宜的載體中，用于經(jīng)由緩釋或非侵入性遞送平臺遞送。術(shù)語″ERA″或″紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑″指一類可以活化EPO受體的重組體分子。這些重組體分子可包含或不包含與天然hEPO同源性的序列。.根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的ERA可選自具有重組體hEPO生物活性的多肽和蛋白質(zhì)、EPO類似物、EPO同工型、EPO模擬物、EPO片段、雜種EPO蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)低聚體和上述多聚體、上述的同系物、上述的糖基化模式變異體(glycosylation patternvariants)、上述的突變蛋白和包含上述列舉物小修飾體的EPO分子。根據(jù)本發(fā)明的ERAs將不會(huì)受到合成或制備方法的限制，包括由重組體(無論是由cDNA還是由基因組DNA生成的)法、化學(xué)合成法、轉(zhuǎn)基因法和基因活化法合成或制備的那些。特別優(yōu)選的ERAs為能刺激哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞生成的那些。能刺激哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞生成的ERAs的實(shí)例包括，但不限于，epoetinα(商品名EPREX、ERYPO、PROCRIT)、epoetinβ(商品名NEORECORMON)和darbepoetinα(商品名 NESPTM、ARANESP)。darbepoetinα的一種形式描述于PCT公布WO95/05465(Amgen，Inc.)中，將其教導(dǎo)性內(nèi)容引入本文作為參考。在WO95/05465公布中，darbepoetinα包括hEPO的類似物，其含有包括至少一個(gè)另外的位點(diǎn)或至少一個(gè)用于糖基化位點(diǎn)重排的氨基酸序列。糖基化位點(diǎn)位于N-連接的或O-連接的碳水化合物鏈。表明能刺激哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞生成的其它ERAs包括hEPO類似物，例如在PCT公布WO 99/66054(Genzyme Transgenics Corp)中描述的人血清白蛋白融合蛋白質(zhì)，將其教導(dǎo)性內(nèi)容引入本文作為參考，和EPO突變體，例如在PCT公布WO 99/38890(Beth IsraelDeaconess Medical Center)中描述的，將其教導(dǎo)性內(nèi)容引入本文作為參考。在WO 99/38890公布中，EPO突變體包括分離的核酸編碼的EPO，其中在非編碼區(qū)域，核酸具有一個(gè)或多個(gè)突變，且EPO具有改變的生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變位于非編碼區(qū)域的51位。表明能刺激哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞生成的其它ERAs包括EPOω，其可產(chǎn)生自描述于U.S.專利No.5,688,679(Powell)中的hEPO基因的Apa I限制性片斷，將其教導(dǎo)性內(nèi)容引入本文作為參考，和改變的糖基化hEPO，例如描述于PCT公布WO 99/11781(Hoechst MarionRoussel Deutschland GMBH)中，將其內(nèi)容引入本文作為參考。在WO99/11781公布中，改變的糖基化hEPO包括具有EPO的部分或所有主要結(jié)構(gòu)構(gòu)型的多肽，其為外原性DNA序列的真核表達(dá)產(chǎn)物。證實(shí)能刺激哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞生成的另一種ERA包括聚乙二醇(PEG)共軛的紅細(xì)胞生成素類似物，其公開于例如PCT公布WO98/05363(Ortho Pharmaceutical Corporation)中，將其教導(dǎo)性內(nèi)容引入本文作為參考，和WO 01/76640(Amgen，Inc.)，將其教導(dǎo)性內(nèi)容引入本文作為參考，和U.S.專利No.5,643,575(Martinez等.)，將其內(nèi)容引入本文作為參考。其它的實(shí)例包括用于表達(dá)內(nèi)源性人EPO的修飾的細(xì)胞系，如描述于PCT公布WO 99/05268(Boehringer Mannheim GMBH)中，將其教導(dǎo)性內(nèi)容引入本文作為參考，和WO 94/12650(transkaryoticTherapies，Inc)，將其教導(dǎo)性內(nèi)容引入本文作為參考。ERAs的組織和細(xì)胞保護(hù)形式也包括在內(nèi)。]根據(jù)本發(fā)明的ERAs也可包括長效形式的EPO。如本文使用的″長效EPO″包括具有循環(huán)半衰期增加的EPO，典型地通過修飾獲得，例如降低免疫原性和清除率，和包囊在聚合物微球體中的EPO的緩釋組合物和制劑。長效EPO的一個(gè)實(shí)例公開于PCT公布WO 02/49673(F.Hoffman-La Roche AG)中，將其內(nèi)容引入本文作為參考。WO02/49673公布描述了包含具有N-末端α-氨基的紅細(xì)胞生成素糖蛋白的共軛物，選自hEPO或其類似物，該類似物具有通過通過添加1-6糖基化位點(diǎn)或糖基化位點(diǎn)重排來修飾的hEPO序列，其中糖蛋白共價(jià)連接至PEG基。長效EPO的其它實(shí)例包括，但不限于公開于PCT公布WO02/32957(Chugal Seiyaku Kabushiki Kaisha，Japan)中的PEG-修飾的EPO，描述于PCT公開WO 94/28024(Enzon，Inc.)中的具有紅細(xì)胞生成活性和具有至少一個(gè)與非抗原性聚合物共價(jià)連接的氧化的碳水化物部分的糖蛋白共軛物，及使用琥珀酰亞胺基羧甲基化PEG(SCM-PEG)、琥珀酰亞胺基丙酸酯PEG(SPA-PEG)和SBA-PEG制備的其它PEG-EPO。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的微粒制劑可包括占全部固體0.1至99.9％重量，優(yōu)選占全部固體1至30％重量的ERA。在一個(gè)實(shí)施方案中，微粒制劑中的ERA為穩(wěn)定的，采用穩(wěn)定劑和緩沖劑來防止聚集。在一個(gè)實(shí)施方案中，在微粒制劑使用的穩(wěn)定劑包括糖。糖在ERA微粒制劑中的含量可以為0.1至99.9％重量。可包括在微粒制劑中的糖的實(shí)例包括，但不限于，蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖和果糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，在微粒制劑中使用的緩沖劑的含量為0.1至99.8％重量。優(yōu)選地，緩沖劑具有的pH值為5.0至8.0，更優(yōu)選地為5.5至7.5.。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑在溶液中的濃度為5 mM至50 mM。緩沖劑的實(shí)例包括，但不限于檸檬酸鹽、組氨酸、磷酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、醋酸鹽、碳酸鹽和甘氨酸-甘氨酸(gly-gly)。在這些實(shí)例中，檸檬酸鹽and組氨酸緩沖劑是最優(yōu)選的。穩(wěn)定劑與ERA的比率可以改變。使用檸檬酸鹽緩沖劑時(shí)，穩(wěn)定劑和ERA的比率優(yōu)選為大于2.0。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，在微粒制劑中使用的穩(wěn)定劑可包括糖和一種或多種選自下述的組分氨基酸、多元醇和聚合物。微粒制劑可包括0至99.9％重量的氨基酸，0至99.9％重量的多元醇，和0至99.9％重量的聚合物。.可加入到微粒制劑中的氨基酸的實(shí)例包括，但不限于組氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-亮氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、L-蘇氨酸、2-苯胺和精氨酸。可加入到微粒制劑中的多元醇的實(shí)例包括，但不限于脫水山梨醇和甘露醇?？杉尤氲轿⒘Ｖ苿┲械木酆衔锏膶?shí)例包括，但不限于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖和丙二醇。微粒制劑可包括其它的賦形劑，選自例如表面活性劑、填充劑和鹽。微粒制劑可包括0至10wt％，優(yōu)選0至5wt％的表面活性劑，0至99.9wt％，優(yōu)選0至70wt％的填充劑和0至99.9wt％，優(yōu)選0至70wt％的鹽。包括在微粒制劑中的表面活性劑可以是離子型的或非離子型的。表面活性劑的實(shí)例包括，但不限于聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯(商品名TWEEN20)、聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(商品名TWEEN80)、聚氧乙烯-聚氧丙二醇(商品名PLURONICF68)和十二烷基硫酸鈉(SDS)。填充劑的實(shí)例包括，但不限于，甘露醇和甘氨酸。鹽的實(shí)例包括，但不限于氯化鈉、氯化鈣和氯化鎂。進(jìn)行制劑前研究來評價(jià)pH、緩沖劑類型(檸檬酸鹽、組氨酸、三羥甲基氨基甲烷)、鹽(NaCl)、金屬絡(luò)合物(醋酸鋅和氯化鈣)、氨基酸(精氨酸)和糖(蔗糖)對EPO(epoetinα)溶液的穩(wěn)定性的效果。使用尺寸排阻色譜法(SEC)來評價(jià)EPO溶液的穩(wěn)定性。根據(jù)總可溶性聚集體來評價(jià)穩(wěn)定性，其為比單體大的和可溶于水的EPO相關(guān)化合物的百分?jǐn)?shù)。下述實(shí)施例用于闡述本發(fā)明的目的，而不應(yīng)當(dāng)看作是以與本文描述的不同方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1獲得呈冷凍溶液的EPO的本體溶液，具有的濃度為約3.1mg/ml。用緩沖溶液滲析EPO溶液的四份樣品，得到具有pH分別為4.8、5.8、7.0和7.7的最終溶液。在40℃下，于74天內(nèi)，評價(jià)具有pH為4.8、5.8、7.0和7.7的EPO溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在圖1A中。在74天，具有pH為4.8的溶液的總可溶性聚集體為100％，具有pH為5.8和7.0的溶液的小于10％，具有pH為7.7的溶液的略大于20％。
實(shí)施例2獲得呈冷凍溶液的EPO的本體溶液，具有的濃度為約3.1mg/ml。分別用檸檬酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑和三羥甲基氨基甲烷緩沖液滲析EPO溶液的三份樣品，每種緩沖劑具有的pH為7.0.。在40℃，在74天內(nèi)評價(jià)檸檬酸鹽、組氨酸和三羥甲基氨基甲烷緩沖液中EPO的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在圖1B中。在74天，含有檸檬酸鹽緩沖劑的溶液中總可溶性聚集體略大于4％，含有組氨酸緩沖劑的等于8％，含有三羥甲基氨基甲烷緩沖液的略大于18％。
實(shí)施例3獲得呈冷凍溶液的EPO的本體溶液，具有為約3.1mg/ml的濃度。將濃度為50mM和100mM的NaCl分別加入到兩份樣品中制備三份EPO溶液樣品。在40℃，于74天內(nèi)評價(jià)EPO溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在圖1C中。在74天，不含NaCl的溶液中總可溶性聚集體為略大于4％，含有50mM NaCl的為大約4.5％，含有100mM NaCl的為大約5.5％。結(jié)果表明隨著NaCl濃度增加總可溶性聚集體增加。
實(shí)施例4獲得呈冷凍溶液的EPO的本體溶液，具有為約3.1mg/ml的濃度。將TWEEN20(表面活性劑)以0.01w/v％的量加入到樣品中制備兩份EPO溶液樣品。在40℃，于74天內(nèi)評價(jià)EPO溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在圖1D中。在74天內(nèi)，不含表面活性劑的溶液中總可溶性聚集體為略大于4％，含有表面活性劑的為大約7.5％。
實(shí)施例5獲得呈冷凍溶液的EPO的本體溶液，具有為約3.1mg/ml的濃度。將醋酸鋅和氯化鈣(金屬絡(luò)合物)分別加入到兩份樣品中來制備三份EPO溶液樣品。在40℃，于74天內(nèi)評價(jià)EPO溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在圖1E中。在74天，含有金屬絡(luò)合物的溶液中總可溶性聚集體為大約4％，含有醋酸鋅為大約9.5％，含有氯化鈣的為大約8％。
實(shí)施例6獲得呈冷凍溶液的EPO的本體溶液，具有為約3.1mg/ml的濃度。制備兩份EPO溶液樣品。一份樣品包含精氨酸(氨基酸)，而其它的樣品不包含精氨酸。在40℃，于74天內(nèi)評價(jià)EPO溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在圖1F中。在74天，不含有精氨酸的溶液中總可溶性聚集體為大約4％，含有精氨酸的為大約5.3％。
實(shí)施例7獲得呈冷凍溶液的EPO的本體溶液，具有為約3.1mg/ml的濃度。制備四份EPO溶液樣品。給樣品中加入蔗糖，制備蔗糖與EPO比率分別為0∶1、2.5∶1、5∶1和10∶1的最終溶液。在40℃，于74天內(nèi)評價(jià)EPO的蔗糖溶液的穩(wěn)定性。.結(jié)果顯示在圖1G中。在74天，具有蔗糖與EPO比率為0∶1的溶液中總可溶性聚集體為大約4.2％，具有蔗糖與紅細(xì)胞生成素比率為2.5∶1的為大約2.7％，具有蔗糖與EPO比率為5∶1的為大約2.6％，和具有蔗糖與EPO的比率為10∶1.的為大約2.2％，結(jié)果顯示出隨著蔗糖與EPO的比率增加，總可溶性聚集體的量降低。研究旨在評價(jià)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的微粒制劑的穩(wěn)定性。所述微粒制劑是通過冷凍干燥或噴霧干燥制備的。使用SEC評價(jià)微粒制劑的穩(wěn)定性。根據(jù)EPO負(fù)載量和總可溶性凝聚體來評價(jià)穩(wěn)定性。EPO負(fù)載量為總可溶性EPO在包括單體、二聚體、及其它較高分子量產(chǎn)品的凍干或噴霧干燥的制劑中的百分?jǐn)?shù)。EPO負(fù)載量提供在存貯期間有關(guān)是否存在明顯量的形成的不溶蛋白的某些信息?？偪扇苄跃奂w為比單體大且可溶于水的EPO有關(guān)化合物的百分?jǐn)?shù)。為了研究，獲得呈冷凍溶液的EPO的本體溶液，具有為約3.1mg/ml的濃度。用緩沖溶液滲析不同的EPO溶液樣品。將穩(wěn)定劑和任選的表面活性劑加入到滲析的EPO溶液中來使得最終紅細(xì)胞生成素和穩(wěn)定劑和表面活性劑為想要比率。根據(jù)下述表1顯示的冷凍干燥周期凍干溶液。
表1 下述實(shí)施例是用于闡述的目的，而不應(yīng)當(dāng)看作是以與本文描述的不同方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例8如上所述，用作為緩沖劑的檸檬酸鹽、作為穩(wěn)定劑的蔗糖和作為表面活性劑的TWEEN20來制備十種凍干制劑。下述表2顯示了凍干制劑。
表2 將表2顯示的凍干制劑在40℃下貯存4周，在37℃下貯存三個(gè)月。下述表3顯示了在40℃初始時(shí)、8天和4周和在37℃下3個(gè)月的EPO負(fù)載量。在這些穩(wěn)定點(diǎn)的EPO負(fù)載量也描述在圖2中。結(jié)果顯示出當(dāng)將制劑在40℃下貯存4周和在37℃三個(gè)月的EPO負(fù)載量沒有降低的趨勢，表明不可能形成明顯量的不溶性蛋白。
表3 下述表4顯示了在40℃下初始時(shí)、8天和4周和在37℃下3個(gè)月的總可溶性聚集體。.在這些穩(wěn)定點(diǎn)的總可溶性聚集體也描述在圖3中。當(dāng)在40℃下將制劑C、D、E、F、G、H和J貯存4周，其具有0％的總可溶性聚集體。當(dāng)在37℃下將制劑C、D、G和H貯存3個(gè)月，其具有0.1％的總可溶性聚集體。
表4 使用統(tǒng)計(jì)分析軟件分析蔗糖與紅細(xì)胞生成素的比率和TWEEN20和檸檬酸鹽的濃度對總可溶性聚集體的效果。分析結(jié)果顯示在圖4中。結(jié)果顯示出在冷凍干燥和在40℃下貯存期間，較高比率的蔗糖與EPO穩(wěn)定了EPO制劑。在冷凍干燥期間，加入TWEEN20可減少制劑聚集，但在40℃貯存期不會(huì)改善其穩(wěn)定性。在冷凍干燥期間，檸檬酸鹽的濃度對EPO穩(wěn)定性有很小的影響。然而，在40℃下的貯存期，低濃度的檸檬酸鹽顯示出良好的穩(wěn)定性。
實(shí)施例9如上所述，用組氨酸作為緩沖劑、蔗糖作為穩(wěn)定劑和TWEEN20作為表面活性劑來制備六種凍干制劑。下述表5顯示了凍干制劑。
表5 將所述凍干制劑在40℃下貯存4周，在37℃下儲(chǔ)存三個(gè)月。下述表6顯示了在60℃下初始時(shí)、8天和6周和在37℃下3個(gè)月的EPO負(fù)荷量。
在這些穩(wěn)定點(diǎn)的EPO負(fù)載量也描述在圖5中。結(jié)果顯示出當(dāng)將制劑在40℃下貯存4周和在37℃下貯存三個(gè)月的EPO負(fù)載量沒有降低的趨勢。
表6 下述表7顯示了在40℃下初始時(shí)、8天和4周和在37℃下3個(gè)月的總可溶性聚集體。在這些穩(wěn)定點(diǎn)的總可溶性聚集體也描述在圖6中。對于所有的組氨酸制劑，當(dāng)在40℃下貯存4周和在37℃下貯存3個(gè)月時(shí)，總可溶性聚集體小于0.2％。當(dāng)在40℃下貯存4周，和在37℃下貯存3個(gè)月時(shí)，制劑L和O顯示出0％總可溶性聚集體。
表7
實(shí)施例10獲得呈冷凍溶液的EPO的本體溶液，具有為約3.1mg/ml的濃度。用10mM組氨酸緩沖溶液滲析EPO溶液。將蔗糖(穩(wěn)定劑)和TWEEN20(表面活性劑)加入到滲析的EPO溶液中，以使EPO和蔗糖和表面活性劑得到想要的比率。將該緩沖溶液噴霧干燥成具有EPO∶蔗糖∶TWEEN20∶10mM組氨酸的比率等于1∶4.53∶0.03∶0.50，pH為6.9，EPO負(fù)載量為16.5％。在40℃下貯存噴霧干燥的EPO制劑3個(gè)月。分別在初始時(shí)、1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月使用SEC分析三份樣品。在初始時(shí)間點(diǎn)，EPO粉末具有的平均粒度為大約4.5μm，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為54.9±5.6℃，含水量為1.1 6±0.01％。下述表8顯示了穩(wěn)定性結(jié)果。該結(jié)果顯示出當(dāng)將其在40℃下貯存3個(gè)月時(shí)，EPO粉末可穩(wěn)定地防止聚集。
表8 雖然本發(fā)明參照有限的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，從本發(fā)明公開的內(nèi)容受益的本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以設(shè)計(jì)其它的實(shí)施方案，而不會(huì)背離如本文公開的本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)當(dāng)僅由附加的權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
1.微粒制劑，包含紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑；緩沖劑；和糖；其中緩沖劑和糖使紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑穩(wěn)定以防止聚集。
2.權(quán)利要求1的微粒制劑，其在40℃下穩(wěn)定至少1個(gè)月。
3.權(quán)利要求1的微粒制劑，其在37℃下穩(wěn)定至少3個(gè)月。
4.權(quán)利要求1的微粒制劑，其為凍干的或噴霧干燥的。
5.權(quán)利要求1的微粒制劑，其中紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑的含量為0.1至99.9％重量。
6.權(quán)利要求1的微粒制劑，其中紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑的含量為0.1至30％重量。
7.權(quán)利要求1的微粒制劑，其中紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑為紅細(xì)胞生成素。
8.權(quán)利要求1的微粒制劑，其中糖為蔗糖，緩沖劑為檸檬酸鹽或組氨酸。
9.權(quán)利要求1的微粒制劑，其中糖為蔗糖，緩沖劑為檸檬酸鹽，并且糖與紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑的重量比為大于2.0。
10.權(quán)利要求1的微粒制劑，其中緩沖劑具有5.0至8.0的pH值。
11.權(quán)利要求1的微粒制劑，其中緩沖劑具有5.5至7.5的pH值。
12.權(quán)利要求1的微粒制劑，其中緩沖劑的含量為大約0.1至99.8％重量。
13.權(quán)利要求1的微粒制劑，進(jìn)一步包含含量達(dá)為10％重量的表面活性劑。
14.權(quán)利要求1的微粒制劑，進(jìn)一步包含選自表面活性劑、填充劑和鹽中的一種或多種組分。
15.權(quán)利要求1的微粒制劑，進(jìn)一步包含選自氨基酸、填充劑和聚合物的穩(wěn)定組分。
16.權(quán)利要求1的微粒制劑，其在37℃下于3個(gè)月內(nèi)具有的總可溶性聚集體小于3％。
17.權(quán)利要求1的微粒制劑，其在40℃下于3個(gè)月內(nèi)具有的二聚物小于3％。
18.微粒制劑，包含紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑；緩沖劑，選自檸檬酸鹽和組氨酸；和糖；其中在40℃下于1個(gè)月內(nèi)，微粒制劑具有的總可溶性聚集體小于3％。
19.權(quán)利要求18的微粒制劑，其中糖為蔗糖。
20.權(quán)利要求18的微粒制劑，進(jìn)一步包含含量達(dá)為10％重量的表面活性劑。
全文摘要
微粒制劑，包含紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑、緩沖劑和糖，其中緩沖劑和糖使紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑穩(wěn)定以防止聚集。
文檔編號A61K9/19GK1993110SQ200580026258
公開日2007年7月4日 申請日期2005年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月5日
發(fā)明者劉葵, M·A·德斯賈丁 申請人:阿爾扎公司