專利名稱：用于制藥用途的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與源自擬諾卡氏菌屬菌種(Nocardiopsis sp.)NRRL 18262的蛋白酶(SEQ ID NO1)有關(guān)的蛋白酶，任選地與脂肪酶和/或淀粉酶組合的制藥用途。醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的例子為消化病癥、胰腺外分泌功能不全(PEI)、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的治療。
背景技術(shù)：
已知一些胰酶補(bǔ)充劑形式的商品化的藥物用于胰腺外分泌功能不全的治療。這些產(chǎn)品的活性組分為消化酶，主要為淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，其通常在胰腺中產(chǎn)生并且分泌至小腸上部(十二指腸)。用于所述藥物中的酶來源于?；蜇i胰腺。
US5614189(EP 600868)描述了某些微生物脂肪酶在胰酶替代療法，例如在患有囊性纖維化的患者治療中的用途。
WO00/54799描述了具有分解脂肪、水解蛋白和分解淀粉活性的酶混合物在I型和II型糖尿病治療中的用途。
WO02/060474描述了某些脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶在消化不良治療中的用途。
源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL 18262的蛋白酶(SEQ ID NO1)，以及其制備和其各種工業(yè)應(yīng)用在WO88/03947和WO01/58276中描述。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及與SEQ ID NO1具有至少70％同一性的蛋白酶，任選地和脂肪酶和/或淀粉酶組合，用作藥物。
本發(fā)明還涉及所述蛋白酶用于消化病癥、PEI、胰腺功能不全、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病治療藥物制備的用途，這些用途進(jìn)一步任選地包括脂肪酶和/或淀粉酶的使用。
本發(fā)明此外涉及包括所述蛋白酶，以及至少一種藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)的藥物組合物，任選地包括脂肪酶和/或淀粉酶。
本發(fā)明還涉及施用治療消化病癥、PEI、胰腺功能不全、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，其通過施用治療有效量的所述蛋白酶，任選地與脂肪酶和/或淀粉酶一起施用。
發(fā)明詳述酶術(shù)語“蛋白酶”此處定義為水解肽鍵的酶。其包括屬于EC 3.4酶組的任何酶(包括其13個(gè)亞類的每一個(gè)，這些酶在下面稱為“屬于EC3.4-.-組”)。EC編號(hào)指來自NC-IUBMB，Academic Press，San Diego，California的酶命名1992，分別包括刊登于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6；和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650的增刊1-5。命名定期補(bǔ)充并且更新；參見例如World Wide Web http//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
蛋白酶根據(jù)其催化機(jī)理分為下列組絲氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金屬蛋白酶(M)和未知的，或尚未分類的蛋白酶(U)，參見Handbook of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(eds)，Academic Press(1998)，尤其是總引言部分。
本發(fā)明涉及與源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL 18262，并且在WO88/03947和WO01/58276中描述的SEQ ID NO1的蛋白酶至少70％同一性的蛋白酶的制藥用途。
本發(fā)明另外的蛋白酶在WO2004/111220、WO2004/111221、WO2004/111222、WO2004/111223、WO2005/035747、WO2004/111219中公開，在此通過引用并入。
本發(fā)明蛋白酶的具體例子源自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種(Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei)DSM 43235(SEQ ID NO2)、Nocardiopsis alba DSM 15647(SEQ ID NO3)、Nocardiopsis prasina DSM15648(SEQ ID NO4)、Nocardiopsis prasina DSM 15649(SEQ ID NO5)，以及其片段、突變體和變體，如蛋白酶22(SEQ ID NO6)。任選地，SEQID NO1-6的每一序列具有C-末端延伸部分，其由一個(gè)或多個(gè)氨基酸，例如非極性的或不帶電荷的氨基酸，如Q、S、V、A或P的一種或多種組成，優(yōu)選選自QSHVQSAP(SEQ ID NO7)、QSAP、QP、TL、TT、QL、TP、LP、TI、IQ、QP、PI、LT、TQ、IT、QQ和PQ。
具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶選自(a)屬于EC 3.4.-.-酶組的蛋白酶；(b)絲氨酸蛋白酶；(c)肽酶家族S2A的絲氨酸蛋白酶；(d)Biochem.J.290205-218(1993)中和2003年3月24日發(fā)布的6.20MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫(www.merops.ac.uk)中所述的肽酶家族S1E的絲氨酸蛋白酶。上述數(shù)據(jù)庫在Rawlings，N.D.，O′Brien，E.A.& Barrett，A.J.(2002)MEROPSthe protease database.Nucleic Acids Res.30，343-346中有描述；和(e)源自擬諾卡氏菌屬菌株的蛋白酶為了確定給定的蛋白酶是否為絲氨酸蛋白酶以及家族S2A蛋白酶，參照上述手冊(cè)和其中表明的原理。可對(duì)所有類型的蛋白酶進(jìn)行所述測定，不管其為天然存在的或野生型的蛋白酶；或基因工程改造的或合成的蛋白酶。
具體的實(shí)施方案中，與SEQ ID NO1的同一性程度為至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。替代實(shí)施方案中，同一性程度為至少約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％或至少69％。
另外具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶為酸穩(wěn)定的，其指純蛋白酶在對(duì)應(yīng)A280＝1.0的稀釋度下，在下面的緩沖液100mM琥珀酸、100mMHEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％TritonX-100，pH 3.5中37℃溫育2小時(shí)后，蛋白酶活性為參照活性的至少40％(或至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少97％)，所述蛋白酶活性利用WO01/58276的實(shí)施例2C中所述的測定法來測量(底物Suc-AAPF-pNA，pH 9.0，25℃)。術(shù)語“參照活性”指相同的蛋白酶，在對(duì)應(yīng)A280＝1.0的稀釋度下，以純的形式在下面的緩沖液中5℃溫育2小時(shí)的蛋白酶活性100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mMCABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％TritonX-100，pH 9.0，其中所述活性如上所述測定。術(shù)語A280＝1.0指所述純的蛋白酶的這樣的濃度(稀釋度)，其在1cm光程長度的比色杯中相對(duì)于緩沖液空白對(duì)照在280nm處產(chǎn)生1.0的吸收。術(shù)語“純的蛋白酶”指A280/A260比率大于或等于1.70的樣品(參見WO01/58276的實(shí)施例2E)，并且通過掃描Coomassie染色的SDS-PAGE凝膠，其至少95％的掃描強(qiáng)度在對(duì)應(yīng)于所述蛋白酶的條帶中(參見WO01/58276的實(shí)施例2A)。
其他的具體實(shí)施方案中，任選地，可以利用另外的蛋白酶，例如哺乳動(dòng)物蛋白酶，例如以來自豬的胰臟提取物的形式，或微生物蛋白酶，例如源自細(xì)菌或真菌菌株，如芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、曲霉屬(Aspergillus)或根霉屬(Rhizopus)。蛋白酶尤其可源自曲霉屬株，如米曲霉或蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)，尤其是產(chǎn)品Prozyme 6TM(中性的，堿性蛋白酶EC 3.4.21.63)，其可購自Amano Pharmaceuticals，Japan。
本發(fā)明的蛋白酶可與脂肪酶組合使用。
本文的上下文中，脂肪酶指羧酸酯水解酶EC 3.1.1.-，其包括如EC3.1.1.3三?；视椭久浮C 3.1.1.4磷脂酶A1、EC 3.1.1.5溶血磷脂酶、EC 3.1.1.26半乳糖脂酶、EC 3.1.1.32磷脂酶A1、EC 3.1.1.73阿魏酰酯酶的活性。具體的實(shí)施方案中，脂肪酶為EC 3.1.1.3三?；视椭浮?br> 具體的實(shí)施方案中，脂肪酶為哺乳動(dòng)物脂肪酶，例如以來自豬的胰臟提取物的形式，或微生物脂肪酶，例如源自細(xì)菌或真菌菌株，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、曲霉屬或根霉菌屬。脂肪酶尤其可源自根霉屬菌株，如爪哇根霉(Rhizopus javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)或代氏根霉(Rhizopus delemar)，例如產(chǎn)品脂肪酶D Amano 2000TM(也稱Lipase D2TM)，其可購自Amano Pharmaceuticals，Japan。
另外具體的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的脂肪酶為重組產(chǎn)生的微生物脂肪酶，例如源自如腐殖菌屬(Humicola)或根毛霉屬(Rhizomucor)的真菌，來自如假絲酵母屬(Candida)的酵母，或來自如假單胞菌屬的細(xì)菌。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂酶源自Humicola lanuginosa或米赫毛霉(Rhizomucormiehei)菌株。
Humicola lanuginosa(異名Thermomyces lanuginosus)脂肪酶(SEQ IDNO8)在EP 305216中描述，并且具體的脂肪酶變體在例如WO92/05249、WO92/19726、WO94/25577、WO95/22615、WO97/04079、WO97/07202、WO99/42566、WO00/32758、WO00/60063、WO01/83770、WO02/055679和WO02/066622中描述。真菌脂肪酶另外的例子有來自Humicola insoilens的角質(zhì)酶(cutinase)，其在EP 785994中描述，以及來自尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)的磷脂酶，其在EP 869167中描述。酵母脂肪酶的例子有來自南極假絲酵母(Candida antarctica)的脂酶A和B，其中脂肪酶A在EP652945中描述，而脂肪酶B在例如Uppenberg等.在Structure，2(1994)，293中描述。細(xì)菌脂肪酶的例子有源自洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)的脂肪酶，其在EP 214761中描述。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂酶與SEQ ID NO8的脂酶至少70％相同。另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，與SEQ ID NO8的同一性程度為至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。替代實(shí)施方案中，與SEQ ID NO8的同一性程度為至少約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％或至少69％。
另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酶，如哺乳動(dòng)物胰脂肪酶，為1，3-位特異性的脂肪酶。
本發(fā)明的蛋白酶在有或無上述脂肪酶時(shí)，也可與淀粉酶組合使用。
在本文的上下文中，淀粉酶為催化淀粉和其他線性的和分枝的寡糖和多糖內(nèi)水解(endo-hydrolysis)的酶。淀粉的直鏈淀粉部分富含1，-α-糖苷鍵，而支鏈淀粉部分分枝程度更高，不僅包含1，-α-糖苷鍵而且包含1，6-α-糖苷鍵。具體的實(shí)施方案中，淀粉酶為屬于EC 3.2.1.1組的酶。
具體的實(shí)施方案中，淀粉酶為哺乳動(dòng)物淀粉酶，例如以來自豬的胰臟提取物的形式，或微生物淀粉酶，例如源自細(xì)菌或真菌菌株，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、曲霉屬或根霉屬。
淀粉酶可尤其源自曲霉屬菌株，如黑曲霉、米曲霉或蜂蜜曲霉，例如可購自Amano Pharmaceuticals，Japan的源自米曲霉的產(chǎn)品淀粉酶A1TM，或可購自Extract-Chemie，Germany的源自蜂蜜曲霉的淀粉酶EC。
其他真菌淀粉酶的例子為黑曲霉淀粉酶(SWISSPROT P56271)，其也在WO89/01969的實(shí)施例3中描述，以及米曲霉淀粉酶(SEQ ID NO9)。米曲霉淀粉酶變體的例子在WO01/34784中描述。
源自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶為細(xì)菌α-淀粉酶的例子。該淀粉酶與例如源自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的其他同源的細(xì)菌α-淀粉酶以及其變體一起例如在WO99/19467中描述。另外的淀粉酶變體的例子在美國專利no.4,933,279；EP 722490和EP 904360中描述。
具體的實(shí)施方案中，淀粉酶與SEQ ID NO9的淀粉酶至少70％相同。另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，與SEQ ID NO9的同一性程度為至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。替代實(shí)施方案中，與SEQ ID NO9的同一性程度為至少約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％或至少69％。
通常，用于本發(fā)明的所述蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶(在下文中為“酶”)可以是天然或野生型酶，其獲自動(dòng)物，尤其哺乳動(dòng)物，例如人或豬的酶；獲自植物，或獲自微生物，以及呈現(xiàn)所需酶活性的任何突變體、變體、片段等等，以及合成酶，如改組(shuffled)酶和共有酶(consensus enzyme)。
在一具體的實(shí)施方案中，所述酶(S)為低變應(yīng)原性的變體，其被設(shè)計(jì)為當(dāng)其暴露于動(dòng)物，包括人時(shí)，引起降低的免疫應(yīng)答。術(shù)語“免疫應(yīng)答”理解為暴露于所述酶的動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的任何反應(yīng)。一種類型的免疫應(yīng)答為在被暴露的動(dòng)物中引起提高的IgE水平的變應(yīng)性應(yīng)答。低變應(yīng)原性的變體可利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備。例如酶可與屏蔽參與免疫應(yīng)答的酶部分或表位的聚合物部分結(jié)合。與聚合物結(jié)合可包括酶與聚合物體外化學(xué)偶聯(lián)，例如在WO96/17929、WO98/30682、WO98/35026和/或WO99/00489中描述的。并且/或者，結(jié)合可包括酶與聚合物的體內(nèi)偶聯(lián)。這樣的結(jié)合可通過如下實(shí)現(xiàn)基因工程改造編碼所述酶的核苷酸序列，插入編碼酶中另外的糖基化位點(diǎn)的共有序列并且在能糖基化所述酶的宿主中表達(dá)該酶，參見例如WO00/26354。提供低變應(yīng)原性變體的另一種方法為基因工程改造編碼該酶的核苷酸序列，以引起酶的自身寡聚，使酶單體可以屏蔽其他酶單體的表位，并且因此降低寡聚物的抗原性。所述產(chǎn)物和其制劑在例如WO96/16177中描述。參與免疫應(yīng)答的表位可通過各種方法鑒定，如WO00/26230和WO01/83559中所述的噬菌體展示方法，或EP 561907中所述的隨機(jī)法。表位一旦鑒定，可通過已知的基因操作技術(shù)如位點(diǎn)定向誘變(參見例如WO00/26230、WO00/26354和/或WO00/22103)改變其氨基酸序列而產(chǎn)生改變免疫特性的酶，并且/或者，可以在足夠鄰近所述表位處結(jié)合聚合物，使得聚合物可屏蔽該表位。
具體的實(shí)施方案中，蛋白酶、脂酶和/或淀粉酶為(i)在pH 4-8，優(yōu)選還在pH 3-4，更優(yōu)選在pH 3.5是穩(wěn)定的；(ii)在pH 4-9，優(yōu)選4-8，更優(yōu)選在pH 6.5是有活性的；(iii)對(duì)通過胃蛋白酶和其他消化蛋白酶(如胰臟蛋白酶，即主要為胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的降解穩(wěn)定的；和/或(iv)在膽汁鹽存在時(shí)穩(wěn)定的和/或有活性的。
術(shù)語“與......組合”指蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶根據(jù)本發(fā)明的組合使用。組合使用可以是同時(shí)的、重疊的或按順序的，這三個(gè)術(shù)語通常考慮醫(yī)師的處方來解釋。
術(shù)語“同時(shí)的”指該情況下各酶同時(shí)具有活性，例如當(dāng)它們作為一種或多種各自獨(dú)立的藥品同時(shí)被施用，或在同一個(gè)藥物組合物中被施用。
術(shù)語“按順序的”指各酶中一種和/或兩種酶首先起作用，并且第二種和/或第三種酶隨后起作用的所述情況。依次起作用可通過下面的方式實(shí)現(xiàn)將所述的酶作為各自獨(dú)立的藥物制劑以所需的時(shí)間間隔施用，或所述的酶作為一種藥物組合物，施用，該藥物組合物中所述的酶以不同方式配制(分隔的(compartmentalized))，例如為了獲得不同的釋放時(shí)間，提供改進(jìn)的產(chǎn)品穩(wěn)定性，或優(yōu)化酶劑量。
術(shù)語“重疊的”指其中各酶的活性期既不完全同時(shí)又不完全按順序的所述情況，即存在其中所有酶均有活性的某個(gè)時(shí)期。
術(shù)語“一”例如當(dāng)用于本發(fā)明的蛋白酶、脂酶和/或淀粉酶的上下文時(shí)，指至少一種。具體的實(shí)施方案中，“一”指“一種或多種”或“至少一種”，“至少一種”指一種、兩種、三種、四種、五種等等。
對(duì)本發(fā)明而言兩種氨基酸序列間的同一性程度通過程序“比對(duì)”確定，其為Needleman-Wunsch比對(duì)(即全局比對(duì))。通過程序比對(duì)序列，使用利用缺省得分矩陣的BLOSUM50。缺口的第一個(gè)殘基的罰分為12，而對(duì)于缺口更多的殘基罰分為2。
“比對(duì)”為FASTA程序包v20u6版本的一部分(參見WR.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”，PNAS852444-2448，以及W.R.Pearson(1990)“Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA，”Methods in Enzymology 18363-98)。FASTA蛋白質(zhì)比對(duì)利用對(duì)缺口大小無限制的Smith-Waterman算法(參見“Smith-Waterman algorithm”，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)。
可利用任何合適的測定法測量本發(fā)明酶的活性。通常，測定pH和測定溫度要適應(yīng)于所述的酶。測定pH值的例子為pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。測定溫度的例子為30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95℃。
例如，可利用任何測定法測量蛋白酶的活性，其中采用包括針對(duì)所述的蛋白酶特異性的有關(guān)肽鍵的底物。
合適的酶測定法的例子包括在實(shí)驗(yàn)部分。其他的例子有用于脂肪酶和淀粉酶活性的Ph.Eur.測定法。
藥物本文的上下文中，術(shù)語“藥物”指治療、預(yù)防和/或減輕疾病癥狀的化合物，或化合物的混合物。藥物可通過醫(yī)師處方，或可以是非處方的產(chǎn)品。
藥物組合物本發(fā)明的酶的分離、純化和濃縮可通過常規(guī)方法進(jìn)行。
具體的實(shí)施方案中，分別制備每種酶的濃縮的固體或液體制劑。如下面更詳細(xì)所述的，這些濃縮物還可至少部分地分別配制。
另一具體的實(shí)施方案中，酶以固體濃縮物的形式摻入本發(fā)明的藥物組合物中?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的各種方法使酶成為固態(tài)。例如，固態(tài)可以是結(jié)晶的，其中酶分子以高度有序形式排列，或沉淀物，其中酶分子以較低的有序性或無序的形式排列。
結(jié)晶例如可在接近酶pI的pH以及低導(dǎo)電率，例如10mS/cm或更低下進(jìn)行，如在EP691982中所述的(也參見此處的實(shí)施例2)。
各種沉淀方法為本領(lǐng)域所知，包括用鹽沉淀，如硫酸銨和/或硫酸鈉；用有機(jī)溶劑沉淀，如乙醇和/或異丙醇；或用聚合物沉淀，如PEG(聚乙二醇)。替代方案中，酶可通過本領(lǐng)域已知的各種方法除去溶劑(通常為水)而從溶液沉淀，例如冷凍干燥、蒸發(fā)(例如在降低的壓力下)和/或噴霧干燥。
另一具體的實(shí)施方案中，酶的固體濃縮物具有相對(duì)固體濃縮物總蛋白含量的至少50％的活性酶蛋白的含量(w/w)。在另一具體的實(shí)施方案中，相對(duì)于固體濃縮物的總蛋白含量，活性酶蛋白的含量為至少55、60、65、70、75、80、85、90或至少95％(w/w)。可如本領(lǐng)域已知的測量蛋白含量，例如利用商品化的試劑盒，如Protein Assay ESL，定購號(hào)1767003，其可從Roche購買，或根據(jù)WO01/58276的實(shí)施例8中所述的方法。
本發(fā)明的藥物組合物包括優(yōu)選以濃縮酶制劑形式，更優(yōu)選固體濃縮物形式的酶，與至少一種藥學(xué)上可接受輔助或附加物質(zhì)如(i)至少一種載體和/或賦形劑；或(ii)至少一種載體、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑。均為藥學(xué)上可接受的任選的其他組分的非限制性例子有崩解劑、潤滑劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑、調(diào)味劑、溶劑、增溶劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、推進(jìn)劑和賦形劑或載體(vehicles)。
通常，根據(jù)所述的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥，本發(fā)明的組合物可設(shè)計(jì)用于本領(lǐng)域已知的各種給藥方式，包括腸給藥(通過消化道)，和腸胃外給藥例如通過注射(如皮下的、肌內(nèi)的或靜脈內(nèi)的等等)。因此，組合物可以為固體、半固體、液體或氣體形式，如片劑、膠囊劑、粉劑、粒劑、微球、膏劑、乳膏劑、泡沫、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球、洗劑和氣霧劑。
下列方法和輔助材料僅是示例性的而不用于限制。
對(duì)于固體口服制劑，酶可單獨(dú)或與合適的添加劑組合以制成片劑、粉劑、顆粒劑或膠囊劑而使用，例如與常規(guī)載體，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；與賦形劑或粘合劑，如結(jié)晶的或微晶的纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；與崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；與潤滑劑，如巴西棕櫚蠟、白蠟、蟲膠、無水膠態(tài)硅石(waterless colloid silica)、聚乙二醇(macrogol)6000、聚烯吡酮(povidone)、滑石、monolein或硬脂酸鎂；并且如果需要，與稀釋劑、佐劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑如對(duì)羥基苯甲酸甲酯(E218)、著色劑如二氧化鈦(E171)和調(diào)味劑如蔗糖、糖精、橙油、檸檬油和香草醛結(jié)合。口服制劑為用于PEI醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥治療的優(yōu)選制劑的例子。
很常見的，酶還可以通過將其溶解、懸浮或乳化在水溶劑如水中，或非水性溶劑如植物或其他類似的油類、合成的脂肪酸甘油酯、高級(jí)脂肪酸酯、丙二醇、聚乙二醇如PEG 4000或低級(jí)醇如線性或分支的C1-C4醇，例如2-丙醇中，并且如果需要，與常規(guī)的附加材料或添加劑如增溶劑、佐劑、稀釋劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑一起而配制為用于注射的制劑或液體口服制劑。
同樣常見的，酶此外可以經(jīng)吸入給藥的氣霧劑而利用，例如通過配制入密封的可接受的推進(jìn)劑如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾鹊取?br> 此外，酶通?？赏ㄟ^與各種基質(zhì)如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì)混合而制成用于直腸給藥的栓劑。栓劑可包括溶媒如可可脂、聚乙二醇(carbowaxes)和聚乙二醇，其在體溫下熔化，而在室溫下凝固。
作為投遞載體的脂質(zhì)體的利用為通?？赡芨信d趣的另一種方法。脂質(zhì)體與靶位點(diǎn)的細(xì)胞融合并且向細(xì)胞內(nèi)投遞腔內(nèi)的內(nèi)容物。利用維持接觸的各種方法，如隔離、粘合劑等等，脂質(zhì)體與細(xì)胞維持足以融合的時(shí)間的接觸。本發(fā)明的一個(gè)方面中，脂質(zhì)體設(shè)計(jì)為霧化的而用于肺給藥。脂質(zhì)體可用介導(dǎo)膜融合的純化的蛋白質(zhì)或肽制備，如仙臺(tái)病毒或流感病毒等等。脂類可以是已知形成脂質(zhì)體的脂類的任何有效組合，包括陽離子的或兩性離子的脂類如磷脂酰膽堿。剩下的脂類通常為中性或酸性脂類，如膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等等。用于制備脂質(zhì)體，可利用Kato等.(1991)J.Biol.Chem.2663361所述的方法。
可提供用于口服或直腸給藥的單位劑型如糖漿、酏劑、粉劑和懸浮液，其中每個(gè)劑量單位，例如一茶匙、一湯匙、每膠囊、每片或每栓，包含預(yù)定量的酶。類似地，用于注射或靜脈內(nèi)給藥的單位劑型可包括作為無菌水、生理鹽水或另一種藥學(xué)可接受載體中溶液的組合物中的酶。
如此處所用的術(shù)語“單位劑型”指適合作為用于人和動(dòng)物受試者的單一劑量的物理上離散的單位，每一單位包含足以產(chǎn)生預(yù)期效果的預(yù)定量的酶。
具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物用于腸，優(yōu)選口服給藥。
另一具體的實(shí)施方案中，口服組合物為(i)包含酶的晶體的液體組合物；(ii)(高度)純化的酶的沉淀的懸浮液；(iii)包含固體或溶解形式的酶的凝膠；(iv)固定的酶或吸附至顆粒等的酶的懸浮液；或(v)含有酶的粉劑、丸粒、顆粒劑或微球形式的固體組合物，如果需要，為片劑、膠囊劑等等形式的，其任選地被包被，例如用酸穩(wěn)定的包衣包被。。
組合物的另一具體的實(shí)施方案中，酶為分隔的，即相互隔離的，例如通過獨(dú)立的包被。
在組合物的另一具體的實(shí)施方案中，蛋白酶與組合物的其他酶組分，如脂肪酶和/或淀粉酶隔離。
取決于所給的特定的酶、給藥頻率、給藥方式、癥狀嚴(yán)重程度和受試者對(duì)副作用的易感性等等，酶的劑量可在很大的范圍內(nèi)改變。一些特定的酶可能比其它的更有效。
酰胺(肽)鍵，以及氨基和羧基末端，可為了更好的口服穩(wěn)定性而修飾。例如，羧基末端可經(jīng)酰胺化。
治療方法本發(fā)明的蛋白酶，任選地與脂肪酶和/或淀粉酶(本發(fā)明的酶)組合，可用于動(dòng)物中各種疾病或病癥的治療性的和/或預(yù)防性的治療。術(shù)語“動(dòng)物”包括所有動(dòng)物，且尤其包括人類。動(dòng)物的例子有非反芻動(dòng)物和反芻動(dòng)物，如綿羊、山羊、馬和牛，例如肉牛、母牛和年幼的小牛。具體的實(shí)施方案中，動(dòng)物為非反芻動(dòng)物。非反芻動(dòng)物包括單胃動(dòng)物，例如豬(pigs)或豬(swine)(包括但不限于，小豬、成長中的豬和母豬)；家禽如火雞、鴨和雞(包括但不限于童子雞、產(chǎn)卵雞)；年幼的小牛；寵物如貓和狗；以及魚(包括但不限于鮭魚、鱒魚、羅非魚(tilapia)、鯰魚和鯉魚)；和甲殼類動(dòng)物(包括但不限于蝦和對(duì)蝦)。具體的實(shí)施方案中動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，更具體為人。
例如，酶可用于如消化不良(maldigestion)或消化不良(dyspepsia)的消化病癥的治療，其常常由缺乏通常分泌自，包括其他的，胃和胰腺的消化酶產(chǎn)生和/或分泌進(jìn)入胃腸道而引起。
此外，酶尤其可用于PEI的治療。PEI可利用，包括其他的，Borgstrom檢測(JOP.J Pancreas(Online)2002；3(5)116-125)證實(shí)，并且其可能由如胰腺癌、胰腺和/或胃手術(shù)，例如胰腺的完全或部分切除術(shù)、胃切除術(shù)、胃腸后繞道手術(shù)(例如Billroth II胃腸吻合術(shù))；慢性胰腺炎；Shwachman菱形綜合癥；胰腺或膽總管的導(dǎo)管梗阻(例如腫瘤所致)；和/或囊性纖維化(一種遺傳病，其中稠的粘液阻斷胰腺導(dǎo)管)的疾病和病情引起。酶還可用于急性胰腺炎的治療。
酶對(duì)消化病癥的作用可如EP0600868通常所述的測量，其中實(shí)施例2描述了用于測量脂肪酶在胃條件下的穩(wěn)定性的體外消化率(digestibility)試驗(yàn)，而實(shí)施例3為在膽鹽存在下脂肪酶活性的體外消化率試驗(yàn)?？蓪?duì)蛋白酶和淀粉酶建立相應(yīng)的試驗(yàn)。WO02/060474還公開了合適的試驗(yàn)，例如(1)用于測量家豬試驗(yàn)飼料中脂類消化的體外試驗(yàn)，和(2)用胰腺功能不全的家豬的體內(nèi)試驗(yàn)，其中測量脂肪、蛋白質(zhì)和淀粉的消化率。
具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白酶的作用利用此處實(shí)施例1的體外胰腺功能不全消化模型測量，其中依照要求可利用不同的其他底物，例如動(dòng)物性蛋白質(zhì)，其他的植物蛋白質(zhì)，谷物，動(dòng)物或植物油脂，以及任何其混合物。
其他具體的實(shí)施方案中，利用實(shí)施例4的蛋白酶效力體內(nèi)篩選試驗(yàn)，或?qū)嵤├?的完全體內(nèi)消化率試驗(yàn)測量本發(fā)明蛋白酶的作用。
作為另一個(gè)實(shí)施例，酶可用于I型和/或II型糖尿病的治療，尤其可在糖尿病療法中用于輔助治療通常伴隨該病的消化病癥，以減少晚期并發(fā)癥。
酶對(duì)糖尿病的作用可通過WO00/54799中描述的一種或多種方法確定，例如通過控制糖基化血紅蛋白的水平，血糖水平，低血糖發(fā)作，脂溶性維生素如維生素A、D和E的狀態(tài)，所需的胰島素的日劑量，體重指標(biāo)和高血糖周期。
此處描述和要求的本發(fā)明不限于此處公開的具體實(shí)施方案的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案只是用作本發(fā)明一些方面的例證。任何等同實(shí)施方案也在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)際上，除此處呈現(xiàn)和描述的那些外本發(fā)明的各種改進(jìn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述說明而言是顯而易見的。所述改進(jìn)也落入附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。如有矛盾，參照說明書包括的定義。
此處引用各種參考文獻(xiàn)，其中公開的內(nèi)容通過引用整體引入。
實(shí)施例實(shí)施例1體外胰腺功能不全消化模型如WO01/58276的實(shí)施例2中的一般描述制備源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL 18262蛋白酶(SEQ ID NO1)的純化制劑，并且在患有胰腺功能不全個(gè)體的模擬消化的體外模型中檢測該試劑。
該體外系統(tǒng)由24個(gè)燒瓶組成，其中底物(以玉米和豆粕(SBM)為基礎(chǔ))首先與HCl/胃蛋白酶(模擬胃內(nèi)消化)溫育，隨后與兩種降低水平的胰酶溫育，模擬患有部分和完全胰腺功能不全個(gè)體中的腸消化。陽性對(duì)照中與正常水平的胰酶溫育。
10個(gè)燒瓶在胃階段開始時(shí)按劑量施用蛋白酶，而剩下的燒瓶用作空白。在腸內(nèi)溫育階段結(jié)束時(shí)，取出體外消化物的樣品并且分析經(jīng)溶解和消化的蛋白質(zhì)。
體外消化方法概要


條件底物4g SBM，6g玉米(預(yù)混合的)HCl0.105M 1.5小時(shí)(即30min HCl-底物預(yù)混合)胃蛋白酶Sigma P-7000；3000U/g底物1小時(shí)胰酶Sigma P-7545；0、4或8mg/g底物4小時(shí)(假定的胰酶正常水平為8mg/g)蛋白酶100mg蛋白酶酶蛋白(EP)/kg底物(酶蛋白利用S.C.Gill&P.H.von Hippel，Analytical Biochemistry 182，319-326，(1989)中描述的原理根據(jù)A280值和氨基酸序列(氨基酸組成)計(jì)算)pH3.0胃步驟/6.8-7.0腸步驟溫度40℃重復(fù)5(4)溶液0.39M NaOH0.105M HCl每5ml含有6000U胃蛋白酶的0.105M HCl每ml含有16mg胰酶的1M NaHCO3125mM NaAc緩沖液，pH 6.0用于體外模型的實(shí)驗(yàn)過程根據(jù)上述上述說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過程。在時(shí)間1、2.5和5.5小時(shí)測量pH。6小時(shí)后終止溫育并且取出30ml樣品置于冰上，然后離心(10000xg，10min，4℃)。取出上清并且在-20℃儲(chǔ)存。
分析利用凝膠過濾分析所有樣品經(jīng)溶解和消化的蛋白質(zhì)含量。
經(jīng)溶解和消化的蛋白質(zhì)的估計(jì)通過利用凝膠過濾HPLC定量總蛋白質(zhì)(CP)而估計(jì)來自體外消化樣品的上清中經(jīng)溶解的蛋白質(zhì)含量。融解上清，濾器通過0.45μM聚碳酸酯濾器并且用H2O稀釋(1∶50，v/v)。稀釋的樣品利用Superdex Peptide PE(7.5×300mm)凝膠過濾柱(Global)HPLC層析。用于等度洗脫的洗脫液為含有150mMNaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)。每次運(yùn)行的洗脫液的總體積為26ml，并且流速為0.4ml/min。在214nm處記錄洗脫圖并且通過積分確定洗脫圖總面積。為了從積分面積評(píng)估蛋白質(zhì)含量，由體外消化的已知總蛋白質(zhì)含量的參照玉米/SBM樣品系列稀釋物制成校準(zhǔn)曲線(R2＝0.9993)。該參照樣品中的蛋白質(zhì)測定利用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(在這種情況下，為用于氮％測定的凱氏定氮法；A.O.A.C.(1984)Official Methods of Analysis 14th ed.，WashingtonDC)。
通過積分對(duì)應(yīng)于具有1500道爾頓或以下分子量的肽和氨基酸的層析面積而評(píng)估消化的蛋白質(zhì)含量(Savoie，L.；Gauthier，S.F.Dialysis Cell For TheIn-vitro Measurement Of Protein Digestibility.J.Food Sci.1986，51，494-498；Babinszky，L.；Van，D.M.J.M.；Boer，H.；Den，H.L.A.An In-vitro Methodfor Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds.J.Sci.FoodAgr.1990，50，173-178；Boisen，S.；Eggum，B.O.Critical Evaluation ofIn-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-StomachAnimals.Nutrition Research Reviews 1991，4，141-162)。為了確定1500道爾頓分界線，凝膠過濾柱利用細(xì)胞色素C(Boehringer，Germany)、牛胰蛋白酶抑制劑、胃泌素I和P物質(zhì)(substance P)(Sigma Aldrich，USA)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)校正。
試驗(yàn)結(jié)果顯示在表1中并且還顯現(xiàn)在

圖1中。表1中，欄“酶”顯示每克底物的胰酶(縮寫“pan”)量，以及擬諾卡氏菌蛋白酶的量(方括號(hào)中)。下一列中，“n”為每一實(shí)驗(yàn)的重復(fù)數(shù)。接下來欄的組顯示可消化的粗蛋白質(zhì)的百分比(縮寫％dig.CP)，包括標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，以及如表下注腳中解釋的顯著性上標(biāo)字母。最后，欄的最后一組顯示可溶性粗蛋白質(zhì)的百分比(縮寫％sol.CP)，也包括SD和顯薯性上標(biāo)字母。
如表1呈現(xiàn)的，擬諾卡氏菌蛋白酶的添加有改善溶解的以及可消化的蛋白質(zhì)百分比的強(qiáng)烈趨勢(P＜0.10)，并且在用4mg/g胰酶的實(shí)驗(yàn)中，以及用0mg/g胰酶的實(shí)驗(yàn)中是這樣的(比較“4mg pan，[100]”與“4mg pan，
；”和“0mg pan，[100]”與“0mg pan，
”)。此指擬諾卡氏菌蛋白酶能補(bǔ)償胰酶的部分或全部缺乏。
表1

LSD 90％一列內(nèi)具有不同大寫上標(biāo)字母的值指示差異的強(qiáng)烈趨勢(1-wayANOVA，最小顯著差(LSD)檢驗(yàn)，P＜0.10)。SD＝標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實(shí)施例2結(jié)晶蛋白酶制劑的制備如實(shí)施例l中所述發(fā)酵SEQ ID NO1的蛋白酶，并且在pH 4.5在離心機(jī)上收集含有蛋白酶的培養(yǎng)液。得到的上清利用具有6kD截留值的膜超濾，以及滲濾直至含有蛋白酶的溶液中電導(dǎo)率為2mS/cm。蛋白酶含量為大約100mg/mL。
濃縮和滲濾的蛋白酶溶液通過用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至pH 8.5，即接近于該蛋白酶pI(其為9.3)而結(jié)晶。pH調(diào)節(jié)后溶液在室溫下過夜，并且發(fā)生結(jié)晶。
第二天通過離心收集結(jié)晶的蛋白酶。
實(shí)施例3酶測定蛋白酶底物Suc-AAPF-pNA(SigmaS-7388)。
測定緩沖液100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mMCABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％TritonX-100，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH 9.0。
測定溫度25℃。
300μl稀釋的蛋白酶樣品與1.5ml測定緩沖液混合，添加1.5ml pNA底物(50mg溶于1.0ml DMSO，再用0.01％TritonX-100稀釋45x)啟動(dòng)活性反應(yīng)，混合后，用分光光度計(jì)監(jiān)測A405的提高，作為蛋白酶活性的度量?；钚詼y量之前稀釋蛋白酶樣品，以確保所有活性測量結(jié)果落入用于該測定的劑量-響應(yīng)曲線的線性部分內(nèi)。
蛋白酶FIP測定還可利用FIP測定(Fédération Internationale Pharmaceutique)，1FIP-單位＝1Ph.Eur.-單位(European Pharmacopoeia)測定蛋白酶活性。該測定法與其他FIP測定法一起在Fédération Internationale Pharmaceutique，Scientific SectionInternational Commission for the standardisation ofpharmaceutical enzymes中描述。a)“Pharmaceutical Enzymes，”EditorsR.Ruyssen和A.Lauwers，E.Story Scientia，Ghent，Belgium(1978)，b)EuropeanPharmacopoeia.也參見Deemester等.Lauwers A，ScharpéS(eds)Pharmaceutical Enzymes，New York，Marcel Dekker，1997，p.343-385。
原理底物酪蛋白在pH 7.5和35℃溫度時(shí)被蛋白酶水解。通過添加三氯乙酸終止反應(yīng)，并過濾掉未降解的酪蛋白。溶液中剩下的肽量通過分光光度測定法在275nm測定。
活性定義蛋白酶活性確定為與已知FIP活性的胰腺參照粉劑(蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn))對(duì)照，未被5.0％(wt/vol，即5.0g/100ml)的三氯乙酸溶液所沉淀的肽量。
材料和方法酪蛋白溶液
1.25g酪蛋白(干物質(zhì))，例如Calbiochem no.218680，懸浮于水中直至獲得幾乎澄清的溶液。pH調(diào)節(jié)至8.0，并且溶液用水稀釋至終體積100ml。此處和以下，水指去離子水。
硼酸鹽緩沖液pH 7.52.5g氯化鈉，2.85g四硼酸二鈉和10.5g硼酸溶于900ml水，pH調(diào)節(jié)至pH 7.5+/-0.1并且用水稀釋至1000ml。
濾紙具有125mm直徑的折疊濾紙，例如Schleicher & Schuell no.15731/2。濾紙的檢驗(yàn)過濾5ml 5.0％的三氯乙酸通過該濾紙。利用未過濾的三氯乙酸溶液作為空白，濾液在275nm的吸收應(yīng)該小于0.04。
蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶(胰腺)可購自International Commission on PharmaceuticalEnzymes，Centre for Standards，Harelbekestraat 72，B-9000 Ghent，Belgium。該標(biāo)準(zhǔn)物具有標(biāo)定的FIP/Ph.Eur-單位/g活性(A)。準(zhǔn)確地稱取相當(dāng)于大約130蛋白酶-FIP/Ph.Eur.-單位的量。添加一刮勺端的海沙，用幾滴冰冷的0.02M氯化鈣(pH 6.0-6.2)潤濕，并且用平頭玻璃棒全部磨碎。用大約90ml同樣冰冷的氯化鈣溶液稀釋并且在冰浴中攪拌懸浮液15至30分鐘。pH調(diào)節(jié)至6.1并且體積用同樣的氯化鈣溶液調(diào)節(jié)至100ml。5.0ml該懸浮液用pH 7.5的硼酸鹽緩沖液稀釋至100ml。用于活性試驗(yàn)，1.0、2.0和3.0ml該溶液用作參照(在下文中稱為S1、S2和S3，S代表標(biāo)準(zhǔn)物)。
檢測懸浮液利用相當(dāng)于約260FIP/Ph.Eur.-單位的樣品量制備用于蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn)的如上所述的樣品懸浮液。pH調(diào)節(jié)至6.1并且添加水至100ml。5.0ml該溶液與5ml氯化鈣溶液混合。5ml該稀釋物進(jìn)一步用硼酸鹽緩沖液稀釋至100ml。利用2.0ml該溶液用于測定(在下文中樣品稱為Un，未知活性的樣品，編號(hào)n)。
測定過程(活性試驗(yàn))對(duì)三種對(duì)照懸浮液(S1、S2、S3)和樣品懸浮液(Un)進(jìn)行測定，所有的一式三份。每種樣品的一個(gè)空白就足夠了(分別稱為S1b、S2b、S3b和Unb)。制備無樣品/標(biāo)準(zhǔn)作為用于分光光度計(jì)的校正液的盲樣。硼酸鹽緩沖液如下添加至試管分別為盲樣(B)3.0ml；樣品(Un)1.0ml；標(biāo)準(zhǔn)分別為(S1、S2和S3)2.0、1.0和0ml。蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn)如下添加至S1、S2和S3分別為1.0、2.0和3.0ml。檢測懸浮液如下(Un)添加至樣品試管2.0ml。5ml三氯乙酸添加至所有盲樣(S1b、S2b、S3b、Unb和B)隨后立即混合。所有試管用玻璃塞塞住并且與底物溶液一起置于恒溫水浴中(35+/-0.5℃)。當(dāng)達(dá)到溫度平衡時(shí)，在時(shí)間零點(diǎn)，將2.0ml酪蛋白溶液添加至試管S1、S2、S3和Un，隨后立即混合。正好30分鐘后，將5.0ml三氯乙酸添加至每一試管S1、S2、S3和Un，隨后立即混合。從水浴取出試管并且在室溫下保持20分鐘以完成蛋白質(zhì)的沉淀。每一試管的內(nèi)容物通過同樣的濾器過濾兩次，并且利用來自試管B的濾液作為校正液在275nm測量濾液的吸收。較之標(biāo)準(zhǔn)(S1、S2、S3)已知的標(biāo)記活性(A)，計(jì)算以FIP單位計(jì)的樣品活性(Un)。減去各自盲樣的吸收值(例如S1的吸收減去S1b的吸收)應(yīng)當(dāng)在0.15-0.60區(qū)間。
脂肪酶底物對(duì)-硝基苯基(pNP)戊酸酯測定pH7.7測定溫度40℃反應(yīng)時(shí)間25分鐘具有黃顏色的消化的產(chǎn)物在405nm處具有特有的吸光度。其量通過分光光度測定法測定。一個(gè)脂肪酶單位為在給定的測定條件下每分鐘釋放1微摩爾可滴定丁酸的酶量。更詳細(xì)的測定說明書，AF95/6-GB，可從NovozymesA/S，Krogshoejvej 36，DK-2880Bagsvaerd，Denmark得到。
淀粉酶底物Phadebas片劑(Pharmacia Diagnostics；交聯(lián)的、不溶的、藍(lán)色淀粉聚合物，其與和牛血清白蛋白和緩沖物質(zhì)混合，并且制成片劑)測定溫度37℃測定pH4.3反應(yīng)時(shí)間20分鐘懸浮于水中后淀粉被α-淀粉酶水解，產(chǎn)生可溶性的藍(lán)色片段。在620nm測量的產(chǎn)生的藍(lán)色溶液的吸光度為α-淀粉酶活性的函數(shù)。一個(gè)真菌α-淀粉酶單位(1FAU)為在標(biāo)準(zhǔn)測定條件時(shí)每小時(shí)分解5.26g淀粉(Merck，Amylumsolubile Erg.B.，Batch 9947275)的酶量。更詳細(xì)的測定說明書，APTSMYQI-3207，可從Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880Bagsvaerd，Denmark得到。
實(shí)施例4蛋白酶效力的體內(nèi)篩選試驗(yàn)實(shí)施例1中所述的蛋白酶在雌性Gottingen小型豬(minipigs)(Ellegaard)中檢測。小型豬中，結(jié)扎胰管以誘導(dǎo)胰腺外分泌功能不全(PEI)，并且裝入回腸盲腸折返插管，所有的豬都被氟烷麻醉，并且體重約25kg，如Tabeling等.，J.1999，Studies on nutrient digestibilities(pre-caecal and total)in pancreaticduct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution，J.Anim.Physiol.A.Anim.Nutr.82251-263(下文中稱作“Tabeling 1999”)；和在Gregory等.，J.1999.Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs，Effect of enzyme supplementation in“Biology of the Pancreas in GrowingAnimals”(SG Pierzynowski & R.Zabielski eds)，Elsevier Science BV，Amsterdam，pp 381-393(hereinafter referred to as“Gregory等1999”)中所述。手術(shù)后恢復(fù)至少4周時(shí)間再開始研究。研究開始之前，每只豬的PEI狀態(tài)經(jīng)糞便胰凝乳蛋白酶檢測(可購自Immundiagnostik AG，Wiesenstrasse 4，D-64625 Bensheim，Germany，目錄號(hào)K 6990)而確定。
研究期間，豬以12:12h的光照-黑暗周期放置在改進(jìn)的代謝試籠中，允許水的自由攝入，并每天飼喂兩餐。為了評(píng)估蛋白酶的效力，給豬飼喂250g與1升水、0.625g Cr2O3(氧化鉻標(biāo)記物)混合的試餐，并且其中在喂養(yǎng)之前立即混合入不同量的蛋白酶(0、1000、2500、6000FIP U蛋白酶/餐(蛋白酶FIP單位，參見實(shí)施例3))。試餐包含21.4％的蛋白質(zhì)、51.9％的淀粉、2.6％的脂肪，并且具有下列組成(g/100g干物質(zhì))魚粉3.5、家禽肉粗粉10.2、小麥粉29.5、脫殼(shelled)水稻14、馬鈴薯淀粉11、玉米淀粉14、酪蛋白5.9、纖維素粉4.3、維生素、礦物質(zhì)和微量元素7.6(根據(jù)豬/小豬的營養(yǎng)需要，參見例如WO01/58276的表A)。
回腸中首次出現(xiàn)試餐標(biāo)記物(綠色食糜)后，在冰上收集回腸食糜總共8h，并且分析之前儲(chǔ)存在-20℃。單獨(dú)的測定之間允許至少一天的洗出(washout)。
簡單地說，冷凍干燥冰凍樣品并且分析干物質(zhì)(DM)和總蛋白質(zhì)。根據(jù)凍干后再在103℃保溫8h后的重量估計(jì)DM?？偟鞍踪|(zhì)作為氮(N)乘以系數(shù)6.25而計(jì)算，即如Animal Nutrition，4th edition，Chapter 13中陳述的，總蛋白質(zhì)(g/kg)＝N(g/kg)×6.25(Eds.P.McDonald，R.A.Edwards andJ.F.D.Greenhalgh，Longman Scientific and Technical，1988，ISBN0-582-40903-9)。含氮量通過凱氏定氮法(Naumann和bassler，1993，Diechemische Untersuchung von Futtermitteln.3 edition VDLUFA-Verlag，Darmstadt，Germany(VDLUFA＝Verband Deutscher LandwirtschaftlicherUntersuchungs-und Forschungsanstalten))測定。
根據(jù)下面的方程式進(jìn)行表觀盲腸前(pre-caecal)蛋白質(zhì)消化能力的計(jì)算

其中Cr2O3和蛋白質(zhì)表示為g/100g干物質(zhì)。
表2酶補(bǔ)充對(duì)表觀蛋白質(zhì)消化率的影響

值為均值±SD實(shí)施例5完全體內(nèi)消化率試驗(yàn)實(shí)施例1中所述的蛋白酶在雌性Gottingen小型豬中(Ellegaard)檢測，其中結(jié)扎胰管以誘導(dǎo)PEI，給豬安置回腸盲腸折返插管，所有的豬都用氟烷麻醉并且體重約25kg，如之前所述的(Tabeling 1999；Gregory等1999，)。以類似的方法制備對(duì)照的小型豬，但保留胰管為完整的。手術(shù)后恢復(fù)至少4周時(shí)間再開始研究。研究開始之前，每只豬的PEI狀態(tài)經(jīng)糞便胰凝乳蛋白酶檢測而確定(參見實(shí)施例4)。
豬可自由攝取水，且每天飼喂兩餐(分別在08.00和20.00h)，每餐為250g磨細(xì)的飼料(如實(shí)施例4)，與1升水，0.625g Cr2O3混合，并在喂養(yǎng)之前立即混合入不同量的蛋白酶(0，6000FIP U蛋白酶/餐)。每種劑量供給豬2周，并且最后的3天在冰上收集回腸食糜12h。分析前樣品儲(chǔ)存在-20℃。
簡單地說，冷凍干燥冰凍樣品并且分析干物質(zhì)(DM)和粗蛋白質(zhì)。如實(shí)施例4估計(jì)DM和粗蛋白質(zhì)并計(jì)算盲腸前蛋白質(zhì)消化率(表觀消化率)。
對(duì)照(胰腺功能完全的)豬中對(duì)所用飼料的盲腸前蛋白質(zhì)消化率為大約80％。未處理的PEI豬中相比這些對(duì)照值蛋白質(zhì)消化率嚴(yán)重地降低，但用胰酶或微生物蛋白進(jìn)行酶補(bǔ)充大大地改善了消化率，其接近對(duì)照值(參見底下表3中的結(jié)果)。
表3酶補(bǔ)充對(duì)表觀蛋白質(zhì)消化率的影響

值為均值±SD
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>用于制藥用途的酶<130>10627.204-WO<160>9<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>188<212>PRT<213>擬諾卡氏菌(Nocardiopsis sp.)NRRL 18262<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..(188)<400>1Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser1 5 10 15Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr20 25 30Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly35 40 45Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe50 55 60Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr65 70 75 80Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile85 90 95Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly100 105 110Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val115 120 125Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly130 135 140Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr165 170 175Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr180 185
<210>2<211>188<212>PRT<213>達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種(Nocardiopsis dassonvilleisubsp.Dassonvillei)DSM 43235<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..(188)<400>2Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser1 5 10 15Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr20 25 30Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly35 40 45Thr Gly Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe50 55 60Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr65 70 75 80Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala85 90 95Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly100 105 110Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val115 120 125Tyr Ser Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly130 135 140Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Ser Gly Asn Cys Ser Val Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr165 170 175Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly Val Arg Ile Arg Thr180 185<210>3<211>188<212>PRT<213>擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)alba DSM 15647<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..(188)<400>3Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser1 5 10 15Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr20 25 30Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly Asn Gly35 40 45Gln Gly Val Phe Glu Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Ala Phe50 55 60Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr65 70 75 80Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Ala Ile85 90 95Gly Ser Gln Ile Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly100 105 110Thr Val Gln Ala Arg Gly Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly Thr Val115 120 125Gln Asn Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly130 135 140Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Ser Gly Asn Cys Ser Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn165 170 175Pro Met Leu Ser Ser Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr180 185<210>4<211>188<212>PRT<213>擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)prasina DSM 15648<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..(188)<400>4Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser1 5 10 15Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr20 25 30
Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Ser Ile Gly Asn Gly35 40 45Gln Gly Val Phe Glu Gln Ser Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe50 55 60Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr65 70 75 80Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile85 90 95Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly100 105 110Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val115 120 125Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly130 135 140Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr165 170 175Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr180 185<210>5<211>188<212>PRT<213>擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)prasina DSM 15649<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..(188)<400>5Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser1 5 10 15Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr20 25 30Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly35 40 45Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe50 55 60Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr65 70 75 80
Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile85 90 95Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly100 105 110Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val115 120 125Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly130 135 140Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr165 170 175Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr180 185<210>6<211>196<212>PRT<213>合成的<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..(196)<400>6Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser1 5 10 15Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr20 25 30Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly Asn Gly35 40 45Lys Gly Val Phe Glu Arg Ser Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ser Ala Phe50 55 60Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr65 70 75 80Asn Ser Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile85 90 95Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly100 105 110Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val115 120 125Tyr Ser Leu Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly
130 135 140Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Ser Gly Asn Cys Ser Ala Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn165 170 175Pro Met Leu Ser Ser Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr Gln Ser His Val180 185 190Gln Ser Ala Pro195<210>7<211>8<212>PRT<213>合成的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(8)<223>C-末端延伸<400>7Gln Ser His Val Gln Ser Ala Pro1 5<210>8<211>269<212>PRT<213>Thermomyces lanuginosus<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..()<400>8Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr15 10 15Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr20 25 30Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp35 40 45Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr50 55 60Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe65 70 75 80
Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp85 90 95Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly100 105 110Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val115 120 125Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly130 135 140His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg145 150 155 160Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val165 170 175Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr180 185 190Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro195 200 205Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser210 215 220Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly225 230 235 240Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro245 250 255Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu260 265<210>9<211>478<212>PRT<213>米曲霉<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..(478)<400>9Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr1 5 10 15Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asn Thr20 25 30Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys35 40 45Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Thr Pro
50 55 60Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr Gly Asp Ala Tyr His65 70 75 80Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn Glu Asn Tyr Gly Thr85 90 95Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu His Glu Arg Gly Met100 105 110Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly Tyr Asp Gly Ala115 120 125Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro Phe Ser Ser Gln Asp130 135 140Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr Glu Asp Gln Thr Gln145 150 155 160Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val Ser Leu Pro Asp Leu165 170 175Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp Tyr Asp Trp Val Gly180 185 190Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Thr Val195 200 205Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn Lys Ala Ala Gly210 215 220Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro Ala Tyr Thr Cys225 230 235 240Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Tyr245 250 255Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly Ser Met Asp Asp Leu260 265 270Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys Pro Asp Ser Thr Leu275 280 285Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Ser Tyr290 295 300Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala Ala Phe Ile Ile Leu305 310 315 320Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu Gln His Tyr Ala325 330 335Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr340 345 350Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala Ser Ala Asn Ala Ile355 360 365
Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe Val Thr Tyr Lys Asn370 375 380Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala Met Arg Lys Gly Thr385 390 395 400Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn Lys Gly Ala Ser Gly405 410 415Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr Thr Ala Gly Gln420 425 430Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val Thr Val Gly Ser Asp435 440 445Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu Pro Arg Val Leu Tyr450 455 460Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys Ser Ser Ser465 470 47權(quán)利要求
1.用作藥物的、與SEQ ID NO1有至少70％同一性的蛋白酶。
2.權(quán)利要求1的蛋白酶，與脂肪酶或淀粉酶組合用作藥物。
3.權(quán)利要求1的蛋白酶，與脂肪酶和淀粉酶組合用作藥物。
4.與SEQ ID NO1有至少70％同一性的蛋白酶在制備治療消化病癥、胰腺功能不全、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的藥物中的用途。
5.權(quán)利要求4的用途，進(jìn)一步包括脂肪酶或淀粉酶的用途。
6.權(quán)利要求4的用途，進(jìn)一步包括脂肪酶和淀粉酶的用途。
7.藥物組合物，包括優(yōu)選為固體濃縮物形式的、與SEQ ID NO1有至少70％同一性的蛋白酶，以及至少一種藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的組合物，進(jìn)一步包括脂肪酶或淀粉酶，優(yōu)選為固體濃縮物的形式。
9.權(quán)利要求7的組合物，進(jìn)一步包括脂肪酶和淀粉酶，優(yōu)選為固體濃縮物的形式。
10.通過施用治療有效量的與SEQ ID NO1有至少70％同一性的蛋白酶來治療消化病癥、胰腺功能不全、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法。
11.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括施用治療有效量的脂肪酶或淀粉酶。
12.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括施用治療有效量的脂肪酶和淀粉酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及與源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶有關(guān)的蛋白酶(SEQ ID NO1)，可選地與脂酶和/或淀粉酶組合的制藥用途。醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的例子為消化病癥、胰腺外分泌功能不全(PEI)、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的治療。
文檔編號(hào)A61P11/00GK1956728SQ200580016683
公開日2007年5月2日 申請(qǐng)日期2005年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月24日
發(fā)明者艾倫·斯文德森, 斯文德·卡斯加爾德, 金·博爾奇, 莫滕·費(fèi)希爾, 丹·彼得森, 彼得·C·格雷戈里 申請(qǐng)人:諾維信公司