專利名稱：結(jié)合紅細(xì)胞生成素受體的新肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及肽化合物，其是紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)的激動(dòng)劑。本發(fā)明還涉及使用此類肽化合物治療與紅細(xì)胞產(chǎn)生不足或缺陷相關(guān)的疾病的治療方法。還提供了包含本發(fā)明的肽化合物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞生成素(EPO)是具有165個(gè)氨基酸的糖蛋白激素，其分子量為約34千道爾頓((kD))，在24、38、83和126位氨基酸上優(yōu)選具有糖基化位點(diǎn)。它最初以具有23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽的前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生。EPO可以以三種形式α、β和脫唾液酸的形式發(fā)生。α和β形式在它們的糖組分中稍有不同，但是具有相同的潛能效力、生物活性和分子量。脫唾液酸形式是除去末端糖((唾液酸))的α或β形式。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了編碼EPO的DNA序列[Lin的美國專利號(hào)4,703,008]。
EPO刺激有絲分裂和紅細(xì)胞前體細(xì)胞的分化，從而確保產(chǎn)生紅細(xì)胞。當(dāng)?shù)脱鯒l件占優(yōu)勢(shì)時(shí)，EPO在腎中產(chǎn)生。在紅細(xì)胞前體細(xì)胞的EPO誘導(dǎo)的分化期間，誘導(dǎo)珠蛋白合成；刺激血紅素復(fù)合體合成；并且鐵蛋白受體數(shù)增加。這些改變?cè)试S細(xì)胞利用更多鐵和合成功能血紅蛋白，其在成熟紅細(xì)胞中結(jié)合氧。從而，紅細(xì)胞和它們的血紅蛋白在為身體供氧中其關(guān)鍵作用。這些改變由EPO與紅細(xì)胞前體細(xì)胞的細(xì)胞表面上的適宜受體的相互作用啟動(dòng)[見，例如，Graber和Krantz(1978)Ann.Rev.Med.29.51-66]。
當(dāng)身體處于健康狀態(tài)時(shí)，EPO以極低濃度存在于血漿中，其中組織從現(xiàn)有的紅細(xì)胞接受足夠的氧合作用。該正常的低濃度足夠刺激通過老化正常損失的血紅細(xì)胞的更替。
在低氧條件下，此時(shí)循環(huán)中血細(xì)胞運(yùn)輸?shù)难鯗p少，循環(huán)中EPO的量增加。例如，通過出血引起的大量失血、過量暴露于輻射導(dǎo)致血紅細(xì)胞的破壞、由于高海拔或者長時(shí)間不省人事導(dǎo)致氧攝取減少，或者多種形式的貧血可以導(dǎo)致低氧。響應(yīng)此類低氧應(yīng)激，升高的EPO水平通過刺激紅細(xì)胞類祖細(xì)胞增殖增加血紅細(xì)胞產(chǎn)生。當(dāng)循環(huán)中血紅細(xì)胞數(shù)大于正常組織氧需求所需時(shí)，循環(huán)中的EPO水平降低。
因?yàn)镋PO是血紅細(xì)胞形成過程中必需的，所以該激素在診斷和治療特征是低或者有缺陷的血紅細(xì)胞產(chǎn)生的血液疾病中具有潛在有用的應(yīng)用。最近的研究已經(jīng)為多種疾病狀態(tài)、疾病和血液不規(guī)則性狀態(tài)提供了設(shè)計(jì)EPO治療功效的基礎(chǔ)，所述疾病狀態(tài)、疾病和血液不規(guī)則性狀態(tài)包括β-地中海貧血[見，Vedovato，等人(1984)Acta.Haematol.71211-213]；囊性纖維化[見，Vichinsky，等人(1984)J.Pediatric 10515-21]；妊娠和月經(jīng)失調(diào)[見，Cotes，等人(193)Brit.J.Ostet.Gyneacol.90304-311]；早產(chǎn)兒貧血[見，Haga，等人(1983)Acta Pediatr.Scand.72；827-831]；脊髓損傷[見，Claus-Walker，等人(1984)Arch.Phys.Med.Rehabil.65370-374]；太空飛行[見，Dunn，等人(1984)Eur.J.Appl.Physiol.52178-182]；急性失血[見，Miller，等人(1982)Brit.J.Haematol.52545-590]；老化[見，Udupa，等人(1984)J.Lab.Clin.Med.103574-580和581-588和Lipschitz，等人(1983)Blood 63502-509]；伴隨著異常紅細(xì)胞發(fā)生的多種瘤性疾病狀態(tài)[見，Dainia k，等人(1983)Cancer 51101-1106和Schwartz，等人(1983)Otolaryngol.109269-272]；和腎機(jī)能不全[見，Eschbach.等人(1987)N.Eng.J.Med.31673-78]。
已經(jīng)表征了經(jīng)純化的同質(zhì)EPO[Hewick的美國專利號(hào)4,677,195]。純化、克隆并表達(dá)了編碼EPO的DNA序列以產(chǎn)生具有與天然EPO相同生物化學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)的重組多肽。還產(chǎn)生了具有與天然EPO上寡糖相同的寡糖的重組EPO分子[見，Sasaki，等人(1987)J.Biol.Chem.26212059-12076]。
EPO的生物學(xué)效應(yīng)似乎部分通過與細(xì)胞膜結(jié)合的受體的相互作用介導(dǎo)。使用從小鼠脾臟分離的不成熟紅細(xì)胞樣細(xì)胞的初步研究表明結(jié)合EPO的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)包括包含兩種多肽，它們分別具有約85,000道爾頓和100,000道爾頓的分子量[Sawyer，等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA843690-3694]。計(jì)算出EPO結(jié)合位點(diǎn)數(shù)平均為每個(gè)細(xì)胞表面800到1000個(gè)。在這些結(jié)合位點(diǎn)中，約300個(gè)以約90pM((皮摩爾的))的Kd結(jié)合EPO，而剩下的以約570pM的更小親和力結(jié)合EPO[Sawyer，等人(1987)J.Biol.Chem.2625554-5562]。獨(dú)立的研究表明從注射弗羅德白血病病毒的貧血株系((FVA))的小鼠制備的EPO-反應(yīng)性脾成紅血細(xì)胞具有總共約400個(gè)高和低親和性EPO結(jié)合位點(diǎn)，它們的Kd值分別為約100pM和800pM[Landschulz，等人(1989)Blood 731476-1486]。
隨后的工作表明EPO受體((EPO-R))的兩種形式由一種基因編碼。該基因已被克隆[見，例如，Jones，等人(1990)Blood 76，31-35；Noguchi，等人(1991)Blood 782548-2556；Maouche，等人(1991)Blood 782557-2563]。例如，在D′Andrea，等人的PCT公開號(hào)WO 90/08822中描述了鼠和人EPO-R蛋白質(zhì)的DNA序列和編碼的肽序列。當(dāng)前的模型表明EPO與EPO-R的結(jié)合導(dǎo)致兩種EPO-R分子的二聚化二聚化和激活，其導(dǎo)致隨后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的隨后步驟[見，例如，Watowich，等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892140-2144]。
EPO-R的克隆基因的可得性促進(jìn)了對(duì)該重要受體的激動(dòng)劑和拮抗劑的研究。所述重組受體蛋白質(zhì)的可得性允許在多種隨機(jī)和半隨機(jī)肽多樣性產(chǎn)生系統(tǒng)中研究受體-配體相互作用。這些系統(tǒng)包括“質(zhì)粒上肽”系統(tǒng)[美國專利號(hào)6,270,170中描述]；“噬菌體上肽”系統(tǒng)[美國專利號(hào)5,432,018和Cwirla，等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378-6382描述]；“編碼的合成文庫”((ESL))系統(tǒng)[1992年9月16日提交的美國專利申請(qǐng)序號(hào)946,239中描述]；和“極大規(guī)模固定化聚合物合成”系統(tǒng)[美國專利號(hào)5,143,854；PCT公開號(hào)90/15070；Fodor，等人(1991)Science 251767-773；Dower和Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.26271-180；和美國專利號(hào)5,424,186中描述]。
至少一定程度與EPO-R相互作用的肽已經(jīng)得到鑒定并且在例如，Wrighton，等人的美國專利號(hào)5,773,569；5,830,851；和5,986,047；Wrighton，等人的PCT公開號(hào)WO 96/40749；Johnson和Zivin的美國專利號(hào)5,767,078和PCT公開號(hào)96/40772；Balu的PCT公開號(hào)WO01/38342；和Smith-Swintosky，等人的WO01/91780中描述。尤其，已經(jīng)鑒定了一組含有肽基序的肽，該組肽的成員結(jié)合EPO-R并且刺激EPO-依賴性細(xì)胞增殖。然而，目前為止鑒定的含有所述基序的肽在體外以約20納摩爾(nM)到約250nM的EC50值刺激EPO-依賴性細(xì)胞增殖。從而，需要約20nM到250nM的肽濃度刺激EPO刺激的最大細(xì)胞增殖的50％。
考慮到EPO-R激動(dòng)劑對(duì)于研究該受體介導(dǎo)的重要的生物活性和治療疾病的巨大潛力，仍然需要鑒定具有增強(qiáng)的效力和活性的肽EPO-R激動(dòng)劑。本發(fā)明提供了此類化合物。
本章節(jié)中和整個(gè)說明書中的引用和/或?qū)σ玫膮⒖嘉墨I(xiàn)的討論僅僅提供用于闡明本發(fā)明的描述并且不是承認(rèn)此類參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的“現(xiàn)有技術(shù)”。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有顯著增強(qiáng)的效力和活性的EPO-R激動(dòng)劑肽。這些激動(dòng)劑包括長17到約40個(gè)氨基酸的單體肽激動(dòng)劑，其包含核心氨基酸序列LYACHX0GPITX1VCQPLR(SEQ ID NO1)，其中每個(gè)氨基酸通過標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫表示，X0為甲硫氨酸(M)或者高絲氨酸甲醚(Hsm)，X1為色氨酸(W)、1-萘基丙氨酸(1-nal)或者2-萘基丙氨酸(2-nal)；還提供了包含兩個(gè)肽單體的二聚體肽激動(dòng)劑，其中每個(gè)肽單體長17到約40個(gè)氨基酸并且包含核心氨基酸序列LYACHX0GPITX1VCQPLR(SEQ ID NO1)，其中每個(gè)氨基酸通過標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫表示，X0為甲硫氨酸(M)或者高絲氨酸甲醚(Hsm)，X1為色氨酸(W)、1-萘基丙氨酸(1-nal)或者2-萘基丙氨酸(2-nal)。通過一種或多種修飾可以進(jìn)一步增強(qiáng)這些新肽激動(dòng)劑的效力，所述修飾包括乙?；⒎肿觾?nèi)二硫鍵形成，和共價(jià)連接一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇(PEG)部分。本發(fā)明還提供了包含此類肽激動(dòng)劑的藥物組合物，和使用此類肽激動(dòng)劑治療多種醫(yī)學(xué)病癥的方法。
發(fā)明詳述定義肽中氨基酸殘基如下簡寫苯丙氨酸為Phe或F；亮氨酸為Leu或L；異亮氨酸為Ile或I；甲硫氨酸為Met或M；纈氨酸為Val或V；絲氨酸為Ser或S；脯氨酸為Pro或P；蘇氨酸為Thr或T；丙氨酸為Ala或A；酪氨酸為Tyr或Y；組氨酸為His或H；谷氨酰胺為Gln或Q；天冬酰胺為Asn或N；賴氨酸為Lys或K；天冬氨酸為Asp或D；谷氨酸為Glu或E；半胱氨酸為Cys或C；色氨酸為Trp或W；精氨酸為Arg或R；甘氨酸為Gly或G。肽中非常規(guī)氨基酸縮寫如下1-萘基丙氨酸為1-nal或者Np；2-萘基丙氨酸為2-nal；N-甲基氨基酸(也稱作肌氨酸)為MeG或Sc；高絲氨酸甲醚為Hsm；乙?；拾彼?N-乙酰基甘氨酸)為AcG。
如文中所用的，術(shù)語“多肽”或者“蛋白質(zhì)”指通過酰胺鍵連接在一起的α氨基酸的氨基酸單體的聚合物。因此，多肽為長至少兩個(gè)氨基酸殘基并且通常更長。通常，術(shù)語“肽”指長僅為幾個(gè)氨基酸殘基的多肽。本發(fā)明的新的EPO-R激動(dòng)劑肽優(yōu)選長度不超過約50個(gè)氨基酸殘基。它們更優(yōu)選長為約17到約40個(gè)氨基酸殘基。與肽相比，多肽可以含有任意數(shù)目的氨基酸殘基。所以，術(shù)語多肽包括肽以及氨基酸的更長序列。
如文中所用的短語“藥學(xué)上可接受的”指“通常認(rèn)為安全”，即當(dāng)施用于人時(shí)為生理上可耐受的并且通常不產(chǎn)生過敏或者類似的不良反應(yīng)，如胃不適、眩暈等等的分子實(shí)體和組合物。優(yōu)選地，如本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”指得到聯(lián)邦或者州政府管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)或者美國藥典或者其他公知的藥典中所列用于動(dòng)物，更尤其用于人。術(shù)語“載體”指與化合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或者運(yùn)載體。此類藥物載體可以是無菌液體，如水或油，包括石油、動(dòng)物、植物或者合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。水或者水性溶液鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液優(yōu)選用作載體，尤其用于可注射溶液。適宜的藥物載體在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。
如本文所用的術(shù)語“激動(dòng)劑”指生物活性配體，其結(jié)合其互補(bǔ)生物活性受體并激活該受體而導(dǎo)致該受體中生物應(yīng)答或者增強(qiáng)所述受體的現(xiàn)有生物活性。
作為EPO-R激動(dòng)劑的新肽本發(fā)明涉及肽，其是EPO-R的激動(dòng)劑并且顯示出顯著增強(qiáng)的效力和活性。這些肽激動(dòng)劑優(yōu)選長為17到約40個(gè)氨基酸并且包含核心氨基酸序列LYACHX0GPITX1VCQPLR(SEQ ID NO1)，其中每個(gè)氨基酸通過標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫表示，X0為甲硫氨酸(M)或者高絲氨酸甲醚(Hsm)，X1為色氨酸(W)、1-萘基丙氨酸(1-nal)，或者2-萘基丙氨酸(2-nal)。
本發(fā)明的肽可以是單體、二聚體或者其他多聚體。本發(fā)明的肽多聚體可以是三聚體、四聚體、五聚體或者其他更高級(jí)別的結(jié)構(gòu)。此外，此類二聚體和其他多聚體可以是異二聚體或者異多聚體。本發(fā)明的肽單體可以是降解產(chǎn)物(例如，甲硫氨酸或者脫酰胺化谷氨酰胺、精氨酸和C-末端酰胺的氧化產(chǎn)物)。此類降解產(chǎn)物可以用于本發(fā)明并且因此認(rèn)為是本發(fā)明的部分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的異多聚體包含都是EPO-R激動(dòng)劑肽的多個(gè)肽。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多聚體是同型多聚體即，它們包含相同氨基酸序列的多個(gè)EPO-R激動(dòng)劑肽。
因此，本發(fā)明還涉及EPO-R的二聚體肽激動(dòng)劑，其顯示出顯著增強(qiáng)的效力和活性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體包含都是EPO-R激動(dòng)劑肽的兩種肽。這些優(yōu)選的二聚體肽激動(dòng)劑包含兩個(gè)肽單體，其中每個(gè)肽單體長為17到約40個(gè)氨基酸并且包含核心氨基酸序列LYACHX0GPITX1VCQPLR(SEQ ID NO1)，其中每個(gè)氨基酸通過標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫表示，X0為甲硫氨酸(M)或者高絲氨酸甲醚(Hsm)，X1為色氨酸(W)、1-萘基丙氨酸(1-nal)或者2-萘基丙氨酸(2-nal)。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體包含相同氨基酸序列的兩個(gè)EPO-R激動(dòng)劑肽。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，獨(dú)立地選自20種遺傳編碼的L-氨基酸或者立體異構(gòu)的D-氨基酸的2個(gè)和多個(gè)，優(yōu)選2-6個(gè)氨基酸殘基偶聯(lián)到上述核心序列的一端或兩端。例如，序列GG將通常附著到核心序列的一端和兩端。
20種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸，如a，a-雙取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明化合物的適宜組分。非常規(guī)氨基酸的實(shí)例包括，但不限于β-丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-羥基脯氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙酰基絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、正亮氨酸，和其他相似的氨基酸和亞氨基酸。
其他修飾也是可能的，包括氨基末端的修飾、羧基末端修飾、一個(gè)或多個(gè)天然發(fā)生的遺傳編碼的氨基酸用非常規(guī)氨基酸替換、一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈的修飾、肽磷酸化等等。優(yōu)選的氨基末端修飾是乙酰化(例如，用乙酸或者鹵素取代的乙酸)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將N-末端甘氨酸乙?；蒒-乙酰基甘氨酸(AcG)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，C-末端甘氨酸是N-甲基甘氨酸(MeG，也稱作肌氨酸)。
本發(fā)明優(yōu)選的肽單體包括，但不限于
LYACHMGPITWCQPLR (SEQ ID NO2)；LYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(SEQ ID NO3)；LYACHMGPIT(2-nal)VCQPLR(SEQ ID NO4)；GGLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO5)；GGLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO6)；GGLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO7)；(AcG)GLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO8)；(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO9)；(AcG)GLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO10)；GGLYACHMGPITWVCQPLR(MeG) (SEQ ID NO11)；GGLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO12)；GGLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO13)；(AcG)GLYACHMGPITWVCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO14)；(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO15)；(AcG)GLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO16)；LYACH(Hsm)GPITWVCQPLR (SEQ ID NO17)；LYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLR(SEQ ID NO18)；LYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLR(SEQ ID NO19)；GGLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO20)；GGLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO21)；GGLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO22)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO23)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO24)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO25)；GGLYACH(Hsm)GPITWVCQPLR(MeG) (SEQ ID NO26)；GGLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO27)；GGLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO28)；(AcG)GLYACH(Hsn)GPITWVCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO29)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO30)；和(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO31).
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽單體含有核心序列的兩個(gè)半胱氨酸殘基間的分子內(nèi)二硫鍵。此類單體可以圖示如下 或 本發(fā)明還提供了這些肽單體的綴合物。從而，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的肽單體被二聚化或者寡聚化，從而增強(qiáng)EPO-R激動(dòng)劑活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用生物素/鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)可以寡聚化本發(fā)明的肽單體。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以合成肽單體的生物素化類似物。例如，肽單體可以C-末端生物素化。這些生物素化單體然后通過與鏈霉抗生物素蛋白孵育[例如，在室溫下以4∶1摩爾比在磷酸緩沖鹽水(PBS)或者HEPES緩沖的RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen)中孵育1小時(shí)]寡聚化。在該實(shí)施方案的變通方案中，生物素化單體可以通過與多種通過商業(yè)途徑可得到的抗-生物素抗體的任意一種[例如，山羊抗-生物素IgG，來自Kirkegaard & PerryLaboratories，Inc.(Washington，DC)]孵育而寡聚化。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽單體通過共價(jià)連接到至少一個(gè)連接體部分二聚化。連接體(LK)部分是優(yōu)選的，但是不是必需的，C1-12連接部分任選以一個(gè)或兩個(gè)NH-鍵結(jié)束并且任選在一個(gè)或多個(gè)可利用的碳原子上用低級(jí)烷基取代基取代。優(yōu)選地，連接體LK包含-NH-R-NH-，其中R是低級(jí)(C1-6)亞烷基，其經(jīng)諸如羧基或氨基的官能團(tuán)取代從而能夠結(jié)合另一分子部分(例如，可以存在于固態(tài)支持體的表面上)。最優(yōu)選地，連接體是賴氨酸殘基或者賴氨酸酰胺(賴氨酸殘基，其中羧基已經(jīng)被轉(zhuǎn)化成酰胺部分-CONH2)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體通過同時(shí)連接到每一個(gè)單體的C-末端氨基酸橋接兩個(gè)肽單體的C-末端。
例如，當(dāng)C-末端連接體LK是賴氨酸酰胺時(shí)，二聚體可以在結(jié)構(gòu)上如式1所示并且如式II概述
式I 式II 在式I和式II中，N2代表賴氨酸的ε-氨基的氮原子，N1代表賴氨酸的α-氨基的氮原子。該二聚結(jié)構(gòu)可以寫作[肽]2Lys-酰胺以表示肽結(jié)合賴氨酸的α和ε氨基，或者寫作[Ac-肽]2Lys-酰胺以表示N-末端乙?；慕Y(jié)合賴氨酸的α和ε氨基，或者寫作[Ac-肽，二硫鍵]2Lys-酰胺以表示N-末端乙酰化肽結(jié)合到賴氨酸的α和ε氨基，每個(gè)肽含有分子內(nèi)二硫鍵環(huán)，或者寫作[Ac-肽，二硫鍵]2Lys-間隔臂-PEG以表示N-末端乙?；慕Y(jié)合賴氨酸的α和ε氨基，每個(gè)肽含有分子內(nèi)二硫鍵環(huán)，并且間隔臂分子在賴氨酸的C末端和PEG部分之間形成共價(jià)鍵，或者[Ac-肽-Lys*-NH2]2-亞氨酸二乙酸-N-(Boc-βAla)以表示具有C-末端賴氨酸酰胺殘基的N-末端乙酰化肽的同型二聚體，其中賴氨酸的酰胺結(jié)合到亞氨基二乙酸的兩個(gè)羧基的每一個(gè)并且其中Boc-β-丙氨酸通過酰胺鍵共價(jià)結(jié)合到亞氨基二乙酸的氮原子。
在額外的實(shí)施方案中，聚乙二醇(PEG)可以作為二聚化兩個(gè)肽單體的連接體LK例如，一個(gè)PEG部分可以同時(shí)連接肽二聚體的兩條肽鏈的N-末端。
在再一個(gè)額外實(shí)施方案中，連接體(LK)部分是優(yōu)選地，但不是必須的，一個(gè)分子含有兩個(gè)羧酸并且在一個(gè)和多個(gè)可利用的原子用能夠結(jié)合一個(gè)和多個(gè)PEG分子的額外的官能團(tuán)如胺任選取代。這種分子可以描繪為-CO-(CH2)n-X-(CH2)m-CO-其中n為0到10的整數(shù)，m為1到10的整數(shù)，X選自O(shè)、S、N(CH2)pNR1、NCO(CH2)pNR1和CHNR1，R1選自H、Boc、Cbz等等，p為1到10的整數(shù)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)肽的一個(gè)氨基與連接體LK形成酰胺鍵。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合連接體LK的肽的氨基是賴氨酸殘基的ε胺或者N-末端殘基的α胺，或者任選的間隔臂分子的氨基。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，n和m為1，X為NCO(CH2)pNR1，p為2，R1為Boc。含有此類優(yōu)選的連接體的二聚EPO肽可以在結(jié)構(gòu)上以式III表示。
式III 任選地，可以除去Boc基團(tuán)以釋放活性氨基，其能夠與適當(dāng)激活的水溶性聚合物種類形成共價(jià)鍵，所述聚合物種類為例如，PEG種類，如mPEG-對(duì)-硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)、mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯(mPEG-SPA)和N-羥基琥珀酰亞胺-PEG(NHS-PEG)(見，例如，美國專利號(hào)5,672,662)。含有此類優(yōu)選的連接體的二聚EPO肽可以在結(jié)構(gòu)上如式IV表示。
式IV 通常，盡管不是必須，肽二聚體將還含有肽單體的半胱氨酸殘基之間的一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。優(yōu)選地，兩個(gè)單體含有至少一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。最優(yōu)選地，肽二聚體的兩個(gè)單體都含有分子內(nèi)二硫鍵，從而每個(gè)單體含有環(huán)狀基團(tuán)。
肽單體或二聚體可以還包含一個(gè)或多個(gè)間隔臂部分。此類間隔臂部分可以連接到肽單體或者肽二聚體。優(yōu)選地，此類間隔臂部分連接到連接體LK部分，該LK部分連接肽二聚體的單體。例如，此類間隔臂部分可以通過賴氨酸連接體的羰基碳或者通過亞氨基二乙酸連接體的氮原子連接到肽二聚體。例如，此類間隔臂可以將肽二聚體的連接體連接到所連接的水溶性聚合物部分或者保護(hù)基。在另一實(shí)例中，此類間隔臂可以將肽單體連接到所附的水溶性聚合物部分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔臂部分是任選以-NH-鍵或者羧基(-COOH)基團(tuán)結(jié)束的C1-12連接部分，其任選在一個(gè)或多個(gè)可利用的碳原子上用低級(jí)烷基取代基取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔臂是R-COOH，其中R是低級(jí)(C1-6)亞烷基，其任選用能夠使得結(jié)合另一分子部分的官能團(tuán)如羧基或氨基取代。例如，間隔臂可以是甘氨酸(G)殘基，或者氨基己酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，氨基己酸是6-氨基己酸(Ahx)。例如，當(dāng)間隔臂6-氨基己酸(Ahx)結(jié)合肽的N-末端時(shí)，肽末端胺基可以通過標(biāo)準(zhǔn)酰胺偶聯(lián)連接到Ahx的羧基。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)Ahx結(jié)合肽的C-末端時(shí)，Ahx的胺可以通過標(biāo)準(zhǔn)酰胺偶聯(lián)連接到末端氨基酸的羧基。此類肽的結(jié)構(gòu)可以如式V描繪，并且在圖VI中概述。
式V 式VI 在其他實(shí)施方案中，間隔臂是-NH-R-NH-，其中R是低級(jí)(C1-6)亞烷基，其任選用能夠使得結(jié)合另一分子部分的官能團(tuán)如羧基或氨基取代。例如，間隔臂可以是賴氨酸(K)殘基或者賴氨酸酰胺(K-NH2，其中羧基已經(jīng)轉(zhuǎn)化成酰胺部分-CONH2的賴氨酸殘基)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，間隔臂部分具有下面的結(jié)構(gòu)-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-其中α、β、γ、δ和ε每個(gè)都是整數(shù)，它們的值獨(dú)立地選擇。在優(yōu)選實(shí)施方案中，α、β和ε每個(gè)都是整數(shù)，它們的值獨(dú)立地選自1到約6，δ為0或1，γ為選自0到約10的整數(shù)，只是當(dāng)γ大于1時(shí)，β為2，Y選自NH或CO。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，α、β和ε每個(gè)都等于2，γ和δ都等于1，Y為NH。例如，含有此類間隔臂的肽二聚體在式VII中圖示，其中連接體是賴氨酸并且間隔臂將連接體連接到Boc保護(hù)基。
式VII 在另一尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，γ和δ為0，α和ε一起等于5，Y為CO。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體加上間隔臂部分具有式VIII或式IX中所示的結(jié)構(gòu)。
式VIII 式IX 本發(fā)明的肽單體、二聚體、或者多聚體可以還包含一種或多種水溶性聚合物部分。優(yōu)選地，這些聚合物共價(jià)連接本發(fā)明的肽化合物。優(yōu)選地，對(duì)于終產(chǎn)物制備物的治療用途，所述聚合物將是藥學(xué)上可接受的。本領(lǐng)域所述技術(shù)人員將能夠基于該聚合物-肽綴合物是否用于治療，和如果用于治療，那么所希望的劑量、循環(huán)時(shí)間、對(duì)蛋白酶解的抗性，和其他考慮選擇所希望的聚合物。水溶性聚合物可以是例如，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環(huán)和聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/馬來酐共聚物、聚氨基酸(例如，均聚物或者隨機(jī)共聚物)、聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物和聚氧乙烯化多元醇。優(yōu)選的水溶性聚合物是PEG。
所述聚合物可以是任意分子量，并且可以是分枝或非分枝的。用于本發(fā)明的優(yōu)選的PEG包含線性、未分枝的PEG，其分子量大于10千道爾頓(kD)，更優(yōu)選分子量為約20到60kD。更優(yōu)選地，所述線性、未分枝的PEG部分具有約20到40kD的分子量，尤其優(yōu)選20kD PEG。應(yīng)該理解在給定PEG制備物中，個(gè)別分子之間分子量通常不同。某些分子量比所述分子量大，某些分子量比所述分子量小。此類變化通常通過使用“約”反映以描述PEG分子的分子量。
連接的聚合物分子數(shù)可以改變；例如，1、2、3或更多水溶性聚合物可以連接到本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽。多個(gè)連接的聚合物可以是相同或者不同的化學(xué)部分(例如，不同分子量的PEG)。從而，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)想連接兩個(gè)或更多PEG部分的EPO-R激動(dòng)劑肽。優(yōu)選地，兩個(gè)PEG部分都是線性、未分枝的PEG，每個(gè)PEG優(yōu)選具有約10到約60kD的分子量。更優(yōu)選地，每個(gè)線性、未分枝的PEG部分具有約20到40kD，尤其優(yōu)選約20到30kD的分子量，尤其優(yōu)選每個(gè)線性PEG部分的分子量約20kD。然而，在這些實(shí)施方案中還設(shè)想PEG的其他分子量。例如，本發(fā)明設(shè)想并且包括連接兩個(gè)或更多線性未分枝的PEG部分的EPO-R激動(dòng)劑肽，至少一個(gè)或兩個(gè)PEG具有約20到40kD或約20到30kD的分子量。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)想并且包括連接兩個(gè)或更多線性未分枝的PEG部分的EPO-R激動(dòng)劑肽，至少一個(gè)PEG具有約40到60kD的分子量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG可以作為二聚化兩個(gè)肽單體的連接體。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG連接到肽單體或者二聚體的至少一個(gè)末端(N-末端或C-末端)。在另一實(shí)施方案中，PEG連接到肽單體或者二聚體的間隔臂部分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，PEG連接到肽二聚體的連接體部分。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG連接到間隔臂部分，其中所述間隔臂部分連接到連接體LK部分，該LK部分連接肽二聚體的單體。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG連接到間隔臂部分，其中所述間隔臂部分通過賴氨酸連接體的羰基碳或者賴氨酸酰胺連接體的酰胺氮連接到肽二聚體。
本發(fā)明的優(yōu)選肽二聚體包括，但不限于



本發(fā)明的其他肽(包括肽單體和二聚體)如下



本發(fā)明的肽序列可以單獨(dú)存在或者結(jié)合肽鏈的N-末端和/或C-末端延伸(extension)存在。此類延伸可以是天然編碼的肽序列，其任選具有或者基本上沒有非天然發(fā)生的序列；該延伸可以包括任意加入、缺失、點(diǎn)突變或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所希望的其他序列修飾或者組合。例如并且不限于，天然發(fā)生的序列可以是全長或者部分長度并且可以包括氨基酸替換以提供糖、PEG、其他聚合物等通過側(cè)鏈綴合連接的位點(diǎn)。在變通方案中，氨基酸替換導(dǎo)致序列的人源化，使得所述序列與人免疫系統(tǒng)相容。提供了所有類型的融合蛋白質(zhì)，包括與有或者沒有非免疫球蛋白間隔臂序列的本發(fā)明的EPO-R活化序列相鄰或者接近的免疫球蛋白序列。一種實(shí)施方案是免疫球蛋白鏈，其具有代替重鏈和/或輕鏈的可變(V)區(qū)的EPO-R活化序列。
制備本發(fā)明的肽化合物肽合成通過本領(lǐng)域已知的經(jīng)典方法可以制備本發(fā)明的肽。這些標(biāo)準(zhǔn)方法包括完全固相合成、部分固相合成方法、片段縮合、經(jīng)典溶液合成、和重組DNA技術(shù)[見，例如，Merrifield J.Am.Chem.Soc.1963852149]。
在一個(gè)實(shí)施方案中，分別合成肽二聚體的肽單體并合成后二聚化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，二聚體的肽單體具有相同的氨基酸序列。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，二聚體的肽單體經(jīng)由它們的C-末端通過連接體LK部分連接，所述LK部分具有能夠作為肽合成的起始位點(diǎn)的兩個(gè)官能團(tuán)和能夠結(jié)合另一分子部分(例如，可以存在于固相支持體的表面上)的第三個(gè)官能團(tuán)(例如，羧基或者氨基)。在該情況中，可以以固相合成技術(shù)的變通方案直接在連接體LK部分的兩個(gè)活性氮基團(tuán)上合成兩個(gè)肽單體。此類合成可以是順序的或者同時(shí)的。
當(dāng)進(jìn)行將二聚體的肽鏈順序合成到連接體上時(shí)，用兩個(gè)不同的可以獨(dú)立(orthogonally)除去的胺保護(hù)基保護(hù)連接體分子上的兩個(gè)胺官能團(tuán)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受保護(hù)的二胺是受保護(hù)的賴氨酸。受保護(hù)的連接體通過該連接體的第三個(gè)官能團(tuán)偶聯(lián)固相支持體。除去第一個(gè)胺保護(hù)基，并在第一個(gè)去保護(hù)的胺部分上合成二聚體的第一個(gè)肽。然后除去第二個(gè)胺保護(hù)基，并在第二個(gè)去保護(hù)的胺部分上合成二聚體的第二個(gè)肽。例如，可以用Alloc保護(hù)連接體的第一個(gè)氨基部分，用Fmoc保護(hù)第二個(gè)氨基部分。在該情況下，可以用弱堿[例如，二甲基甲酰胺[DMF]中的20％哌啶]處理除去Fmoc基(但不是Alloc基)，并合成第一條肽鏈。之后，可以用適宜的試劑[例如，Pd(PPh3)/4-甲基嗎啉和氯仿]除去Alloc基，并合成第二條肽鏈。該技術(shù)可以用于產(chǎn)生二聚體，其中兩條肽鏈的序列相同或不同。注意到將對(duì)半胱氨酸使用不同的硫羥保護(hù)基以控制二硫鍵形成(如下文討論)，甚至當(dāng)二聚體的肽鏈的最后氨基酸序列相同時(shí)也必須使用該技術(shù)。
當(dāng)將二聚體的肽鏈同時(shí)合成到連接體上時(shí)，可以用相同的可除去的胺保護(hù)基保護(hù)連接體分子的兩個(gè)胺官能團(tuán)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受保護(hù)的二胺是受保護(hù)的賴氨酸。通過連接體的第三個(gè)官能團(tuán)將受保護(hù)的連接體偶聯(lián)到固相支持體。在該情況中，連接體分子的兩個(gè)受保護(hù)的官能團(tuán)同時(shí)去保護(hù)，并在去保護(hù)的胺上同時(shí)合成兩條肽鏈。注意到使用該技術(shù)，二聚體的肽鏈的序列將相同，并且半胱氨酸殘基的硫羥保護(hù)基都是相同的。
肽合成的優(yōu)選方法是固相合成。固相肽合成方法是本領(lǐng)域公知的[見，例如，Stewart Solid Phase Peptide Syntheses(Freeman和同事SanFrancisco)1969；Novabiochem Corp，San Diego，USA的2002/2003通用目錄；Goodman Synthesis of Peptides and Peptidomimetics(Houben-Weyl，Stuttgart)2002]。在固相合成中，通常使用α-氨基受保護(hù)的樹脂從肽的C-末端開始合成。例如，通過將所需的α-氨基酸連接到氯甲基化樹脂、羥基甲基樹脂、聚苯乙烯樹脂、二苯甲基胺樹脂等等可以制備適宜的起始材料。一種此類氯甲基化樹脂由Bio Rad Laboratories(Richmond，CA)以商標(biāo)名BIO-BEADS SX-1出售。已經(jīng)描述了羥基甲基樹脂的制備[Bodonszky，等人(1966)Chem.Ind.London 381597]。已經(jīng)描述了二苯甲基胺(BHA)樹脂，并且可以從Beckman Instruments，Inc.(Palo Alto，CA)通過商業(yè)途徑獲得所述樹脂的氯化氫形式。例如，通過利用碳酸氫銫催化劑，根據(jù)Gisin(1973)Helv.Chim.Acta 561467的方法可以將α-氨基受保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)到氯甲基化樹脂。
最初偶聯(lián)后，例如，使用三氟乙酸(TFA)或者氫氯酸(HCl)在有機(jī)溶劑中的溶液在室溫下除去α-氨基保護(hù)基。之后，將α-氨基受保護(hù)的氨基酸連續(xù)偶聯(lián)到增長的支持體結(jié)合的肽鏈。α-氨基保護(hù)基是肽的逐步合成領(lǐng)域中公知的那些，包括?；捅Ｗo(hù)基(例如，甲?；?、三氟乙?；?、乙?；?、芳香尿烷型保護(hù)基[例如，芐氧基羰基(Cbz)和取代的Cbz]、脂肪族尿烷保護(hù)基[例如，叔丁氧基羰基(Boc)、異丙氧基羰基、環(huán)己基氧基羰基]，和烷基型保護(hù)基(例如，芐基、三苯基甲基)、芴基甲氧基羰基(Fmoc)、烯丙氧基羰基(Alloc)和1-(4，4-二甲基-2，6-二噁環(huán)己-1-叉基)乙基(Dde)。
側(cè)鏈保護(hù)基(通常醚、酯、三苯甲基、PMC等等)在偶聯(lián)期間保持完整并且在氨基末端保護(hù)基的去保護(hù)期間或者偶聯(lián)期間不分裂。該側(cè)鏈保護(hù)基必須在最終肽的合成完成時(shí)和在將不改變靶肽的反應(yīng)條件下是可以除去的。Tyr的側(cè)鏈保護(hù)基包括四氫吡喃基、叔丁基、三苯甲基、芐基、Cbz、Z-Br-Cbz、和2，5-二氯芐基。Asp的側(cè)鏈保護(hù)基包括芐基、2，6-二氯芐基、甲基、乙基和環(huán)己基。Thr和Ser的側(cè)鏈保護(hù)基包括乙?；?、苯甲?；⑷郊谆?、四氫吡喃基、芐基、2，6-一二氯芐基和Cbz。Arg的側(cè)鏈保護(hù)基包括硝基、甲苯磺酰基(Tos)、Cbz、金剛烷氧基羰基?；酋；?Mts)、2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?Pbf)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)、或者Boc。Lys的側(cè)鏈保護(hù)基包括Cbz、2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Cbz)、2-溴代芐氧基羰基(2-Br-Cbz)、Tos或者Boc。
除去α-氨基保護(hù)基后，以所希望的順序逐步偶聯(lián)剩余的受保護(hù)氨基酸。每種受保護(hù)的氨基酸通常以約3倍過量進(jìn)行反應(yīng)，使用適宜的羰基激活劑，如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3四甲基尿鎓六氟磷酸鹽(HBTU)或者二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的溶液，例如，在二氯甲烷(CH2Cl2)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺(DMF)或者它們的混合物中的溶液。
完成所希望的氨基酸序列后，通過用不僅從樹脂切割肽而且切割所有剩余的側(cè)鏈保護(hù)基的試劑，如三氟乙酸(TFA)或者氟化氫(HF)處理從樹脂支持體解偶聯(lián)所希望的肽。當(dāng)使用氯甲基化樹脂時(shí)，氟化氫處理導(dǎo)致形成游離肽酸。當(dāng)使用二苯甲基胺樹脂時(shí)，氟化氫處理直接導(dǎo)致游離肽酰胺。備選地，當(dāng)使用氟甲基化樹脂時(shí)，通過用氨處理肽樹脂可以解偶聯(lián)側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的肽得到所希望的側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的酰胺，或者用烷基胺處理得到側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的烷基酰胺或者二烷基酰胺。然后以常用的方式通過用氟化氫處理除去側(cè)鏈保護(hù)，得到游離酰胺、烷基酰胺或者二烷基酰胺。
在本發(fā)明酯的制備中，使用用于制備肽酸的樹脂，并用堿和適宜的醇(例如，甲醇)切割側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的肽。然后以常用的方式通過用氟化氫處理除去側(cè)鏈保護(hù)基，得到所希望的酯。
這些方法也可以用于合成這樣的肽，在所述肽中，在本發(fā)明化合物的任一種的一個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)位置上用20種天然發(fā)生的遺傳編碼的氨基酸之外的氨基酸替換?？梢蕴鎿Q到本發(fā)明肽的合成氨基酸包括，但不限于，N-甲基、L-羥基丙基、L-3，4-二羥基苯丙氨酰基δ氨基酸，如L-δ-甲基賴氨?；⒑虳-δ-甲基丙氨酰基、L-α-甲基丙氨酰基，β氨基酸和異喹啉基。D-氨基酸和非天然發(fā)生的合成氨基酸也可以摻入到本發(fā)明的肽中。
肽修飾還可以修飾本發(fā)明肽化合物的氨基和/或羧基末端以產(chǎn)生本發(fā)明的其他化合物。氨基末端修飾包括甲基化(即，-NHCH3或者-N(CH3)2)、乙?；?例如，用乙酸或者其鹵化衍生物，如α-氯乙酸、α-溴乙酸、α-碘乙酸)、加入芐氧基羰基(Cbz)，或者用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)氨基末端，所述保護(hù)基團(tuán)含有RCOO-定義的羧化物官能度或者R-SO2-定義的磺酰官能度，其中R選自烷基、芳基、雜芳基、烷基芳基等等，和類似基團(tuán)。還可以在N-末端摻入脫氨基酸(從而沒有N-末端氨基)以減小對(duì)蛋白酶的敏感性或者限制肽化合物的構(gòu)象。在優(yōu)選實(shí)施方案中，N-末端被乙?；Ｔ谧顑?yōu)選的實(shí)施方案中，乙?；疦-末端甘氨酸以產(chǎn)生N-乙酰甘氨酸(AcG)。
羧基末端修飾包括用氨甲?；〈坞x酸或者在羧基末端形成環(huán)狀內(nèi)酰胺以導(dǎo)入結(jié)構(gòu)限制。還可以環(huán)化本發(fā)明的肽，或者在肽的末端摻入脫氨基或者脫羧基殘基，從而沒有末端氨基或者羧基，從而減小對(duì)蛋白酶的敏感性或者限制肽的構(gòu)象。本發(fā)明化合物的C-末端官能團(tuán)包括酰胺、酰胺低級(jí)烷基、酰胺二(低級(jí)烷基)、低級(jí)烷氧基、羥基，和羧基，和它們的低級(jí)酯衍生物，和其藥學(xué)上可接受的鹽。
可以將20種遺傳編碼的氨基酸(或者立體異構(gòu)的D型氨基酸)的天然發(fā)生的側(cè)鏈用其他側(cè)鏈取代，所述其他側(cè)鏈為例如，烷基、低級(jí)烷基、4-、5-、6-到7-元環(huán)狀烷基、酰胺、酰胺低級(jí)烷基、酰胺二(低級(jí)烷基)、低級(jí)烷氧基、羥基，和羧基，和它們的低級(jí)酯衍生物，和4-、5-、6-到7-元雜環(huán)。具體地，可以使用脯氨酸類似物，其中脯氨酸殘基的環(huán)大小從5元改變到4、6或7元。環(huán)狀基團(tuán)可以是飽和的或不飽和的，如果飽和，可以是芳族或者非芳族的。雜環(huán)基團(tuán)優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)氮、氧和/或硫雜原子。此類基團(tuán)的實(shí)例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、異噻唑基、異噁唑基、嗎啉基(例如，嗎啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如，1-哌嗪基)、哌啶基(例如，1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如，1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代嗎啉基(例如，硫代嗎啉代)，和三唑基。這些雜環(huán)基團(tuán)可以是取代或未取代的。當(dāng)基團(tuán)被取代時(shí)，取代基可以是烷基、烷氧基、鹵素、氧，或者取代或未取代的苯基。
可以通過磷酸化和其他方法(例如，如Hruby，等人(1990)BiochemJ.268249-262中描述]修飾肽部分。
本發(fā)明的肽部分還可以作為具有相似生物活性的非肽化合物的結(jié)構(gòu)模型。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到可以用多種技術(shù)構(gòu)建具有與前導(dǎo)肽化合物相同或相似的所希望的生物活性的化合物，但是它們?cè)谌芙庑?、穩(wěn)定性和對(duì)水解和蛋白水解方面比前導(dǎo)肽化合物具有更有利的活性[見，Morgan和Gainor(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24243-252]。這些技術(shù)包括用由膦酸酯、酰胺化物、氨基甲酸酯、磺酰胺、仲胺和N-甲基氨基酸組成的主鏈替換肽主鏈。
二硫鍵的形成本發(fā)明的化合物可以含有一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽單體或者二聚體包含至少一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。在優(yōu)選實(shí)施方案中，肽二聚體包含兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。
可以通過氧化肽核心序列的半胱氨酸殘基形成此類二硫鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過選擇類型和濃度有效優(yōu)化所希望的異構(gòu)體形成的氧化劑進(jìn)行半胱氨酸鍵形成的控制。例如，當(dāng)氧化劑是DMSO時(shí)，優(yōu)先實(shí)現(xiàn)肽二聚體的氧化以形成兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵(每條肽鏈上一個(gè)二硫鍵)(比分子間二硫鍵形成優(yōu)先)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過在肽合成期間選擇性使用硫羥-保護(hù)基控制半胱氨酸鍵的形成。例如，當(dāng)希望具有兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的二聚體時(shí)，合成第一條單體肽，其中核心序列的兩個(gè)半胱氨酸殘基用第一種硫羥保護(hù)基[例如，三苯甲基(Trt)、烯丙氧基羰基(Alloc)，和1-(4，4-二甲基-2，6-二噁環(huán)己-1-叉基)乙基(Dde)等等]保護(hù)，然后合成第二條單體肽，其中核心序列的兩個(gè)半胱氨酸殘基用不同于第一種硫羥保護(hù)基的第二種硫羥保護(hù)基[乙酰氨基甲基(Acm)、叔丁基(tBu)等等]保護(hù)。之后，除去影響第一種單體的二硫鍵環(huán)化的第一種硫羥保護(hù)基，然后除去影響第二種單體的二硫鍵環(huán)化的第二種硫羥保護(hù)基。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案提供了這些二硫鍵衍生物的類似物，其中一個(gè)硫已經(jīng)通過CH2基或者硫的其他isotere替換?？梢詮谋景l(fā)明的化合物制備這些類似物，其中每個(gè)核心序列含有至少一個(gè)C或者高半胱氨酸殘基和α-氨基-γ-丁酸代替第二個(gè)C殘基，所述代替是通過分子內(nèi)或者分子間替換，使用本領(lǐng)域已知的方法[見，例如，Barker，等人(1992)J.Med.Chem.352040-2048和Or，等人(1991)J.Org.Chem.563146-3149]。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易明白使用α-氨基-γ-丁酸和高半胱氨酸的其他同系物也可以進(jìn)行代替。
除了前面的環(huán)化策略，還可以使用其他非二硫鍵肽環(huán)化策略。此類備選環(huán)化策略包括例如，酰胺環(huán)化策略以及包括形成硫醚鍵的策略。從而，本發(fā)明的化合物可以以具有分子內(nèi)酰胺鍵或者分子內(nèi)硫醚鍵的環(huán)化形式存在。例如，可以合成這樣的肽，其中用賴氨酸代替核心序列的一個(gè)半胱氨酸，用谷氨酸代替另一個(gè)半胱氨酸。之后，通過這兩個(gè)殘基的側(cè)鏈間的酰胺鍵可以形成環(huán)狀單體。備選地，可以合成這樣的肽，其中用賴氨酸代替核心序列的一個(gè)半胱氨酸。然后可以通過賴氨酸殘基的側(cè)鏈和核心序列的第二個(gè)半胱氨酸殘基之間的硫醚鍵形成環(huán)狀單體。同樣地，除了二硫鍵環(huán)化策略，可以容易地使用酰胺環(huán)化策略和硫醚環(huán)化策略以環(huán)化本發(fā)明的化合物。備選地，可以用α-取代的乙酸帽化肽的氨基末端，其中α取代基為離去基團(tuán)，如α-鹵乙酸，例如，α-氯乙酸、α-溴乙酸或者α-碘乙酸。
加入連接體在其中通過連接體LK部分二聚化肽二聚體的實(shí)施方案中，可以在肽合成期間將所述連接體摻入到肽中。例如，當(dāng)連接體LK部分含有能夠作為肽合成起始位點(diǎn)的兩個(gè)官能團(tuán)和使得能夠結(jié)合另一分子部分的第三個(gè)官能團(tuán)(例如，羧基或者氨基)時(shí)，可以將連接體綴合到固相支持體。之后，在固相合成技術(shù)的變通方案中，可以將兩個(gè)肽單體直接合成到連接體LK部分的兩個(gè)活性氮基團(tuán)上。
在備選實(shí)施方案中，當(dāng)通過連接體LK部分二聚化肽二聚體時(shí)，肽合成后，所述連接體可以綴合到肽二聚體的兩個(gè)肽單體。通過本領(lǐng)域成熟的方法可以實(shí)現(xiàn)此類綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體含有適于連接到合成的肽單體的靶官能團(tuán)的至少兩個(gè)官能團(tuán)。例如，具有兩個(gè)游離胺基的連接體可以與兩個(gè)肽單體的每一個(gè)的C-末端羧基反應(yīng)。在另一實(shí)例中，預(yù)活化的或者在適宜偶聯(lián)試劑存在下，含有兩個(gè)羧基的連接體可以與兩個(gè)肽單體的每一個(gè)的N-末端或者側(cè)鏈胺基或者C-末端賴氨酸酰胺反應(yīng)。
加入間隔臂在其中肽化合物含有間隔臂部分的實(shí)施方案中，在肽合成期間，所述間隔臂可以摻入到肽中。例如，當(dāng)間隔臂含有游離氨基和使得能夠結(jié)合另一分子部分的第二個(gè)官能團(tuán)(例如，羧基或氨基)時(shí)，可以將間隔臂綴合到固相支持體。之后，通過標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)可以將肽直接合成到間隔臂的游離氨基。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，含有兩個(gè)官能團(tuán)的間隔臂首先通過第一個(gè)官能團(tuán)偶聯(lián)固相支持體。接著，具有能夠作為肽合成的起始位點(diǎn)的兩個(gè)官能團(tuán)和能夠結(jié)合另一分子部分的第三個(gè)官能團(tuán)(例如，羧基或氨基)的連接體LK部分通過間隔臂的第二個(gè)官能團(tuán)和連接體的第三個(gè)官能團(tuán)綴合到間隔臂。之后，以固相合成技術(shù)的變通方案，可以將兩個(gè)肽單體直接合成到連接體LK部分的兩個(gè)活性氮基團(tuán)上。例如，具有游離胺基的固相支持體偶聯(lián)的間隔臂可以通過連接體的游離羧基與賴氨酸連接體反應(yīng)。
在備選實(shí)施方案中，當(dāng)肽化合物含有間隔臂部分時(shí)，可以在肽合成后將所述間隔臂綴合到肽。可以用本領(lǐng)域成熟的方法實(shí)施所述綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體含有適于連接所合成的肽的靶官能團(tuán)的至少一個(gè)官能團(tuán)。例如，具有游離胺基的間隔臂可以與肽的C-末端羧基反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，具有游離羧基的連接體可以與肽的N-末端的或者賴氨酸殘基的游離胺基反應(yīng)。在另一實(shí)例中，通過氧化形成二硫鍵可以將含有游離巰基的間隔臂綴合到肽的半胱氨酸殘基。
連接水溶性聚合物近年來，水溶性聚合物，如聚乙二醇(PEG)，已經(jīng)用于具有治療和診斷重要性的肽的共價(jià)修飾。認(rèn)為此類聚合物的連接增強(qiáng)生物活性、延長血液循環(huán)時(shí)間、降低免疫原性、增加水溶性，和增強(qiáng)對(duì)蛋白酶消化的抗性。例如，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)PEG對(duì)治療性多肽如白介素[Knauf，等人(1988)J.Biol.Chem.263；15064；Tsutsumi，等人(1995)J.Controlled Release 33447)、干擾素(Kita，等人(1990)Drug Des.Delivery 6157)、過氧化氫酶(Abuchowski，等人(1977)J.Biol.Chem.252582)、超氧化物歧化酶(Beauchamp，等人(1983)Anal.Biochem.13125)和腺苷脫氨酶(Chen，等人(1981)Biochim.Biophy.Acta 660293)的共價(jià)連接延長了它們的體內(nèi)半壽期和/或降低了它們的免疫原性和抗原性。
本發(fā)明的肽化合物還可以包含一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合物部分。優(yōu)選地，這些聚合物共價(jià)連接到肽化合物。水溶性聚合物可以為例如，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環(huán)和聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/馬來酐共聚物、聚氨基酸(例如，均聚物或者隨機(jī)共聚物)、聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物和聚氧乙烯化多元醇。優(yōu)選的水溶性聚合物是PEG。
使用將水溶性聚合物連接到分子的受體結(jié)合部分(例如，肽+間隔臂)的多種化學(xué)方法的任意一種可以將本發(fā)明的肽、肽二聚體和其他基于肽的分子連接到水溶性聚合物(例如，PEG)。通常的實(shí)施方案利用一個(gè)連接接頭將水溶性聚合物共價(jià)連接到受體結(jié)合部分，然而，在備選實(shí)施方案中，可以使用多個(gè)連接接頭，包括其他變通方案，其中不同種類的水溶性聚合物連接到不同連接接頭處的受體結(jié)合部分，所述接頭可以包括間隔臂和/或一個(gè)或多個(gè)肽鏈的共價(jià)連接接頭。在一些實(shí)施方案中，二聚體或者更高級(jí)多聚體將包含不同種類的肽鏈(即，異二聚體或者其他異多聚體)。作為實(shí)例并且不限制，二聚體可以包含具有PEG連接接頭的第一條肽鏈和缺少PEG連接接頭或者利用不同于第一條肽鏈的連接化學(xué)的第二條肽鏈，在一些變通方案中，間隔臂可以包含或者缺乏PEG連接接頭和所述間隔臂，如果被PEG化，可以利用不同于第一和/或第二條肽鏈的連接化學(xué)。備選實(shí)施方案利用連接到受體結(jié)合部分的間隔臂部分的PEG和綴合到所述分子的肽部分的氨基酸之一的側(cè)鏈的不同水溶性聚合物(例如，糖)。
多種聚乙二醇(PEG)種類可以用于PEG化受體結(jié)合部分(肽+間隔臂)。基本上可以使用任意適宜的反應(yīng)性PEG試劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)性PEG試劑將導(dǎo)致綴合到受體結(jié)合部分時(shí)形成氨基甲酸酯或者酰胺鍵。適宜的反應(yīng)性PEG種類包括，但不限于，可以在NOF Corporation(Yebisu Garden Place Tower，20-3Ebisu 4-chome，Shibuya-ku，Tokyo150-6019)的Drug Delivery Systems目錄(2003)和Nektar Therapeutics(490Discovery Drive，Huntsville，Alabama 35806)的Molecular Engineering目錄(2003)中出售的那些種類。例如并且不限于下面的PEG試劑通常是多種實(shí)施方案中優(yōu)選的mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、multi-Arm PEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-硫酯、mPEG-Double Esters、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-ACET、雜官能PEGs(NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL)、PEG丙烯酸酯(ACRL-PEG-NHS)、PEG-磷脂(例如，mPEG-DSPE)、SUNBRITE系列的多臂PEGs，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所選化學(xué)活化的基于甘油的PEGs的GL序列，任意一種SUNBRITE活化的PEGs(包括但不限于羧基-PEGs、p-NP-PEGs、Tresyl-PEGs、醛PEGs、縮醛-PEGs、氨基-PEGs、硫醇-PEGs、馬來酰亞胺-PEGs、羥基-PEG-胺、氨基-PEG-COOH、羥基-PEG-醛、羧酸酐型-PEG、官能化PEG-磷脂，和本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇用于他們的特定應(yīng)用和習(xí)慣的其他類似和/或適宜的反應(yīng)性PEGs。
所述聚合物可以是任意分子量，并且可以是分枝或不分枝的。用于本發(fā)明的優(yōu)選的PEG包含分子量為約20千道爾頓(20KD)到約40KD的線性、不分枝的PEG(術(shù)語“約”指出在PEG的制備物中，某些分子將具有大于所陳述的分子量，有些分子具有小于所陳述的分子量)。最優(yōu)選地，PEG具有約30KD到約40KD的分子量?？梢允褂闷渌笮?，這取決于所希望的治療圖(例如，所希望的持續(xù)釋放時(shí)間；對(duì)生物活性的影響(如果存在)、處理的容易性、抗原性程度或者抗原性的缺乏；和PEG對(duì)治療肽的其他已知的影響)。
所連接的聚合物分子的數(shù)目可以改變，例如，1、2、3或更多水溶性聚合物可以連接到本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽。多個(gè)所連接的聚合物可以是相同或不同的化學(xué)部分(例如，不同分子量的PEG)。在一些情況中，聚合物連接的程度(連接到肽的聚合物部分的數(shù)目和/或聚合物連接的肽的總數(shù))可以受到連接反應(yīng)中聚合物分子與肽分子的比例的影響，以及受到反應(yīng)混合物中聚合物分子與肽分子每一種的總濃度的影響。通常，最佳聚合物對(duì)肽的比例(按照不提供過量未反應(yīng)的肽和/或聚合物部分的反應(yīng)效率)將由如下因素決定，這些因素為諸如所希望聚合物連接的程度(例如，單、二-、三-等等)、所選聚合物的分子量、聚合物是分枝的還是未分枝的，和具體連接方法的反應(yīng)條件。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，共價(jià)連接的水溶性聚合物是PEG。為了闡明目的，下面描述共價(jià)連接PEG(PEG化)的方法的實(shí)例。這些闡明性描述不意在限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解多種水溶性聚合物的多種共價(jià)連接方法是本領(lǐng)域成熟的。同樣，通過本領(lǐng)域多種連接方法的任一種連接本領(lǐng)域已知的多種水溶性聚合物的任一種的肽化合物被本發(fā)明包括。
在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG可以作為二聚化肽單體的連接體。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG連接到肽單體或二聚體的至少一個(gè)末端(N-末端或C-末端)。在另一實(shí)施方案中，PEG連接到肽單體或者二聚體的間隔臂部分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，PEG連接到肽二聚體的連接體部分。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG連接到間隔臂部分，其中所述間隔臂連接到連接體LK部分，該LK部分連接肽二聚體的單體。最優(yōu)選地，PEG連接到間隔臂部分，其中所述間隔臂部分通過賴氨酸連接體的羰基碳或者賴氨酸酰胺連接體的酰胺氮連接到肽二聚體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用多種PEG連接方法[見，例如，Goodson，等人(1990)Bio/Technology 8343(PEGylation of interleukin-2 at itsglycosylation site after site-directed mutagenesis)；EP 0 401 384(couplingPEG to G-CSF)；Malik，等人，1992)Exp.Hematol.201028-1035(PEGylation of GM-CSF using tresyl chloride)；PCT公開號(hào)WO90/12874(PEGylation of erythropoietin containing a recombinantly introducedcysteine residue using a cysteine-specific mPEG derivative)；美國專利號(hào)5,757,078(PEGylation of EPO peptides)；美國專利號(hào)6,077,939(PEGylation of an N-terminal α-carbon of a peptide)]。
例如，PEG可以通過反應(yīng)基共價(jià)結(jié)合氨基酸殘基。反應(yīng)基為活化的PEG分子可以結(jié)合的基團(tuán)(例如，游離氨基或羧基)。例如，N-末端氨基酸殘基和賴氨酸(K)殘基具有游離氨基；C-末端氨基酸具有游離羧基。巰基(例如，半胱氨酸殘基中存在的)也可以用作連接PEG的反應(yīng)基。此外，已經(jīng)描述了用于特別在多肽的C-末端特異引入活化基團(tuán)(例如，酰肼、醛和芳香族氨基)的酶輔助方法[Schwarz，等人(1990)Methods Enzymol.184160；Rose，等人(1991)Bioconjugate Chem.2154；Gaertner，等人(1994)J.Biol.Chem.2697224]。
例如，使用具有不同反應(yīng)部分的甲氧基化PEG(“mPEG”)可以將PEG分子連接到肽氨基。此類聚合物包括mPEG-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、mPEG-琥珀酰亞胺基碳酸酯、mPEG-亞胺酯、mPEG-4-硝基苯基碳酸酯和mPEG-氰尿酰氯。類似地，使用具有游離胺基的甲氧基化PEG(mPEG-NH2)可以將PEG分子連接到肽羧基。
當(dāng)PEG的連接不是特異的并且希望包含特異PEG連接的肽時(shí)，可以從PEG化化合物的混合物純化所希望的PEG化化合物。例如，如果希望N-末端PEG化的肽，那么可以從隨機(jī)PEG化肽群體純化N-末端PEG化形式(即，從其他單PEG化部分分離該部分)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，PEG位點(diǎn)特異地連接到肽。通過固相合成已經(jīng)進(jìn)行了在生長激素釋放因子的有效類似物的N-末端、側(cè)鏈和C-末端的位點(diǎn)特異PEG化[Felix，等人(1995)Int.J.Peptide Protein Res.46253]。另一種位點(diǎn)特異方法包括通過N-末端蘇氨酸的高碘酸鈉氧化產(chǎn)生的N-末端的反應(yīng)性醛基以位點(diǎn)特異的方式將肽連接到脂質(zhì)體表面嫁接的PEG鏈的末端[Zalipsky，等人(1995)Bioconj.Chem.6705]。然而，該方法局限于具有N-末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的多肽。在Wei等人的美國專利號(hào)6,077,939中描述了通過腙、還原的腙、肟或者還原的肟鍵對(duì)肽的N-末端PEG化的另一種位點(diǎn)特異方法。
在一個(gè)方法中，通過還原性烷基化可以實(shí)現(xiàn)選擇性N-末端PEG化，還原性烷基化利用特定蛋白質(zhì)中可用于衍生的伯氨基(賴氨酸對(duì)N-末端)的不同類型的差別反應(yīng)性。在適宜的反應(yīng)條件下，含有羰基的PEG選擇性連接到肽的N-末端。例如，通過在一定pH下進(jìn)行反應(yīng)可以選擇性N-末端PEG化蛋白質(zhì)，所述反應(yīng)利用賴氨酸殘基的ε-氨基和肽的N-末端殘基的α-氨基之間的pKa不同。通過這種選擇性連接，主要在蛋白質(zhì)的N-末端發(fā)生PEG化，而不明顯修飾其他反應(yīng)基(例如，賴氨酸側(cè)鏈氨基)。使用還原性烷基化，PEG應(yīng)該具有用于偶聯(lián)蛋白質(zhì)的一種反應(yīng)性醛(例如，可以使用PEG丙醛)。
位點(diǎn)特異誘變是可以用于制備用于位點(diǎn)特異聚合物連接的肽的另一種方法。通過該方法，肽的氨基酸序列設(shè)計(jì)成在肽內(nèi)的希望的位置上摻入適宜的反應(yīng)基。例如，WO 90/12874描述了通過插入半胱氨酸殘基或者用半胱氨酸殘基替換其他殘基修飾的蛋白質(zhì)的位點(diǎn)定向PEG化。該公開還描述通過將半胱氨酸特異的mPEG衍生物與EPO上重組導(dǎo)入的半胱氨酸殘基反應(yīng)制備mPEG-紅細(xì)胞生成素(“mPEG-EPO”)。
當(dāng)PEG部分連接到間隔臂部分或者連接體部分時(shí)，可以使用類似的連接方法。在該情況中，連接體或者間隔臂含有反應(yīng)基并且含有適宜的補(bǔ)充反應(yīng)基的活化的PEG分子用于實(shí)現(xiàn)共價(jià)連接。在優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體或者間隔臂反應(yīng)基含有末端氨基(即，位于連接體或者間隔臂的末端)，其與適宜活化的PEG分子反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定的共價(jià)鍵，如酰胺或者氨基甲酸酯。適宜的經(jīng)活化的PEG種類包括，但不限于，mPEG-對(duì)-硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)、mPEG-琥珀酰亞胺基碳酸酯(mPEG-SC)和mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯(mPEG-SPA)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體或者間隔臂反應(yīng)基含有羧基，其在適宜的反應(yīng)條件下能夠被活化而與含有胺的PEG分子形成共價(jià)鍵。適宜的PEG分子包括mPEG-NH2，適宜的反應(yīng)條件包括碳二亞胺介導(dǎo)的酰胺形成等等。
EPO-R激動(dòng)劑活性測(cè)定體外功能測(cè)定體外競爭結(jié)合測(cè)定法定量受試肽與EPO競爭結(jié)合EPO-R的能力。例如(見，例如，美國專利5,773,569中描述)，人EPO-R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(EPO結(jié)合蛋白質(zhì)，EBP)可以在大腸桿菌(E.coli)中重組產(chǎn)生，并將重組蛋白質(zhì)偶聯(lián)到固相支持體，如微量滴定皿或者合成珠[例如，PierceChemical Co.(Rockford，IL)的Sulfolink珠]。然后將固定化EBP與與經(jīng)標(biāo)記的重組EPO或者經(jīng)標(biāo)記的重組EPO和受試肽反應(yīng)。受試肽的連續(xù)稀釋液用于此類實(shí)驗(yàn)。沒有加入受試肽的測(cè)定點(diǎn)定義了EPO對(duì)EBP的總的結(jié)合。對(duì)于含有受試肽的反應(yīng)物，結(jié)合的EPO的量經(jīng)定量并表達(dá)為對(duì)照(總的＝100％)結(jié)合的百分?jǐn)?shù)。這些值對(duì)肽濃度作圖。IC50值定義為EPO對(duì)EBP的結(jié)合減小50％的受試肽的濃度(即，EPO結(jié)合的50％抑制)。
一種不同的體外競爭結(jié)合測(cè)定法測(cè)量產(chǎn)生的光信號(hào)作為兩種珠子綴合EPO的珠子和綴合EPO-R的珠子的接近性的函數(shù)。通過EPO與EPO-R的結(jié)合產(chǎn)生珠子接近性。與EPO競爭結(jié)合EPO-R的受試肽將防止該結(jié)合，導(dǎo)致光發(fā)射的降低。導(dǎo)致光發(fā)射降低50％的受試肽的濃度定義為IC50值。
本發(fā)明的肽非常有效地與EPO競爭結(jié)合EPO-R。該增強(qiáng)的功能由它們?cè)诤艿偷碾臐舛认乱种平Y(jié)合EPO結(jié)合的能力代表(即，它們具有非常低的IC50值)。
可以使用體外基于細(xì)胞的功能測(cè)定法測(cè)量特異結(jié)合EPO受體的本發(fā)明的單體和二聚體肽EPO-R激動(dòng)劑的生物活性和效力。
一種測(cè)定法基于表達(dá)人EPO-R并且還用fos-啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)道基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的鼠前-B-細(xì)胞系。當(dāng)暴露于EPO或者另一種EPO-R激動(dòng)劑時(shí)，此類細(xì)胞通過合成螢光素酶應(yīng)答。螢光素酶導(dǎo)致加入其底物螢光素時(shí)發(fā)光。從而，通過測(cè)量螢光素酶活性可以定量此類細(xì)胞中EPO-R活化的水平。通過向細(xì)胞加入受試肽的連續(xù)稀釋液，然后孵育細(xì)胞4小時(shí)來測(cè)量受試肽的活性。孵育后，向細(xì)胞加入螢光素底物，并測(cè)量光發(fā)射。導(dǎo)致半最大光發(fā)射的受試肽濃度記錄為EC50。
在該測(cè)定中，本發(fā)明的肽顯示出促進(jìn)EPO-R信號(hào)依賴性螢光素酶表達(dá)的顯著增強(qiáng)的能力。該增強(qiáng)的功能由它們?cè)诜浅５偷碾臐舛认庐a(chǎn)生半最大螢光素酶活性來代表(即，它們具有非常低的EC50值)。該測(cè)定法是估計(jì)本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的效力和活性的優(yōu)選方法。
可以使用FDC-P1/ER細(xì)胞[Dexter，等人(1980)J.Exp.Med.1521036-1047]進(jìn)行另一種測(cè)定法，F(xiàn)DC-P1/ER細(xì)胞是良好表征的非轉(zhuǎn)化的鼠骨髓來源的細(xì)胞系，其已經(jīng)用EPO-R穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。這些細(xì)胞表現(xiàn)出EPO-依賴性增殖。
在一種此類測(cè)定法中，在必須生長因子(見，例如，美國專利5,773,569中描述)的存在下，細(xì)胞生長到半穩(wěn)定密度。然后在PBS中洗滌細(xì)胞并在沒有生長因子的完全培養(yǎng)基中饑餓16-24小時(shí)。測(cè)定細(xì)胞的生存力后(通過錐蟲藍(lán)染色)，制備貯存液(用沒有生長因子的完全培養(yǎng)基)得到約105個(gè)細(xì)胞/50μL。在96孔組織培養(yǎng)板中以每孔50μL的終體積測(cè)試肽EPO-R激動(dòng)劑化合物的連續(xù)稀釋液(通常為游離的溶液相肽，與結(jié)合噬菌體或者其他結(jié)合或固定化的肽相反)。向每孔加入細(xì)胞(50μL)并孵育細(xì)胞24-48小時(shí)，此時(shí)陰性對(duì)照將死亡或者休眠。通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)(如測(cè)量指示細(xì)胞增殖的H3胸苷摻入的MTT測(cè)定法)測(cè)量細(xì)胞增殖[見Mosmann(1983)J.Immunol.Methods 6555-63]。對(duì)表達(dá)EPO-R的細(xì)胞系和親代不表達(dá)的細(xì)胞系評(píng)估肽。產(chǎn)生最大細(xì)胞增殖一半所需的受試肽的濃度記錄為EC50。
在該測(cè)定中，本發(fā)明的肽顯示出促進(jìn)EPO-依賴性細(xì)胞增殖的顯著增強(qiáng)的能力。該增強(qiáng)的功能由它們?cè)诜浅５偷碾臐舛认庐a(chǎn)生半最大細(xì)胞增殖刺激活性來代表(即，它們具有非常低的EC50值)。該測(cè)定法是估計(jì)本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的效力和活性的優(yōu)選方法。
在另一測(cè)定中，在補(bǔ)加EPO的培養(yǎng)基中使細(xì)胞生長到穩(wěn)定期，收集細(xì)胞，然后在沒有EPO的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)18小時(shí)。將細(xì)胞分成相等細(xì)胞密度的三組沒有加入因子的一組(陰性對(duì)照)，具有EPO的一組(陽性對(duì)照)，具有受試肽的實(shí)驗(yàn)組。然后在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)的細(xì)胞，將其固定、并用結(jié)合DNA的熒光染料(例如，碘化丙錠或者Hoechst染料，都可以從Sigma得到)染色。然后例如使用FACS Scan Flow細(xì)胞儀測(cè)量熒光。然后例如，使用CelIFIT軟件(BectonDickinson)的SOBR型可以測(cè)定細(xì)胞周期的每個(gè)期中的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。用EPO或者活性肽處理的細(xì)胞將相對(duì)于陰性對(duì)照組顯示出在S期中的更大比例的細(xì)胞(通過指示增加的DNA含量的增加的熒光來測(cè)定)。
使用FDCP-1[見，例如，Dexter等人(1980)J.Exp.Med.1521036-1047]或TF-1[Kitamura，等人(1989)Blood 73375-380]細(xì)胞系進(jìn)行類似測(cè)定。FDCP-1是生長因子依賴性鼠多能原始造血祖細(xì)胞系，當(dāng)補(bǔ)加WEHI-3條件培養(yǎng)基(含有IL-3的培養(yǎng)基，ATCC號(hào)TIB-68)時(shí)，所述細(xì)胞系可以增殖，但是不分化。對(duì)于此類實(shí)驗(yàn)，用人或者鼠EPO-R轉(zhuǎn)染FDCP-1細(xì)胞系以分別產(chǎn)生FDCP-1-hEPO-R或FDCP-1-mEPO-R細(xì)胞系，在EPO的存在下所述細(xì)胞系可以增殖但是不能分化。還可以使用一種依賴EPO的細(xì)胞系TF-1測(cè)量肽EPO-R激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
在再一個(gè)測(cè)定法中，在Krystal(1983)Exp.Hematol 11649-660中提出的基于H3-胸苷向脾細(xì)胞摻入的微測(cè)定法的方法可以用于確定本發(fā)明化合物作為EPO激動(dòng)劑的能力。簡言之，對(duì)B6C3F1小鼠每天用苯肼(60mg/kg)注射，為期兩天。在第三天，除去脾細(xì)胞并使用MTT測(cè)定法確定所述細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)增殖的能力。
在紅細(xì)胞生成素應(yīng)答細(xì)胞系中EPO對(duì)EPO-R的結(jié)合誘導(dǎo)受體和多種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，包括Shc、vav和JAK2激酶的酪氨酸磷酸化。因此，另一種體外測(cè)定法測(cè)量本發(fā)明的肽誘導(dǎo)EPO-R和下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的酪氨酸磷酸化。如通過上述結(jié)合和增殖測(cè)定法鑒定的活性肽在紅細(xì)胞生成素應(yīng)答細(xì)胞中引起與EPO近乎相同的磷酸化模式。對(duì)于該測(cè)定法，F(xiàn)DC-P1/ER細(xì)胞[Dexter，等人(1980)J Exp Med 1521036-47]在補(bǔ)加EPO的培養(yǎng)基中保持并生長到穩(wěn)定期。然后在沒有EPO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞24小時(shí)。然后將確定數(shù)目的這些細(xì)胞與受試肽在37℃孵育約10分鐘。還用每種測(cè)定法運(yùn)行細(xì)胞的對(duì)照樣品與EPO。通過離心收集處理的細(xì)胞，將它們重懸浮在SDS裂解緩沖液中，并進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。將凝膠上的電泳蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素，并通過標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)顯現(xiàn)印跡上的含有磷酸酪氨酸的蛋白質(zhì)。例如，可以用抗磷酸酪氨酸抗體(例如，Upstate Biotechnology，Inc.的小鼠抗磷酸酪氨酸IgG)探測(cè)印跡，洗滌，然后用二級(jí)抗體[例如，Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.(Washington，DC)的過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG]探測(cè)。之后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)顯現(xiàn)含有磷酸酪氨酸的蛋白質(zhì)，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括比色、化學(xué)發(fā)光或者熒光測(cè)定法。例如，用來自Amersham的ECL Western Blotting System可以進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定。
可以用于評(píng)估本發(fā)明肽的活性的另一種基于細(xì)胞的體外測(cè)定法是菌落測(cè)定法，使用鼠骨髓或者人外周血細(xì)胞?？梢詮男∈蟮墓晒堑玫绞蠊撬瑁梢詮慕】倒w得到人外周血樣品。對(duì)于外周血，首先從血液分離單核細(xì)胞，例如，通過離心通過Ficoll-Hypaque梯度[Stem Cell Technologies，Inc.(Vancouver，Canada)]進(jìn)行分離。對(duì)于該測(cè)定，進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)以建立最初樣品中有核細(xì)胞的數(shù)目和濃度。按照生產(chǎn)商的使用說明[Stem CellTechnologies，Inc.(Vancouver，Canada)]將確定數(shù)目的細(xì)胞鋪在甲基纖維素上。用受試肽處理實(shí)驗(yàn)組，用EPO處理陽性對(duì)照組，不處理陰性對(duì)照組。在確定的孵育期，通常10天到18天后對(duì)每組生長的集落數(shù)打分?；钚噪膶⒋龠M(jìn)集落形成。
可以用于闡明本發(fā)明化合物的活性的其他體外生物測(cè)定法公開于Greenberger，等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802931-2935(EPO-依賴性造血祖細(xì)胞細(xì)胞系)；Quelle和Wojchowsld(1991)J.Biol.Chem.266609-614(B6SUt.EP細(xì)胞中的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化)；Dusanter-Fourt，等人(1992)J.Biol.Chem.28710670-10678(人EPO應(yīng)答細(xì)胞中EPO受體的酪氨酸磷酸化)；Quelle，等人(1992)J.Biol.Chem.26717055-17060(FDC-ER細(xì)胞中胞質(zhì)溶膠蛋白質(zhì)pp100的酪氨酸磷酸化)；Worthington，等人(1987)Exp.Hematol.1585-92(血紅蛋白的比色測(cè)定)；Kaiho和Miuno(1985)Anal.Biochem.149117-120(用2，7--二氨基芴檢測(cè)血紅蛋白)；Patel，等人(1992)J.Biol.Chem.26721300-21302(c-myb的表達(dá))；Witthuhn，等人(1993)Cell 74227-236(JAK2的結(jié)合和酪氨酸磷酸化)；Leonard，等人(1993)Blood 821071-1079(GATA轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá))；和Ando，等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 909571-9575(通過環(huán)D2和D3對(duì)G1過渡的調(diào)節(jié))。
已經(jīng)報(bào)導(dǎo)Molecular Devices Corp.設(shè)計(jì)的稱作microphysiometer的儀器成功地用于測(cè)量激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)多種受體的影響。該儀器的基礎(chǔ)是測(cè)量應(yīng)答受體活化中細(xì)胞外基質(zhì)的酸化速率。
體內(nèi)功能測(cè)定法可以用于評(píng)估受試肽的效力的一種體內(nèi)功能測(cè)定法是polycythemicexhypoxic小鼠生物測(cè)定法。對(duì)于該測(cè)定法，將小鼠置于交替的調(diào)節(jié)循環(huán)數(shù)天。在該循環(huán)中，大鼠在低壓條件和環(huán)境壓力條件期間交替。之后，在施用受試樣品前將小鼠在環(huán)境壓力下保持2-3天。將受試肽樣品，或者對(duì)于陽性對(duì)照小鼠，將EPO標(biāo)準(zhǔn)皮下注射到受調(diào)節(jié)的小鼠中。2天后施用放射標(biāo)記的鐵(例如，F(xiàn)e59)，施用放射標(biāo)記的鐵兩天后采集血樣。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)每個(gè)血樣測(cè)定血細(xì)胞比容和放射性測(cè)量。用活性受試肽注射的小鼠的血樣將顯示出比未接受受試肽或者EPO的小鼠的血樣更大的放射性(由于紅細(xì)胞血紅蛋白對(duì)Fe59的結(jié)合。
可以用于評(píng)估受試肽的效力的另一種體內(nèi)功能測(cè)定法是網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定法。對(duì)于該測(cè)定法，用EPO或者受試肽在三個(gè)連續(xù)日皮下注射正常的未處理的小鼠。在第三天，還用葡聚糖鐵腹膜內(nèi)注射小鼠。在第5天，從小鼠收集血樣。通過噻唑橙染色和流式細(xì)胞儀分析(reticcount程序)測(cè)定血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(％)。此外，手工測(cè)定血細(xì)胞比容。用下面的公式確定校正的網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)％RETIC校正的＝％RETIC觀察值×(血細(xì)胞比容個(gè)體/血細(xì)胞比容正常)活性受試化合物將顯示出相對(duì)于未接受受試肽或者EPO的小鼠增加的％RETIC校正的水平。
本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的用途本發(fā)明的肽化合物可以體外用作理解EPO的生物功能的工具，包括評(píng)估認(rèn)為影響或者受到EPO的產(chǎn)生和EPO對(duì)EPO-R的結(jié)合的許多因素(例如，EPO/EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/受體激活的機(jī)制)。本發(fā)明的肽還可以用于開發(fā)結(jié)合EPO-R的其他化合物，因?yàn)楸景l(fā)明化合物提供了重要的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系信息，其有助于開發(fā)。
此外，基于它們結(jié)合EPO-R的能力，本發(fā)明的肽可以用作檢測(cè)EPO-R對(duì)活細(xì)胞、固定細(xì)胞上、生物液體、組織勻漿物、純化的天然生物材料等等中的活細(xì)胞、固定細(xì)胞上EPO-R的試劑。例如，通過標(biāo)記此類肽，可以鑒定在表面上具有EPO-R的細(xì)胞。此外，基于它們結(jié)合EPO-R的能力，本發(fā)明的肽可以用于原位染色、FACS(熒光激活細(xì)胞分類術(shù))分析、蛋白質(zhì)印跡、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)，等等。此外，基于它們結(jié)合EPO-R的能力，本發(fā)明的肽可以用于受體純化，或者純化在細(xì)胞表面上(或者在可滲透的細(xì)胞內(nèi))表達(dá)EPO-R的細(xì)胞。
本發(fā)明的肽還可以用作多種醫(yī)學(xué)研究和診斷目的的商業(yè)試劑。此類用途可以包括但不限于(1)用作定量多種功能測(cè)定法中候選EPO-R激動(dòng)劑活性的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)；(2)用作隨機(jī)肽篩選，即尋找EPO-R肽配體的新家族中的阻斷試劑，所述肽可以用于阻斷本發(fā)明的EPO肽的回收；(3)用于與EPO-R的共結(jié)晶，即，可以形成結(jié)合EPO-R的本發(fā)明肽的晶體，使得可以通過X-射線晶體學(xué)測(cè)定受體/肽的結(jié)構(gòu)；(4)用于測(cè)量紅細(xì)胞前體細(xì)胞誘導(dǎo)珠蛋白合成和血紅素復(fù)合體合成的能力，和通過啟動(dòng)分化增加鐵蛋白受體數(shù)；(5)用于保持依賴EPO的細(xì)胞系(如FDCP-1-mEPO-R和TF-1細(xì)胞系)的增殖和生長；和(6)其他研究和診斷應(yīng)用，其中優(yōu)選激活EPO-R或者對(duì)已知量的EPO-R激動(dòng)劑方便地校準(zhǔn)此類激活，等等。
在本發(fā)明的再一方面，提供了治療方法和藥物生產(chǎn)方法。可以將本發(fā)明的肽化合物施用于溫血?jiǎng)游?，包括人，以刺激在體內(nèi)EPO與EPO-R的結(jié)合。從而，本發(fā)明包括與EPO缺乏相關(guān)的疾病的治療性治療方法，所述方法包括以足夠刺激EPO-R的量施用本發(fā)明的肽化合物，從而減輕與體內(nèi)EPO缺乏相關(guān)的癥狀。例如，本發(fā)明的肽可以用于治療腎機(jī)能不全和/或末期腎衰竭/透析；與艾滋病相關(guān)的貧血；與慢性炎性疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和慢性腸炎)相關(guān)的貧血和自身免疫??；和用于手術(shù)前增加患者的紅細(xì)胞數(shù)?？梢酝ㄟ^施用本發(fā)明的肽治療的其他疾病狀態(tài)、病癥和血液學(xué)不規(guī)則狀態(tài)包括β-地中海貧血；囊性纖維化；妊娠和絕經(jīng)病癥；早熟性早期貧血(early anemia of prematurity)；脊髓損傷；太空飛行、急性失血；衰老；和伴隨著異常紅細(xì)胞生成的多種腫瘤疾病狀態(tài)。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽化合物可以用于治療特征不是低或者不足的血紅細(xì)胞的病癥的治療，例如，作為輸液前的預(yù)處理。此外，施用本發(fā)明的化合物可以導(dǎo)致出血時(shí)間減少，從而將可以用于在手術(shù)前施用于患者或者其中預(yù)期發(fā)生出血的適應(yīng)癥。此外，本發(fā)明的化合物可以用于巨核細(xì)胞的激活。
因?yàn)橐呀?jīng)表明EPO對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有促有絲分裂和趨化效果以及對(duì)中樞膽堿能神經(jīng)元與具有效果[見，例如，Amagnostou，等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 875978-5982和Konishi，等人(1993)Brain Res.60929-35]，所以本發(fā)明的化合物將可以用于治療多種血管病癥，如促進(jìn)傷口愈合；促進(jìn)側(cè)枝冠狀血管(如心肌梗死后可能發(fā)生的那些血管)的生長；創(chuàng)傷治療；和血管移植后的治療。本發(fā)明的化合物還可以用于多種神經(jīng)學(xué)病癥的治療，所述病癥通常的特征是絕對(duì)低水平乙酰膽堿或者與其他神經(jīng)活性物質(zhì)，例如，神經(jīng)遞質(zhì)相比，相對(duì)低水平的乙酰膽堿。
藥物組合物在本發(fā)明的再一方面，提供了上面的EPO-R拮抗劑肽化合物的藥物組合物。通過施用此類組合物減輕或者調(diào)節(jié)的疾病包括上文指出的那些疾病。此類藥物組合物可以通過經(jīng)口、腸胃外((肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)((IV))或者皮下注射))、透皮((被動(dòng)地或者使用離子電滲療法或者電穿孔))、透粘膜((鼻、陰道、直腸或者舌下))施用途徑或者使用生物可侵蝕的插入物施用，并且可以配制成適宜每種施用途徑的劑型。通常，本發(fā)明包括含有包含有效量EPO-R激動(dòng)劑肽、或者衍生產(chǎn)物以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體的藥物組合物。此類組合物包括多種緩沖成分((例如，Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽))、pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑；添加劑，如去污劑和增溶劑((例如，Tween 20，Tween 80，聚山梨酯80))、抗氧化劑((例如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉))、防腐劑((例如，Thimersol、苯甲醇))和膨脹性物質(zhì)((例如，乳糖、甘露醇))；將所述物質(zhì)摻入到聚合物化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等等的顆粒制劑，或者摻入到脂質(zhì)體中。還可以使用透明質(zhì)酸。此類組合物可以影響本發(fā)明蛋白質(zhì)和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率，和體內(nèi)清除速率。見，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，MackPublishing Co.，Easton，PA18042)1435-1712頁，將其并入本文作為參考?？梢砸砸后w形式，或者可以以干燥粉劑((例如，凍干))形式制備組合物。
經(jīng)口遞送預(yù)計(jì)用于本文的是經(jīng)口固體劑型，其在Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版1990(Mack Publishing Co.Easton PA18042)第89章中一般性描述，將其并入本文作為參考。固體劑型包括片劑、膠囊劑、丸劑、藥片或者錠劑、扁囊劑、微型藥片、粉劑或者粒劑。而且，脂質(zhì)體或者類蛋白質(zhì)膠囊化也可以用于配制本發(fā)明組合物((例如，在美國專利號(hào)4,925,673中報(bào)導(dǎo)的類蛋白質(zhì)微球體))?？梢允褂弥|(zhì)體膠囊化并且可以用多種聚合物衍生脂質(zhì)體((例如，美國專利號(hào)5,013,556)。用于治療劑的可能的固體劑型的描述由Marshall，K.在G S.Banker和C.T.Rhodes編輯的Modern Pharmaceutics((1979年))的第10章中給出，將其并入本文作為參考。通常，該制劑將包括EPO-R激動(dòng)劑肽((或者其化學(xué)修飾的形式))和插入物成分，其允許保護(hù)免于胃環(huán)境的破壞，并在腸中釋放生物活性物質(zhì)。
還預(yù)計(jì)用于本文的是經(jīng)口施用的液體劑型，包括藥學(xué)上可接受的乳劑、溶液劑、混懸劑和糖漿劑，它們可以含有其他組分，包括惰性稀釋劑；和佐劑，如濕潤劑、乳化劑和混懸劑；和甜味劑、矯味劑和芳香劑。
肽可以經(jīng)化學(xué)修飾從而衍生物的經(jīng)口遞送是有效的。通常，預(yù)計(jì)化學(xué)修飾將至少一個(gè)部分附著連接到組成分子自身，其中所述部分允許((a))抑制蛋白水解；和((b))從胃和腸吸收到血流中。還希望一種或幾種組分的總體穩(wěn)定性的增加和增加在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。如上文討論，PEG化是藥物使用的優(yōu)選的化學(xué)修飾?？梢允褂玫钠渌糠职ū肌⒁叶己捅嫉墓簿畚?、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-1，3-二氧戊環(huán)和聚-1，3，6-tioxocane[見，例如，Abuchowski和Davis(1981)″Soluble Polymer-Enzyme Adducts，″in Enzymes as Drugs.Hocenberg和Roberts，編著(Wiley-InterscienceNew York，NY)367-383頁；和Newmark，等人(1982)J.Appl.Biochem.4185-189]。
對(duì)于經(jīng)口制劑，釋放部位可以是胃、小腸((十二指腸、空腸或回腸))，或者大腸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用這樣的制劑，其將不在胃中釋放，而是將在十二指腸或者腸的別處釋放。優(yōu)選地，該釋放將避免胃環(huán)境的有害影響，可以通過保護(hù)肽((或者衍生物))或者通過遠(yuǎn)離胃環(huán)境，如在腸中釋放肽((或衍生物))避免胃環(huán)境的有害影響。
為了確保完全的胃抗性，對(duì)至少pH5.0不可滲透的包衣是必需的。用作腸包衣的更常見的惰性成分的實(shí)例是乙酸-1，2，4-苯三酸纖維素((CAT))、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯((HPMCP))、HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯((PVAP))、丙烯酸樹脂L30D、Aquateric、醋酞纖維素((CAP))、丙烯酸樹脂L、丙烯酸樹脂S和Shellac。這些包衣可以用作混合膜。
包衣或者包衣混合物也可以用在片劑上，這些包衣或者包衣混合物不意在保護(hù)免于胃的影響。所述包衣或者包衣混合物可以包括糖包衣，或者使得片劑更易吞咽的包衣。膠囊劑可以由用于遞送干燥治療劑((例如即，粉劑))的硬殼((如明膠))組成，對(duì)于液體形式，可以使用軟明膠殼。扁囊劑的殼材料可以是厚淀粉或者其他可食用的紙。對(duì)于丸劑、錠劑、模制片或者片劑研制劑，可以使用濕法塊化((moist massing))技術(shù)。
肽((或者衍生物))可以包括在制劑中作為顆粒大小為約1mm的粒劑或者微型藥片形式的多微粒((multiparticulate))。用于膠囊施用的材料的制劑也可以是粉劑、略微壓制的塊(plug)，或者甚至片劑。這些治療劑可以通過壓縮制備。。
還可以包括著色劑和/或矯味劑。例如，可以((如通過脂質(zhì)體或者微球體膠囊化))制備肽((或衍生物))，然后將其包含在可食用產(chǎn)品，如含有著色劑和矯味劑的冷藏飲料中。
可以用惰性物質(zhì)稀釋或者增加肽((或衍生物))的體積。這些稀釋劑可以包括糖，尤其甘露醇、α-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改良葡聚糖和淀粉。某些無機(jī)鹽也可以用作填充劑，它們包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。一些通過商業(yè)途徑可獲得的稀釋劑是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。
固體劑型的治療劑制劑中可以包含崩解劑。用作崩解劑的物質(zhì)包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商用崩解劑Explotab。淀粉羥乙酸鈉、Amberlite、羧甲基纖維素鈉、ultramylopectin、藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿和膨潤土都可以使用。崩解劑還可以是不溶性陽離子交換樹脂。粉狀樹膠也可以用作崩解劑和粘合劑并且可以包括諸如瓊脂、Karaya或黃蓍膠的粉狀樹膠。海藻酸和其鈉鹽也可以用作崩解劑。
粘合劑可以用于將肽((或衍生物))活性劑保持在一起以形成硬片劑并且包括來自天然產(chǎn)物的材料，如阿拉伯樹膠、黃蓍膠、淀粉和明膠。其他包括甲基纖維素((MC))、乙基纖維素((EC))和羧甲基纖維素((CMC))。聚乙烯吡咯烷酮((PVP))和羥丙基甲基纖維素((HPMC))都可以用于醇溶液以?；?(或衍生物))。
肽((或衍生物))的制劑中可以包括抗摩擦劑以防止配制過程期間粘著。潤滑劑可以用作肽((或衍生物))和模壁中間層，這些潤滑劑包括但不限于硬脂酸，包括其鎂和鈣鹽；聚四氟乙烯((PTFE))、液體石蠟、植物油和蠟。也可以使用可溶性潤滑劑，如十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鎂、多種分子量的聚乙二醇、碳蠟4000和6000。
可以加入助流劑，其改善配制期間藥物的流動(dòng)性質(zhì)并且?guī)椭鷫褐破陂g的重排。助流劑可以包括淀粉、滑石粉、致熱性硅石和水合硅鋁酸鹽。
為了幫助肽((或衍生物))溶于水性環(huán)境，可以加入表面活性劑作為濕潤劑。表面活性劑可以包括陰離子去污劑，如十二烷基硫酸鈉、磺基琥珀酸二辛酯鈉和磺酸二辛酯鈉?？梢允褂藐栯x子去污劑并且其可以包括苯扎氯銨或芐索氯銨?？梢园ㄔ诒景l(fā)明制劑中作為表面活性劑的可能的非離子去污劑的名單為聚桂醇400、聚氧乙烯((40))硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、甘油單硬脂酸酯、聚山梨酯20、40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可以單獨(dú)或者以不同比例的混合物存在于所述蛋白質(zhì)或者衍生物的制劑中。
可以增強(qiáng)肽((或衍生物))吸收的添加劑為例如脂肪酸油酸、亞油酸和亞麻酸。
控釋經(jīng)口制劑也是希望的。肽((或衍生物))可以摻入到允許通過擴(kuò)散或者浸取機(jī)制釋放的惰性基質(zhì)，如樹膠中。緩慢變性基質(zhì)也可以摻入到制劑中。某些腸包衣也具有緩釋效果?？蒯尩牧硪环N形式是通過基于Oros治療系統(tǒng)(Alza Corp.)的方法，即藥物封裝在半透性膜中，該膜允許水進(jìn)入并且由于滲透作用將藥物擠過一個(gè)小的開口。
其他包衣可以用于制劑。這些包衣包括可以在包衣鍋中應(yīng)用的多種糖。肽((或衍生物))還可以以膜包衣的片劑提供并且用于該情況的材料分成兩組。第一組是非腸物質(zhì)并且包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥基-乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基-甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚維酮和聚乙二醇。第二組由通常為苯二甲酸酯的腸材料組成。
材料混合物可以用于提供最佳膜包衣?？梢栽阱佂坎计骰蛘咴诹骰不蛘咄ㄟ^壓縮包衣進(jìn)行膜包衣。
腸胃外遞送用于腸胃外施用的根據(jù)本發(fā)明的制劑包括無菌水性或非水性溶液劑、混懸劑或乳劑。非水性溶劑或者賦形劑的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄欖油和玉米油、明膠和可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。此類劑型還可以含有佐劑，如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。它們可以通過例如，通過保留細(xì)菌的濾器過濾、向組合物摻入消毒劑、通過放射處理組合物或者通過熱處理組合物可以消毒。它們還可以在使用即刻前用無菌水或者某種其他無菌可注射介質(zhì)產(chǎn)生。
直腸或陰道遞送用于直腸或陰道施用的組合物優(yōu)選為栓劑，其除了活性物質(zhì)還含有包含賦形劑，如可可脂或者栓劑蠟。用于經(jīng)鼻或舌下施用的組合物也可以用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)賦形劑制備。
經(jīng)肺遞送本文還設(shè)想經(jīng)肺遞送EPO-R激動(dòng)劑肽((或者其衍生物))。肽((或衍生物))被吸入式遞送到哺乳動(dòng)物的肺中并穿過肺上皮層進(jìn)入血流[見，例如，Adjei，etal.(1990)Pharmaceutical Research 7565-569；Adjei等人(1990)Int.J.Pharmaceutics 63135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet，等人(1989)J.Cardiovascular Pharmacology 13(sup5)143-146(內(nèi)皮素-1)；；Hubbard，等人(1989)Annals of Internal Medicine，卷III，206-212頁(α1-抗胰蛋白酶)；；Smith，等人(1989)J.Clin.Invest.841145-1146(α-1-蛋白酶)；Oswein，等人(1990)″Aerosolization of Proteins″，Proceedings ofSymposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone，Colorado(重組人生長激素)；Debs，等人(1988)J.Immunol.1403482-3488(γ干擾素和腫瘤壞死因子α)；；和Platz等人的美國專利號(hào)5,284,656(粒細(xì)胞集落刺激因子)]。在Wong等人的美國專利號(hào)5,451,569中描述了經(jīng)肺遞送藥物實(shí)現(xiàn)全身性效果的方法和組合物。
預(yù)計(jì)用于本發(fā)明實(shí)踐中的是設(shè)計(jì)用于經(jīng)肺遞送治療產(chǎn)品的多種機(jī)械裝置，其包括但不限于噴霧器、定量吸入器和粉末吸入器，它們都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。適于本發(fā)明實(shí)踐的通過商業(yè)途徑可獲得的裝置的一些特例為Ultravent噴霧器(Mallinckrodt Inc.，St.Louis，MO)；Acorn II噴霧器(Marquest Medical Products，Englewood，CO)；Ventolin定量吸入器(GlaxoInc.，Research Triangle Park，NC)；和Spinhaler粉末吸入器(FisonsCorp.，Bedford，MA)。
所有此類裝置需要使用適于肽((或衍生物))的調(diào)劑的制劑。通常，每種制劑對(duì)于所有裝置的類型是特異的并且可以包括除了用于治療的常規(guī)稀釋劑、佐劑和/或載體之外還使用適宜的推進(jìn)推進(jìn)劑物質(zhì)。而且，預(yù)計(jì)使用脂質(zhì)體、微囊劑或者微球體，包括復(fù)合物，或者其他類型載體。根據(jù)所用的化學(xué)修飾類型或者裝置類型，在不同制劑中還可以使用化學(xué)修飾的肽。
適于用射流或超聲噴霧器使用的制劑將通常含有溶于水中的肽((或衍生物))，其濃度為每毫升溶液約0.1到25mg生物活性蛋白質(zhì)。該制劑還可以包括緩沖劑和簡單糖((例如，用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定和滲透壓的調(diào)節(jié)))。噴霧器制劑還可以含有表面活性劑，其減小或者防止形成氣溶膠中溶液的霧化導(dǎo)致的肽((或衍生物))的聚集。
定量吸入器裝置使用的制劑將通常包含細(xì)分的粉末，其含有通過表面活性劑懸浮在推進(jìn)劑中的肽((或衍生物))。推進(jìn)劑可以是用以該目的的任意常規(guī)物質(zhì)，如含氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或者烴，包括三氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷或者它們的組合。適宜的表面活性劑包括三油酸山梨坦和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性劑。
用于從粉末吸入器裝置調(diào)劑的制劑將含有細(xì)分的干燥粉劑，其含有肽((或衍生物))并且還可以包括膨脹劑，如乳糖、山梨醇、蔗糖或者甘露醇，它們的量將促進(jìn)粉劑從裝置的分散，例如，按重量計(jì)為制劑的50-90％。肽((或衍生物))應(yīng)該有利地以顆粒形式制備，其平均顆粒大小小于10mm((或者微米))，最優(yōu)選0.5到5mm，以最有效地遞送到遠(yuǎn)端肺。
鼻遞送還預(yù)計(jì)EPO-R激動(dòng)劑肽((或衍生物))的鼻遞送。鼻遞送允許向鼻子使用治療產(chǎn)物產(chǎn)品后，肽直接進(jìn)入血流，而不必使產(chǎn)物沉積在肺中。用于經(jīng)鼻遞送的制劑包括使用葡聚糖或者環(huán)葡聚糖環(huán)糊精的那些制劑。
劑量對(duì)于所有肽化合物，隨著進(jìn)一步研究的進(jìn)行，將出現(xiàn)關(guān)于治療多種患者中多種疾病的適宜的劑量水平的信息，普通技術(shù)人員考慮接受者的治療背景、年齡和一般健康，將能夠確定適宜給藥。所選劑量取決于所希望的治療效果、施用途徑和所希望的治療持續(xù)時(shí)間。通常，每天將0.001到10mg/kg體重的劑量水平施用于哺乳動(dòng)物。通常，對(duì)于靜脈內(nèi)注射或者灌注，劑量可以較低。給藥方案可以取決于循環(huán)半壽期和所用制劑而變。
本發(fā)明的肽((或者它們的衍生物))可以與一種或多種額外的活性成分或者藥物組合物結(jié)合施用。
實(shí)施例接下來通過下面的實(shí)施例描述本發(fā)明。然而，本說明書中這些和其他實(shí)施例僅用于闡明并且絕不限制本發(fā)明或者任意例證形式的范圍和意義。同樣，本發(fā)明不限于本文描述的任何具體優(yōu)選的實(shí)施方案。實(shí)際上，閱讀本說明書時(shí)本發(fā)明的許多修改和變通方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且可以做出所述修改和變通方案而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明僅僅由所附權(quán)利要求的術(shù)語以及權(quán)利要求等價(jià)的完整范圍所限制。
實(shí)施例1合成EPO-R激動(dòng)劑肽1.肽單體合成使用Merrifield固相合成技術(shù)[見Stewart和Young.Solid PhasePeptide Synthesis，第二版(Pierce Chemical，Rocl ford，IL)1984]在AppliedBiosystems 433A自動(dòng)化儀器上合成本發(fā)明的多種肽單體。所用樹脂為PAL(Milligen/Biosearch)，其是與5-(4’-Fmoc-氨基甲基-3，5’-二甲氧基苯氧基)戊酸交聯(lián)的聚苯乙烯。使用PAL樹脂導(dǎo)致當(dāng)從樹脂切割肽時(shí)得到羧基末端酰胺功能。用Fmoc實(shí)現(xiàn)氨基酸上伯胺保護(hù)，側(cè)鏈保護(hù)基對(duì)于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸羥基為叔丁基；對(duì)于谷氨酰胺和天冬酰胺酰胺為三苯甲基；對(duì)于半胱氨酸為Trt或者Acm；對(duì)于精氨酸胍基為Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃磺酸)。用BOP(苯并三唑基N-氧代三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽)和HOBt(1-羥基苯并三唑)進(jìn)行每種偶聯(lián)1小時(shí)或2小時(shí)。
為了合成具有酰胺化羧基末端的肽，將完全裝配的肽用90％三氟乙酸、5％乙二硫醇和5％水的混合物切割，最初在4℃，并在1.5小時(shí)內(nèi)逐漸增加到室溫。從樹脂過濾去保護(hù)的產(chǎn)物并用二乙醚沉淀。充分干燥后，通過C18反相高效液相層析純化產(chǎn)物，使用0.1％三氟乙酸中的乙腈/水梯度。
2.肽二聚體合成以固相合成技術(shù)的變通方案將本發(fā)明的多種肽二聚體直接合成到賴氨酸連接體上。
對(duì)于同時(shí)合成兩條肽鏈，將Fmoc-Lys-Fmoc偶聯(lián)到PAL樹脂(Milligen/Biosearch)，從而提供最初的賴氨酸殘基作為待合成的兩條鏈之間的連接體。用弱堿(DMF中的20％哌啶)除去Fmoc保護(hù)基，并使用所得游離氨基作為起點(diǎn)合成肽鏈。使用上述固相合成技術(shù)進(jìn)行肽鏈合成。用Trt保護(hù)所有半胱氨酸殘基。二聚體去保護(hù)后，從樹脂切割，并純化，通過將去保護(hù)的二聚體在100％DMSO中5℃到25℃下孵育2-3天進(jìn)行半胱氨酸殘基的氧化。該氧化反應(yīng)主要產(chǎn)生(＞75％)具有兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的二聚體。
對(duì)于順序合成兩條肽鏈，將Fmoc-Lys-Alloc偶聯(lián)到PAL樹脂(Milligen/Biosearch)，從而提供作為待合成的兩條鏈間的連接體的最初賴氨酸殘基。用弱堿(DMF中的20％哌啶)除去Fmoc保護(hù)基。然后使用所得游離氨基作為起點(diǎn)合成第一條肽鏈。使用上述固相合成技術(shù)進(jìn)行肽合成。用Trt保護(hù)第一條鏈的兩個(gè)半胱氨酸殘基。第一條肽鏈合成后，用Pd[P(C6H5)3]4、4-甲基嗎啉和氯仿從支持體結(jié)合的賴氨酸除去Alloc基。然后在該第二個(gè)游離氨基上合成第二條肽鏈。用Acm保護(hù)第二條鏈的兩個(gè)半胱氨酸殘基。通過用三氟乙酸除去Trt保護(hù)基，然后通過在20％DMSO中過夜攪拌氧化形成第一條鏈中的分子內(nèi)二硫鍵。然后通過同時(shí)除去Acm保護(hù)基和用碘、甲醇和三氟乙酸鉈氧化去保護(hù)的半胱氨酸殘基在第二條肽鏈中形成分子內(nèi)二硫鍵。
3.連接間隔臂當(dāng)間隔臂是氨基酸(例如，分別在AF35462和AF35464中的甘氨酸或賴氨酸)時(shí)，在固相肽合成期間將間隔臂摻入到肽中。在該情況中，將間隔臂氨基酸偶聯(lián)到PAL樹脂，其游離氨基作為連接另一間隔臂氨基酸或者賴氨酸連接體的基礎(chǔ)。連接賴氨酸連接體后，如上述合成二聚體肽。
4.合成代表性肽二聚體下面概述這些合成技術(shù)的代表性實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)例中，描述了通過C-末端賴氨酸酰胺連接的肽二聚體的合成。在另一實(shí)例中，描述了通過C-末端賴氨酸連接并且含有連接到連接賴氨酸的間隔臂分子的肽二聚體的合成。
通過C-末端賴氨酸酰胺連接的肽二聚體的合成步驟1-形成TentalGel-Rink-Lys將TentaGel-Rink樹脂(0.18mml/g，Rapp Polymere，德國)用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的活化溶液(5當(dāng)量氨基酸和5當(dāng)量HATU溶于0.5M DMF，然后加入10當(dāng)量DIEA制備)處理并溫和搖動(dòng)14小時(shí)。洗滌(DIF、THF、DCM、MeOH)樹脂并干燥以產(chǎn)生受保護(hù)的樹脂。通過用10％乙酸酐、20％吡啶在DCM中的溶液處理樹脂20分鐘帽化殘留胺基，然后如上洗滌。通過在DMF中的30％哌啶溫和搖動(dòng)樹脂20分鐘除去Fmoc基，然后洗滌(DIF、THF、DCM、MeOH)并干燥。
步驟2-形成TentaGel-Rink-Lys(肽)2將來自步驟1的樹脂進(jìn)行用HBTU/HOBt活化偶聯(lián)Fmoc-氨基酸和用哌啶除去Fmoc的反復(fù)循環(huán)以同時(shí)增長肽鏈。這在可以從Applied Biosystems，Inc得到的ABI 433自動(dòng)化肽合成儀上方便地進(jìn)行。除去最后的Fmoc后，將末端胺基用乙酸酐(10當(dāng)量)和DIEA(20當(dāng)量)在DMF中的溶液?；?0分鐘，然后如上洗滌。
步驟3-從樹脂切割將來自上面的樹脂在室溫懸浮在TFA(82.5％)、苯酚(5％)、乙二硫醇(2.5％)、水(5％)和苯硫基甲烷(5％)的溶液中3小時(shí)。也可以使用備選切割混合液，如TFA(95％)，水(2.5％)和三異丙基硅烷(2.5％)。將TFA溶液冷卻到5℃并倒入Et2O中沉淀肽。過濾并減壓干燥得到所希望的肽。通過制備HPLC用C18柱純化得到純肽。
合成通過C-末端賴氨酸酰胺連接并且含有間隔臂分子的肽二聚體步驟1-合成Cbz-TAP將含有通過商業(yè)途徑可獲得的二胺(AldrichChemical Co.的“TAP”)(10g，67.47mmol)在無水DCM(100ml)中的溶液冷卻到0℃。通過滴液漏斗在6-7小時(shí)內(nèi)緩慢加入氯甲酸芐基酯(4.82ml，33.7mmol)在無水DCM(50ml)中的溶液，整個(gè)過程中保持反應(yīng)混合物的溫度為0℃，然后允許升溫到室溫(～25℃)。再過16h后，真空下除去DCM并且殘?jiān)?N HCl和乙醚之間分配。收集水性層并用50％NaOH水溶液中和到pH8-9并用乙酸乙酯萃取。用無水Na2SO4干燥乙酸乙酯層，然后真空濃縮得到粗品單-Cbz-TAP(5g，約50％產(chǎn)率)。該化合物不經(jīng)進(jìn)一步純化用于接下來的反應(yīng)。
步驟2-合成Cbz-TAP-Boc向Cbz-TAP(5g，17.7mmol)在己烷(25ml)中的劇烈攪拌的懸浮液加入Boc2O(3.86g，17.7mmol)并繼續(xù)在室溫過夜攪拌。將反應(yīng)混合物用DCM(25ml)稀釋并用10％檸檬酸水溶液(2×)、水(2×)和鹽水洗滌。用無水Na2SO4干燥有機(jī)層并真空濃縮。粗產(chǎn)物(產(chǎn)率5g)直接用于接下來的反應(yīng)。
步驟3-合成Boc-TAP將來自前面反應(yīng)的粗產(chǎn)物溶于甲醇(25ml)中并在5％披鈀炭(5％w/W)存在下氣球壓力下氫化16小時(shí)。將混合物過濾，用甲醇洗滌并真空濃縮濾液得到粗品H-TAP-Boc產(chǎn)物(產(chǎn)率3.7g)。步驟1-3后Boc-TAP的總體大概產(chǎn)率為44％(基于所用Cbz-Cl的量計(jì)算)。
步驟4-合成TentaGel-連接體，將溴化TentaGel(2.5g，0.48mmol/g，來自Rapp Polymere，德國)、酚連接體(5當(dāng)量)和K2CO3(5當(dāng)量)在20mlDMF中加熱到70℃并保持14小時(shí)。冷卻到室溫后，洗滌樹脂(0.1N HCl、水、ACN、DMF、MeOH)并干燥得到琥珀色樹脂。
步驟5-合成TentaGel-連接體-TAP(Boc)將來自上面的2.5gms樹脂和H-TAP-Boc(1.5gms，5當(dāng)量)和冰AcOH(34μl，5當(dāng)量)用1∶1MeOH-THF混合物吸收并過夜搖動(dòng)。氰基硼氫化鈉(5當(dāng)量)在THF中的1M溶液加入該混合物中并再搖動(dòng)7小時(shí)。將樹脂過濾洗滌(DMF、THF、0.1N HCl、水、MeOH)并干燥。將少量樹脂用Bz-Cl和DIEA在DCM中的溶液苯甲?；⒂?0％TFA-DCM切割并通過LCMS和HPLC檢查。
步驟6-合成TentaGel-連接體-TAP-Lys將來自上面的樹脂用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的活化溶液(5當(dāng)量氨基酸和5當(dāng)量HATU溶于0.5M DMF，然后加入10當(dāng)量DIEA制備)處理并溫和搖動(dòng)14小時(shí)。洗滌(DMF、THF、DCM、MeOH)樹脂并干燥以產(chǎn)生受保護(hù)的樹脂。通過用10％乙酸酐、20％吡啶在DCM中的溶液處理樹脂20分鐘帽化殘留胺基，然后如上洗滌。通過在DMF中的30％哌啶溫和搖動(dòng)樹脂20分鐘除去Fmoc基，然后洗滌(DMF、THF、DCM、MeOH)并干燥。
步驟7-合成TentaGel-連接體-TAP-Lys(肽)2將來自上面的樹脂進(jìn)行用HBTU/HOBt活化偶聯(lián)Fmoc-氨基酸和用哌啶除去Fmoc的反復(fù)循環(huán)以同時(shí)增長肽鏈。這在可以從Applied Biosystems，Inc得到的ABI 433自動(dòng)化肽合成儀上方便地進(jìn)行。除去最后的Fmoc后，將末端胺基用乙酸酐(10當(dāng)量)和DIEA(20當(dāng)量)在DMF中的溶液?；?0分鐘，然后如上洗滌。
步驟8-從樹脂切割將來自上面的樹脂在室溫重懸浮在TFA(82.5％)，苯酚(5％)，乙二硫醇(2.5％)，水(5％)和苯硫基甲烷(5％)的溶液中3小時(shí)。也可以使用備選切割混合液，如TFA(95％)，水(2.5％)和三異丙基硅烷(2.5％)。將TFA溶液冷卻到5℃并倒入Et2O中沉淀肽。過濾并減壓干燥得到所希望的肽。通過制備HPLC用C18柱純化得到純肽。
5.氧化肽以形成分子內(nèi)二硫鍵將肽二聚體溶解在20％DMSO/水(1mg干重肽/ml)并允許在室溫靜置36小時(shí)。通過將反應(yīng)混合物裝入C18HPLC柱(Waters Delta-Pak C18，15微米顆粒大小，300?？讖?，40mm×200mm長度)，然后用在40分鐘內(nèi)從5到95％ACN的線性ACN/水/0.01％TFA梯度純化。凍干含有所希望的肽的級(jí)分得到疏松的白色固體。例如對(duì)于AF35525，可以如下圖示該反應(yīng) 含有還原的半胱氨酸殘 含有氧化的二硫鍵的二基的二聚肽(XYZ) 聚肽(XYZ)6.肽的PEG化使用幾種不同的技術(shù)實(shí)施本發(fā)明肽的PEG化。
末端-NH2基的PEG化將肽二聚體用無水DMF中的1.5當(dāng)量(基于摩爾)活化的PEG種類(日本NOF Corp.的mPEG-NPC)混合得到澄清溶液。5分鐘后向上面的溶液加入4當(dāng)量DIEA。在室溫下攪拌混合物14小時(shí)，然后通過C18反相HPLC純化。通過MALDI質(zhì)譜證實(shí)PEG化肽的結(jié)構(gòu)。還將純化的肽進(jìn)行如下面概述的陽離子交換層析的純化。例如，對(duì)于AF35593，可以如下圖示連接體部分的末端-NH2基團(tuán)的單PEG化 肽二聚體的N-末端的二PEG化將肽二聚體用無水DMF中的2.5當(dāng)量(基于摩爾)活化的PEG種類(日本NOF Corp.的mPEG-NPC)混合得到澄清溶液。5分鐘后向上面的溶液加入4當(dāng)量DIEA。在室溫下攪拌混合物14小時(shí)，然后通過C18反相HPLC純化。還將純化的肽進(jìn)行如下面概述的陽離子交換層析的純化。例如，對(duì)于AF35083，該反應(yīng)可以圖示如下
通過N-末端的PEG化進(jìn)行肽二聚化將肽(2.5當(dāng)量)和PEG-(SPA-NHS)2(1當(dāng)量，來自Shearwater Corp，USA)以0.25M溶于無水DMF中得到澄清溶液。5分鐘后向上面的溶液加入10當(dāng)量DIEA。在室溫下攪拌混合物2小時(shí)，然后通過C18反相HPLC純化。還將純化的肽進(jìn)行如下面概述的陽離子交換層析的純化。例如，對(duì)于AF33131，該反應(yīng)可以圖示如下 通過C-末端PEG化進(jìn)行肽二聚化將肽(2.5當(dāng)量)和PEG-(SPA-NHS)2(1當(dāng)量，來自Shearwater Corp，USA)以0.25M溶于無水DMF中得到澄清溶液。5分鐘后向上面的溶液加入10當(dāng)量DIEA。在室溫下攪拌混合物2小時(shí)，然后通過C18反相HPLC純化。還將純化的肽進(jìn)行如下面概述的陽離子交換層析的純化。例如，該反應(yīng)可以圖示如下
7.肽的離子交換純化對(duì)數(shù)種交換支持體檢查它們保持保留起始二聚肽的能力以及它們分離上面的肽-PEG綴合物以未反應(yīng)的(或者水解的)PEG的能力。將離子交換樹脂(2-3g)裝入1cm柱中，然后轉(zhuǎn)化成鈉型(向柱子加入0.2N NaOH直到洗脫液的pH為14，約5柱體積)，然后轉(zhuǎn)化成氫型(用0.1N HCl或0.1M HOAc洗脫直到洗脫液匹配加樣pH，約5柱體積)，然后用25％ACN/水洗滌直到pH6。將綴合前的肽或者肽-PEG綴合物溶于25％ACN/水(10mg/mL)中并用TFA調(diào)節(jié)pH到＜3，然后加入柱子。用2-3柱體積25％ACN/水洗滌并收集5mL級(jí)分后，通過用25％ACN/水中的0.1MNH4OAc洗脫從柱子釋放肽，再次收集5mL級(jí)分。通過HPLC分析揭示哪些級(jí)分含有所希望的肽。用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)分析表明當(dāng)肽保留在柱子上并用NH4OAc溶液洗脫(通常在級(jí)分4到10之間)時(shí)，沒有觀察到作為污染物的非綴合的PEG。當(dāng)用最初洗滌緩沖液洗脫肽(通常前2個(gè)級(jí)分)時(shí)，沒有觀察到所希望的PEG綴合物和過量PEG的分離。
下面的柱子成功地保留了所述肽和肽-PEG綴合物，并從未綴合的肽成功地純化了肽-PEG綴合物
表1離子交換樹脂
實(shí)施例2體外活性測(cè)定該實(shí)施例描述可用于評(píng)估本發(fā)明肽的EPO-R激動(dòng)劑肽的活性和效力的多種體外測(cè)定法。這些測(cè)定法的結(jié)果表明本發(fā)明的新肽結(jié)合EPO-R并激活EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，這些測(cè)定的結(jié)果表明所述新肽組合物與以前描述的EPO模擬肽相比顯示EPO-R結(jié)合親和力和生物活性的令人驚奇的增加。
根據(jù)實(shí)施例1中提供的方法制備EPO-R激動(dòng)劑肽單體和二聚體。使用一系列體外活性測(cè)定法評(píng)估這些肽單體和二聚體的效力，所述測(cè)定法包括報(bào)道子測(cè)定法、增殖測(cè)定法、競爭結(jié)合測(cè)定法和C/BFU-e測(cè)定法。這四種測(cè)定法在下文詳細(xì)描述。
這些體外活性測(cè)定法的結(jié)果在表2(對(duì)于肽單體)和表3(對(duì)于肽二聚體)中總結(jié)。這些表提供了每種受試肽的化合物名稱和結(jié)構(gòu)，以及這四種測(cè)定法的每一種的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些結(jié)果表明本發(fā)明的新肽的顯著增強(qiáng)的效力。
1.報(bào)道子測(cè)定法該測(cè)定法基于鼠前-B細(xì)胞系來源的報(bào)道細(xì)胞Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux。該報(bào)道細(xì)胞系表達(dá)嵌合受體，該受體包含人EPO受體的細(xì)胞外部分到人GCSF受體的細(xì)胞內(nèi)部分。用fos啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)道基因構(gòu)建體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化該細(xì)胞系。通過加入紅細(xì)胞生成劑激活該嵌合受體導(dǎo)致螢光素酶報(bào)道基因的表達(dá)，因此加入螢光素酶底物螢光素時(shí)產(chǎn)生光。從而，可以通過測(cè)量螢光素酶活性可以定量此類細(xì)胞中EPO-R激活的水平。
將Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)加10％胎牛血清(FBS；Hyclone)，10％WEHI-3上清液(來自WEHI-3細(xì)胞ATCC#TIB-68的培養(yǎng)物的上清液)和青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中。測(cè)定前約18小時(shí)，通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到補(bǔ)加10％FBS和0.1％WEHI-3上清液的DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞。在測(cè)定當(dāng)天，用補(bǔ)加10％FBS(無WEHI-3上清液)的DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，然后在已知濃度的受試肽的存在下培養(yǎng)1×106個(gè)細(xì)胞/ml，或用EPO(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)作為陽性對(duì)照，在補(bǔ)加10％FBS(無WEHI-3上清液)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。同時(shí)在該測(cè)定中試驗(yàn)受試肽的連續(xù)稀釋液。將測(cè)定板在37℃下5％CO2大氣中孵育，之后向每孔加入螢光素(Steady-Glo；Promega，Madison，Wi)。孵育5分鐘后，在Packard Topcount Luminometer(Packard Instrument Co.，Downers Grove，Ill.)上測(cè)量光發(fā)射。將光計(jì)數(shù)相對(duì)于受試肽濃度作圖并用Graph Pad軟件分析。導(dǎo)致光的半最大發(fā)射的受試肽濃度記錄為EC50[見表2和3報(bào)道子EC50]。
2.增殖測(cè)定法該測(cè)定法基于鼠前-B細(xì)胞系Baf3，其經(jīng)轉(zhuǎn)染而表達(dá)人EPO-R。所得細(xì)胞系BaF3/Gal4/Elk/EPOR的增殖取決于EPO-R激活。使用MTT定量細(xì)胞增殖的程度，其中MTT測(cè)定中信號(hào)與活細(xì)胞數(shù)成比例。
將BaF3/Gal4/Elk/EPOR細(xì)胞培養(yǎng)在旋轉(zhuǎn)瓶中補(bǔ)加10％FBS(Hyclone)和2％WEHI-3上清液(ATCC#TIB-68)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。在旋轉(zhuǎn)瓶中補(bǔ)加10％FBS和0.1％WEHI-3上清液的DMEM/F12培養(yǎng)基中以1×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度過夜饑餓所培養(yǎng)的細(xì)胞。然后將饑餓的細(xì)胞用Dulbecco′s PBS(Gibco)洗滌兩次，用補(bǔ)加10％FBS(無WEHI-3上清液)的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸浮到1×106個(gè)細(xì)胞/ml的密度。然后將細(xì)胞懸浮物的50μL等分試樣((～50,000個(gè)細(xì)胞))以一式三份鋪在96孔測(cè)定板中。向96孔測(cè)定板加入受試EPO模擬肽或者50μL EPO(R&DSystems Inc.，Minneapolis，MN)或AranespTM(darbepoeitinα，可以從Amgen以商業(yè)途徑得到的EPO-R激動(dòng)劑)在補(bǔ)加10％FBS(無WEHI-3上清液I)的DMEM/F12培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋液的50μL等分試樣或者50μLEPO(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)或AranespTM(darbepoeitinα，可以從Amgen以商業(yè)途徑得到的EPO-R激動(dòng)劑)在補(bǔ)加10％FBS(無WEHI-3上清液)的DMEM/F12培養(yǎng)基中的溶液50μL加入到96孔測(cè)定板((最終孔體積100μL))。例如，當(dāng)受試肽((或者對(duì)照EPO肽))的最終濃度為810pM到0.0045pM時(shí)，可以試驗(yàn)12種不同的稀釋液。然后在37℃孵育平鋪的細(xì)胞。接著，向每個(gè)培養(yǎng)皿孔加入10μLMTT(Roche Diagnostics)，并孵育4小時(shí)。通過加入10％SDS+0.01N HCl中止反應(yīng)。然后在37℃過夜孵育板。通過分光光度法測(cè)量595nm波長下每孔的吸收。用吸收讀數(shù)對(duì)受試肽濃度作圖并使用Graph Pad軟件計(jì)算EC50。導(dǎo)致半最大吸收的受試肽濃度記錄為EC50[見表3增殖EC50]。
3.競爭結(jié)合測(cè)定法使用一種測(cè)定法進(jìn)行競爭結(jié)合計(jì)算，在該測(cè)定法中產(chǎn)生光信號(hào)作為兩種珠子的接近性的函數(shù)，所述珠子為具有生物素化EPO-R結(jié)合肽示蹤物的鏈霉抗生物素蛋白供體珠，和EPO-R結(jié)合的受體珠。通過非輻射能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生光，在所述轉(zhuǎn)移期間照明時(shí)從第一種珠子釋放單線態(tài)氧，與所釋放的單線態(tài)氧的接觸導(dǎo)致第二種珠子發(fā)光。這些珠子組可以通過商業(yè)途徑得到(Packard)。通過EPO-R結(jié)合肽示蹤物與EPO-R的結(jié)合產(chǎn)生珠子接近性。與EPO-R結(jié)合肽示蹤物競爭結(jié)合EPO-R的受試肽將防止該結(jié)合，導(dǎo)致光發(fā)射的降低。
該方法更詳述如下向384孔板的孔中加入受試EPO-R激動(dòng)劑肽或者陽性或陰性對(duì)照的4μL連續(xù)稀釋液。之后，加入2μL/孔受體/珠子混合物。受體珠子混合物由15μL 5mg/ml鏈霉抗生物素蛋白供體珠子(Packard)，15μL 5mg/ml單克隆抗體ab179(該抗體識(shí)別重組EPO-R中所含人胎盤堿性磷酸酶蛋白質(zhì)部分)，蛋白質(zhì)A包被的受體珠(蛋白質(zhì)A將結(jié)合ab179抗體；Packard)，重組EPO-R(在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生，作為人胎盤堿性磷酸酶蛋白質(zhì)部分的融合蛋白質(zhì)，其含有ab179靶表位)的1∶6.6稀釋液112.5μL，和607.5μL Alphaquest緩沖液(40mM HEPES，pH7.4；1mM MgCl2；0.1％BSA，0.05％Tween 20)組成。輕拍混合。加入2μL/孔生物素化EPO-R結(jié)合肽示蹤物AF33068(30nM終濃度)。根據(jù)實(shí)施例1描述的方法制備AF33068-一種EPO-R結(jié)合肽(見表3“報(bào)道子EC50(pM)”)AF33068 離心1分鐘混合。用Packard Top Seal密封板并用箔纏繞。在室溫過夜孵育。18小時(shí)后用AlphaQuest讀出器(Packard)讀出光發(fā)射。將光發(fā)射對(duì)肽濃度作圖并用Graph Pad或Excel分析。
相對(duì)于沒有受試肽所觀察到的光發(fā)射，導(dǎo)致光發(fā)射降低50％的受試肽的濃度記錄為IC50[見表2和3AQ IC50]。
4.C/BFU-e測(cè)定法EPO-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激骨髓干細(xì)胞分化成血紅細(xì)胞前體。該測(cè)定法測(cè)量受試肽刺激來自原代人骨髓多能干細(xì)胞的血紅細(xì)胞前體增殖和分化的能力。
對(duì)于該測(cè)定，以補(bǔ)加10％FBS(Hyclone)的IMDM培養(yǎng)基(Gibco)配制受試肽的連續(xù)稀釋液。然后將這些連續(xù)稀釋液或者陽性對(duì)照EPO肽加入甲基纖維素得到終體積1.5mL。然后充分渦旋甲基纖維素和肽的混合物。將人骨髓來源的CD34+細(xì)胞(Poietics/Cambrex)的等分試樣(100,000個(gè)細(xì)胞/mL)解凍。向50mL管中的0.1mL 1mg/ml DNA酶(Stem Cells)溫和加入解凍的細(xì)胞。接著，向細(xì)胞溫和加入40-50mL IMDM培養(yǎng)基該培養(yǎng)基沿著50mL管邊沿逐滴加入前10mL，然后沿著管的邊沿緩慢加入剩余體積的培養(yǎng)基。以900轉(zhuǎn)/分鐘離心細(xì)胞20分鐘，通過溫和吸出除去培養(yǎng)基。將細(xì)胞重懸浮在1ml IMDM培養(yǎng)基中并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器載玻片上計(jì)數(shù)每mL細(xì)胞密度(載玻片上細(xì)胞懸浮液的10μL等分試樣，細(xì)胞密度是平均計(jì)數(shù)×10,000個(gè)細(xì)胞/mL)。然后將細(xì)胞在IMDM培養(yǎng)基中稀釋到15,000個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度。然后向每1.5mL甲基纖維素加肽樣品加入100μL稀釋細(xì)胞(測(cè)定介質(zhì)中最終細(xì)胞濃度為1000個(gè)細(xì)胞/mL)，并渦旋混合物。允許混合物中氣泡消失，然后用鈍端針頭吸出1mL。
將來自每個(gè)樣品的0.25mL吸出的混合物加入24孔板(Falcon商標(biāo))的4個(gè)孔的每孔中。在37℃下5％CO2下在濕潤培養(yǎng)箱中孵育平鋪的混合物14天。使用相差顯微鏡(5×-10×目鏡，最終放大率100×)對(duì)類紅細(xì)胞集落的存在打分。相對(duì)于用EPO陽性對(duì)照所觀察的EPO陽性對(duì)照，所形成的集落數(shù)為最大值的90％時(shí)的受試肽濃度記錄為EC90[見表3C/BFU-eEC90]。
5.放射性配體競爭結(jié)合測(cè)定法可以用備選的放射性配體競爭結(jié)合測(cè)定法測(cè)量本發(fā)明中肽的IC50值。該測(cè)定法測(cè)量125I-EPO與EPOr的結(jié)合。根據(jù)下面的代表性方案進(jìn)行測(cè)定。
A.材料
B.測(cè)定適宜的受體濃度用1mL測(cè)定緩沖液重構(gòu)50μg瓶中凍干的與人IgG1的Fc部分融合的重組EPOr細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。為了測(cè)定用于測(cè)定的受體的正確量，將該受體制備物的100μL連續(xù)稀釋液與約20,000cpm碘化重組人紅細(xì)胞生成素(125I-EPO)在12×75mm聚丙烯試管中混合。蓋上試管并在LabQuake旋轉(zhuǎn)搖床上4℃溫和混合過夜。
第二天，向每管加入50μL蛋白質(zhì)G Sepharose的50％漿液。將管在4℃孵育2小時(shí)，溫和混合。然后以4000轉(zhuǎn)/分鐘(3297×G)將管離心15分鐘以沉淀蛋白質(zhì)-G sepharose。小心除去上清液并丟棄。用1ml 4℃測(cè)定緩沖液洗滌3次后，在Wallac Wizardγ計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)沉淀。然后分析結(jié)果并計(jì)算達(dá)到最大結(jié)合值的50％所需的稀釋度。
C.肽的IC50測(cè)定為了測(cè)定本發(fā)明肽的IC50，將肽的100μL連續(xù)稀釋液與100μL重組紅細(xì)胞生成素受體(100Pg/管)在12×75mm聚丙烯試管中混合。向每管加入100μL碘化重組人紅細(xì)胞生成素(125I-EPO)，蓋上試管并在4℃溫和混合過夜。
第二天，如上述定量結(jié)合的125I-EPO。分析結(jié)果并使用GraphPadSoftware，Inc.(San Diego，CA)的Graphpad Prism版本4.0計(jì)算IC50值。對(duì)于通過該方法測(cè)量IC50值的每種肽優(yōu)選重復(fù)該測(cè)定兩次和多次，總共3次一式兩份IC50測(cè)定。
6.討論將本發(fā)明的肽單體的體外報(bào)道子測(cè)定結(jié)果直接與以前公開的相關(guān)肽序列的結(jié)果相比較(見表2中的AF31552和AF31748)即，GGLYACHMGPMTVCQPLRG SEQ ID NO32和GGLYACHMGPMT(1-nal)VCQPLRGSEQ ID NO33。
這些結(jié)果表明本發(fā)明的新肽單體的顯著增強(qiáng)的效力，因?yàn)樾码亩垠w的效力為報(bào)道子測(cè)定中以前公開的肽單體的3到7.5倍。然后用這些新肽單體制備具有甚至更大效力和活性的新肽二聚體。
表2肽單體的體外報(bào)道子測(cè)定 表3肽二聚體的體外活性測(cè)定







實(shí)施例3體內(nèi)活性測(cè)定法該實(shí)施例描述可以用于評(píng)估本發(fā)明的EPO-R激動(dòng)劑肽的活性和效力多種體內(nèi)測(cè)定法。根據(jù)實(shí)施例1中提供的方法制備EPO-R激動(dòng)劑肽單體和二聚體。使用一系列測(cè)定法評(píng)估這些肽單體和二聚體的體內(nèi)活性，所述測(cè)定法包括polycythemic exhypoxic小鼠生物測(cè)定法和網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定法。這兩種測(cè)定法在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述。
1.polycythemic exhypoxic小鼠生物測(cè)定法以從Cotes和Bangham(1961)，Nature 1911065-1067描述的方法改編的polycythemic exhypoxic小鼠生物測(cè)定法測(cè)定受試肽的體內(nèi)活性。該測(cè)定法檢查受試肽作為EPO模擬物，即，激活EPO-R和誘導(dǎo)新的血紅細(xì)胞合成的能力?；诜派湫詷?biāo)記的鐵向合成的血紅細(xì)胞的血紅蛋白中的摻入定量血紅細(xì)胞合成。
讓BDF1小鼠適應(yīng)環(huán)境條件7-10天。測(cè)定所有動(dòng)物的體重并且不使用低體重動(dòng)物(＜15克)。將動(dòng)物置于低壓室中連續(xù)調(diào)節(jié)循環(huán)共14天。每個(gè)24小時(shí)循環(huán)由0.40±0.02％大氣壓下18小時(shí)和環(huán)境氣壓下6小時(shí)組成。調(diào)節(jié)后將小鼠保持在環(huán)境氣壓72小時(shí)后給藥。
將受試肽或者重組人EPO標(biāo)準(zhǔn)在PBS+0.1％BSA載體(PBS/BSA)中稀釋。首先將肽單體貯存液在二甲亞砜(DMSO)中溶解。陰性對(duì)照組包括僅用PBS/BSA注射的一組小鼠，和用1％DMSO注射的一組。每個(gè)劑量組包含10只小鼠。用0.5mL適宜的樣品皮下注射(頸背)小鼠。
樣品注射后48小時(shí)，對(duì)小鼠施用腹膜內(nèi)注射0.2ml Fe59(Dupont，NEN)，劑量為約0.75μ居里/小鼠。Fe59施用后24小時(shí)測(cè)定小鼠體重，并在Fe59施用后48小時(shí)處死小鼠。通過心臟穿刺從每只動(dòng)物收集血液并測(cè)定血細(xì)胞比容(用肝素作為抗凝劑)。使用Packardγ計(jì)數(shù)器分析每個(gè)血樣(0.2ml)的Fe59摻入。從適宜的數(shù)據(jù)集除去非應(yīng)答小鼠(即，放射性摻入小于陰性對(duì)照組的那些小鼠)。還除去血細(xì)胞比容值小于陰性對(duì)照組53％的小鼠。
對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量，從10只動(dòng)物的組得到結(jié)果。計(jì)算來自每組的血樣中摻入的放射性的平均量[每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)]。
2.網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定法以EPO對(duì)照或者受試肽在三個(gè)連續(xù)日對(duì)正常BDF1小鼠給藥(0.5mL，皮下注射)。在第3天，還用右旋糖苷鐵(100mg/ml)對(duì)小鼠給藥(0.1mL，腹膜內(nèi)注射)。在第5天，用CO2麻醉小鼠并通過心臟穿刺取血。通過噻唑黃染色和流式細(xì)胞儀分析(retic-count程序)測(cè)定每個(gè)血樣的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(％)。手工測(cè)定血細(xì)胞比容。用下面的公式確定校正的網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)％RETIC校正的＝％RETIC觀察值×(血細(xì)胞比容個(gè)體/血細(xì)胞比容正常)3.血液學(xué)測(cè)定法通過四次每周快速濃注靜脈內(nèi)注射EPO陽性對(duì)照、受試肽或者載體對(duì)正常CD1小鼠給藥。通過改變制劑中活性化合物濃度測(cè)試陽性對(duì)照和受試肽劑量范圍，其表達(dá)為mg/kg。注射的體積為5ml/kg。載體對(duì)照組包含12只動(dòng)物，剩余的劑量組每一組包括8只動(dòng)物。每日記錄生存力并且每周記錄體重。
對(duì)給藥的小鼠禁食通過吸入異氟醚麻醉并通過在第1天(對(duì)于載體對(duì)照小鼠)和第15和29天(4只小鼠/組/天)心臟或者腹部主動(dòng)脈穿刺收集終末血樣。將血液轉(zhuǎn)移到Vacutainer商標(biāo)管。優(yōu)選的抗凝劑是乙二胺四乙酸(EDTA)。
使用本領(lǐng)域公知的自動(dòng)化臨床分析儀(例如，Coulter，Inc.生產(chǎn)的)對(duì)血樣評(píng)估終點(diǎn)測(cè)量紅細(xì)胞合成和生理機(jī)能，諸如血細(xì)胞比容(Hct)、血紅蛋白(Hgb)和總紅細(xì)胞數(shù)(RBC)。
該測(cè)定中的代表性EPO-R激動(dòng)劑肽的數(shù)據(jù)在表4中給出。結(jié)果以在的第15天和第29天，相對(duì)于注射載體的對(duì)照小鼠，百分?jǐn)?shù)(％)血細(xì)胞比容(Ht)的增加。以1mg/kg的劑量對(duì)受試小鼠施用所指出的肽化合物。
本發(fā)明的范圍不局限于本文描述的具體實(shí)施方案的。實(shí)際上，根據(jù)前面的描述和附圖
，除了本文描述的之外對(duì)本發(fā)明的多種修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些修飾意在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
還將理解所有值都是近似的，并且提供這些值用于描述。
本發(fā)明的說明書中引用和討論了多種參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)、方案和多種出版物。提供這些參考文獻(xiàn)的引用和/或討論僅僅是用于闡明本發(fā)明的描述并且不是承認(rèn)此類參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的“現(xiàn)有技術(shù)”。該說明書中引用和討論的所有參考文獻(xiàn)在此完整并入本文作為參考，就像每個(gè)參考文獻(xiàn)單獨(dú)并入作為參考一樣。
權(quán)利要求
1.肽，其包含長約17到約40個(gè)氨基酸殘基并且包含氨基酸序列LYACHX0GPITX1VCQPLR(SEQ ID NO1)，其中X0為選自甲硫氨酸(M)和高絲氨酸甲醚(Hsm)的殘基，X1為選自色氨酸(W)、1-萘基丙氨酸(1-nal)和2-萘基丙氨酸(2-nal)的殘基，其中所述肽結(jié)合并活化紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中將所述肽的N-末端乙酰化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中所述肽包含選自LYACHMGPITWVCQPLR(SEQ ID NO2)；LYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR (SEQ ID NO3)；LYACHMGPIT(2-nal)VCQPLR (SEQ ID NO4)；GGLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO5)；GGLYACHMGPIT(1-Nal)VCQPLRG (SEQ ID NO6)；GGLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO7)；(AcG)GLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO8)；(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO9)；(AcG)GLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO10)；GGLYACHMGPITWVCQPLR(MeG) (SEQ ID NO11)；GGLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO12)；GGLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO13)；(AcG)GLYACHMGPITWVCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO14)；(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO15)；(AcG)GLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO16)；LYACH(Hsm)GPITWVCQPLR(SEQ ID NO17)；LYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLR(SEQ ID NO18)；LYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLR(SEQ ID NO19)；GGLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO20)；GGLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO21)；GGLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO22)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO23)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO24)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO25)；GGLYACH(Hsm)GPITWVCQPLR(MeG) (SEQ ID NO26)；GGLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO27)；GGLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO28)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO29)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO30)；和(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO31)的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中所述肽是單體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中所述肽是二聚體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的肽，其中所述肽是同型二聚體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其還包含共價(jià)結(jié)合所述肽的一種或多種水溶性聚合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的肽，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的肽，其中所述PEG包含具有約500到約60,000道爾頓的分子量的線性不分枝的分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的肽，其中所述PEG具有小于約20,000道爾頓的分子量。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的肽，其中所述PEG具有約20,000到約60,000道爾頓的分子量。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的肽，其中所述PEG具有約20,000到約40,000道爾頓的分子量。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的肽，其中兩個(gè)PEG部分共價(jià)結(jié)合所述肽，所述PEG的每一個(gè)包含線性不分枝的分子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的肽，其中每個(gè)所述PEG具有約20,000到約30,000道爾頓的分子量。
15.肽二聚體，其包含(a)第一條肽鏈；(b)第二條肽鏈；和(c)連接所述第一和第二條肽鏈的連接部分，其中所述第一條肽鏈和所述第二條肽鏈的至少一條包含長約17到約40個(gè)氨基酸殘基并且包含氨基酸序列LYACHX0GPITX1VCQPLR(SEQ ID NO1)，其中X0為選自甲硫氨酸(M)和高絲氨酸甲醚(Hsm)的殘基，X1為選自色氨酸(W)、1-萘基丙氨酸(1-nal)和2-萘基丙氨酸(2-nal)的殘基，其中所述肽二聚體結(jié)合并活化紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的肽二聚體，其中所述第一條肽鏈和所述第二條肽鏈的至少一條包含選自LYACHMGPITWVCQPLR(SEQ ID NO2)；LYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR (SEQ ID NO3)；LYACHMGPIT(2-nal)VCQPLR (SEQ ID NO4)；GGLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO5)；GGLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO6)；GGLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO7)；(AcG)GLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO8)；(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO9)；(AcG)GLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO10)；GGLYACHMGPITWVCQPLR(MeG) (SEQ ID NO11)；GGLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO12)；GGLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO13)；(AcG)GLYACHMGPITWVCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO14)；(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO15)；(AcG)GLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO16)；LYACH(Hsm)GPITWVCQPLR(SEQ ID NO17)；LYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLR (SEQ ID NO18)；LYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLR (SEQ ID NO19)；GGLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO20)；GGLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO21)；GGLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO22)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO23)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO24)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO25)；GGLYACH(Hsm)GPITWVCQPLR(MeG) (SEQ ID NO26)；GGLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO27)；GGLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO28)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO29)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO30)；和(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO31)的氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的肽二聚體，其中連接部分包含式-NH-R3-NH-其中R3為低級(jí)(C1-6)亞烷基。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的肽二聚體，其中連接部分是賴氨酸殘基。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的肽二聚體，其中連接部分包含式-CO-(CH2)n-X-(CH2)m-CO-其中n為0到10的整數(shù)，m為1到10的整數(shù)，X選自O(shè)、S、N(CH2)pNR1、NCO(CH2)pNR1和CHNR1，R1選自H、Boc和Cbz，p為1到10的整數(shù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的肽二聚體，其中n和m都為1，X為NCO(CH2)pNR1，p為2，R1為H。
21.根據(jù)權(quán)利要求15的肽二聚體，其還包含水溶性聚合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的肽二聚體，其中水溶性聚合物共價(jià)結(jié)合連接體部分。
23.根據(jù)權(quán)利要求15的肽二聚體，其還包含間隔臂部分。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的肽二聚體，其中間隔臂部分包含式-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-其中α、β和ε每個(gè)都是整數(shù)，它們的值獨(dú)立地選自1到6，δ為0或1，γ為選自0到10的整數(shù)，Y選自NH或CO，條件是γ大于1時(shí)β為2。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的肽二聚體，其中α、β和ε每個(gè)都為2，γ和δ每個(gè)都為1，Y為NH。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的肽二聚體，其還包含一種或多種水溶性聚合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的肽二聚體，其中水溶性聚合物共價(jià)結(jié)合間隔臂部分。
28.根據(jù)權(quán)利要求21或26的肽二聚體，其中水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的肽二聚體，其中所述PEG是具有約500到約60,000道爾頓的分子量的線性不分枝的PEG。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的肽二聚體，其中所述PEG具有約500到小于約20,000道爾頓的分子量。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的肽二聚體，其中所述PEG具有約20,000到60,000道爾頓的分子量。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的肽二聚體，其中所述PEG具有約20,000到約40,000道爾頓的分子量。
33.根據(jù)權(quán)利要求28的肽，其中兩個(gè)PEG部分共價(jià)結(jié)合所述肽，所述PEG的每一個(gè)包含線性不分枝的分子。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的肽，其中每個(gè)所述PEG具有約20,000到約30,000道爾頓的分子量。
35.治療患者的方法，其包括對(duì)患有特征是紅細(xì)胞生成素不足或者低或者有缺陷的血紅細(xì)胞群體的疾病的患者施用治療有效量的肽，所述肽包含長約17到約40個(gè)氨基酸殘基并且包含氨基酸序列LYACHX0GPITX1VCQPLR(SEQ ID NO1)，其中X0為選自甲硫氨酸(M)和高絲氨酸甲醚(Hsm)的殘基，X1為選自色氨酸(W)、1-萘基丙氨酸(1-nal)和2-萘基丙氨酸(2-nal)的殘基。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述疾病選自末期腎衰竭或透析、與艾滋病、自身免疫病或者惡性腫瘤相關(guān)的貧血、β-地中海貧血、囊性纖維化、早熟性早期貧血、與慢性炎癥疾病相關(guān)的貧血、脊髓損傷、急性失血、衰老和伴隨著異常紅細(xì)胞生成的腫瘤疾病狀態(tài)。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述肽包含選自LYACHMGPITWVCQPLR(SEQ ID NO2)；LYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR (SEQ ID NO3)；LYACHMGPIT(2-nal)VCQPLR (SEQ ID NO4)；GGLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO5)；GGLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO6)；GGLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO7)；(AcG)GLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO8)；(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO9)；(AcG)GLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO10)；GGLYACHMGPITWVCQPLR(MeG) (SEQ ID NO11)；GGLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO12)；GGLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO13)；(AcG)GLYACHMGPITWVCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO14)；(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO15)；(AcG)GLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO16)；LYACH(Hsm)GPITWVCQPLR(SEQ ID NO17)；LYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLR (SEQ ID NO18)；LYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLR (SEQ ID NO19)；GGLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO20)；GGLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO21)；GGLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO22)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO23)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO24)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPII(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO25)；GGLYACH(Hsn)GPITWVCQPLR(MeG) (SEQ ID NO26)；GGLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO27)；GGLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO28)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO29)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO30)；和(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO31)的氨基酸序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述肽是單體。
39.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述肽是二聚體。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述肽是同型二聚體。
41.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中一種或多種水溶性聚合物共價(jià)結(jié)合所述肽。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述PEG是具有約500到約60,000道爾頓分子量的線性不分枝的PEG。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述PEG具有約500到小于約20,000道爾頓的分子量。
45.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述PEG具有約20,000到約60,000道爾頓的分子量。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述PEG具有約20,000到約40,000道爾頓的分子量。
47.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中兩個(gè)PEG部分共價(jià)結(jié)合所述肽，所述PEG的每一個(gè)包含線性不分枝的分子。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中每個(gè)所述PEG具有約20,000到約30,000道爾頓的分子量。
49.藥物組合物，其包含(i)肽，其長約17到約40個(gè)氨基酸殘基并且包含氨基酸序列LYACHX0GPITX1VCQPLR(SEQ ID NO1)，其中X0為選自甲硫氨酸(M)和高絲氨酸甲醚(Hsm)的殘基，X1為選自色氨酸(W)、1-萘基丙氨酸(1-nal)和2-萘基丙氨酸(2-nal)的殘基；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述肽包含選自LYACHMGPITWVCQPLR (SEQ ID NO2)；LYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(SEQ ID NO3)；LYACHMGPIT(2-nal)VCQPLR(SEQ ID NO4)；GGLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO5)；GGLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO6)；GGLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO7)；(AcG)GLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO8)；(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO9)；(AcG)GLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO10)；GGLYACHMGPITWVCQPLR(MeG) (SEQ ID NO11)；GGLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO12)；GGLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO13)；(AcG)GLYACHMGPITWVCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO14)；(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO15)；(AcG)GLYACHMGPIT(2-nal)VCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO16)；LYACH(Hsm)GPITWVCQPLR (SEQ ID NO17)；LYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLR(SEQ ID NO18)；LYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLR(SEQ ID NO19)；GGLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO20)；GGLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO21)；GGLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO22)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO23)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO24)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG (SEQ ID NO25)；GGLYACH(Hsm)GPITWVCQPLR(MeG) (SEQ ID NO26)；GGLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO27)；GGLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO28)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPITWVCQPLRG(MeG) (SEQ ID NO29)；(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(1-nal)VCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO30)；和(AcG)GLYACH(Hsm)GPIT(2-nal)VCQPLRG(MeG)(SEQ ID NO31)的氨基酸序列。
51.根據(jù)權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述肽是單體。
52.根據(jù)權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述肽是二聚體。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的藥物組合物，其中所述肽是同型二聚體。
54.根據(jù)權(quán)利要求49的藥物組合物，其中一種或多種水溶性聚合物共價(jià)結(jié)合所述肽。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的藥物組合物，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的藥物組合物，其中所述PEG是具有約500到約60,000道爾頓分子量的線性不分枝的PEG。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述PEG具有約500到小于約20,000道爾頓的分子量。
58.根據(jù)權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述PEG具有約20,000到約60,000道爾頓的分子量。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的藥物組合物，其中所述PEG具有約20,000到約40,000道爾頓的分子量。
60.根據(jù)權(quán)利要求55的藥物組合物，其中兩個(gè)PEG部分共價(jià)結(jié)合所述肽，所述PEG的每一個(gè)包含線性不分枝的分子。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的藥物組合物，其中每個(gè)所述PEG具有約20,000到30,000道爾頓的分子量。
全文摘要
本發(fā)明涉及肽化合物，其為紅細(xì)胞生成素受體(EPO－R)的激動(dòng)劑。本發(fā)明還涉及使用此類肽化合物治療與不足和有缺陷的血紅細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)的疾病。還提供了包含本發(fā)明的肽化合物的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1823088SQ200480019935
公開日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2004年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月12日
發(fā)明者C·P·霍姆斯, 殷群, G·拉隆德, P·J·沙茨, D·圖梅爾提, B·帕蘭尼, G·澤梅德 申請(qǐng)人:阿費(fèi)麥克斯公司