專利名稱：酶的演化和對組合和醫(yī)藥化學(xué)的用途的制作方法
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背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及采用演化的酶酶促合成有機分子的組合文庫領(lǐng)域。本發(fā)明提供了酶文庫，它通過定向演化，能生物催化合成許多有機分子衍生物?？珊Y選該有機分子衍生物文庫，來鑒定活性化合物，如抗生素和其它治療劑，、除草劑和殺蟲劑等。
背景在發(fā)現(xiàn)藥物的過程中，優(yōu)化前導(dǎo)化合物代表了眾多的挑戰(zhàn)之一。前導(dǎo)化合物通常缺乏完全的藥理功能，如高效、選擇性、低毒性、生物利用率等所需的一些藥理性質(zhì)。因此，對于實現(xiàn)具有理想性質(zhì)的完整組合的優(yōu)化藥物常常需要對前導(dǎo)化合物作額外修飾。傳統(tǒng)的衍生方法主要依賴于經(jīng)驗來指導(dǎo)醫(yī)藥化學(xué)師選擇要合成和測試的化學(xué)類似物。選擇一些化合物用于合成，另一些不用于合成。類似的，當(dāng)用組合化學(xué)產(chǎn)生前導(dǎo)化合物的衍生物時，選擇特定的建筑組件來平行合成許多同類物，而其它組件不用于合成。這些選擇通常是根據(jù)對醫(yī)藥化學(xué)的經(jīng)驗作出的，能對可導(dǎo)致改進(jìn)的修飾，能導(dǎo)致新的不良性質(zhì)或惡化現(xiàn)有性質(zhì)的修飾提供指導(dǎo)。然而不幸的是，這些經(jīng)驗大多數(shù)是個別醫(yī)藥化學(xué)師獨有的，沒有完整的描述，僅在許多文獻(xiàn)的章節(jié)片段中提到。
對具有潛在藥用性能的前導(dǎo)化合物的改進(jìn)并不是衍生改變有機分子的唯一感興趣的事情。有機分子具有許多用途，包括例如殺蟲劑、除草劑等。為了獲得對某具體應(yīng)用具有改進(jìn)性質(zhì)的化合物，常常需要產(chǎn)生可供篩選的有機分子衍生物文庫，來鑒定顯示理想特性的那些衍生物。
組合合成方法能提供合成各種各樣前導(dǎo)化合物衍生物的方法，而不需要預(yù)先猜測哪種衍生物可能最理想。人們可同時制備大量不同的衍生物，而不需要各個合成并對其進(jìn)行測試。組合合成不僅可用于前導(dǎo)化合物的衍生，還可用于合成篩選用的化合物，以鑒定作為可能的前導(dǎo)化合物，那些化合物值得進(jìn)一步研究。然而，有機分子衍生物組合物文庫的合成非常有限，因為僅通過化學(xué)方法難于或甚至不可能合成許多種類的有機分子衍生物。
酶對可供鑒定顯示所需性質(zhì)的化合物的化合物文庫的合成，提供了引人注目的方法。酶可在溶液中作用于復(fù)雜分子的混合物，催化這些分子衍生物的合成而不產(chǎn)生副產(chǎn)物。前導(dǎo)化合物衍生的傳統(tǒng)化學(xué)方法通常是非選擇性的，需要多次保護(hù)和去保護(hù)步驟，但是酶促合成不需要這些步驟。而且，酶可在相對溫和，不破壞反應(yīng)產(chǎn)物的條件下起作用。另外，酶可對有機分子，如目前已有的和潛在的前導(dǎo)化合物和其它感興趣的生物活性分子進(jìn)行多種不同類型的修飾。例如，酶可催化在化合物上加上一個基團(tuán)(如酯、酰胺、羧酸、氨基甲酸酯或糖苷鍵等)。酶還可在有機分子上加上新的官能團(tuán)，或可修飾存在于化合物上的現(xiàn)存官能團(tuán)。酶生物催化還可提供某些特別的優(yōu)點，如底物、立體和區(qū)域選擇性。
雖然酶的組合性生物催化作用具有強大的功能，但仍存在顯著的缺點。例如，還不能得到能夠促進(jìn)全部有機分子衍生物(合成)的足夠多種多樣的酶。從一組天然存在的酶中不可能得到對于任何感興趣的具體有機分子具有所需底物、立體和區(qū)域特異性的酶。因此，存在著對能夠產(chǎn)生各種各樣有機分子衍生物的衍生酶的需要。缺乏這些酶限制了用組合生物催化可獲得的有機分子衍生物的數(shù)量和種類。因此，存在著對獲得能催化各種各樣不同有機分子衍生物的衍生酶的方法的需要，以及對這些有機分子衍生物文庫的需要。本發(fā)明滿足了這些和其它需要。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了獲得有機分子衍生物文庫的方法。該方法涉及將一有機分子與重組衍生性酶文庫的一個或多個成員和其它必需的反應(yīng)試劑接觸，形成有機分子衍生物文庫。該衍生性酶能催化如下反應(yīng)a)有機分子上一個或多個官能團(tuán)的修飾；b)在存在于該有機分子上的一個或多個官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)；或c)在該有機分子上引入新的官能團(tuán)。此方法可用于各種各樣的有機分子，包括例如具有藥物、除草劑、殺蟲劑等活性的分子，或在工業(yè)加工中有用的分子。
在一些實施例中，此方法還涉及通過與衍生性酶接觸獲得的衍生物上進(jìn)行一次或多次加成反應(yīng)。因此，最初反應(yīng)的產(chǎn)物作為進(jìn)一步反應(yīng)的中間物。進(jìn)一步反應(yīng)包括例如使有機分子衍生物文庫與第二個重組衍生性酶文庫的一個或多個成員以及其它必需的反應(yīng)試劑接觸，形成另一個有機分子衍生物文庫。另外，可用化學(xué)方法或用其它酶修飾該中間物。
在一些實施例中，可通過(1)重組編碼某衍生性酶的至少第一和第二形式的某核酸(其中第一和第二形式在兩個或多個核苷酸上彼此不同)，產(chǎn)生一重組多核苷酸文庫；和(2)表達(dá)此重組多核苷酸文庫，獲得重組衍生性酶文庫。如果需要，該方法還包括(3)重組至少一種重組多核苷酸(它編碼此重組衍生性酶文庫的一個成員)和編碼某衍生性酶的核酸的另一種形式(它與第一和第二種形式相同或不同)，從而產(chǎn)生另一個重組核酸文庫；(4)表達(dá)該另一個重組多核苷酸文庫，獲得重組衍生性酶的另一個文庫；和(5)如需要，重復(fù)(3)和(4)，直到重組衍生性酶的另一個文庫含有所需數(shù)量的不同重組衍生性酶。
本發(fā)明還提供了獲得能催化所需有機分子衍生物合成的酶的方法。這些方法包括使一有機分子與重組衍生性酶文庫的成員和其它必需的反應(yīng)試劑接觸，形成一有機分子衍生物文庫；鑒定該有機分子衍生物文庫中所需的有機分子衍生物；和鑒定能催化所需有機分子衍生物合成的該重組衍生性酶文庫成員。
本發(fā)明還提供了重組衍生性酶文庫，其中當(dāng)重組衍生性酶與具有一個或多個官能團(tuán)的有機分子接觸時，能催化以下反應(yīng)，例如a)一個或多個官能團(tuán)的修飾；b)在一個或多個官能團(tuán)上加入一個化學(xué)基團(tuán)；或c)引入一新的官能團(tuán)。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供了有機分子衍生物文庫。通過使具有一個或多個官能團(tuán)的有機分子與一重組衍生性酶文庫的多個成員接觸，生物催化性合成該文庫。這些酶能催化如下反應(yīng)例如a)一個或多個官能團(tuán)的修飾；b)在一個或多個官能團(tuán)上加入一個化學(xué)基團(tuán)；或c)引入一新的官能團(tuán)。
附圖簡述


圖1顯示了萬古霉素鹽酸鹽上可能的糖結(jié)合點。
圖2顯示了促生長素抑制素上可能的糖結(jié)合點。
圖3顯示了膽酸上可能的糖結(jié)合點。
圖4顯示了L-甲狀腺素上可能的糖結(jié)合點。
圖5顯示了諾加霉素上可能的糖結(jié)合點。
圖6顯示了丁香醛連氮上可能的糖結(jié)合點。
圖7顯示了阿柔比星上可能的糖結(jié)合點。
圖8顯示了鹽酸羥芐羥麻黃堿上可能的糖結(jié)合點。
圖9顯示了利福霉素上可能的糖結(jié)合點。
圖10顯示了硫酸瑞斯托霉素上可能的糖結(jié)合點。還顯示了骨架上的5個另外的羥基(未用箭頭標(biāo)出)；這些基團(tuán)構(gòu)成了可能的糖結(jié)合點。
圖11顯示了紅霉素A的多步化學(xué)甲基化及其同類物。
圖12顯示了用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)。
圖13顯示了可進(jìn)行改組獲得使用紅霉素及其同類物作為底物的具有6-OMT酶活性的O-甲基轉(zhuǎn)移酶的專一性。
圖14顯示了通過改組獲得使用紅霉素及其同類物作為底物的具有6-OMT酶活性的O-甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列和蛋白質(zhì)序列的相似性。
圖15顯示了鑒定具有新專一性的甲基轉(zhuǎn)移酶的微量滴定板高通量初步篩選。
圖16顯示了采用紅霉素A 6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶生物催化合成甲紅霉素的示意圖。
圖17顯示了甲紅霉素合成酶的二次試驗。590/158對的MS/MS檢測鑒定了大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的甲基化。
圖18顯示了甲紅霉素合成酶的另一二次試驗。硼酸苯酯在中性pH時特異性與順式二醇反應(yīng)。只有甲紅霉素具有能反應(yīng)的11-12-順式二醇，得到834.5離子。
圖19顯示了載體pCKZEBB的基因圖。
發(fā)明詳述定義“衍生性酶”是能在有機分子上催化反應(yīng)的酶。例如，衍生性酶能修飾存在于分子上的官能團(tuán)，在官能團(tuán)上加上一個化學(xué)基團(tuán)，或在有機分子上加上一新的官能團(tuán)。有機分子可包括合成的(包括例如非天然存在的化合物如含鹵素的化合物等)和天然存在的化合物。
“重組衍生性酶”是非天然存在的酶，與天然存在的衍生性酶在序列上至少有一個氨基酸殘基不同。重組衍生性酶包括由多種氨基酸組件組成的衍生性酶，這些組件在天然存在的酶中不連續(xù)。這些組件通常為隨機長度。重組衍生性酶可能是嵌合的，因此其部分序列衍生自至少兩條不同親本酶的序列。嵌合的重組衍生性酶是由含有衍生自至少兩條不同親本基因或親本基因區(qū)段的嵌合基因編碼的。親本基因可任選地編碼一衍生性酶。
本文所用的術(shù)語“文庫”指多種分子的集合，例如重組衍生性酶和有機化合物同類物的集合。本發(fā)明的文庫具有至少兩種不同成員分子，但大小可以不同。通常本發(fā)明的文庫具有至少約5個不同分子，更通常具有至少約10個不同成員分子。本發(fā)明較大的文庫通常具有至少約100個不同成員分子，有時多于約10,000個，甚至多于約100,000個。本發(fā)明非常大的文庫可具有多于1,000,000個成員。
“官能團(tuán)”指一個或一組原子，它限定于具體有機化合物家族的結(jié)構(gòu)并確定其性質(zhì)。官能團(tuán)包括例如鏈烯、炔烴、芳族、鹵素、羥基、醚、酯、醛、酮、羧酸、酰胺、胺等。
“前導(dǎo)化合物”是一種具有所需生物學(xué)或藥物活性，但可能具有其它不需要的特征的原型化合物。例如，前導(dǎo)化合物可能有毒，不溶，具有其它生物活性，具有較差的生物利用率(如吸收、分布、代謝和排泄(即ADME))或較差的生物活性等。
“核酸”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其單鏈或雙鏈形式的多聚物。此術(shù)語包括含有已知核苷酸同類物或修飾的骨架殘基或連接鍵的合成性、天然存在或非天然存在的核酸，其具有與參比核酸相似的結(jié)合性質(zhì)，并以參比核苷酸相類似的方式代謝。這些同類物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酸酰胺、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。
除非另外說明，特定的核酸序列還默認(rèn)包括其保守性修飾變體(如簡并密碼子取代)和互補序列，以及明白說明的序列。術(shù)語“核酸”在本文中與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換使用。
本文中術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，指氨基酸殘基的多聚物。此術(shù)語用于氨基酸多聚物，其中一個或多個氨基酸殘基是對應(yīng)的天然存在氨基酸以及天然存在的氨基酸多聚物的的同類物或模擬物。
術(shù)語“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及功能與天然存在的氨基酸相似的氨基酸同類物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是遺傳密碼子編碼的氨基酸，以及隨后修飾的氨基酸如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸同類物指與天然存在的氨基酸具有相同基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即α碳和一個氫、一個羧基、一個氨基和一個R基團(tuán)結(jié)合(如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。這些同類物具有修飾的R基團(tuán)(如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指具有與氨基酸的通用化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但功能與天然存在的氨基酸相似的化合物。
本文的氨基酸可以用它們一般已知的IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的三字母符號或一字母符號表示。類似的，核苷酸可用它們通常接受的一字母碼表示。
“保守性修飾變體”可同時用于氨基酸和核酸序列。對于具體核酸序列，保守性修飾變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或當(dāng)核酸不編碼氨基酸序列時，指基本相同的序列。具體講可以通過一個或多個所選(或全部)密碼子的第三位用混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代序列來進(jìn)行簡并密碼子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。由于基因密碼子的簡并性，大部分功能相同的核苷酸可編碼任一給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸中某密碼子限定的每一處，可將此密碼子改變成所述的任一對應(yīng)密碼子，而不會改變編碼的多肽。這些核酸變體是“沉默變體”，它們是一種保守性修飾的變體。本文引用的編碼某多肽的每一種核酸序列還包括該核酸的每一種可能的沉默變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得核酸中的每一個密碼子(除了AUG，它和一些生物中的GUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；和TGG，它通常是酪氨酸的唯一密碼子)都可被修飾，以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，在各描述的序列中包括編碼多肽的核酸的每一個沉默變體。
對于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得對核酸進(jìn)行個別取代、缺失或加成，可改變肽、多肽或蛋白質(zhì)的序列、在其序列上加入或缺失一個氨基酸或小比例的氨基酸是一種“保守修飾變體”，其中的改變導(dǎo)致用化學(xué)上類似的氨基酸取代一氨基酸。提供功能上類似的氨基酸的保守性取代表是本領(lǐng)域熟知的。這些保守性修飾變體補充但不排除本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因。
本文所用的術(shù)語“改組”表示不相同序列之間的重組，在一些實施例中改組可包括通過同源重組或通過非同源重組，例如通過cre/lox和flp/frt系統(tǒng)進(jìn)行交換。改組可使用各種不同形式，包括例如體外和體內(nèi)改組形式、硅內(nèi)(in silico)改組形式、利用雙鏈或單鏈模板的改組形式、基于引物的改組形式、基于核酸片段化的改組形式、寡核苷酸介導(dǎo)的改組形式，所有這些都基于不相同序列之間的重組活動，以及其它類似的基于重組的形式將在下文中更詳細(xì)的描述或引用。
優(yōu)選例描述本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生化合物，特別是有機分子的組合文庫的重組衍生性酶文庫。還提供了用該重組衍生性酶文庫獲得的有機分子衍生物文庫。此有機分子衍生物文庫可用于例如鑒定具有理想生物活性的那些衍生物，因此適用于作為藥用或其它用途的前導(dǎo)化合物的測試，和用于建立先前已鑒定的前導(dǎo)化合物的衍生物組合文庫，該前導(dǎo)化合物用于測試改進(jìn)的藥物學(xué)或其它參數(shù)。這些化合物通常是有機分子，包括合成分子(包括例如非天然存在的化合物)和天然存在的化合物例如抗生素。
本發(fā)明提供的重組衍生性酶文庫對獲得有機分子衍生物文庫提供了優(yōu)于現(xiàn)有方法的幾個優(yōu)點。例如，此重組文庫將含有顯示彼此催化特性不同的酶，催化特征包括催化速率和催化常數(shù)、立體、區(qū)域和對映體特異性、底物選擇性的多樣性、產(chǎn)物抑制、在用于生物催化合成的溶劑中的穩(wěn)定性、在化學(xué)加工中的穩(wěn)定性等。所產(chǎn)生的一群不同酶增加了通過生物催化反應(yīng)產(chǎn)生的不同化合物的數(shù)量。當(dāng)用一種酶與一有機分子和一化學(xué)基團(tuán)供體作生物催化時，通常僅產(chǎn)生一種衍生物。相反，一群重組酶中包括的酶可能催化與原來的酶不同的反應(yīng)，從而能產(chǎn)生不同產(chǎn)物，即使開始時采用原來的酶的同一底物。而且用酶合成感興趣的有機化合物大大促進(jìn)了合成反應(yīng)的規(guī)模。
在優(yōu)選實施例中，用DNA改組或遞歸重組的其它方法來產(chǎn)生重組酶文庫。DNA改組已證明在改進(jìn)生物催化劑的已知活性水平上非常有效。該技術(shù)的其他價值在于能夠產(chǎn)生先前在野生型酶中未知的催化活性。因此，該技術(shù)提供了一種生物催化生成的可靠方法，減少或甚至避免了靶向反應(yīng)對獲得天然存在的生物催化劑的需要。例如，一類相關(guān)基因的DNA改組產(chǎn)生了具有不同生理性質(zhì)的功能多樣的基因文庫，該文庫包括的序列比一特定蛋白質(zhì)天然可發(fā)現(xiàn)的序列范圍更復(fù)雜。由于這些酶文庫的新成員從未在生物中經(jīng)歷選擇性壓力，它們沒有偏向，可對其篩選是否具有天然樣品中很少或不存在的新活性。因此人們可建立多樣和復(fù)雜的能催化一系列重要化學(xué)物質(zhì)的酶文庫。例如，酶可催化存在于有機分子上的官能團(tuán)的修飾，在官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)(如?；?、糖基化、和甲基化)，和在有機分子中引入新的官能團(tuán)(如通過氧化引入羥基，通過還原引入雙鍵等)。可用此酶文庫直接從底物混合物開始合成一批產(chǎn)物，或從一組確定的底物開始合成一特定化合物。另外，可用該重組酶文庫的一個成員通過使其與底物混合物的諸成員接觸，合成眾多化合物的混合物。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，可用一組確定的底物測試該重組衍生性酶文庫的每一個成員，來鑒定具有新的和有用的底物選擇性或其它有用特征的酶。
然后，可篩選這樣合成的有機分子衍生物，來鑒定那些具有所需特征的有機分子，或可通過一個或多個其他的化學(xué)或酶促反應(yīng)進(jìn)一步修飾。人們還可篩選該酶文庫來鑒定這些具有新的和有用的底物選擇性或其它理想特征的酶，并用這些酶產(chǎn)生理想的化合物。
用本發(fā)明的方法獲得的重組酶可在體外使用，或由能進(jìn)行生物催化的微生物細(xì)胞表達(dá)。在一些實施例中，改進(jìn)這些微生物使其表達(dá)一種或多種衍生性酶，用于有效地生物催化來制造衍生的產(chǎn)物。例如，該微生物可含有一種或多種，編碼改進(jìn)的?；D(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、氧化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶或其它生物催化酶的重組多核苷酸，然后由微生物細(xì)胞表達(dá)?？蓪⑦@些多核苷酸引入能天然產(chǎn)生感興趣的起始底物的生物。例如，可將編碼某重組衍生性酶的多核苷酸引入能天然產(chǎn)生或通過基因工程改造能產(chǎn)生聚酮或其它抗生素的生物體中。因此，編碼本發(fā)明的重組衍生性酶的重組多核苷酸可用于體內(nèi)衍生預(yù)先制備了骨架的有機化合物，在能生物合成此有機分子骨架的生物體體內(nèi)衍生這些有機化合物；和體外用于衍生預(yù)先制備的化合物。
A.重組文庫的建立本發(fā)明在一些實施例中涉及建立多核苷酸的重組文庫，然后篩選此文庫以鑒定編碼顯示所需性質(zhì)的酶或其它多肽的那些文庫成員，所需性質(zhì)包括例如增強的酶活性、立體特異性、區(qū)域特異性和對映特異性、對抑制劑易感性降低、加工穩(wěn)定性(如溶劑穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等)。可用多種方法之一建立該重組文庫，包括本文所描述的這些。例如，可獲得各種核酸改組方案，對此本領(lǐng)域有完全描述?？蓪⑾铝谐霭嫖锩枋龅母鞣N這樣的程序和/或方法摻入這些程序中，以及其它多樣性產(chǎn)生方案中Stemmer等(1999)“用于靶向和其它臨床性能的病毒分子育種，腫瘤靶向”41-4；Nesset等(1999)“枯草桿菌蛋白酶亞基因組序列的DNA改組”NatureBiotechnology 17893-896；Chang等(1999)“用DNA家族改組演化細(xì)胞因子”NatureBiotechnology 17793-797；Minshull和Stemmer(1999)“分子育種的蛋白質(zhì)演化”Current Opioion in Chemical Biology 3284-290；Christians等(1999)“用DNA家族改組對用于AZT磷酸化的胸腺嘧啶激酶直接演化”Nature Biotechnology17259-264；Crameri等(1998)“對多個物種的基因家族的DNA改組加速了定向演化”Nature 391288-291；Crameri等“DNA改組對砷酸鹽解毒途徑的分子演化”Nature Biotechnology 15436-438；Zhang等(1997)“通過DNA改組和篩選從半乳糖苷酶直接演化成有效的巖藻糖酶”Proceedings of the National Academy ofScience，U.S.A.944504-4509；Patten等(1997)“DNA改組在藥物和疫苗中的應(yīng)用”Current Opinion in Biotechnology 8724-733；Crameri等(1996)“通過DNA改組構(gòu)建和演化抗體-噬菌體文庫”Nature Medicine 2100-103；Crameri等(1996)“通過采用DNA改組的分子演化改進(jìn)綠色熒光蛋白”Nature Biotechnology14315-319；Gates等(1996)“通過在乳糖抑制蛋白‘頭部二聚體’上展示從肽文庫中親和選擇分離配體”Journal of Molecular Biology 255373-386；Stemmer(1996)“性PCR和集合PCR”于The Encyclopedia of MolecularBiology.VCH Publishers，New York，447-457頁；Crameri和Stemmer(1995)“組合多基因盒誘變建立了所有突變體和野生型基因盒的置換圖”Biotechniques18194-195；Stemmer等(1995)“一步裝配一個基因和全質(zhì)粒形成大量寡聚脫氧核糖核苷酸”Gene 16449-53；Stemmer(1995)“分子計算的演化”Science2701510；Stemmer(1995)“搜索序列空間”Bio/Technology 13549-553；Stemmer(1994)“體外蛋白質(zhì)通過DNA改組快速演化”Nature 370389-391；和Stemmer(1994)“隨機片段化和重新裝配的DNA改組分子演化的體外重組”Proceedings of National Acadamey of Sciences，U.S.A.9110747-10751。
發(fā)明人及其同事在美國專利中發(fā)現(xiàn)了其它關(guān)于DNA改組方法的詳細(xì)內(nèi)容，包括Stemmer(1997年2月25日)的美國專利5,605,793，“體外重組的方法；”Stemmer等(1998年9月22日)的美國專利5,811,238“通過重復(fù)選擇和重組產(chǎn)生具有所需特征的多核苷酸的方法；”Stemmer等(1998年11月3日)的美國專利5,830,721“通過隨機片段化和重新裝配進(jìn)行DNA誘變；”Stemmer等(1998年11月10日)的美國專利5,834,252“末端互補聚合酶反應(yīng)”和Minshull等(1998年11月17日)的美國專利5,837,458“細(xì)胞和代謝工程的方法和組合物”。
另外，可在各種PCT和外國專利申請出版物中找到DNA改組方案的細(xì)節(jié)和形式，包括Stemmer和Crameri“通過隨機片段化和重新裝配進(jìn)行DNA誘變”WO95/22625；Stemmer和Lipschutz“末端互補聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”WO96/33207；Stemmer和Crameri“用重復(fù)選擇和重組產(chǎn)生具有所需特征的多核苷酸的方法”WO97/0078；Minshull和Stemmer，“細(xì)胞和代謝工程的方法和組合物”WO97/35966；Punnonen等，“基因疫苗載體的靶向”WO99/41402；Punnonen等“抗原文庫免疫”WO99/41383；Punnonen等“基因疫苗載體工程”WO99/41369；Punnonen等“基因疫苗免疫調(diào)節(jié)性能的優(yōu)化”WO99/41368；Stemmer和Crameri，“通過隨機片段化和重新裝配進(jìn)行DNA誘變”EP 0934999；Stemmer“通過重復(fù)序列重組進(jìn)化細(xì)胞的DNA攝取”EP0932670；Stemmer等“通過病毒基因組改組對病毒嗜性和宿主范圍進(jìn)行改進(jìn)”WO9923107；Apt等，“人乳頭瘤病毒載體”WO9921979；Del Cardayre等，“重復(fù)序列重組的全細(xì)胞和生物進(jìn)化”WO9831837；Patten和Stemmer，“多肽工程的方法和組合物”WO9827230；Stemmer等，“通過重復(fù)序列改組和選擇優(yōu)化基因治療的方法”WO9813487；Arnold等，“用隨機或限定引物對多核苷酸序列重組”WO9842832；Arnold等“建立多核苷酸和多肽序列的方法”WO9929902；Vind，“構(gòu)建DNA文庫的體外方法”WO9841653；和Borchert等，“用DNA改組構(gòu)建文庫的方法”，WO9841622。
一些美國專利申請?zhí)峁┝岁P(guān)于DNA改組和相關(guān)技術(shù)的其他細(xì)節(jié)，以及其它多樣性生成方法，包括Patten等1998年9月29日(USSN 60/102,362)，1999年1月29日(USSN 60/117,729)和1999年9月28日(USSN09/407,800)，(代理人卷宗號20-28520US/PCT)提交的“密碼子改變的基因的改組”；del Cardayre等1998年7月15日(USSN 09/166,188)和1999年7月15日(USSN 09/354,922)提交的“重復(fù)序列重組的全細(xì)胞和生物進(jìn)化”；Crameri等1999年2月5日(USSN 60/118,813)和1999年6月24日(USSN 60/141,049)和1999年9月28日(USSN 09/408,392，代理人卷宗號02-29620US)提交的“寡核苷酸介導(dǎo)的核酸重組”；和Welch等1999年9月28日(USSN 09/408,393，代理人卷宗號02-010070US)提交的“基于密碼子的寡核苷酸合成在合成改組中的用途”；Selifonov和Stemmer在1999年2月5日(USSN 60/118854)和1999年10月12日(USSN 09/416,375)提交的“制備具有所需特征的特征串、多核苷酸和多肽的方法”。在Patten等，WO9827230“多肽工程的方法和組合物”；Affholter2000年3月2日提交的USSN 60/186,482“單鏈核酸模板介導(dǎo)的重組和核酸片段分離”；“產(chǎn)生高度多樣的文庫的方法”，WO0000632；和“獲得體外重組的多核苷酸序列，序列庫和產(chǎn)生序列的方法”，WO0009679中描述了使用單鏈模板的改組形式。
作為前述出版物、專利、出版的申請以及美國專利申請的綜述，可用許多已建立的重組方法進(jìn)行核酸改組，來提供具有所需性質(zhì)的新核酸，這些方法可以和其它多樣性生成方法聯(lián)合應(yīng)用。
簡單說，幾種不同類型的重組方法可用于本發(fā)明，在上述參考文獻(xiàn)中已列出。第一，核酸可以在體外用任何上述參考文獻(xiàn)中所討論的技術(shù)(如DNA酶消化核酸，然后連接和/或PCR重新裝配核酸)重組。第二，核酸可以在體內(nèi)重復(fù)重組，如通過在細(xì)胞內(nèi)的核酸之間發(fā)生重組。第三，可采用全基因組重組方法，其中細(xì)胞或其它生物體的全基因組進(jìn)行了重組，可任選的包括用所需的文庫成分摻入基因組重組混合物。第四，可采用合成重組方法，其中合成對應(yīng)于感興趣的靶的寡核苷酸，在PCR或連接反應(yīng)中重新裝配，包括對應(yīng)于一個以上親本核酸的寡核苷酸，從而產(chǎn)生新的重組核酸?？捎脴?biāo)準(zhǔn)核苷摻入法制備寡核苷酸，或用三核苷酸合成法制備。第五，可用硅內(nèi)重組法，其中在計算機中使用遺傳算法來重組對應(yīng)于核酸同類物(或甚至非同源序列)的序列串。可將產(chǎn)生的重組序列串任選的通過核酸合成轉(zhuǎn)變成對應(yīng)于該重組序列的核酸，如與寡核苷酸合成/基因重新裝配技術(shù)協(xié)同?？梢灾貜?fù)方式進(jìn)行前述一般重組形式之一種，來產(chǎn)生更多樣的重組核酸組。第六，可采用實現(xiàn)天然多樣性的方法，例如通過多樣性核酸或核酸片段與單鏈模板雜交，隨后多聚化和/或連接以再產(chǎn)生全長序列，然后任選地降解模板，回收產(chǎn)生的修飾的核酸。
為了說明，在本發(fā)明的一個實施例中，用于制備編碼重組衍生性酶的多核苷酸的改組方法包括在一組變種多核苷酸的重疊區(qū)段上引發(fā)多核苷酸擴增，條件是一個區(qū)段作為另一個區(qū)段的延伸模板，產(chǎn)生一組重組多核苷酸；和選擇或篩選具有所需特性的重組多核苷酸。
重疊區(qū)段可通過各種方法制備，這些方法如本文或本文引用的參考文獻(xiàn)所述，例如化學(xué)合成、切割或片段化、多核苷酸群的擴增和其它本領(lǐng)域熟知的方法。
在另一個實施例中，用于產(chǎn)生重組衍生性酶的改組方法包括雜交至少兩組核酸，其中第一組核酸含有單鏈核酸模板，第二組核酸含有至少一組核酸片段；和延長和連接雜交的核酸片段之間的序列缺口，產(chǎn)生至少基本全長的嵌合性核酸序列，該序列對應(yīng)于此單鏈核酸模板，從而重組了該組核酸片段，和可任選的使至少基本全長的此嵌合性核酸序列與單鏈核酸模板變性；和用至少一種分離技術(shù)從單鏈核酸模板上分離至少基本全長的此嵌合性核酸序列；通過核酸消化或物理片段法，片段化分離的至少基本全長的此嵌合性核酸序列，以提供嵌合性核苷酸片段。
上述參考文獻(xiàn)提供了這些和其它基本的重組方式，以及許多對這些方式的改進(jìn)。不論采用什么改組方式，都可重組本發(fā)明的核酸(彼此重組或與相關(guān)的(或甚至不相關(guān)的)重組)產(chǎn)生一組多樣性的重組核酸，包括例如同源核苷酸組。
重組后，可選擇產(chǎn)生的任何核酸有無所需活性。在本發(fā)明中，這可能包括用任何本領(lǐng)域的試驗以自動化方式測試和鑒定任何可檢測的活性?？捎萌魏慰傻玫降脑囼灉y試各種相關(guān)(或甚至不相關(guān))的性能。根據(jù)本文描述的本發(fā)明，這些方法是自動化的。
DNA誘變和改組提供了產(chǎn)生(用于具有改進(jìn)特性的蛋白質(zhì)、途徑、細(xì)胞和生物體工程)多樣性的強大而且廣泛適用的方法。除了上述基本方式，有時候需要將改組方法與其它技術(shù)聯(lián)合以產(chǎn)生多樣性。許多產(chǎn)生多樣性的方法可與改組法聯(lián)合(或分別)實施，在本發(fā)明的系統(tǒng)中篩選結(jié)果(即多樣核酸群)。用本領(lǐng)域已知的誘變法可誘導(dǎo)額外的多樣性。
誘變方法可包括例如出版號WO98/42727中描述的那些；定點誘變(Ling等(1997)“DNA誘變的方法綜述”于Anal Biochem.254(2)157-78；Dale等(1996)“用硫代磷酸酯法針對寡核苷酸隨機誘變”Methods Mol Biol.57369-74；Smith(1985)“體內(nèi)誘變”Ann.Rev.Genet.19，423-462；Botstein和Shortle(1985)“體內(nèi)誘變的策略和應(yīng)用”Science 229，1193-1201；Carter(1986)“定點誘變”Biochem J.237，1-7；Kunkel(1987)“寡核苷酸定向誘變的效果”Nucleic Acids&Molecular Biology)Eckstein，F(xiàn).和Lilley，D.M.J.編SpringerVerlag，Berlin)；采用含有模板的尿嘧啶誘變(Kunkel(1985)“不經(jīng)表型選擇快速和有效的位點專一性誘變”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，488-492；Kunkel，T.A.，Roberts，J.D.&Zakour，R.A.(1987)“不經(jīng)表型選擇快速和有效的位點專一性誘變”Methods in Enzymol.154，367-382；Bass，S.，V.Sorrels和P.Youderian(1988)“具有新DNA結(jié)合專一性的突變Trp阻遏蛋白”Science 242240-245)；寡核苷酸定向誘變(對于綜述參見Smith，Ann.Rev.Genet.19423-462(1985)；Botstein和Shortle，Science 2291193-1201(1985)；Carter，Biochem.J.2371-7(1986)；Kunkel，“寡核苷酸定向誘變的效果”于Nucleic Acids&Molecular Biology，Eckstein和Lilley編，Springer Verlag，Berlin(1987))；寡核苷酸定向的誘變(Methods in Enzymol.100468-500(1983)，和Methods inEnzymol.154329-350(1987)；Zoller&Smith(1982)“采用M13-衍生的載體寡核苷酸定向誘變在任一DNA片段中產(chǎn)生點突變的有效和通用方法”Nucleic AcidsRes.10，6487-6500，Zoller&Smith(1983)“DNA片段克隆入M13載體的寡核苷酸定向誘變”Methods in Enzymol.100，468-500；Zoller&Smith(1987)“寡核苷酸定向的誘變一種采用兩條寡核苷酸引物和單鏈DNA模板的簡單方法”，Methods inEnzymol.154，329-350)；硫代磷酸酯修飾的DNA誘變(Taylor等(1985)“在限制性酶反應(yīng)中用硫代磷酸酯修飾的DNA制備帶缺口的DNA”Nucl.Acids.Res.138749-8764；Taylor等(1985)“用硫代磷酸酯修飾的DNA以高頻率快速產(chǎn)生寡核苷酸定向突變”Nucl.Acids.Res.138765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein(1986)“硫代磷酸酯基團(tuán)對限制性內(nèi)切酶Nci I的抑制及其在寡核苷酸定向誘變中的應(yīng)用”Nucl.Acids.Res.149679-9698；Sayers等(1988)，Nucl.Acids.Res.“基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向誘變中的Y-T外切酶”16791-802；Sayers等(1988)“通過在溴乙錠存在下與限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，鏈專一性切割含有硫代磷酸酯的DNA”Nucl.Acids.Res.16803-814)；采用含尿嘧啶的模板進(jìn)行誘變(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492(1985)和Kunkel等，Methodsin Enzymol.154367-382))；采用缺口雙鏈體DNA進(jìn)行誘變(Kramer等“寡核苷酸定向突變構(gòu)建物的缺口雙鏈體DNA方法”Nucl.Acids.Res.129441-9456(1984)；Kramer和Fritz，Methods in Enzymol.“通過缺口雙鏈體DNA進(jìn)行突變體的寡核苷酸定向構(gòu)建”154350-367(1987)；Kramer等，Nucl.Acids.Res.167207(1988)；Fritz等(1988)“突變的寡核苷酸定向構(gòu)建體外無酶促反應(yīng)的缺口雙鏈體DNA法”Nucl.Acids.Res.166987-6999(1988)采用缺口雙鏈體DNA的誘變；Kramer，W.，Ohmayer，A.&Fritz，H.-J.(1988)“在缺口雙鏈體DNA方法中改進(jìn)的體外酶促反應(yīng)實現(xiàn)寡核苷酸定向構(gòu)建突變體”Nucl.Acids.Res.16，7207；和Bass，S.，V.Sorrels和P.Youderian(1988)“具有新DNA結(jié)合專一性的突變Trp阻遏蛋白”Science，242240-245)。
其它合適方法包括點錯配修復(fù)(Kramer等(1984)“點錯配修復(fù)”Cell38879-887(1984))，采用修復(fù)缺陷的宿主株進(jìn)行誘變(Carter等(1985)，“采用M13載體的改進(jìn)的寡核苷酸定點誘變”Nucl.Acids.Res.134431-4443(1985)；Carter(1987)“采用M13載體的改進(jìn)寡核苷酸定向的誘變”Methods in Enzymol.154382-403)，缺失誘變(Eghtedarzadeh和Henikoff(1986)“用寡核苷酸產(chǎn)生大缺失”Nucl.Acids.Res.145115)，限制性選擇和限制性選擇與限制性純化(Wells等(1986)“氫鍵形成在穩(wěn)定枯草桿菌蛋白轉(zhuǎn)換期中的重要性”Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317415-423)，總基因合成的誘變(Nambiar等(1984)“編碼核糖核酸酶S蛋白的基因的全部合成和克隆”Science 2231299-1301；Sakamar和Khorana(1988)“牛桿狀體外側(cè)區(qū)段鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(轉(zhuǎn)導(dǎo)素)亞單位的基因的全部合成和表達(dá)”Nucl.Acids.Res.146361-6372；Wells等“基因盒誘變在限定位點產(chǎn)生多重突變的有效方法”Gene 34315-323(1985)；和Grundstrm等(1985)“微量“鳥槍”基因合成的寡核苷酸定向誘變”Nucl.Acids.Res.133305-3316)，雙鏈損傷的修復(fù)(Band aid)(Mandecki(1986)“大腸桿菌質(zhì)粒中寡核苷酸定向的雙鏈損傷的修復(fù)位點專一性誘變位點的方法”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 837177-7181)?？稍贛ethods in Enzymol.，154卷中找到上述方法的許多其他細(xì)節(jié)，此書也是各種誘變方法疑難解答的有用對照。
誘變試劑盒是商品可得到的。例如，試劑盒可購自Stratagene(如QuickChange定點誘變試劑盒；Chameleon雙鏈、定點誘變試劑盒)，Bio/CanScientific，Bio-Rad(如采用上述Kunkel法)，Boehringer Mannheim Corp.Clonetch Laboratories，DNA Technologies，Epicentre Technologies(如5prime3prime試劑盒)；Genpak Inc，Lemargo Inc，Life Technologies(Gibco BRL)，New England Biolabs.Pharmacia Biotech，Promega Corp.QuantumBiotechnologies，Amersham International plc(如采用上述Eckstein法)，和Anglian Biotechnology Ltd(如采用上述Carter/Winter法)。
另外，可使用任何所述的改組技術(shù)聯(lián)合在基因組(如細(xì)菌基因組)中引入額外多樣性的方法。例如，已提出了能產(chǎn)生適合轉(zhuǎn)化入各種物種(包括大腸桿菌和枯草桿菌)的核酸多聚物的技術(shù)(見例如，Schellenberger美國專利號5,756,316)。當(dāng)這些多聚物含有彼此不同的基因(如衍生自天然多樣性或通過定點誘變、易錯PCR、通過突變細(xì)菌菌株傳代等)，轉(zhuǎn)化入合適的宿主時，引入DNA改組的其他核酸多樣性來源。轉(zhuǎn)化入宿主的多聚物特別適用于作為體內(nèi)改組方案的底物。另外，可將共同具有部分序列類似區(qū)域的多核苷酸重復(fù)性轉(zhuǎn)化入一宿主，由該宿主細(xì)胞體內(nèi)重組?？捎秒S后的細(xì)胞分裂周期產(chǎn)生文庫，該文庫的成員各含有一個同源性單體群或合并的核酸。另外，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)回收此單體核酸，并以任何所述的改組方式重組。
還提出了使用鏈終止法的改組方式(見例如美國專利號5,965,408)。在該方法中，合并對應(yīng)于一個或多個共同具有序列相似性區(qū)域的基因的雙鏈DNA，并使其在存在或不存在對該基因特異性的引物條件下變性。然后退火此單鏈多核苷酸并在聚合酶和鏈終止劑(如紫外線、γ或X-射線輻照；溴乙錠或其它插入物；DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，如單鏈結(jié)合蛋白，轉(zhuǎn)錄激活因子或組蛋白；多環(huán)芳烴；三價鉻或三價鉻鹽；或快速熱循環(huán)介導(dǎo)的縮短聚合等)存在下溫育，產(chǎn)生部分雙鏈體分子。然后變性含有部分延伸鏈的該部分雙鏈體分子，在隨后的復(fù)制或部分復(fù)制循環(huán)中重新退火，產(chǎn)生共同具有不同程度序列相似性的多核苷酸，其對DNA分子起始群而言是嵌合體?？扇芜x的，可在此過程的一個或多個階段擴增這些產(chǎn)物或這些產(chǎn)物的合并物。上述鏈終止方法產(chǎn)生的多核苷酸是以所述方式進(jìn)一步DNA改組的合適底物。
可通過非同源性改組法(如上述出版物和申請中所述，可以是同源性或非同源性，取決于精確方式)進(jìn)一步增加多樣性。例如，Ostermeier等(1999)“得到不依賴于DNA同源性的雜交酶的組合方法”Nature Biotechnol.171205所述的產(chǎn)生雜交酶的增量截短法(ITCHY)可用于產(chǎn)生改組文庫，此文庫可任選的作為一輪或多輪體外或體內(nèi)改組法的底物，另見Ostermeier等(1999)“增量截短的組合蛋白質(zhì)工程”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 963562-3567；Ostermeier等(1999)“作為新生物催化工程策略的增量截短”Biologlcal and Medical Chmiestry，72139-2144。
已描述了產(chǎn)生多物種表達(dá)文庫的方法(如美國專利號5,783,431；5,824,485)并提出了它用于鑒定感興趣的蛋白質(zhì)活性的用途(美國專利5,958,672)。多物種表達(dá)文庫一般是含有多個物種或品系的cDNA或基因組序列，與合適的調(diào)控序列在表達(dá)盒中可操縱性連接的文庫。cDNA和/或基因組序列可任選的隨機連接，進(jìn)一步增加多樣性。載體可以是適合在一種以上物種的宿主有機體內(nèi)(如細(xì)菌菌種、真核細(xì)胞)轉(zhuǎn)化和表達(dá)的穿梭載體。在某些情況下，通過預(yù)先選擇編碼感興趣的蛋白質(zhì)，或與感興趣的基因雜交的序列，使此文庫具有偏向。可提供任何這樣的文庫作為本文所述改組方法的底物。
在某些應(yīng)用中，需要在改組前預(yù)選或預(yù)篩文庫(如擴增的文庫、基因組文庫、cDNA文庫、標(biāo)準(zhǔn)化文庫等)或其它底物核酸，或使底物偏向編碼功能性產(chǎn)物的核酸(改組程序也可能獨立的具有這些作用)。例如，就抗體工程而言，可以在DNA改組之前通過任何描述的方法，將改組過程通過利用體內(nèi)重組事件，偏向具有功能性抗原結(jié)合位點的抗體。例如，在DNA改組前可根據(jù)任何本文所描述的方法擴增衍生自B細(xì)胞cDNA文庫的重組CDR，將其裝配在框架區(qū)中(如Jirholt等(1998)“探索序列空間將體內(nèi)形成的互補決定區(qū)改組到主框架中”Gene 215417)。
文庫可偏向編碼具有所需酶活性的蛋白質(zhì)的核酸。例如，從文庫鑒定到一顯示特定活性的克隆后，可用任何能引入DNA改變的已知方法(包括但不限于DNA改組)誘變此克隆。然后篩選含有該誘變同源物的文庫中有無所需的活性，它可以與最初限定的活性相同或不同。在美國專利號5,939,250中提出了該過程的一個例子?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法鑒定所需活性。例如WO99/10539提出可通過將基因文庫提取物與從代謝豐富的細(xì)胞中獲得的成分組合，并鑒定顯示所需活性的組合，來篩選基因文庫。還提出(如WO98/58085)可通過在文庫樣品中插入生物活性底物，來鑒定具有所需活性的克隆，并用熒光分析儀(如流式細(xì)胞計數(shù)裝置，CCD，熒光計或分光光度計)檢測對應(yīng)于具有所需活性的產(chǎn)物的生物活性熒光。
還可將文庫偏向具有特定特征(如與所選核酸探針雜交)的核酸。例如，專利申請WO99/10539提出了可從基因組DNA序列中以下列方法鑒定出編碼所需活性(如酶活性，例如脂肪酶、酯酶、蛋白酶、糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶、激酶、加氧酶、過氧化酶、水解酶、水化酶、腈水解酶、轉(zhuǎn)胺酶、氨化酶或?；?的多核苷酸。使來自一群基因組DNA的單鏈DNA分子與偶聯(lián)了配體的探針雜交。此基因組DNA可衍生自培養(yǎng)或非培養(yǎng)的微生物，或來自環(huán)境樣品。另外，此基因組DNA可衍生自多細(xì)胞生物，或衍生自該多細(xì)胞生物的組織。
可從捕獲中使用的雜交探針預(yù)先或不預(yù)先從捕獲介質(zhì)上釋放，或通過各種各樣本領(lǐng)域已知的其它策略直接進(jìn)行第二鏈合成，。另外，不經(jīng)進(jìn)一步克隆可片段化分離的單鏈基因組DNA群，直接用于使用單鏈模板的改組方式。在例如WO98/27239“多肽工程的方法和組合物”，Patten等；Affholter，2000年3月2日提交的USSN 60/186,482“單鏈核酸模板介導(dǎo)的重組和核酸片段分離”；WO 0000632“產(chǎn)生高度多樣性文庫的方法”；和WO 0009679“獲得體外重組的多核苷酸序列庫的方法和得到的序列”中描述了一些單鏈模板改組方式。在一個這樣的方法中，將此片段群衍生的基因組文庫與對應(yīng)于相對鏈的部分或通常接近全長的ssDNA或RNA一起退火。該群的復(fù)雜嵌合基因的裝配是通過核酸酶去除非雜交的片段末端，聚合填補這些片段之間的缺口，隨后單鏈連接所介導(dǎo)的。可用消化(如果是RNA或者含尿嘧啶)、在變性條件下磁分離(如果以進(jìn)行這種分離的方式標(biāo)記)和其它可行的分離/純化方法除去親本鏈。另外，親本鏈可任選的與嵌合鏈共同純化，并在隨后的篩選和加工步驟中除去。
在一常規(guī)方法中，將單鏈分子轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA(dsDNA)，特dsDNA分子通過配體介導(dǎo)的結(jié)合與固態(tài)載體結(jié)合。分離未結(jié)合的DNA后，將所選DNA分子從載體上釋放下來，并引入合適的宿主細(xì)胞中，產(chǎn)生富含能與探針雜交的序列的文庫。用該方法產(chǎn)生的文庫提供了采用本文所述的改組反應(yīng)進(jìn)一步改組所需的底物。
還應(yīng)理解任何適合改組前能豐富文庫的上述技術(shù)，可用于篩選用該DNA改組方法產(chǎn)生的產(chǎn)物。
在一個優(yōu)選例中，用DNA改組制備了重組文庫。可用改組和篩選或選擇“演化”各基因、全質(zhì)?；虿《?、多基因簇、或甚至整個基因組(Stemmer(1995)Bio/technology 13549-553)?？蛇M(jìn)行重復(fù)的重組和篩選/選擇循環(huán)進(jìn)一步演化感興趣的核酸。這些技術(shù)不需要常規(guī)多肽工程方法所要求的廣泛分析和計算。改組能在最少數(shù)量的篩選/選擇循環(huán)中重組大量的突變，此與傳統(tǒng)的配對重組相反。因此，本文描述的序列重組技術(shù)提供了特別的優(yōu)點，在于它們提供了在這些任一或所有突變之間的重組，從而提供了一種非常迅速的方法探查不同組合的突變可能影響到所需結(jié)果的方式。然而在一些情況下，結(jié)構(gòu)和/或功能信息是可得到的，雖然不是序列重組需要的，但提供了修改此技術(shù)的機會。
這些改組方法通常使用至少兩種起始核酸底物的變種形式。候選底物的變種形式可能顯示彼此基本序列或二級結(jié)構(gòu)有相似性，但它們應(yīng)該至少在兩個位置是不同的。兩形式之間的最初多樣性可能是天然變異的結(jié)果，例如可從一種生物(包括地理變體)的不同個體或品系或同一生物構(gòu)建的相關(guān)序列(如等位變體)獲得此不同變異形式(同源物)。另外，可通過例如易錯轉(zhuǎn)錄(例如易錯PCR或采用缺乏第一變種形式的校閱活性的聚合酶(見例如Liao(1990)Gene 88107-111))產(chǎn)生第二變種形式，或通過在突變品系中復(fù)制第一形式，或通過DNase片段的突變加工和用易錯聚合酶重新裝配引入起始多樣性。底物之間的起始多樣性在重復(fù)序列重組的后續(xù)步驟中大大增加。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，采用核酸“家族”的改組來建立重組多核苷酸的文庫。當(dāng)核酸家族被改組時，編碼不同品系、物種或基因家族或其部分的核酸可用作該核酸的不同形式。由于基因組提供了增量的序列信息，用設(shè)計引物直接擴增同源物更加可能。例如，如果有幾個物種的脂肪酶或蛋白酶基因序列，可設(shè)計引物來擴增同源物。然后可對得到的核酸區(qū)段進(jìn)行改組。
在本發(fā)明的實施中不難使用本文描述的所有改組方法。例如，在密碼子修飾改組(在Patten等1998年9月29日提交的“密碼子改變的基因的改組”(USSN60/102,362)、1999年1月29日提交的USSN 60/117,729和1999年9月28日提交的USSN 09/102,362)中，合成了其中編碼多肽的密碼子被改變的核酸，使得可能在該核酸的隨后突變中得到完全不同的突變區(qū)域。這增加了改組方案的起始核酸序列多樣性，改變了強迫演化程序的速度和結(jié)果?？刹捎妹艽a子修飾程序來修飾本文任何編碼衍生性酶的核酸，例如在進(jìn)行DNA改組之前，或可將密碼子修飾方法與下文所述的寡核苷酸改組程序聯(lián)用。
密碼子修飾改組涉及編碼第一多肽序列或其部分的第一核酸序列。然后選擇多條密碼子改變的核酸序列，其每一條都編碼第一多肽的部分或全部，或修飾的或相關(guān)的多肽(如可在一生物學(xué)試驗中選擇密碼子改變的核酸文庫，該試驗?zāi)茏R別文庫成分或活性)，重組多條密碼子改變的核酸序列，產(chǎn)生靶密碼子改變的第二蛋白質(zhì)的核酸編碼部分或全部。然后篩選靶密碼子改變的核酸是否有可檢測的功能或結(jié)構(gòu)性質(zhì)，可任選的包括與第一多肽和/或相關(guān)多肽的性質(zhì)比較。該篩選的目的是鑒定具有與第一種多肽或相關(guān)多肽結(jié)構(gòu)或功能特性相等或比它卓越的多肽?；旧峡稍谒璧娜魏畏椒ㄖ惺褂镁幋a這樣的多肽的核酸，包括將靶密碼子改變的核酸引入細(xì)胞、載體、病毒(如作為疫苗或免疫原性組合物的成分)、轉(zhuǎn)基因生物等。
“硅內(nèi)”改組(Selifonov和Stemmer在“產(chǎn)生具有所需特性的特征串、多核苷酸和多肽的方法”詳述)，1999年2月5日提交(USSN 60,118,854)和1999年10月12日(USSN 09/416,375)利用計算機算法，在計算機中用遺傳操縱子進(jìn)行“仿真”改組。對于本發(fā)明，在計算機系統(tǒng)中重組衍生性酶基因序列串，通過例如重新裝配PCR合成寡核苷酸產(chǎn)生所需產(chǎn)物。簡單說，遺傳操縱子(代表給定遺傳活動(如點突變、重組兩條同源核酸鏈等)的算法)可用于通過例如排列對比核酸序列串(用標(biāo)準(zhǔn)排列對比軟件或用手工觀察和排列對比)來模擬一種或多種核酸中可能發(fā)生的重組或突變活動，并預(yù)測重組結(jié)果。例如通過寡核苷酸合成和重新裝配PCR，將預(yù)測的重組結(jié)果用于產(chǎn)生相應(yīng)的分子。
在“寡核苷酸介導(dǎo)的改組”(Crameri等“寡核苷酸介導(dǎo)的核酸重組”，1999年2月5日(USSN 60/118,813)和1999年6月24日提交的(USSN 60/141,049)和1999年9月28日提交的(USSN 09/408,392))中，對應(yīng)于相關(guān)同源核酸(如本發(fā)明中所用的，編碼衍生性酶的核酸的種間或等位變體)家族的寡核苷酸重組產(chǎn)生可選擇的核酸。
寡核苷酸介導(dǎo)的重組的一個優(yōu)點是能重組同源核酸與序列相似性低的或甚至非同源的核酸。在這些同源性低的寡核苷酸改組方法中，將一組或多組核酸區(qū)段，例如與一組交換家族多樣性寡核苷酸重組。這些交換寡核苷酸每一條都具有多個序列多樣性區(qū)域，對應(yīng)于序列相似性低的同源或非同源核酸，的多個序列多樣性區(qū)域。通過與一條或多條同源或非同源核酸比較，衍生的這種交換寡核苷酸可與這些核酸區(qū)段的一個或多個區(qū)域雜交，促進(jìn)重組。
當(dāng)重組同源核酸時，雜交和延伸(如通過重新裝配PCR)諸組寡核苷酸重疊性家族(它們通過比較同源核酸并合成寡核苷酸區(qū)段而產(chǎn)生)，得到一群重組核酸，可選擇所需性狀或特征。通常，諸組重疊寡核苷酸包括多種寡核苷酸成員類型，它們具有衍生自多條同源靶核酸的共有區(qū)域亞序列。一般通過排列對比同源核酸序列和所選的序列相同性保守區(qū)域和序列多樣性區(qū)域，提供這些重疊寡核苷酸組。(依次或平行)合成了多條對應(yīng)于序列多樣性的至少一個區(qū)域的寡核苷酸。
通過切割一條或多條同源核酸(如用Dnase)或更常見，通過合成一組對應(yīng)于至少一條核酸的多個區(qū)域(通常作為一組核酸片段的成員而提供對應(yīng)于全長核酸的寡核苷酸)可提供用于寡核苷酸改組方法中的區(qū)段組或區(qū)段亞組。在本文所述的改組程序中，這些區(qū)段(如編碼衍生性酶的核酸區(qū)段)可與寡核苷酸的改組家族聯(lián)用，例如在一個或多個重組反應(yīng)中產(chǎn)生編碼重組衍生性酶的核酸。
通常在一輪重組和篩選/選擇后可實現(xiàn)改進(jìn)。然而，可采用重復(fù)序列重組來實現(xiàn)所需特性的進(jìn)一步改善?？捎迷S多不同方式和方式的預(yù)突變(它們擁有一些共同的原理)實現(xiàn)序列重組。重復(fù)序列重組需要連續(xù)多輪重組以產(chǎn)生分子多樣性。即建立彼此顯示一些序列相同性，但突變不同的核酸分子家族。在任何給定的輪次中，重組可以在體內(nèi)或體外，胞內(nèi)或胞外發(fā)生。另外，重組產(chǎn)生的多樣性可在任何輪次中通過將先前的誘變方法(如易錯PCR或基因盒誘變)應(yīng)用于重組的底物或產(chǎn)物而得到增強。在一些例子中，當(dāng)使用該序列的不同變體形式作為生物體的不同個體或品系的同源物，或使用同一生物的相關(guān)序列作為等位變體時，可在體內(nèi)或體外重組僅一輪之后實現(xiàn)新的或改進(jìn)的性能或特性。
通常在細(xì)胞中完成重組多核苷酸的表達(dá)，以獲得重組衍生性酶?？稍隗w外或體內(nèi)如美國專利號5,837,458中所述的建立重組多核苷酸文庫。對于體外文庫的產(chǎn)生，可將此重組多核苷酸引入細(xì)胞以表達(dá)。
B.用于生物催化合成組合文庫的衍生性酶的類型本發(fā)明的方法用于能催化感興趣的有機分子修飾的大范圍的衍生性酶。這些酶可通過例如在分子上加上一個官能團(tuán)或通過修飾分子上現(xiàn)存的官能團(tuán)來修飾底物。感興趣的修飾還包括在官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)。在本文優(yōu)選實施例中，衍生性酶不加到有機分子的骨架長度上。在例如Khmelnitsky等(1996)MolecularDiverisity and Combinatorial Chemistry，14章，144-157頁(American ChemicalSociety)和Michels等(1998)Tibtech 16210-215中描述了感興趣的反應(yīng)類型。下文描述了不同類型的衍生性酶種類和本發(fā)明的方法應(yīng)用于這些酶的例子。
除了增加重組酶文庫中發(fā)現(xiàn)的酶活性的多樣性外，還可獲得在某些特性上增強的酶，這增加了此酶在修飾有機化合物(如天然化合物、非天然化合物(如5-氟尿嘧啶、疊氮胸苷等)、小分子和聚合物(如肽和肽變體、寡核苷酸/多核苷酸及其變體、多羥基鏈烷酸酯、多糖、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸、聚乙二醇等))中的用處。本發(fā)明實施中使用的小分子通常具有低于約2500道爾頓的分子量，通常低于約2000道爾頓，有時低于約1500道爾頓。
可篩選這些文庫以鑒定與野生型酶相比較編碼顯示用于感興趣的反應(yīng)，所需的一個或多個性能上有所改進(jìn)的酶。例如，可通過篩選，鑒定編碼對于某具有化合物具有改進(jìn)的底物特異性，或?qū)τ谠摶衔锷系乃韫倌軋F(tuán)具有改進(jìn)的區(qū)域選擇性的酶的文庫成員。
在一些實施例中，重組衍生性酶是某給定的野生型基因的變體，通過本文所述的多樣性產(chǎn)生方法(如改組和基因重裝配改組方法)引入變異。因此可用密集采樣在該給定序列周圍提供有限但完整的多樣性。在其它實施例中，通過對幾種不同的野生型基因使用多樣性產(chǎn)生方法產(chǎn)生了重組文庫。實現(xiàn)了有限和不完整的多樣性，它分散在整個功能性序列空間內(nèi)，與分散采樣相同。當(dāng)產(chǎn)生新的酶的特異性時，后一種方法是優(yōu)選的。
1.對現(xiàn)存官能團(tuán)的修飾和將新官能團(tuán)引入有機分子在一些實施例中，重組衍生性酶及其文庫可催化存在于感興趣的有機分子上現(xiàn)存官能團(tuán)的修飾。例如，感興趣的衍生試劑可氧化或還原一官能團(tuán)、水解一基團(tuán)或用一種官能團(tuán)替換另一種。其它感興趣的反應(yīng)包括內(nèi)酯化，異構(gòu)化和差向異構(gòu)化。
a.羥化在一些實施例中，有機分子中的氫被羥基取代。這常常可導(dǎo)致生物活性的顯著改變。羥化常常與首先通過肝臟的代謝增強相關(guān)。在候選藥物中引入羥基還可以賦予在隨后一組轉(zhuǎn)移酶(如催化甲基化、硫酸鹽化、磷酸化和糖基化的酶)的作用下更快速的代謝。
在用于引入羥基的衍生性酶中有單氧和二氧化酶。本領(lǐng)域已知的單氧化酶范圍提供了產(chǎn)生用于本發(fā)明的方法的重組單氧化酶文庫的合適起始點。一類有用的單氧化酶的例子是亞鐵血紅素依賴性真核和細(xì)菌細(xì)胞色素P-450。在存在氧和完整的氧化還原再循環(huán)系統(tǒng)中，P450顯示了單氧化酶活性。然而對許多同樣的底物可利用加入過氧化氫或其它過氧化物來繞過對NAD(P)H的需要(即考慮到過氧化酶活性)。酶(如P450)在化學(xué)困難位點進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的能力是熟知的。天然存在的P450對類固醇的修飾在生物合成和藥物代謝中很廣泛。因此，例如P450的改組文庫將對進(jìn)一步化學(xué)(或酶促)衍生或篩選產(chǎn)生許多新結(jié)合點。本文提到的其它酶也可以用于在臨床重要的化合物家族中建立新的結(jié)構(gòu)多樣性。
P450單氧化酶基因家族特別適用于家族改組，以獲得重組衍生性酶。已知道許多不同物種的約70-80個P450單氧化酶家族。為了鑒定可作為一個家族一起改組的同源基因，可在“色素P450結(jié)構(gòu)、機制和生物化學(xué)”的附錄，第2版(PaulR.Ortiz de Montellano編，Plenum Press，New York，1995)(“Ortiz deMontellano”)中找到P450酶的代表性排列對比。最新的P450名單可在萬維網(wǎng)World Wide Web上(http//drnelson.utmem.edu/homepage.html)以電子格式找到。為了說明用改組改進(jìn)P450酶家族，選擇了一個或多個超過1000個成員的該超家族，與相似的同源序列排列對比，并根據(jù)這些同源序列進(jìn)行改組。例如，牛P450sec酶的基因(CYP11A1)屬于一個緊密相關(guān)的P450基因家族。DNA改組(Crameri等，Nature 391288)可用于從該基因家族建立雜交變體，其文庫可用于產(chǎn)生有機分子衍生物的組合文庫。特別是鏈霉菌產(chǎn)生的P450單氧化酶可用于產(chǎn)生天然產(chǎn)物如抗生素。適合用于改組的P450單氧化酶的例子包括以下酶，其每一種至少在氨基酸水平上有45％的相同性細(xì)胞色素p450單氧化酶(委內(nèi)瑞拉鏈霉菌)AF087022細(xì)胞色素p450單氧化酶(紅色糖多孢菌)M83110細(xì)胞色素p450單氧化酶(紅色糖多孢菌)M54983細(xì)胞色素p450單氧化酶(吸水鏈霉菌)X86780細(xì)胞色素p450單氧化酶(抗生鏈霉菌)L47200在待批的，共同擁有的美國專利申請?zhí)?0/148,850中更詳細(xì)地討論了重組偏50單氧化酶基因文庫的建立，它在1999年8月12日提交。
注意到下文關(guān)于單氧化酶描述的基礎(chǔ)化學(xué)是已知的。除了Ortiz deMontellano(見上)，Stryer(1988)Biochemistry，第三版(或以后的版本)，F(xiàn)reemanand Co.New York，NY；Pine等，Organic_Chemistry第四版(1980)McGraw-Hill，Inc.(USA)(或以后版本)；March，Advanced_Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure第四版J.Wiley and Sons(New York，NY，1992)(或以后版本)；Greene等，Protective Groups In Organic Chemistry，第二版，JohnWiley&Sons，New York，NY，1991(或以后版本)；Lide(編)(1995)The CRC Handbookof Chemistry and Physics 75th版(或以后版本)；和其中的參考文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)了所涉及的各種化學(xué)物質(zhì)的一般指南。另外，用于本發(fā)明的許多化學(xué)和工業(yè)過程的廣泛指南可在Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology(第三版和第四版，1998年)，Martin Grayson，執(zhí)行編輯，Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，NY和其中的參考文獻(xiàn)中找到(“Kirk-Othmer”)。
適用于有機分子引入羥基和其它修飾的其它單氧化酶包括具有以下活性的酶，例如烷烴氧化(如羥基化、酮、醛的形成等)、烯烴環(huán)氧化、芳族羥基化、N-去烷基化(如烷基胺的)、S-去烷基化(如還原的含硫有機物)、D-去烷基化(如烷基醚的)、酰氧基苯酚的氧化、醛轉(zhuǎn)化成酸、醇轉(zhuǎn)化成醛或酮、脫氫、脫羰基、鹵代芳族和鹵代糖類的氧化性脫鹵素、Baeyer-Villiger單氧化、環(huán)孢菌素的修飾、美伐他汀的羥基化、紅霉素的羥基化、N-羥基化、亞砜形成、或磺酰脲的氧化。本領(lǐng)域技術(shù)人員對于其它氧化性轉(zhuǎn)化是清楚的。用于本發(fā)明的合適單氧化酶的例子在待批的，共同擁有的美國專利申請系列號09/373,928，標(biāo)題為“產(chǎn)生工業(yè)化合物的單氧化酶基因的DNA改組”(1999年8月12日提交)中有所描述。
二氧化酶是另一類用于生物催化合成有機分子衍生物的衍生性酶。例如細(xì)菌芳烴二氧化酶(ADO)可將π鍵氧化成相應(yīng)的鄰位二醇。在氧的存在下和還原性化合物如NAD(P)H的存在下這些酶能催化與芳環(huán)和非芳環(huán)多鍵一樣多樣性的化合物的還原性雙加氧化。芳烴二氧化酶作用產(chǎn)生的環(huán)狀順-二羥基化產(chǎn)物的非苯酚性質(zhì)，通過避免聚集毒性和反應(yīng)性環(huán)氧中間物(它們可顯著損害生物催化劑的性能)，為制造有機分子衍生物提供了顯著優(yōu)點。
芳烴二氧化酶包括例如甲苯2，3-二氧化酶、異丙基苯2，3-二氧化酶、苯-1，2-二氧化酶、二苯基-2，3-二氧化酶、萘-1，2-二氧化酶和許多同源和/或功能上相似的酶。合適的芳烴二氧化酶編碼的多核苷酸可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的克隆方法從許多生物獲得。下列名單提供了編碼芳烴二氧化酶并適用于本發(fā)明的方法的多核苷酸例子?；蜃峭ㄟ^GenBank ID鑒定的，其編碼芳烴二氧化酶的全部或部分蛋白質(zhì)組分。合適的基因座包括例如[PSETODC1C]甲苯1，2-二氧化酶；[AF006691]、[PJU53507]、[PSECUMA]、[REU24277]、異丙基苯-2，3-[E04215]、[PSEBDO]二氧化酶；苯-1，2-二氧化酶；[AEBPHA1F]、[CTU47637]、[D78322]、[D88020]、[D88021]、[PSEBPHA]、[PSEBPHABC]、[PSEBPHABCC]、[PSU95095]、[RERBPHA1]、[RGBPHA]、[RSU27591]二苯基-2，3-二氧化酶；[PSU15298]氯苯二氧化酶；[AB004059]、[AF010471]、[AF036940]、[AF053735]、[AF053736]、[AF079317]、[AF004283]、[AF004284]、[PSENAPDOXA]、[PSENAPDOXB]、[PSENDOABC]、[PSEORF1]、[PSU49496]、萘-1，2-二氧化酶；[AF009224]、[PSEBEDC12A]苯甲酸-1，2-二氧化酶；[PWWXYL]甲苯甲酸二氧化酶；[ASCBAABC]、[U18133]3-氯苯甲酸-3，4-二氧化酶；[PCCBDABC]2-氯苯甲酸-1，2-二氧化酶；[BSU62430]2，4-二硝基甲苯二氧化酶；[PSU49504]2-硝基甲苯二氧化酶；[PPU24215]對香豆酸(cumate)-2，3-二氧化酶；[PSEPHT]鄰苯二甲酸-4，5-二氧化酶；[AB008831]、[ACCANI]、[D85415]苯胺1，2-二氧化酶；[D90884]苯丙酸2，3-二氧化酶；[PPPOBAB]苯氧基苯甲酸二氧化酶；[AF060489]、[AB001723]和[D89064]咔唑二氧化酶。
還可利用的是基因組含有編碼其它二氧化酶的生物，其它二氧化酶包括1，2，3，4-四氫化萘-5，6-二氧化酶，Sikkema等，Appl.Eviron.Microbiol.59567-573(1993)；對香豆酸-2，3-二氧化酶DeFrank等，J.Bacteriol 1291356-1364(1977)；芴酮1，1a-二氧化酶，Selifonov等J.Biochem.Biophys.Res.Comm.19367-76(1993)；二苯并呋喃-4，4a二氧化酶，Trenz等，J.Bacteriol 176789-795(1994)；鄰苯二甲酸-3，4-二氧化酶，Eaton等J.Bacteriol.15148-58(1982)；和2-氯苯甲酸-1，2-二氧化酶(Selifonov等，Biochem Biophys.Res.Comm.213(3)759-767(1995)等)。在待批的共同擁有的美國專利申請系列號60/148,450，標(biāo)題為“產(chǎn)生工業(yè)化學(xué)藥物的二氧化酶基因的DNA改組”(1999年8月12日提交)中描述了適用于制備本發(fā)明的酶文庫的這些和其它二氧化酶。
一旦將羥基引入某前導(dǎo)化合物或其它有機分子后，常需要如下所述在羥基上加上官能團(tuán)(如糖基化、酰基化等)。因此，本發(fā)明還提供以下方法通過使該有機分子與第一重組衍生性酶文庫接觸獲得了有機分子衍生物庫，然后與第二重組衍生性酶文庫接觸。第二文庫的酶通常但不必須是能催化在官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)的酶。另外，可用化學(xué)方法或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法修飾該羥基化化合物。
b.鹵化酶鹵化酶組成了可用于獲得有機分子衍生物文庫的另一類衍生性酶的例子。鹵化酶通常鹵化芳環(huán)，它可成為復(fù)雜的天然或非天然產(chǎn)物和其它感興趣的有機分子(如前導(dǎo)分子)的一部分。合適的鹵化酶的例子包括以下酶鹵化酶PrnA、PrnB、PrnC(U74493；(P.fluorescen)熒光變形菌)、推定的鹵化酶PltM、PltD、PltA(AF081920；熒光變形菌)，推定的氧化酶/鹵化酶(Y16952；東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis))。雖然這些具體的酶的氨基酸序列相同性小于35％，編碼這些酶的多核苷酸也能用作探針來獲得可用于DNA改組的更密切相關(guān)的鹵化酶。
c.其它替代類似的，可在有機化合物中引入含硫基團(tuán)。例如通?？梢肓虼?，來產(chǎn)生硫醇根陰離子，它對重金屬具有強親和力。常常在酶活性位點發(fā)現(xiàn)重金屬。用于這些實施例的衍生性酶包括例如酰基磺基轉(zhuǎn)移酶家族?？捎么嗣讣易鍖⒒腔D(zhuǎn)移到有機分子的芳基部分上。芳基磺基轉(zhuǎn)移酶家族包括許多具有非常高的氨基酸序列相同性(＞80％)的成員，從而使它們能容易地一起改組，產(chǎn)生重組衍生性酶文庫。可用于重組的合適的磺基轉(zhuǎn)移酶的例子包括例如芳胺磺基轉(zhuǎn)移酶(U33886，智人)、苯酚磺基轉(zhuǎn)移酶(D85541；獼猴Macaca Fascicularis)、苯酚磺基轉(zhuǎn)移酶(D29807；犬Canisfamiliaris)、苯酚磺基轉(zhuǎn)移酶(U34753；Bos taurus)和長壓定磺基轉(zhuǎn)移酶(L19998；Rattus norvegicus)。
在其它實施例中，一個或多個堿性基團(tuán)可取代先前存在的官能團(tuán)。這些在醫(yī)藥化學(xué)中最常用的堿性基團(tuán)是胺、脒、胍、和幾乎所有含氮的雜環(huán)。在已具有生物活性的分子中引入這些基團(tuán)的作用與引入酸性功能具有基本上相同的增溶作用。胺和堿性雜環(huán)在成功的藥物中是普遍存在的。不難通過例如使用酰基轉(zhuǎn)移酶或酯酶，用含有胺基的雙功能化合物引入胺基。
2.在官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)本發(fā)明的其它實施例提供了重組衍生性酶及其文庫，它們能催化在存在于感興趣的有機分子(如前導(dǎo)化合物)上的官能團(tuán)上加上一個或多個化學(xué)基團(tuán)。在這些實施例中，本發(fā)明的重組衍生性酶是可使一個基團(tuán)與核心功能性藥物基團(tuán)在不破壞該藥物功能的位置結(jié)合的那些酶。這樣的結(jié)合可提高該藥物分子作為前藥的溶解度。
結(jié)合可以是可逆或不可逆的?？赡娴慕Y(jié)合包括例如酯、肽和葡萄糖苷的結(jié)合。不可逆結(jié)合包括例如通過O-和N-烷基化結(jié)合。C-C鍵的建立可通過移植的側(cè)鏈(如二甲基氨基乙基或嗎啉基乙基鏈)或酸性側(cè)鏈(如羧基、磺基、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2)，或用中性基團(tuán)(如甘油基)實現(xiàn)。用本發(fā)明的酶和方法還可加上更大的增溶基團(tuán)。這些實施例包括但不限于-O-CH2-CH2-COOH、-NH2-CH2-CH2-CH2-、-C＝N-O-CH2-CO2H、O-嗎啉基乙基-和-O-CO-CH2-CH2-CO2H。
也可結(jié)合不可離子化的側(cè)鏈，包括例如羥基化和聚氧亞甲基化的側(cè)鏈或多種葡糖苷，以增強溶解度。這類側(cè)鏈還包括聚乙二醇衍生物，它也用于提高溶解度和緩釋。
用于在前導(dǎo)化合物或其它有機分子上預(yù)先存在的官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)的衍生性酶的例子是葡糖苷轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶、酰胺酶、N-甲基轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、芳基磺基轉(zhuǎn)移酶等。
a.酰基轉(zhuǎn)移酶?；且活愋揎椈瘜W(xué)，理論上對有機分子的衍生可提供很大的多樣性。然而酰基化的常規(guī)化學(xué)方法通常是非選擇性的，需要多次保護(hù)和去保護(hù)步驟。在有機溶劑中通過酰基轉(zhuǎn)移酶(包括脂肪酶和蛋白酶)實現(xiàn)的酶?；商峁┠承﹥?yōu)點，例如底物-、立體-和區(qū)域選擇性。然而不能從一組天然存在的?；D(zhuǎn)移酶中獲得對于任何具體有機分子擁有所需的各種底物-、立體-、區(qū)域特異性的-種酶。因此，本發(fā)明提供了含有可用于合成前導(dǎo)化合物和其它有機分子的?；苌锏娜褐亟M酰基轉(zhuǎn)移酶的文庫。
因此，本發(fā)明提供了編碼脂肪酶和蛋白酶和?；D(zhuǎn)移酶的重組多核苷酸文庫。這些方法涉及建立重組多核苷酸文庫作為編碼能進(jìn)行乙?；磻?yīng)的酶的底物多核苷酸。這些酶包括例如脂肪酶和蛋白酶。脂肪酶和蛋白酶在有機溶劑中的逆反應(yīng)可將各種?；D(zhuǎn)移到復(fù)雜天然產(chǎn)物的羥基位點上。這些酶通常具有廣譜底物專一性但活性很低。
例如，脂肪酶家族不難從公眾可得的數(shù)據(jù)庫中鑒定到。適用于改組(氨基酸相同性大于50％)的脂肪酶家族的一個例子包括下列成員Y00557，霍亂弧菌(Vibriocholae)；D50587假單胞菌KFCC10818(AAD22078)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(BAA23128)、銅綠假單胞菌(D50587)；乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)(AF047691)；和威斯康星假單胞菌(P.wisconsinensis)(U88907和2072017)、假單胞菌(P26877)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)(M74101)；短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)(A34992)；Galactomyces geotrichium(A02813)；皺落假絲酵母(Candida rugosa)(WO99/14338)；和乙酸鈣不動桿菌(S61927)。
許多編碼?；D(zhuǎn)移酶的基因(此酰基轉(zhuǎn)移酶利用輔酶A的各種羧酸衍生物作為底物)是已知的，催化這些反應(yīng)的酶在原核和真核生物中是普通存在的。適合用作底物的核酸的例子包括例如糖苷6-O乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.18)；大腸桿菌的lacA(B0342(lacA)或其它生物體的lacA(GENBANK座位號MG396；D02_orf152(lacA)；MJ1064(lacA)，MJ1678，MTH1067)；絲氨酸O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.30)，(GENBANK座位號B3607(cysE)、HI0606(cysE)、HP1210(cysE)、SLR1348(cysE))；醇O-乙?；D(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.84)，來自例如釀酒酵母(座位YGR177C、YOR377W)；芳胺N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.118，代表性GENBANK座位包括Q00267、D90786、Z92774、I78931、AF030398、AF008204、AF042740)；肉毒堿O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.7)來自例如哺乳動物或酵母(GENBANK座位YAR035(YAT1)和YM8054.01(CAT2))；膽堿O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.6)、例如哺乳動物來源的；和乙酰輔酶A去乙酰長春刀靈4-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.107)(St-Pierre等(1998)Plant J.14703-713)。
本發(fā)明改進(jìn)酶的合適?；w包括例如可作為特定酶的供體的那些化合物。代表性酰基供體底物包括乙烯酯、三氟乙酯和其它脂肪族酯，以及芐基和脂肪酸等。見例如Mozhaev等(1998)Tetrahedron 543791-3982，具體是3976頁。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選模式中，改組的酰基轉(zhuǎn)移酶基因是編碼對?；峁┺D(zhuǎn)移的酶的基因，并使用宿主微生物菌株細(xì)胞中的內(nèi)源乙酰輔酶A化合物池。還可通過在進(jìn)行酰基化反應(yīng)的宿主微生物菌株中引入乙酰輔酶A連接酶(可任選的通過DNA改組來改進(jìn))來增強乙酰輔酶A的內(nèi)源性池。然后給菌株提供培養(yǎng)液中的外源乙酸或其它羧酸，它們隨后通過?；B接酶與輔酶A連接。在待批的共同擁有的美國專利申請系列號09/373,928，題為“產(chǎn)生工業(yè)用化學(xué)藥物的單氧化酶基因的DNA改組”(1999年8月12日提交)中描述了合適的?；B接酶及其優(yōu)化方法。
?；苌母信d趣化合物包括例如天然產(chǎn)物和例如多酮、視黃酮、肽抗生素等，以及非天然存在的化合物。這些化合物可作為例如抗生素、化療藥物等用途。一般底物分子在可發(fā)生?；奈恢镁哂幸粋€或多個羥基殘基。區(qū)域選擇性對于在可發(fā)生?；奈恢镁哂卸鄠€官能團(tuán)的分子特別重要。本發(fā)明的方法中提供了一種方法，通過它可獲得一種酶，此酶能?；信d趣的官能團(tuán)，但不酰基化其它可能易被?；幕鶊F(tuán)。
特定分子的?；蓽p少不良特性。在采用本發(fā)明的方法開發(fā)的具有改進(jìn)性能的藥物衍生物中，有抗癌藥，包括通過破壞微管蛋白運動而起作用的藥物。這些化合物包括例如秋水仙堿、秋水仙胺、足葉草毒素、紫杉酚、長春堿、長春新堿等。感興趣的底物的一個特別例子是艾潑昔龍，它是一種候選的強抗癌藥，目前正在研究階段。選擇性在該化合物的兩個羥基上可?；岣咂渌苄??？捎帽景l(fā)明的重組?；D(zhuǎn)移酶文庫獲得在這些位點專一性?；难苌?。其它例子有雷帕霉素和FK506。可利用?；着撩顾氐腃-28羥基或FK506非脫水的C-35羥基來將其免疫抑制活性與其神經(jīng)再生活性分離開(Gold，B.G.(1997)Mol.Neurobiol.15285-306)。已知雷帕霉素或FK506與FKBP(FK結(jié)合蛋白)的一部分結(jié)合負(fù)責(zé)神經(jīng)再生活性。?；善茐腇KBP-雷帕霉素(或FK506)與效應(yīng)蛋白神經(jīng)鈣蛋白(calcineurin)的結(jié)合。因此，上述羥基的?；瘜⑵茐纳窠?jīng)鈣蛋白結(jié)合。區(qū)域選擇性將在這些修飾中起主要作用，因為在這兩種分子中都有幾個羥基。
不論重組多核苷酸文庫(編碼脂肪酶、蛋白酶或其它酰基化酶)是通過DNA改組或其它上述方法獲得，對該文庫的篩選在體外用純化或部分純化的酶或細(xì)菌或酵母裂解液在有機溶劑系統(tǒng)中，通過下面所述的一種或多種篩選方法更容易進(jìn)行。例如，可通過檢測底物和酶促催化反應(yīng)產(chǎn)生的衍生物之間的物理差異檢測天然產(chǎn)物和小分子的?；苌镌黾拥男畔ⅰ＿@些方法包括HPLC、質(zhì)譜、UV/Vis和IR光譜、NMR等。
另一種目前優(yōu)選的方法采用標(biāo)記的?；w前體，如標(biāo)記的羧酸或其衍生物，給予表達(dá)編碼改組脂肪酶、蛋白酶或其它?；D(zhuǎn)移酶的基因文庫的細(xì)胞。測量反應(yīng)產(chǎn)物中標(biāo)記物的量。對于疏水性反應(yīng)產(chǎn)物，可將衍生物抽提到合適的有機溶劑中，或可以通過加入足量疏水多孔樹脂珠(如XAD1180、XAD-2、-4、-8)用固相法抽提這些化合物。就放射性標(biāo)記而言，閃爍染料可存在于有機溶劑中，加到樣品中，或用化學(xué)方法摻入珠聚合物中。后者是一種閃爍臨近試驗法的改進(jìn)。
檢測?；磻?yīng)的區(qū)域選擇性的方法包括例如HPLC和以HTP模式的流通NMR譜。當(dāng)用NMR譜測定天然產(chǎn)物或小分子的不同區(qū)域?；苌锏南鄬α繒r，優(yōu)選通過酶對同位素(13C和/或2H)標(biāo)記底物的作用獲得后者。NMR技術(shù)的另一種變化包括采用對?；w中間物的前體同位素標(biāo)記。
b.糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生有機分子衍生物組合文庫的另一個感興趣的衍生性酶的例子是糖基轉(zhuǎn)移酶。糖基化可提高有機分子(包括前導(dǎo)分子)的生物利用率，降低毒性，和提高的水溶性。因為糖基化難于用化學(xué)方法進(jìn)行，含糖的新抗生素(如新的糖肽和糖基化的大環(huán)內(nèi)酯抗生素)難于制備。
然而用糖基轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)崿F(xiàn)含有一個或多個羥基的有機受體化合物的糖基化。因此伴隨著本發(fā)明重組酶文庫提供的糖基化活性的變化越多，可獲得許多有機分子變體。用本文提供的技術(shù)，提供了能催化各種先前不能實現(xiàn)的糖基化的新酶。例如，本發(fā)明文庫中的重組衍生性酶可顯示對受體(如復(fù)雜的天然和合成的有機分子)和供體(如不同的糖)的改變的專一性。還可獲得合成氨基脫氧糖能力的提高，如通過生物轉(zhuǎn)化。用本發(fā)明的重組衍生性酶，可得到新的底物，建立和改進(jìn)新的酶活性；可用生物催化代替困難的化學(xué)方法，實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
用本文所述的多樣性產(chǎn)生方法(包括例如改組)可演化糖基轉(zhuǎn)移酶，產(chǎn)生在各種不同的反應(yīng)參數(shù)上顯示最佳性能的重組糖基轉(zhuǎn)移酶。典型的反應(yīng)參數(shù)包括但不限于反應(yīng)專一性、酶的混雜程度和立體化學(xué)。例如，可任選地將酶演化成能轉(zhuǎn)移不同的核苷二磷酸(NDP)糖和NDP-糖類似物；能將糖轉(zhuǎn)移到不同的受體分子；能使糖結(jié)合在(與天然存在的酶相比)不同的位置上，以具有在含有受體的多樣位點中位置的模糊性，和能催化多步糖基化。
在另一個實施例中，可演化酶產(chǎn)生重組衍生性酶，該酶能利用其它可任選合成的糖。例如激活的糖(如脫氧和硫酸化的糖)；非天然糖(如硝基化、磺酸化、磷酸化和雙脫氧糖)；聚醇(如肌醇(inositol)、肌醇磷酸酯和肌醇膦酸)；其它類似糖的結(jié)構(gòu)和化合物以及其它核苷。
可任選的用重組糖基轉(zhuǎn)移酶將糖轉(zhuǎn)移到另外的糖受體上，包括但不限于聚酮、非核糖體肽、有機合成的復(fù)雜分子和化合物文庫。本發(fā)明中感興趣的其它糖接受體包括但不限于無糖基萬古霉素鹽酸鹽(一種肽抗生素)、促生長素抑制素(一種生長激素)、胰島素和胰高血糖釋放抑制蛋白、膽酸(一種去污劑類固醇)、諾加霉素(抗腫瘤抗生素)、L-甲狀腺素(一種甲狀腺激素)、丁香醛連氮、阿柔比星(抗腫瘤抗生素和商品RNA合成抑制蛋白)、鹽酸羥芐羥麻黃堿(一種腎上腺能激動劑和平滑肌松弛劑)、利福霉素(一種抗生素)和硫酸瑞斯托霉素(一種抗生素)。這些化合物都具有與萬古霉素糖苷配基的3-二維相似性，如通過與從Chemweb(http//www.chemweb.com/databases)獲得的化學(xué)數(shù)據(jù)庫的分子動態(tài)界面定義的那樣。
圖1-10顯示了這些分子和它們的感興趣的糖結(jié)合位點。其它可糖基化的感興趣的天然產(chǎn)物包括例如洛伐他丁、無糖基紅霉素、海膽霉素、紫杉酚和頭孢氨芐。
可任選的用演化的糖基轉(zhuǎn)移酶糖基化任何含有至少一個羥基的分子。優(yōu)選藥物學(xué)上感興趣的化合物?？扇芜x的僅在一個位置糖基化具有一個以上的羥基的糖接受體。如此可通過在一個或其它位置糖基化來產(chǎn)生不同的異構(gòu)體。另外，例如當(dāng)限于NDP時，可任選在不同位置以不同程度糖基化具有一個以上羥基的化合物。在另一個實施例中，用NDP-糖和糖基轉(zhuǎn)移酶組合在多維上處理化合物，可提供重復(fù)糖基化。
在一些實施例中，選擇的糖基轉(zhuǎn)移酶是能從UDP-己糖衍生物上轉(zhuǎn)移己糖殘基的糖基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選的己糖包括例如D-葡萄糖、D-半乳糖和D-N-乙酰葡糖胺。結(jié)合中需采用演化的糖基轉(zhuǎn)移酶的感興趣的糖包括但不限于以下的糖UDP-N-乙酰半乳糖胺、UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-半乳糖、UDP-半乳糖醛酸、UDP-葡糖醛酸、UDP-甘露糖、UDP-木糖、UDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、ADP-核糖、ADP-甘露糖、GDP-海藻糖、GDP-葡萄糖和GDP-甘露糖，所有都可購自Sigma(St.Louis，MO)。脫氧糖，如2-脫氧-D-木己糖、2-脫氧-D-阿拉伯糖己糖、L-海藻糖、L-鼠李糖、D-霉菌素糖、L-瓦拉糖(vallarose)、D-海藻糖、D-奎諾糖、D-鼠李糖、D-坎那糖(canarose)、D-奧利糖(oliose)、D-毛地黃糖(digitose)、D-波伊文糖、L-夾竹桃糖、抑素糖(chalcose)、D-阿米糖(amicetose)、L-香草糖(rhodinose)、蛔糖、阿比可糖、泊雷糖、泰威糖、可立糖等。這些糖和其它糖在Annu Rev.Microbiol，48223-256(1994)中有所描述。
本發(fā)明提供了獲得重組多核苷酸的方法，這些多核苷酸編碼某些性能增強的糖基轉(zhuǎn)移酶，其特性的增強提高了這些酶在糖基化有機化合物合成中的用處。在目前的優(yōu)選例中，在加到生物催化反應(yīng)混合物中的微生物中引入編碼改進(jìn)的糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸。在一些實施例中，用獲得糖基轉(zhuǎn)移酶基因以外的微生物表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶。
在目前優(yōu)選例中，發(fā)明方法中所用的糖基轉(zhuǎn)移酶，是通過使編碼該酶的核酸重組，然后經(jīng)過選擇鑒定得到編碼具有增強的感興趣特性的酶的重組多核苷酸而優(yōu)化的。例如，可選擇那些重組多核苷酸，它們編碼的酶能選擇性只糖基化一個羥基。這樣可控制區(qū)域選擇性，以提供兩種可能的異構(gòu)化合物，或者能糖基化各種各樣的化合物，如能利用天然糖基轉(zhuǎn)移酶通常不利用的各種糖和糖同類物的酶，和能糖基化各種天然糖基轉(zhuǎn)移酶不能結(jié)合糖分子的有機化合物的酶。
可通過對編碼這些酶的核酸(即作為重組底物的核酸)應(yīng)用例如本文所述的各種多樣性產(chǎn)生的重組方法(例如改組)，來建立用于鑒定編碼具有增強特性的重組糖基轉(zhuǎn)移酶，經(jīng)過選擇或篩選的重組多核苷酸文庫。在建立重組多核苷酸文庫中，適合用作底物的糖基轉(zhuǎn)移酶來源包括例如東方擬無枝酸菌(A.orientalis)的gtf基因，它編碼能催化例如葡萄糖轉(zhuǎn)移到無糖基萬古霉素的糖基轉(zhuǎn)移酶。催化這些反應(yīng)的酶在原核和真核生物中是普通存在的。
可從糖基轉(zhuǎn)移酶超家族中選擇一個或多個糖基轉(zhuǎn)移酶，與相似的同源序列排列對比，針對這些同源序列進(jìn)行改組。糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)在自然界普遍存在，本領(lǐng)域技術(shù)人員可從各種生物中用一種或多種已知方法分離得到這些基因。以下例舉可用作建立重組文庫核酸來源的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，然后篩選文庫鑒定顯示有機化合物的糖基化改進(jìn)(如改變的底物專一性)的那些。例如在建立本發(fā)明的重組文庫中可用肌醇1-α-半乳糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.123；苯酚β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.35(NTU32643、NTU32644)；視黃酮7-O-β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.81；視黃醇3-O-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.91(AB002818、ZMMCCBZ1、AF000372、AF028237、AF078079、D85186、ZMMC2BZ1、VVUFGT)；o-二羥基香豆素7-O-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.104；牡荊葡基黃酮β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.105；松果醇葡萄糖轉(zhuǎn)移酶EC2.4.1.111；單萜醇β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.127；芳胺葡萄糖轉(zhuǎn)移酶EC2.4.1.71；sn-甘油-3-磷酸1-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.96；葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.17(RNUDPGTR、AA912188、AA932333)；人UGT和同工酶(約35個基因)；水楊基-醇葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.172；4-羥基苯甲酸4-O-β-D-半乳糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.194；玉米素O-β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.203；D-海藻糖-2-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，VFAUDPGFTA；和脫皮甾醇UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(egt)MBU41999作為底物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過富集培養(yǎng)技術(shù)從各種土壤、沉淀、空氣和水樣分離的許多微生物中找到合適的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。特別是從土壤細(xì)菌分離出的糖基轉(zhuǎn)移酶，能糖基化多種多酮苷元，這些糖基化的天然產(chǎn)物具有許多不同的生物活性，如抗生素和抗癌藥的活性。編碼這些酶的基因不難從公共數(shù)據(jù)庫得到。例如糖基轉(zhuǎn)移酶(抗生鏈霉菌(S.antibioticus)，AJ002638；紅色酵母(Sac erythraea)Y14332；委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(S.venezuelae)，AF079762；波塞鏈霉菌(S.peucetius)，L47164和弗式鏈霉菌(S.fradiae)，X81885)。這些基因具有50％的氨基酸序列相同性，因此任何兩條或多條是作為一個家族一起改組是理想的。
例如，用于初始改組的糖基轉(zhuǎn)移酶是gtfA、gtfB、gtfC、gtfD和gtfE，來自不同的東方擬無枝酸菌菌株。這些基因編碼將糖基轉(zhuǎn)移到萬古霉素和艾里莫霉素(eremomycin)的糖苷配基上的糖基轉(zhuǎn)移酶，它們是非核糖體肽抗生素。Zmijewski&Briggs FEMS Microbiology Letters 59，129-134(1989)。Solenberg等，Chem&Biol.4，195-202(1997)。Wageningen等Chem&Biol.5，155-162(1998)。例如，GtfB和gtfE從TDP-葡萄糖或UDP-葡萄糖上將糖基轉(zhuǎn)移到萬古霉素上。這些糖基轉(zhuǎn)移酶基因具有59％(gtfA-gtfD)-82％(gtfB-gtfE)之間的相似性。蛋白質(zhì)序列具有52％(gtfA-gtfD)-80％(gtfB-gtfE)之間的相似性?？蓮牟煌臇|方擬無枝酸菌東方亞種菌株擴增得到5個公開的基因(gtfD和gtfE來自ATCC 43490或ATCC 43491，gtfA、gtfB、gtfC來自NNRL18098)。其它許多未確定特征，但是相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因可任選的從其它東方擬無枝酸菌菌株(ATCC 19795、21425、35164、15165、15166、39444、43333、53550和53630)進(jìn)行PCR擴增，并克隆入合適的克隆和表達(dá)載體中。可從產(chǎn)巴爾西霉素(balhimycin)的地中海擬無枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)菌株DSM5908和其它擬無枝酸菌擴增其它基因(Pelzer等(1997)J.Biotechnol.57115-128)。可用SDS-PAGE和考馬斯染色和/或如果加入檢測標(biāo)記，可用蛋白質(zhì)印跡測試gtf編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)?？蓽y試單個克隆如gtfB和gtfE的野生型活性。例如，gtfB和gtfE可從TDP-葡萄糖或UDP-葡萄糖上將葡萄糖轉(zhuǎn)移到萬古霉素的苷元上。(Folena-Wassermann等，J.of Antibiotics 39，1395-1406(1986))。可用反相HPLC監(jiān)測萬古霉素苷元的體外糖基化。(Solenberg等Chem&Biol.4，195-202(1997))。然后，用功能性gtfB和gtfE克隆和幾個表達(dá)所需大小多肽鏈的其它基因的克隆(如gtfA、gtfC、gtfD等)在篩選載體存在下產(chǎn)生gtf基因的PCR產(chǎn)物。例如，用各種上述改組方法產(chǎn)生和重新裝配各PCR產(chǎn)物的DNAsel片斷。通常片斷大小在25個堿基對和250個堿基對之間，但該大小可用本領(lǐng)域熟知的方法通過實驗不難測定。
c.甲基轉(zhuǎn)移酶甲基轉(zhuǎn)移酶是可將一個化學(xué)基團(tuán)加到存在于前導(dǎo)化合物或其它有機分子上的官能團(tuán)上的另一種感興趣的衍生性酶。例如，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶(MT)構(gòu)成了一類酶，它們形成蛋白質(zhì)、核酸、糖、多糖、脂類、木質(zhì)素和各種低分子量化合物(如大環(huán)內(nèi)酯)的甲基-酯、甲基-醚、甲基-硫酯、甲基-胺和甲基-酰胺衍生物。SAM攜帶有活化的甲基，此甲基能有效的轉(zhuǎn)移到具有廣大范圍化學(xué)反應(yīng)性的親核試劑上。活化甲基從SAM轉(zhuǎn)移到受體親核試劑上是熱力學(xué)理想的，因此驅(qū)動甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)至完成。
一類感興趣的甲基轉(zhuǎn)移酶是N-甲基轉(zhuǎn)移酶。作為例子，下列N-甲基轉(zhuǎn)移酶具有至少59％的氨基酸序列相同性，因此使該家族非常適合改組推定的TDP-N-二甲基德氨糖-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(U77459；紅色酵母(Saccharomyces erythraea))、甲基轉(zhuǎn)移酶(AJ002638；抗生鏈霉菌(S.antibiotics))、N，N-二甲基轉(zhuǎn)移酶(AF079762；委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(S.venezuelae))、N-甲基轉(zhuǎn)移酶(X81885；弗式鏈霉菌(S.fradiae))。該酶家族常常甲基化與復(fù)雜天然產(chǎn)物結(jié)合的氨基脫氧糖的氨基。
還感興趣的是O-甲基轉(zhuǎn)移酶，其幾個家族是已知的。例如，下列甲基轉(zhuǎn)移酶家族能甲基化復(fù)雜天然產(chǎn)物的羥基31-去甲基-FK506甲基轉(zhuǎn)移酶(U65940；鏈霉菌)；甲基轉(zhuǎn)移酶(X86780；吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus))、碳霉素4-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(D30759；耐熱鏈霉菌(Streptomyces thermotolerans))和O-甲基轉(zhuǎn)移酶(M93958；生米卡鏈霉菌(Streptomyces mycarofaciens))。這些家族成員在氨基酸水平具有45％以上的相同性。
d.酰胺酶本發(fā)明還提供了重組酰胺酶文庫。該酶家族可用于在有機分子中引入酰胺基團(tuán)。酰胺酶反應(yīng)的逆反應(yīng)將羧酸基團(tuán)轉(zhuǎn)變成羧酰胺。適合本發(fā)明方法中使用的一個這樣的家族包括下列酰胺酶，它們在氨基酸水平具有55％以上的相同性N-乙酰基-脫水胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(AF082575；銅綠假單胞菌)，N-乙?；?脫水胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(U40785；陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae))、AmpD蛋白(X15237；大腸桿菌)和AmpD蛋白質(zhì)(U32716；流感嗜血菌(Haemophilus influenzae Rd)。
e.磷酸轉(zhuǎn)移酶還感興趣的是在前導(dǎo)化合物或其它有機分子的現(xiàn)有官能團(tuán)上加上磷酸基團(tuán)。因此，本發(fā)明提供了用于獲得磷酰基化有機分子衍生物的重組磷酸轉(zhuǎn)移酶的文庫。例如，可對大環(huán)內(nèi)酯和肽磷酸轉(zhuǎn)移酶家族(其成員具有至少36％的氨基酸序列相同性)進(jìn)行重組(如大環(huán)內(nèi)酯2’-磷酸轉(zhuǎn)移酶I(D16251；大腸桿菌)、大環(huán)內(nèi)酯2’-磷酸轉(zhuǎn)移酶II(D85892；大腸桿菌)、紫霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(X02393；酒紅鏈霉菌(S.vinaceus))。這組酶能將磷?；D(zhuǎn)移到大環(huán)內(nèi)酯或肽抗生素上，從而滅活它們。通過使用全組磷酸轉(zhuǎn)移酶文庫可獲得大環(huán)內(nèi)酯或肽抗生素不同位點的磷?；?。
f.其它酶類除以上列出的以外的酶類，在前導(dǎo)產(chǎn)生或/和優(yōu)化中引入或修飾功能基團(tuán)也很重要。例如，能催化氧化-還原反應(yīng)的酶對于在有機化合物中將功能性醇氧化成醛/酮，或?qū)⑷?酮基團(tuán)還原成醇是重要的。然后可用所述的其它類酶進(jìn)一步修飾這些新建立的基團(tuán)。適用于改組的一個這樣的家族是乳糖脫氫酶，它能將酮轉(zhuǎn)變成醇，具有80％以上的氨基酸序列相同性(Y00711。智人；U07181，褐家鼠(Rattusnorvegicus)；77022A，豬(Sus scrofa domestica)；L79954，(Trachemys script)等)。醇脫氫酶是另一種能將醇氧化成醛的酶家族。該酶家族的合適基因不難得到用于改組(M84409，智人；L15704，(Peromyscus maniculatus)；156882，鴕鳥(Struthiocamelus)；P80222，密西西比鱷(Alligator mississippiensis)等)。這兩個酶家族的改組可改變它們對更復(fù)雜的有機化合物的底物專一性。
其它酶家族，例如能將硫化物氧化成亞砜，硫醇氧化成硫醛的酶，和能催化羥腈形成和環(huán)氧化等的酶也是DNA改組的目標(biāo)，因此在組合生物合成中是有價值的催化劑。
C.用重組衍生性酶文庫獲得有機分子衍生物的組合文庫在其它實施例中，本發(fā)明提供了獲得有機分子衍生物文庫的方法。這些方法涉及將一種有機分子(一種底物)與重組衍生性酶文庫和其它必需的試劑接觸，形成有機分子衍生物文庫。如上所述的衍生性酶可催化下列反應(yīng)，例如a)修飾存在于有機分子上的一個或多個官能團(tuán)；b)在存在于有機分子上的一個或多個官能團(tuán)上加上一化學(xué)基團(tuán)；或c)在有機分子上引入新的官能團(tuán)。
1.用于衍生的感興趣的有機分子感興趣的有機分子包括例如具有藥物學(xué)活性、除草劑或殺蟲劑活性等的有機分子。在感興趣的有機分子中有天然產(chǎn)物，如抗生素(包括例如聚酮、類固醇、非核糖體肽抗生素等)。例如，類固醇是藥物的使用非常廣泛的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，其中環(huán)上的取代基可將藥物靶向許多不同的治療目標(biāo)。這些結(jié)構(gòu)大多數(shù)是從天然來源衍生的，并作過效力篩選。類固醇藥物上觀察到的取代基包括羥基、甲氧基、烷氧基、糖基化、硫酸化、鹵化、雙鍵和三鍵、羰基等。類固醇環(huán)結(jié)構(gòu)的化學(xué)衍生可在幾個已有詳細(xì)描述的位點上進(jìn)行，或通過修飾天然存在的結(jié)構(gòu)或其非天然存在的變體來實現(xiàn)。
環(huán)狀糖肽和大環(huán)內(nèi)酯(如萬古霉素和紅霉素)也是化學(xué)上困難的結(jié)構(gòu)，它們可通過使用改組酶文庫修飾。在自然界分離得到了許多這樣的結(jié)構(gòu)，文獻(xiàn)中、公司庫存中也有描述，具有令人感興趣的生物活性但是其它方面是失敗的。如毒性、生物利用率、溶解度、藥物動力學(xué)、缺乏選擇性是候選藥物不能成為藥物的一些原因。可利用改組文庫改善這些缺點和其它特征。
前列腺素、生物堿、蒽醌是其它具有許多生物活性成員的分子家族。這些也是用改組酶文庫改進(jìn)的良好候選對象。
可用重組衍生性酶衍生的藥物化合物的具體例子包括例如筒箭毒堿鹽酸鹽、阿庫氯銨、泮庫溴銨、維庫溴銨、阿曲庫銨苯磺酸鹽、776C85、7CIMe-MDO-CPT、9-氨基喜樹堿、A-007、A-108835、A-121798、紫花洋地黃甙A和B、毛花甙A、B和C、α-乙酰地高辛、β-乙酰地高辛、地高辛、β-甲基地高辛、κ-毒毛旋花苷、κ-毒毛旋花素-β、鈴蘭苷、鈴蘭毒甙、葡萄糖海蔥甙A、海蔥甙A、海蔥次甙、海蔥擬素。還感興趣的有利膽藥和膽動力藥，包括例如羥甲香豆素、肝泰樂、鵝去氧膽酸和烏索脫氧膽酸鹽。氟可龍、帕拉米松、地塞米松、倍他米松、可的松、氫化可的松、強的松、潑尼松龍、曲安奈德、曲安西龍、甲基潑尼松龍和潑尼立定是適合衍生的糖皮質(zhì)激素。感興趣的皮質(zhì)類固醇還包括例如潑尼卡酯、氫可的松醋丙酯、氟考丁酯、(ioteprednol etabonate)等。
2.酶反應(yīng)為了獲得有機分子衍生物文庫，使底物與重組酶文庫的成員接觸。可用許多方法進(jìn)行酶促反應(yīng)，包括用全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化、滲透的細(xì)胞、細(xì)胞裂解液和純化的蛋白質(zhì)。
當(dāng)?shù)孜?如有機分子)與含有重組衍生性酶文庫的細(xì)胞接觸時，發(fā)生全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化。此文庫可表達(dá)成可復(fù)制基因包(如噬菌體或酵母展示)上的表面蛋白質(zhì)，或作為與溶液中的底物相互作用的分泌蛋白質(zhì)。還可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)這些酶，此時底物擴散進(jìn)入細(xì)胞然后發(fā)生反應(yīng)。在每一種情況下，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(包括例如離心、沉淀、用有機溶劑抽提和過濾)從細(xì)胞中分離得到衍生性酶作用的產(chǎn)物。
可通過加入許多熟知的滲透劑(如硫酸多粘菌素B)滲透表達(dá)此文庫的細(xì)胞?？筛倪M(jìn)滲透劑水平，使底物和產(chǎn)物通過自由擴散到文庫的酶中，并再次離開細(xì)胞。在滲透劑水平較高時，蛋白質(zhì)可釋放到溶液中。感興趣的化合物將從全細(xì)胞中分離得到。
可以細(xì)胞裂解液形式利用此文庫，其中可通過施加以下熟知的裂解條件來破碎表達(dá)此文庫的細(xì)胞，包括加入去污劑、PMBS和溶菌酶或超聲?？稍诜磻?yīng)前通過離心除去細(xì)胞碎片，雖然這不是必需的。然后在裂解液中加入底物，在確定溫度下培育一定的時間。然后如前所述抽提產(chǎn)物并如下分析。
另外，可用許多熟知的技術(shù)在篩選或用于制備有機分子衍生物之前純化此文庫編碼的重組衍生性酶。這些方法包括例如凝膠過濾、離子交換、親和或疏水層析，得到部分或完全純化的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道許多其它純化方法。然后使純化的蛋白質(zhì)在有利于酶活性的條件下接觸底物。
可用標(biāo)準(zhǔn)方法使用于轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件對最大程度酶促轉(zhuǎn)化最優(yōu)，這些方法包括用最佳的鹽水平、緩沖液、溫度和反應(yīng)時間長度。酶促反應(yīng)中使用的底物和任何其它物質(zhì)優(yōu)選采用能促進(jìn)高轉(zhuǎn)化率的濃度。
有機分子和其它反應(yīng)試劑與重組衍生性酶的接觸可一次用整個酶文庫，或與此文庫中重組酶的混合物，或在一次反應(yīng)中與一個重組酶接觸。如果使用混合物，一旦用所述方法鑒定到活性的混合，可展開此混合物，以分離得到顯示所需活性的具體克隆。例如，可將表達(dá)重組衍生性酶文庫各個成員的集落置于微量滴定板或其它合適的容器中，進(jìn)行高通量篩選。
在一些實施例中，在與其它反應(yīng)物接觸之前，重組酶的文庫成員被固定在固相載體上。例如，可將編碼酶的重組多核苷酸引入一表達(dá)載體，該載體還包括標(biāo)記的編碼序列，從而使重組衍生性酶作為帶有標(biāo)記的融合蛋白而表達(dá)。另外，標(biāo)記可以在表達(dá)后與衍生性酶結(jié)合。此標(biāo)記通常是一結(jié)合對的成員，其中對應(yīng)的成員易于獲得，并固定在固相載體上。例如，重組酶可表達(dá)成與生物素的融合蛋白，然后通過與鏈霉親和素結(jié)合而固定。其它合適的結(jié)合對包括例如甘露糖結(jié)合蛋白和淀粉、組氨酸標(biāo)記和固定化的金屬離子、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和還原的谷胱甘肽、鏈霉親和素結(jié)合標(biāo)記和鏈霉親和素、表位標(biāo)記(如E-標(biāo)記、myc-標(biāo)記、HAG-標(biāo)記、His-標(biāo)記)和相應(yīng)的抗體、幾丁質(zhì)結(jié)合功能域和幾丁質(zhì)、S-標(biāo)記和RNase減去S-肽突變體、纖維素結(jié)合蛋白和功能域與纖維素、硫氧還蛋白和DsbA與硫醇化合物(如ThiobondTM)、聚陽離子標(biāo)記(如聚精氨酸)和聚陰離子柱、IgG和IgG衍生的肽與蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G等、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽和鈣調(diào)蛋白、histactophilin和固定的金屬螯合層析。
與酶連接的標(biāo)記結(jié)合的結(jié)合對成員優(yōu)選與固相載體結(jié)合。適用的固相載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本文所用的固相載體是基本固定排列的材料基質(zhì)。固相載體的例子包括玻璃、塑料、聚合物、金屬、非金屬、陶瓷、有機物等。固相載體可以是平面或平坦的，或可以是幾乎不同的構(gòu)型。例如，底物可以作為顆粒、珠、束、沉淀、凝膠、片層、管、球、容器、毛細(xì)管、墊、薄片、薄膜、盤、蘸棒、滑片等形式存在。磁珠或顆粒(如磁性乳膠珠和氧化鐵顆粒)是可用于本發(fā)明的固相底物的例子。在例如美國專利號4,672,040中描述了磁性顆粒，可從例如PerSeptiveBiosystems，Inc.(Framingham MA)、Ciba Corning(Medfield MA)、BangsLaboratories(Carmel IN)和BioQuest，Inc.(Atkinson NH)購得。選擇底物擴大信噪比，主要是使背景結(jié)合最小化，從而容易洗滌和節(jié)約成本。
可通過例如從儲器取出珠或蘸棒，傾空或稀釋儲器如微量滴定板孔，漂洗珠(如具有鐵核心的珠可用磁鐵輕易的分離和洗滌)、顆粒、層析柱或用洗液或溶劑過濾，將其它細(xì)胞組分或從反應(yīng)物等與重組酶分離。分離步驟有時包括延長漂洗或洗滌，或多次漂洗或洗滌。例如，當(dāng)固相物質(zhì)是微量滴定板時，可用洗液洗滌諸孔數(shù)次，該洗液通常含有能干擾以后有機分子衍生物的篩選的反應(yīng)混合物的成分，如鹽、緩沖液、去污劑、非特異性蛋白等。
本發(fā)明提供的重組衍生性酶文庫不僅可用于獲得有機分子衍生物文庫，還提供了一個來源，可從該來源鑒定能催化感興趣的特定反應(yīng)的重組酶。例如，一旦鑒定出特定的有機分子衍生物具有所需特性，可從酶文庫中鑒定出能催化特定衍生物的形成的特定的重組酶。
3.有機分子衍生物的篩選此重組衍生性酶文庫可用于產(chǎn)生有機分子衍生物的組合文庫，進(jìn)而篩選后一文庫，以鑒定顯示所需活性的衍生物。在這些實施例中，篩選的產(chǎn)物常常是以前未曾制備過的化合物。另外，此重組酶文庫提供了一種來源，可從此來源鑒定到能催化某有機分子的特定已知修飾的酶。因此例如，可從此文庫獲得一種酶，該酶能酶促合成已知的化合物，該化合物先前僅能通過效果較差的方法(如化學(xué)合成)來合成。
一旦合成了有機分子衍生物文庫，一般對該文庫進(jìn)行篩選，以鑒定具有特別興趣的衍生物。通常為了鑒定在特定生物活性上顯示有改進(jìn)的衍生物，可采用設(shè)計來檢測和/或定量檢測所需活性的生物試驗?？呻S機進(jìn)行所需生物活性(包括例如細(xì)胞毒性、基因毒性等)、所需的生物利用率(包括血漿半衰期、腎清除等特性)、所需物理化學(xué)特性(包括水溶性、脂溶性、有機溶劑(如正辛醇)中的溶解度、pH穩(wěn)定性(如胃中的低pH環(huán)境)、溫度穩(wěn)定性、對小腸酶的抗性、肝臟酶的抗性、血漿酶的抗性、組織滲透性(如皮膚、粘膜等)、血腦屏障滲透性)和其它可通過衍生實現(xiàn)的所需特性的篩選，例如與化合物的結(jié)構(gòu)無關(guān)，或可以先分析文庫中化合物的結(jié)構(gòu)，以鑒定具有感興趣特定結(jié)構(gòu)的化合物。一旦鑒定到具有所需生物活性的化合物，可使用結(jié)構(gòu)分析鑒定此重組衍生性酶文庫賦予的結(jié)構(gòu)特征。
在大多數(shù)情況下，預(yù)計文庫中存在的重組衍生性酶以可預(yù)測的方式化學(xué)修飾某給定底物。例如，糖基轉(zhuǎn)移酶將糖基轉(zhuǎn)移到底物的氨基或羥基上。這可導(dǎo)致該分子物理行為可預(yù)測的改變，而用于篩選。此特定酶文庫催化任何給定底物的化學(xué)轉(zhuǎn)化很可能是相同的，例如糖基轉(zhuǎn)移酶將一糖基置于底物上，甲基轉(zhuǎn)移酶將加上一個甲基，P450將加上一個羥基等。這使得能對于各文庫設(shè)計基因篩選方法。例如，糖基轉(zhuǎn)移酶總是產(chǎn)生一種糖-底物連接，因此對于某種連接的糖的特定化學(xué)測試將能檢測產(chǎn)物的形成。激酶文庫將把一個磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物上，特定磷酸試驗將能檢測產(chǎn)物的存在。
可得到許多分析篩選工具來檢測組合文庫中的化合物結(jié)構(gòu)。例如，已知許多方法能以高通量形式檢測低濃度化合物，包括流式分析NMR和質(zhì)譜。這些分析工具或其它工具包括UV/Vis和IR譜、熒光光譜、發(fā)光等可用于同時檢測和定量酶促反應(yīng)中產(chǎn)生的新化合物。
在文庫篩選中不期望100％的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，因此宜建立分析技術(shù)，來檢測酶活性產(chǎn)生的特定變化。例如，可通過觀察與酶接觸后質(zhì)譜中14amu的增加，檢測重組酶文庫中對特定的感興趣的底物具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的酶的存在。因此，常?？商禺愋缘乇O(jiān)測和檢測此文庫導(dǎo)致的底物化學(xué)結(jié)構(gòu)中的改變。然后可將這些變化與能催化該特定反應(yīng)的重組酶文庫成員聯(lián)系起來。
另一種檢測酶文庫中能催化新底物的特定反應(yīng)的重組酶是否存在的方法是例如，在反應(yīng)過程中摻入一分子標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括例如放射性標(biāo)記如3H、14C、32P等。這可用放射性協(xié)同底物(如3H3甲基S-腺苷甲硫氨酸)來實現(xiàn)，其中僅標(biāo)記甲基化的反應(yīng)產(chǎn)物。還可采用其它標(biāo)記；許多是本領(lǐng)域已知的。例如，可用含有標(biāo)記的糖分子檢測糖基化。
在一些情況下，預(yù)計此改組文庫對底物作用的產(chǎn)物可提供一種比底物在外部應(yīng)力(如極端pH)下更穩(wěn)定的產(chǎn)物，或提高此化合物在特定溶劑中的穩(wěn)定性。還可用合適的分析方法或生物試驗方法監(jiān)測這種行為的改變。
在某些情況下，檢測新形成的產(chǎn)物可能需要通過標(biāo)準(zhǔn)層析方法(如TLC、HPLC、CE或GC)將該產(chǎn)物與底物分開。這之后可以進(jìn)行分光光度或其它(如火焰離子化、質(zhì)譜)方法，以檢測感興趣的新化合物的形成。
實施例提供下列實施例是為了說明，不是為了限制本發(fā)明。
實施例1糖基轉(zhuǎn)移酶文庫的產(chǎn)生和去萬古胺萬古霉素的產(chǎn)生的高通量篩選方法該實施例描述了如何產(chǎn)生重組糖基轉(zhuǎn)移酶文庫，和用這些酶產(chǎn)生去萬古胺萬古霉素的方法。
A.從東方擬無枝酸菌東方亞種菌株克隆gtfA、B、C、D、E基因1.gtf編碼DNA的產(chǎn)生基因組DNA的制備從ATCC和NRR1獲得了東方擬無枝酸菌東方亞種菌株ATCC43490和NRRL18098。根據(jù)提供者的推薦制備了瓊脂糖培養(yǎng)皿中的起始培養(yǎng)物。液態(tài)培養(yǎng)物在TSB，25℃-28℃生長2-5天。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Ausubel等(1987)Current Protocolsin Molecular Biology，第一版，John Wiley&Sons，Inc.NY)抽提基因組DNA。
加入引物進(jìn)行PCR用基因組DNA、1皮摩爾基因特異性引物、200微摩爾dNTP、2單位Deep Vent聚合酶和0.2單位其5’-3’外切核酸酶活性缺乏變體，在1.5M三甲銨乙內(nèi)酯和1-3.5mM MgSO4的50微升體積中，根據(jù)酶供應(yīng)商(New England Biolabs)的指南進(jìn)行PCR。在所有情況下使用用蠟珠(MβP)的熱起始。在DNA工程熱循環(huán)儀上，按下列方案設(shè)置循環(huán)開始95℃5分鐘；5輪95℃45秒，76℃1分鐘20秒；5輪95℃45秒，75℃1分鐘20秒；5輪95℃45秒，74℃1分鐘20秒；10輪95℃45秒，73℃1分鐘20秒；10輪95℃45秒，73℃1分鐘20秒。根據(jù)輸入序列U84349和U84350設(shè)計了所有引物。對于gtfA的擴增，使用了引物gtfA.For和gtfA.Rev。對于gtfB的擴增，使用了引物gtfB.For和gtfB.Rev。對于gtfC的擴增，使用了引物gtfC.For和gtfC.Rev。對于gtfD的擴增，使用了引物gtfD.For和gtfD.Rev。對于gtfE的擴增，使用了引物gtfE.For和gtfE.Rev(表1)。
表1引物、寡核苷酸和多核苷酸
用NdeI和EcoRV消化得到的PCR產(chǎn)物。用瓊脂糖凝膠電泳和QIAEXII(Qiagen)純化對應(yīng)于gtf基因的消化的PCR產(chǎn)物。
2.載體pCKZEBB的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)載體pCKZEBB衍生自pAK400(Krebber等(1997)J.Immunol.Meth.20135-55)。保留了pAK400的下列特征。保留lacIq基因壓制lac操縱子，保留lacIq基因和lac啟動子(lacp/o)之間的轉(zhuǎn)錄終止子(hpt)，以終止從lacI啟動子通讀轉(zhuǎn)錄入lac啟動子控制的操縱子，降低基線非誘導(dǎo)表達(dá)，保留lac啟動子操縱子，以引發(fā)轉(zhuǎn)錄和控制轉(zhuǎn)錄，保留在靶基因起始密碼子前面的來自T7噬菌體基因10的T7g10前導(dǎo)序列，能從NdeI限制性位點的ATG起始密碼子引發(fā)強翻譯。在NdeI-HindIII lac啟動子操縱子控制的表達(dá)盒后是lpp轉(zhuǎn)錄終止子(lppt)，然后是f1復(fù)制起始點，以產(chǎn)生單鏈RNA，然后是氯霉素抗性基因(camR)和雙鏈DNA復(fù)制的ColE1起點。
在pCKZEBB中，lac啟動子操縱子控制的多順反子信息，替換了pAK400中的lac啟動子操縱子控制的單順反子信息。lac啟動子轉(zhuǎn)錄的操縱子位于pAK400載體唯一的NdeI和HindIII之間。在pCKZEEB中，lacZ基因的變體(起始密碼子ATG摻入NdeI位點，除去內(nèi)部NdeI位點，在基因末端，終止密碼子前加入EcoRV位點，產(chǎn)生的EcoRv lacZ片段在載體中倒轉(zhuǎn))作為編輯片段插入NdeI EcoRV靶基因克隆位點?？捎冒刑腔D(zhuǎn)移酶基因替換該lacZ片段。在lacZ后面是生物素化的標(biāo)記(aa序列)，然后是衍生自trp基因末端的翻譯偶聯(lián)標(biāo)記。當(dāng)替換lacZ編輯(stuffer)片段時兩個標(biāo)記都在框內(nèi)與靶糖基轉(zhuǎn)移酶融合。翻譯偶聯(lián)標(biāo)記(TGA)終止密碼子的A核苷酸構(gòu)成了綠色熒光蛋白編碼基因(GFP；Crameri等(1996)Nature Biotechnol.14315-319)的翻譯起始密碼子部分。GFP基因后面是PCR克隆的birA基因，它含有BL21(DE3)的核糖體結(jié)合位點。似乎在birA基因中存在序列模糊性，因為在該區(qū)域中存在一個NcoI限制性位點。
圖19顯示了pCKZEBB的圖，此載體的核苷酸序列為SEQ ID NO19。
當(dāng)在30微克/毫升的氯霉素和1mMIPTG上生長時，用pCKZEBB轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不顯示綠色熒光。當(dāng)編輯lacZ片段被全長靶基因(框內(nèi)含有生物素化-翻譯偶聯(lián)標(biāo)記)所替換時，A)IPTG誘導(dǎo)的靶基因表達(dá)通過與GFP基因翻譯性偶聯(lián)打開了攜帶細(xì)菌綠色熒光的質(zhì)粒(Oppenheim&Yanofsky(1980)Genetics 95，785-795)，和B)該靶基因?qū)⒃隗w內(nèi)通過birA衍生的生物素全酶連接酶(Smith等(1998)Nul.Acids.Res.261414-1420)加上生物素化標(biāo)記而生物素化。(Schartz(1993)Bio/Technology111138-1143)。
3.gtfPCR克隆入pCKZEBB用NdeI和EcoRV切割載體pCKZEBB，作為兩部分除去lacZ基因編輯。得到的載體用牛小腸磷酸酶脫去磷酰基。用QIAEXII(Qiagen)從瓊脂糖凝膠上分離出對應(yīng)于該載體的DNA片段。將上述的EcoRV和NdeI消化的PCR產(chǎn)物按照標(biāo)準(zhǔn)方法連接到此載體片段中。連接后，用連接混合物轉(zhuǎn)化電穿孔的大腸桿菌TG1電感受細(xì)胞(Stratagene)，接種于含有30微克/毫升氯霉素和1mM IPTG的LB-瓊脂培養(yǎng)平板上，37℃生長過夜。挑選顯示不同程度熒光的綠色熒光菌落，并制備質(zhì)粒DNA。
4.限制性分析和測序用限制性酶分析得到的載體，測序含有插入物的克隆。鑒定能表達(dá)作為生物素化-翻譯偶聯(lián)標(biāo)記融合蛋白的糖基轉(zhuǎn)移酶之一的質(zhì)粒。采用攜帶了對應(yīng)于公開序列的基因的克隆，作為改組模板。
B.通過家族改組重組和突變單、雙、三、四和全部五個基因組合。
1.pCK載體中的wt基因擴增通過引物CK.For3和H3.Rev用聚合酶按照廠商推薦，從得到的質(zhì)粒(包括一些載體衍生的旁側(cè)序列)擴增糖基轉(zhuǎn)移酶基因。用Qiaquick柱(Qiagen)純化PCR。
2.隨機DNA片段的產(chǎn)生用DNAseI(Boehringer)消化衍生自各質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物。置于冰上停止反應(yīng)，從2％瓊脂糖凝膠中用玻璃過濾皿(glassfilter disks)(Whatman)和透析膜(Spectrapor)分離得到所需大小的片段(Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91107474-10751和Stemmer(1994)Nature 370389-391)。
3.糖基轉(zhuǎn)移酶基因的裝配對于各家族裝配反應(yīng)，調(diào)節(jié)了DNAsed DNA片段的幾種濃度和比例以及PCR循環(huán)參數(shù)，從而在步驟4中獲得最大量的改組基因(Crameri等(1998)Nature391288-291，Christians等(1999)Nature Biotechnol.17259-64)。
4.PCR拯救糖基轉(zhuǎn)移酶基因用2微升最終裝配反應(yīng)物作為模板。在最后的PCR反應(yīng)中，加入1微摩爾引物CK.For2和N3.Rev、每1單位Tag聚合酶加0.2mM各核苷酸。設(shè)定了下列PCR參數(shù)1輪96℃3分鐘；30輪96℃0.5分鐘，60℃0.5分鐘，72℃1.5分鐘；1輪，72℃5分鐘。
C.gtfPCR產(chǎn)物克隆入pCKZEBB用XbaI和EcoRV消化表達(dá)載體pCKZEBB和PCR拯救的改組的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。載體pCKZEBB另外脫去磷?；沫傊悄z中分離得到載體片段和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的PCR片段，并彼此連接。
用連接混合物轉(zhuǎn)化電感受態(tài)大腸桿菌TG1，接種于含30微克/毫升氯霉素、1％葡萄糖的LB-瓊脂中37℃振搖1小時后，37℃培養(yǎng)過夜。
D.糖基轉(zhuǎn)移酶文庫的預(yù)篩選、主平板的產(chǎn)生和表達(dá)將菌落挑入LB-Cam-葡萄糖平板中，并在37℃ON培養(yǎng)，產(chǎn)生主平板。從主平板上將菌落排列到LB-Cam-Agar上，37℃培育平板過夜。將平板暴露于365納米紫外線中，鑒定綠色熒光菌落。將主平板的各綠色熒光菌落重新排列在96孔平板上，該平板各孔中裝有100微升2YT-Cam30-1％葡萄糖，37℃培養(yǎng)過夜。將50微升培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1毫升2YTCam30-1毫克/毫升生物素中，16℃培養(yǎng)7小時。然后加入50微升100微摩爾IPTG，16℃培育培養(yǎng)物過夜。
E.用溶菌酶和硫酸多粘菌素B的組合裂解細(xì)胞離心培養(yǎng)物(4000rpm15分鐘)沉淀細(xì)胞。用500微升50mM甲酸銨(pH7.4)洗滌細(xì)胞沉淀，再沉淀一次。將細(xì)胞重懸于300微升裂解緩沖液(10微升Ready to Lyse溶菌酶)(Epicentre)、2微升RNaseA(Qiagen)、2微升DNAse I(Boehringer)、2微升1M MgSO4中，10毫升含1毫克/毫升硫酸多粘菌素B(sigma)的溶液、2mM DTT的50mM甲酸銨(pH7.4)的溶液，環(huán)境溫度攪拌30分鐘。然后離心(15分鐘，4000rpm)澄清裂解液。
F.用磁珠從單克隆純化蛋白質(zhì)將鏈霉親和素包裹的磁珠排列在96孔板中。洗滌磁珠，用珠的磁性和緩沖液(50微摩爾甲酸銨，pH7.4，2mM DTT)洗滌珠，重懸于每孔20微升緩沖液中。將澄清的細(xì)胞裂解液(100微升)轉(zhuǎn)移到裂解平板的珠中，在環(huán)境溫度下培育15分鐘。然后用緩沖液(150微升)洗滌5次，最后重懸于20微升緩沖液中。
G.用文庫中的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行化合物的體外修飾將反應(yīng)混合物(80微升)加到珠上的純化蛋白質(zhì)中，環(huán)境溫度攪拌珠過夜。反應(yīng)混合物含有150微摩爾萬古霉素苷元(如J.Chem.Soc.ChemCommun.(1988)1306-1307所述合成)、500微摩爾UDP葡萄糖、2mM DTT的50微摩爾甲酸銨pH7.4溶液。加入1體積甲醇淬滅反應(yīng)，離心混合物(2000rpm5分鐘)。將上清液(100微升)移到新的96孔板中，進(jìn)行質(zhì)譜分析。
H.測量糖基化的發(fā)生將淬滅的反應(yīng)混合物(10微升)注入正模式的三重四極電噴質(zhì)譜儀裝置中。使分子性離子通過第一個四極(萬古霉素苷元為1143amu，去萬古胺萬古霉素為1305amu)，在第二個四極中進(jìn)行碰撞，然后在第三個四極中檢測100amu的子代離子峰。該過程獲得的峰的積分與形成的產(chǎn)物直接成比例。這確定了文庫克隆在產(chǎn)生去萬古胺萬古霉素中的相對合理性。
I.過程的重復(fù)使用如需要，這些步驟可重復(fù)。例如，可用多個編碼特定衍生性酶的變體的基因，用從一個文庫獲得的單個基因，用回交的野生型基因改組的單個基因，用每個基因都編碼具有不同活性的酶的多個基因重復(fù)步驟B-H。
在此過程的變化中，可將步驟G中的UDP-葡萄糖用其它NDP-糖取代。調(diào)整了步驟H中的MS參數(shù)，以檢測預(yù)計的分子性離子。
實施例2用于產(chǎn)生甲紅霉素的甲基轉(zhuǎn)移酶文庫的產(chǎn)生和紅霉素6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的演化該實施例描述了重組O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT酶)文庫的產(chǎn)生和該文庫的酶對合成甲紅霉素(6-O-甲基紅霉素)衍生物的用途。
已顯示具有6-甲氧基的紅霉素同類物家族具有有用的藥物學(xué)性質(zhì)。這些化合物現(xiàn)在是通過多步化學(xué)甲基化紅霉素A及其同類物制備的(
圖11)。能選擇性的將活化的甲基轉(zhuǎn)移到6-羥基的酶能一步高產(chǎn)量的在體內(nèi)或作為一次生物轉(zhuǎn)化在體外生產(chǎn)這類紅霉素同類物。本實施例描述了獲得這些甲基轉(zhuǎn)移酶的方法。
此時未檢測到紅霉素6-OMT酶活性。因此必需建立一種新特異性的OMT酶。如果此文庫的序列多樣性源自天然存在的序列，而不是隨機點突變，通過抽取改組文庫104-105個成員的樣品，大大提高了發(fā)現(xiàn)新活性的機會。這樣的文庫跨越更大部分的序列空間含有豐富的功能性序列。因此，采用編碼(能特異性甲基化類似于紅霉素6-羥基的底物的)OMT酶的同源基因家族進(jìn)行DNA改組。由于不能確定該家族的那個成員在產(chǎn)生6-OMT酶活性中更加強影響，制備了各種改組文庫。例如，對各亞家族單獨改組，或整個家族一起改組。這可用幾種改組方式(設(shè)計用于影響高序列相同性和低序列相同性的基因重組)實現(xiàn)。
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶(MT)構(gòu)成了一類酶，它們能形成蛋白質(zhì)、核酸、糖、多糖、脂類、木質(zhì)素和各種低分子量化合物(如大環(huán)內(nèi)酯)的甲基酯、甲基醚、甲基硫醚、甲基胺和甲基酰胺衍生物。SAM攜帶著能有效轉(zhuǎn)移到具有廣譜化學(xué)反應(yīng)性的親核試劑上的活化甲基。該活化的甲基從SAM轉(zhuǎn)移到接受體的親核試劑是熱力學(xué)理想的，因此能驅(qū)動此甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)至基本完成(
圖12)。已知7個基因家族編碼的SAM-依賴性O(shè)MT酶，對碳霉素、麥迪霉素、番紅霉素(saframycin)、雷帕霉素、利福霉素和FK506的仲醇有特異性(
圖13)。這些底物親核試劑與紅霉素A的6-羥基比較，提示親代OMT酶接受紅霉素作為底物只需要對局部特性上作極小的調(diào)整。其它感興趣的基因是編碼ERYG的基因，它O-甲基化紅霉素C的碳霉糖基團(tuán)，導(dǎo)致合成紅霉素A。EryG在DNA水平上與rapQ共有54％的相同性，可能提供了含有叔醇OMT酶活性的其它OMT酶亞家族(
圖14)。
待改組的基因可從基因組DNA或PCR合成的寡核苷酸合成。然后將這些基因克隆入合適的載體，用于表達(dá)。編碼碳霉素-4-OMT酶的基因的完整序列未知，但是可克隆該基因，或用其它OMT酶的全序列改組其部分序列。
產(chǎn)生了幾個SAM依賴性O(shè)MT酶的文庫。針對紅霉素A及其同類物篩選這些文庫的6-OMT酶活性。合并已鑒定的克隆并進(jìn)一步演化，將酶改進(jìn)到實用活性水平。
通常須篩選該改組家族的104-105個克隆，以鑒定具有去氧紅霉素(deserythormycin)6-OMT酶活性的克隆。在去氧紅霉素A的存在下培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物，然后取出這些培養(yǎng)物的上清液，檢測6-O-甲基去氧紅霉素A肟的存在。將OMT酶基因與已鑒定的克隆相分離，合并，改組，然后篩選活性提高的去氧紅霉素A 6-OMT酶。繼續(xù)進(jìn)行另一輪改組和篩選，直到酶活性達(dá)到適用于生產(chǎn)6-O-甲基去氧紅霉素的水平。
為了確保對有用活性的鑒定，可篩選此改組文庫針對紅霉內(nèi)酯B、去氧紅霉素A、紅霉素A及其肟衍生物的6-OMT酶活性。雖然可能在原始文庫中檢測不到去氧紅霉素A肟6-OMT酶活性，但具有其它6-OMT酶活性的克隆可能存在。然后這些克隆可用于下面輪次的改組，以進(jìn)一步定制6-OMT酶的特異性。例如，如果檢測到對紅霉素A有活性，可首先篩選后面文庫對去氧紅霉素A的活性，最后篩選對去氧紅霉素肟的活性。用該方法預(yù)計從每個新文庫僅產(chǎn)生專一性的精細(xì)改變。
基因和文庫產(chǎn)生分離得到了編碼麥迪霉素3’O-甲基轉(zhuǎn)移酶(mdmC)、黃樟霉素(safromycin)O-甲基轉(zhuǎn)移酶(safC)、雷帕霉素31-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(rapI)和FK506 31-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(fkbM)(
圖13)的開放閱讀框的基因，將其克隆入合適的大腸桿菌表達(dá)載體(pET22B(+))中。對這些基因(相同性范圍是50-80％)然后進(jìn)行家族改組，改組產(chǎn)生一個編碼嵌合性O(shè)-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT酶)的基因文庫。將此文庫克隆回表達(dá)載體，在合適的大腸桿菌宿主(BL21(DE3))中表達(dá)?，F(xiàn)在可篩選該文庫中具有新特性的嵌合酶，如對于目標(biāo)甲基化的新特異性。
OMT酶活性的遺傳篩選可以高通量用以下試驗測量OMT酶活性。該試驗?zāi)軠y量(3H)S-腺苷甲硫氨酸放射性標(biāo)記的甲基轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到所需的供體分子(見
圖15)。此試驗是依據(jù)標(biāo)記的甲基從帶電荷高的分子(SAM)轉(zhuǎn)移到更疏水的分子(
圖12)。用有機溶劑抽提反應(yīng)物，使未反應(yīng)的SAM留在水相中，而甲基化的底物選擇性地抽提入有機相。然后測量有機相中的放射性含量。該試驗的優(yōu)點是一般它可用于可抽提的底物，非常高通量，可用于同時對化合物集合的活性作篩選。方法如下淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)是一種特別合適的宿主，有至少兩個理由第一，它可用從大腸桿菌分離的質(zhì)粒DNA高效轉(zhuǎn)化。第二，它對紅霉素及其同類物是可滲透的，所以可試驗全細(xì)胞而不是裂解液。另外，可用高通量形式測量大腸桿菌或枯草桿菌細(xì)胞抽提物的酶活性。將純化的酶或細(xì)胞裂解液加到50mM磷酸緩沖液，pH7.5(含有0.4mM MgSO4、0.1mM DTT、0.1mM(3H)S-腺苷甲硫氨酸和1-10mM靶底物)的試驗混合物中。培育后，加入乙酸乙酯淬滅反應(yīng)。取出有機相的樣品(50微升)，與閃爍試劑(150微升)混合，用96孔閃爍計數(shù)儀測量放射性。放射活性高于沒加酶的對照樣品的樣品克隆，視為陽性，可在更好的定量試驗中進(jìn)一步研究。
甲紅霉素合成酶的演化甲紅霉素是6-O-甲基紅霉素。目前制備甲紅霉素的方法是紅霉素的7步化學(xué)甲基化。能一步進(jìn)行該化學(xué)反應(yīng)的酶可能提供一種通過發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化制備甲紅霉素的方法(見
圖16)。為了建立這樣的酶，篩選OMT酶文庫的紅霉素6-O-甲基化活性。
將改組的OMT酶文庫接種在固態(tài)培養(yǎng)基上，以分離各克隆。將各克隆挑入含有LB培養(yǎng)液(200微升)和氨芐青霉素(100微克/毫升)的96孔平板中。30℃培養(yǎng)平板10小時，或直到培養(yǎng)物達(dá)到0.7的光密度。加入0.1mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，以誘導(dǎo)MT酶的表達(dá)，細(xì)胞再培養(yǎng)3個小時。離心平板，丟棄上清。將細(xì)胞沉淀重懸于50mM磷酸緩沖液配的pH7.5裂解緩沖液(200微升)中，該緩沖液含有1mM EDTA、1mM DTT、2微克/毫升的硫酸多粘菌素B和1毫克/毫升T4溶菌酶。反應(yīng)物30℃培育15分鐘。
用96頭液體搬運站(如MultimekTM)將各孔(20微升)樣品轉(zhuǎn)移到含有甲紅霉素合成試驗緩沖液(280微升)的96深孔平板中。此緩沖液是50mM磷酸緩沖液，pH7.5，含有0.4mM MgSO4、0.1mM DTT、0.1mM(3H)S-腺苷甲硫氨酸和1mM紅霉素。反應(yīng)物30℃保溫1小時。在各孔中加入乙酸乙酯(300微升)，劇烈振搖平板，離心，取出上面有機相中的樣品(50微升)，加到含有閃爍液(150微升)的平板中。然后用平板閃爍計數(shù)器閱讀此平板。與攜帶親代基因或無MT酶基因的樣品相比，有機相中有放射性的樣品可能含有能將甲基轉(zhuǎn)移到紅霉素上的酶。因為在紅霉素上有5個可轉(zhuǎn)移甲基的羥基，必須分辨其是否轉(zhuǎn)移到6-羥基上。
甲紅霉素合成酶的二次試驗甲紅霉素的二次試驗是以用硼酸苯酯化學(xué)修飾，并用質(zhì)譜分析為基礎(chǔ)的。紅霉素可以在5個位置(大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的6、11或12位，或在克拉定糖或脫氧糖胺上)被O-甲基化。硼酸苯酯可專一性的與順式二醇結(jié)合，例如紅霉素的11，12二醇。因此如果硼酸苯酯與酶促產(chǎn)生的甲基化紅霉素結(jié)合，此甲基不可能位于11或12位。為了測定修飾的紅霉素是否是甲紅霉素，進(jìn)行了下列試驗。
如上所述進(jìn)行了紅霉素的酶促反應(yīng)甲基化，除了修飾用的SAM未放射性標(biāo)記外，一細(xì)胞的抽提物顯示放射性試驗陽性。從反應(yīng)混合物抽提后，用二維質(zhì)譜(MS/MS)分析有機相，其中親低離子片段化成亞分子片段(見
圖17)。
甲紅霉素具有陽離子分子量748.48，帶正電是因為脫氧糖胺的胺質(zhì)子化。甲紅霉素陽離子片段化后，克拉定糖和脫氧糖胺可與大環(huán)內(nèi)酯環(huán)相分離，然而僅檢測到含有脫氧糖胺的分子，因為它們帶有胺。748.48離子的片段化得到兩個不同的新離子590.4和158.12。590離子是6-O-甲基去氧紅霉素A(缺乏克拉定糖基團(tuán)的甲紅霉素)。158.12離子是脫氫脫氧糖胺，除去大環(huán)內(nèi)酯環(huán)5-羥基的結(jié)果。具有590和158離子的748.48峰的MS/MS質(zhì)譜不同于大環(huán)內(nèi)酯環(huán)上(即在6、11或12位)甲基化的紅霉素衍生物。如果樣品顯示該質(zhì)譜，那么須作進(jìn)一步分析以確定是否它是6位甲基化的。用過量硼酸苯酯在中性條件下處理此有機抽提物，然后用質(zhì)譜分析。如果只在6位修飾，11和12位游離可形成與硼酸苯酯的加合物。因此，834.52離子，甲紅霉素硼酸苯酯加合物的存在表明樣品含有甲紅霉素，以及對應(yīng)的克隆編碼紅霉素6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶。
應(yīng)理解本文所述的例子和實施例僅為了說明，以此為根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員可提出各種修改或改變，這些修改和改變均包括在申請和權(quán)利要求范圍內(nèi)的精神和預(yù)測中。本文引用的所有出版物、專利和專利申請在此引入以供參考。
權(quán)利要求
1.一種獲得有機分子衍生物文庫的方法，其特征在于，該方法包括使有機分子與重組衍生性酶文庫的一個或多個成員以及其它必需的反應(yīng)物接觸，形成有機分子衍生物文庫，其中衍生性酶催化選自以下的反應(yīng)a)修飾一個或多個存在于有機分子上的官能團(tuán)；b)在存在于有機分子上的一個或多個官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)；和c)引入新的官能團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括將所述有機分子衍生物文庫與第二個重組衍生性酶文庫以及其它必需的反應(yīng)物接觸，形成另一個有機分子衍生物文庫，其中第二個文庫的衍生性酶催化選自以下的反應(yīng)a)修飾一個或多個官能團(tuán)；b)在一個或多個官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)；和c)引入新的官能團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第二個文庫的衍生性酶在被第一個文庫的衍生性酶修飾或加上的官能團(tuán)上，催化修飾或加上一個化學(xué)基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在與重組衍生性酶文庫接觸后，還通過化學(xué)或酶促反應(yīng)對該有機分子衍生物文庫的一個或多個成員進(jìn)行衍生。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過改組方法獲得此重組衍生性酶文庫。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述改組方法包括(1)重組至少第一和第二種形式的編碼衍生性酶的核酸來產(chǎn)生重組多核苷酸文庫，所述第一和第二種形式的核酸彼此有兩個或多個核苷酸不同；和(2)表達(dá)該重組多核苷酸的文庫，獲得重組衍生性酶文庫。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，重組步驟在體外進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，該方法還包括(3)重組編碼該重組衍生性酶文庫一個成員的至少一種重組多核苷酸和另一種編碼衍生性酶的核酸，所述核酸可以與第一和第二種形式相同或不同，來產(chǎn)生另一個重組核酸文庫；(4)表達(dá)另一個重組多核苷酸文庫，獲得另一個重組衍生性酶文庫；和(5)如需要重復(fù)(3)和(4)，直到另一個重組衍生性酶文庫含有所需數(shù)量的不同重組衍生性酶。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該方法中至少一個重組步驟是在體外進(jìn)行的。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述改組方法包括(1)在一群不同多核苷酸的重疊區(qū)段上，引發(fā)多核苷酸擴增過程，條件是一個區(qū)段作為另一個區(qū)段延伸的模板，來產(chǎn)生一群重組多核苷酸；和(2)選擇或篩選有所需特性的重組多核苷酸。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，重疊區(qū)段是通過切割該變種多核苷酸群產(chǎn)生的。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，切割是通過DNase I消化。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，重疊區(qū)段是通過化學(xué)合成產(chǎn)生的。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，重疊區(qū)段是通過擴增所述多核苷酸群產(chǎn)生的。
15.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述變種多核苷酸群是等位基因的變體。
16.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述變種多核苷酸群是種間變體。
17.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述改組方法包括(1)雜交至少兩組核酸，其中第一組核酸含有單鏈核酸模板，第二組核酸含有至少一組核酸片段；和(2)延伸、連接或同時延伸和連接雜交核酸片段之間的缺口，產(chǎn)生至少基本全長的對應(yīng)于單鏈核酸模板的嵌合性核酸序列，從而重組了該組核酸片段。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，該方法還包括(3)使至少基本全長的嵌合性核酸序列和單鏈核酸模板變性；(4)通過至少一種分離技術(shù)，將至少基本全長的嵌合性核酸序列與單鏈核酸模板相分離；和用核酸酶消化或物理片段化使分離的至少基本全長的嵌合性核酸序列片段化，得到嵌合性核酸片段。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述有機分子是前導(dǎo)化合物。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述有機分子是天然存在的化合物。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述有機分子是非天然存在的化合物。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使重組衍生性酶文庫的成員與有機分子各個接觸。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該重組衍生性酶文庫的成員在與有機分子接觸前細(xì)分成多個庫。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重組衍生性酶文庫的成員以重組衍生性酶的混合物與該有機分子接觸。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過將重組多核苷酸引入可復(fù)制遺傳包裝載體中來表達(dá)此重組多核苷酸，從而產(chǎn)生其編碼的重組衍生性酶，作為與展示在可復(fù)制遺傳包裝表面的蛋白質(zhì)相融合的蛋白。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，可復(fù)制遺傳包裝選自噬菌體、細(xì)胞、孢子和病毒。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶催化有機分子上一個或多個官能團(tuán)的修飾或用另一個官能團(tuán)代替一個或多個官能團(tuán)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述官能團(tuán)是氫，取代是用羥基取代。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，衍生性酶選自單氧化酶和二氧化酶。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，衍生性酶催化在有機分子中引入新的官能團(tuán)。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，衍生性酶選自鹵化酶和磺基轉(zhuǎn)移酶。
32.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶能催化在一個或多個官能團(tuán)上加上一化學(xué)基團(tuán)。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶選自糖基轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶、酰胺酶、甲基轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶是?；D(zhuǎn)移酶，所述化學(xué)基團(tuán)選自乙烯酯、三鹵乙基、酯、羧酸乙烯酯、氨基甲酸乙烯酯、肟酯、羧酸肟和雙功能基團(tuán)。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶是糖基轉(zhuǎn)移酶，所述化學(xué)基團(tuán)選自糖苷、氨基糖苷和糖苷酸。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶是糖基轉(zhuǎn)移酶，所述有機分子選自無糖基萬古霉素HCl、促生長素抑制素、膽酸、L-甲狀腺素、諾加霉素、丁香醛連氮、阿柔比星、鹽酸羥芐羥麻黃堿、利福霉素和瑞斯托霉素。
37.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶是O-甲基轉(zhuǎn)移酶，所述有機分子是紅霉素。
38.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶是酰胺酶，所述化學(xué)基團(tuán)選自酰胺和肽。
39.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括篩選有機分子衍生物文庫，以鑒定顯示所需特性的那些有機分子衍生物。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所需特性是與靶分子結(jié)合。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述靶分子選自受體、信號蛋白和配體。
42.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，該方法還包括篩選重組衍生性酶文庫，以鑒定能催化有機分子修飾的成員，其可賦予產(chǎn)生的有機分子衍生物所需特性。
43.一種獲得能催化所需有機分子衍生物合成的酶的方法，其特征在于，該方法包括使有機分子與重組衍生性酶文庫的成員和其它必需反應(yīng)物接觸，形成有機分子衍生物文庫；在有機分子衍生物文庫中鑒定所需的有機分子衍生物；和鑒定能催化所需有機分子衍生物合成的重組衍生性酶文庫的成員。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，使重組衍生性酶文庫的成員分別與有機分子接觸。
45.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，將重組衍生性酶文庫的成員在與有機分子接觸前細(xì)分成多個庫。
46.一種重組衍生性酶文庫，其特征在于，當(dāng)該重組衍生性酶與具有一個或多個官能團(tuán)的有機分子接觸時，能催化選自以下的反應(yīng)a)修飾一個或多個官能團(tuán)；b)在一個或多個官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)；和c)引入新的官能團(tuán)。
47.如權(quán)利要求46所述的文庫，其特征在于，重組衍生性酶各含有多個氨基酸組件，所述組件在天然存在的衍生性酶中是不鄰接的。
48.如權(quán)利要求47所述的文庫，其特征在于，重組衍生性酶各含有多個氨基酸組件，所述組件起源于兩個或多個衍生性酶的同源物。
49.一種有機分子衍生物文庫，其特征在于，該文庫是通過使具有一個或多官能團(tuán)的有機分子與多個重組衍生性酶文庫的成員接觸而經(jīng)生物催化合成的，所述重組衍生性酶文庫成員能催化選自以下的反應(yīng)a)修飾一個或多個官能團(tuán)；b)在一個或多個官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)；和c)引入新的官能團(tuán)。
50.如權(quán)利要求49所述的文庫，其特征在于，所述重組衍生性酶是通過以下獲得的重組至少第一和第二種形式的編碼衍生性酶的核酸，其中第一和第二種形式彼此至少有兩個或多個核苷酸不同，來產(chǎn)生重組多核苷酸文庫；和表達(dá)所述重組多核苷酸文庫，獲得重組衍生性酶文庫。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組衍生酶文庫,這些酶可用于生物催化合成有機分子的衍生物,包括藥用前導(dǎo)化合物。該重組衍生性酶能催化有機分子上官能團(tuán)的修飾或置換等反應(yīng),或在已存在的官能團(tuán)上加上化學(xué)基團(tuán)。使用重組酶文庫能獲得催化有機分子衍生物形成的酶,這種衍生物僅用天然存在的酶是不能產(chǎn)生的。
文檔編號C12N15/52GK1378598SQ00811801
公開日2002年11月6日 申請日期2000年8月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月12日
發(fā)明者C·克雷布爾, S·C·戴維斯, S·德爾卡德雷, S·A·塞利馮弗, R·霍華德, 劉璐 申請人:麥克西根股份有限公司