專利名稱：糖尿病性心血管病變相關(guān)基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼大鼠糖尿病性心血管病變相關(guān)蛋白R(shí)DCR3(Rat Diabetic Cardiomyopathy Related gene 3，大鼠糖尿病性心血管病變相關(guān)基因3)的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。
背景技術(shù)：
2型糖尿病性心血管病變不僅是患者的主要死因，也較一般人群發(fā)生率高、發(fā)展進(jìn)程快、病情重，加強(qiáng)其發(fā)病機(jī)理的研究十分必要。
雖然人們已認(rèn)識(shí)到發(fā)病過程中蛋白質(zhì)非酶糖化、自由基產(chǎn)生過多、多元醇代謝亢進(jìn)、脂蛋白的多態(tài)性、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子多種介質(zhì)等的相互作用，但這方面的研究進(jìn)展甚微，主要有兩方面的原因，一是臨床上心臟及血管標(biāo)本取材困難；二是受研究方法學(xué)的限制。
疾病的發(fā)生、發(fā)展無不源于相互作用的相關(guān)基因尤其它們?cè)缙诒磉_(dá)的差異，但迄今為止對(duì)于糖尿病性心血管病變相關(guān)基因早期的差異表達(dá)及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究幾乎處于空白。隨著人類基因組草圖的完善，以及生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，用整體、動(dòng)態(tài)的觀點(diǎn)去探索疾病的發(fā)生機(jī)理勢(shì)在必行，揭示疾病早期相關(guān)基因表達(dá)譜的變化不僅是生命科學(xué)研究的一個(gè)重要方向，對(duì)于指導(dǎo)下一步的臨床研究也具有重要意義。
然而，迄今為止人們對(duì)與糖尿病性心血管病變相關(guān)基因還知之甚少，因此，本領(lǐng)域迫切需要尋找和開發(fā)新的糖尿病性心血管病變相關(guān)基因及其編碼蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的糖尿病性心血管病變相關(guān)蛋白R(shí)DCR3蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的RDCR3多肽，它包括具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；
(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進(jìn)心肌誘導(dǎo)分化功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述大鼠RDCR3多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中166-798位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1219位的序列的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有RDCR3蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)RDCR3蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有RDCR3蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的RDCR3多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗RDCR3多肽活性的化合物，以及抑制RDCR3多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是RDCR3多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測(cè)樣品中是否存在RDCR3蛋白的方法，它包括將樣品與RDCR3蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在RDCR3蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測(cè)與RDCR3多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測(cè)編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)RDCR3多肽活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制RDCR3多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的RDCR3蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量(如0.01-99.99wt％)的本發(fā)明的RDCR3多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療糖尿病性心血管病變等病癥。
在本發(fā)明的第十一方面，提供了一種篩選影響RDCR3蛋白表達(dá)的物質(zhì)的方法，包括步驟(a)在測(cè)試物質(zhì)存在下，培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞作為測(cè)試組，并且在無測(cè)試物質(zhì)存在下，培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞作為對(duì)照組；(b)測(cè)定測(cè)試組和對(duì)照組中RDCR3蛋白的表達(dá)情況，其中如果測(cè)試組中RDCR3蛋白的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組就表明該測(cè)試物質(zhì)是促進(jìn)RDCR3蛋白表達(dá)的物質(zhì)，如果測(cè)試組中RDCR3蛋白的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組就表明該測(cè)試物質(zhì)是抑制RDCR3蛋白表達(dá)的物質(zhì)。
較佳地，步驟(b)是通過RT-PCR法或ELISA法檢測(cè)RDCR3蛋白表達(dá)情況。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本圖1是表達(dá)載體pGEX-4T-1-RDCR3的構(gòu)建示意圖。
圖2顯示了RDCR3的滴定曲線及等電點(diǎn)。
圖3A顯示了對(duì)RDCR3二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析結(jié)果，其中H表示螺旋，E表示strand，-表示無預(yù)測(cè))圖3B顯示了對(duì)RDCR3二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析結(jié)果，其中采用Chou&Fasman和Garnier-Osguthorpe-Robson法來預(yù)測(cè)螺旋和轉(zhuǎn)角。
圖4顯示了RDCR3不同組織中的差異表達(dá)情況。泳道1-11分別是下丘腦、垂體、肺、脾、胰臟、脂肪、腎上腺、腎、肝、主動(dòng)脈、心臟、骨骼肌圖5RDCR3的mRNA在不同組織中的分布圖6顯示了RDCR3編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中擴(kuò)增片段為650bp圖7顯示GST-RDCR3表達(dá)和純化的SDS-PAGE分析結(jié)果。其中各泳道如下泳道1.分子量標(biāo)準(zhǔn)品(103道爾頓)97.4，66.2，43，31，20.1，(14.4)；泳道2.在IPTG誘導(dǎo)前的細(xì)菌蛋白；泳道3.在IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白；泳道4.誘導(dǎo)蛋白的上清液；泳道5.誘導(dǎo)蛋白的沉淀物；泳道6.用親和層析純化的GST-RDCR3。
圖8顯示了重組GST-RDCR3蛋白的Western印跡分析結(jié)果，表明分子量約為50Kda。
圖9顯示了的基因組序列，其中省略號(hào)處為基因組未測(cè)通部分，下劃線處為外顯子部分。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首先從建立2型糖尿病性心血管病變的大鼠模型入手，以熒光標(biāo)記的mRNA差異顯示技術(shù)篩選出病變?cè)缙诓町惐磉_(dá)基因RDCR3(RatDiabetic Cardiomyopathy Related Gene 3)，并應(yīng)用生物信息學(xué)分析該相關(guān)基因及其蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，并用試驗(yàn)驗(yàn)證了RDCR3的確是一種與2型糖尿病性心血管病變相關(guān)的蛋白。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明人成功建立了2型糖尿病性心血管病變大鼠模型并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分析。2月齡SD大鼠高熱量飲食喂養(yǎng)2個(gè)月后給予小劑量STZ(15mg/kg)建立2型糖尿病模型，模型建立后半個(gè)月、1.5-2個(gè)月、6個(gè)月取大鼠心肌電鏡觀察及胰島素-葡萄糖耐量試驗(yàn)、胰島免疫組化和其它糖代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，并與大、小劑量STZ、單純高熱量飲食等各組大鼠相應(yīng)指標(biāo)比較。各項(xiàng)指標(biāo)說明，該模型具有外周胰島素抵抗和胰島功能僅輕微受損等特征，超微結(jié)構(gòu)觀察證實(shí)心肌病變隨著病程延長(zhǎng)而加重。
本發(fā)明的2型糖尿病性心血管病變模型的主要特點(diǎn)在于①與人類普通2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程相似。
②STZ用量小，而低劑量的STZ應(yīng)用能最大限度地避免其胰腺外非選擇性的作用。
③該模型動(dòng)物無需治療生命即能維持較長(zhǎng)時(shí)間，可用于2型糖尿病慢性并發(fā)癥的相關(guān)研究。
④2型糖尿病模型建立后，心肌包括線粒體的數(shù)量和質(zhì)量、細(xì)胞間質(zhì)在內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)先后發(fā)生改變，同時(shí)也觀察到電鏡下主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷和平滑肌增殖等。由于這種接近人類普通2型糖尿病模型的大鼠具備多個(gè)罹患心血管疾病的危險(xiǎn)因素高血糖、高血脂、高胰島素血癥，并隨著病程逐漸出現(xiàn)人類心血管病變的特征性改變，從而為糖尿病這種特定狀態(tài)下心血管系統(tǒng)病變相關(guān)基因的篩選奠定了基礎(chǔ)。
基于糖尿病性心血管病變模型，本發(fā)明人應(yīng)用熒光標(biāo)記的DDRT-PCR技術(shù)篩選相關(guān)基因。具體地，在2型糖尿病大鼠模型建立后半個(gè)月，抽提大鼠心肌總RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記的mRNA差異顯示分析，Northern印跡及半定量RT-PCR證實(shí)候選基因的差異表達(dá)。從5000多個(gè)條帶中選擇分離并克隆得到63個(gè)差異表達(dá)的序列，其中已知基因32個(gè)，已知EST 10個(gè)，新EST 21個(gè)，新基因若干。一種新的糖尿病性心血管病變相關(guān)基因是RDCR3，該基因在心血管病變的心肌中表達(dá)上調(diào)。
運(yùn)用相同組織mRNA進(jìn)行Norhern驗(yàn)證，和組織表達(dá)譜研究，進(jìn)一步證明了DD-PCR的結(jié)果。另外，新生鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行高糖和低糖培養(yǎng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)證實(shí)高糖情況下RDCR3基因的表達(dá)高于低糖(p＜0.05)。這表明，RDCR3可以作為早期診斷或輔助診斷糖尿病性心血管病變的一個(gè)標(biāo)志物。
在本發(fā)明中，術(shù)語“RDCR3蛋白”、“RDCR3多肽”或“糖尿病性心血管病變相關(guān)蛋白R(shí)DCR3”可互換使用，都指具有大鼠糖尿病性心血管病變相關(guān)蛋白R(shí)DCR3氨基酸序列(SEQID NO2)的蛋白或多肽。應(yīng)理解，該術(shù)語還包括其他哺乳動(dòng)物中的同源蛋白，例如人的RDCR3蛋白。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的糖尿病性心血管病變相關(guān)蛋白R(shí)DCR3。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的RDCR3蛋白或多肽”是指RDCR3多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化RDCR3蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。RDCR3多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括大鼠RDCR3蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然大鼠RDCR3蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“RDCR3多肽”指具有RDCR3蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與大鼠RDCR3蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括RDCR3蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與RDCR3 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗RDCR3多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含RDCR3多肽或其片段的融合蛋白(如GST融合蛋白)。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了RDCR3多肽的可溶性片段。通常，該片段具有RDCR3多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供RDCR3蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然大鼠RDCR3多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“RDCR3蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
在本發(fā)明中，術(shù)語“RDCR3蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有RDCR3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO1中第166-798位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1中從核苷酸第166-798位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO1中從核苷酸第166-798位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的RDCR3相同功能的蛋白的、SEQ ID NO1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼RDCR3蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的RDCR3核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或RDCR3蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的RDCR3多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼大鼠RDCR3多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，RDCR3多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含RDCR3編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的RDCR3蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療RDCR3蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)筊DCR3蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組RDCR3蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激RDCR3蛋白功能的多肽分子。由于RDCR3在高糖條件下表達(dá)上調(diào)，因此預(yù)期可以抑制或減少RDCR3表達(dá)的物質(zhì)是治療糖尿病性心血管病變的潛在候選物。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)RDCR3 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于RDCR3基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與RDCR3基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制RDCR3蛋白的分子，也包括那些并不影響RDCR3蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的RDCR3基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的RDCR3基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)RDCR3蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷RDCR3蛋白功能的抗體以及不影響RDCR3蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用RDCR3基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與RDCR3基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗RDCR3蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的RDCR3蛋白。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與RDCR3蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷RDCR3蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計(jì)成針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如大鼠RDCR3蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅大鼠RDCR3蛋白陽性的細(xì)胞。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用大鼠RDCR3蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與RDCR3蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于糖尿病性心血管病變方面的治療。在使用本發(fā)明RDCR3蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療糖尿病性心血管病變的治療劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明RDCR3多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的RDCR3蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
大鼠RDCR3蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于RDCR3蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的RDCR3蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計(jì)成表達(dá)變異的RDCR3蛋白，以抑制內(nèi)源性的RDCR3蛋白活性。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將RDCR3基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶RDCR3基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組大鼠RDCR3基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制大鼠RDCR3 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長(zhǎng)度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與大鼠RDCR3蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時(shí)，必須對(duì)大鼠RDCR3蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)RDCR3蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的RDCR3蛋白水平，可以用于輔助診斷RDCR3蛋白起作用的疾病(如糖尿病性心血管病變)。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在RDCR3蛋白的方法是利用RDCR3蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與RDCR3蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在RDCR3蛋白。
RDCR3蛋白的多聚核苷酸可用于RDCR3蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，RDCR3蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)RDCR3蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下RDCR3蛋白的異常表達(dá)。如RDCR3 DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷RDCR3蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用RDCR3蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)RDCR3蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)RDCR3基因的突變也可用于診斷RDCR3蛋白相關(guān)的疾病。RDCR3蛋白突變的形式包括與正常野生型RDCR3 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從大鼠2型糖尿病的心肌細(xì)胞中克隆獲得的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長(zhǎng)為1219個(gè)堿基，其開放讀框位于166-798位，編碼全長(zhǎng)為211個(gè)氨基酸的大鼠RDCR3蛋白(SEQ ID NO2)。
可為治療糖尿病性心血管病變等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1、制備糖尿病大鼠模型1.1動(dòng)物和材料清潔級(jí)雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠100只，2月齡，體重(250±20)g，購自BK公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)滬動(dòng)152；STZ(鏈脲佐菌素)購自Sigma公司提供；血糖、甘油三酯、膽固醇等生化檢測(cè)試劑盒購自名典生物工程有限公司；中性單峰純胰島素購自萬邦生化制藥有限公司；胰島素一抗及相關(guān)免疫組化試劑購自邁新公司；大鼠專用胰島素放免試劑盒購自Linco公司。
飲食成分普通飼料平均熱量3.9cal/g，其中碳水化合物占60％，蛋白質(zhì)占22％，脂肪占10％(豆油為主)，包括纖維素在內(nèi)的其他成分占8％；高脂飼料平均熱量5.1cal/g，其中碳水化合物占50％，蛋白質(zhì)占13％，脂肪占30％(動(dòng)物油脂為主)，包括纖維素在內(nèi)的其他成分占7％。
1.2預(yù)實(shí)驗(yàn)。
確定各組STZ的劑量、高脂飲食后STZ干預(yù)時(shí)間。
1.3動(dòng)物分組。
大鼠隨機(jī)(按隨機(jī)排列表法)分為A-F共6組，A、E每組20只，其余每組15只。每日光照12h，自由飲水進(jìn)食。
A組正常對(duì)照組，普通飼料喂養(yǎng)后2個(gè)月大鼠一次性尾靜脈注射pH4.5，0.1mol/L檸檬酸緩沖液0.5mL(同以下注射液量)，。B組小劑量STZ組即15mg/kg STZ組，普通飼料喂養(yǎng)后2個(gè)月大鼠STZ15mg/kg一次性尾靜脈注射(STZ溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液中，pH4.5)。C組大劑量STZ組即50mg/kg STZ組，普通飼料喂養(yǎng)后2個(gè)月大鼠STZ50mg/kg一次性尾靜脈注射。D組高脂組，高脂飼料喂養(yǎng)后2個(gè)月的大鼠一次性尾靜脈注射檸檬酸緩沖液。E組高脂喂養(yǎng)2個(gè)月后15mg/kg STZ組，大鼠高脂飼料喂養(yǎng)2個(gè)月后一次性尾靜脈注射STZ15mg/kg。F組高脂喂養(yǎng)一個(gè)月后15mg/kg STZ組，普通飼料和高脂先后喂養(yǎng)一個(gè)月后大鼠一次性尾靜脈注射STZ15mg/kg。尾靜脈注射后A、B、C組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，D、E、F組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。
1.4標(biāo)本采集及檢測(cè)。
1.4.1動(dòng)態(tài)觀察大鼠體重、飲水量、食量。
1.4.2STZ或檸檬酸緩沖液尾靜脈注射后2天(即大鼠喂養(yǎng)至4月齡)的標(biāo)本采集。A-F組大鼠分別進(jìn)行空腹?fàn)顟B(tài)下(禁食8h，以下同)尾靜脈采血，測(cè)其血糖、血脂水平。
1.4.3STZ注射后2個(gè)月(即大鼠喂養(yǎng)至6月齡)A-F組的標(biāo)本采集及相關(guān)糖代謝分析。
14.3.1分別測(cè)定空腹?fàn)顟B(tài)下血中葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、胰島素含量。
1.4.3.2通過葡萄糖-胰島素耐量試驗(yàn)測(cè)胰島素敏感性。
方法如下大鼠禁食8h后苯巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射，行股靜脈、股動(dòng)脈插管。繼股靜脈注射葡萄糖0.7g/kg后注射胰島素0.175U/kg，于0，2，4，6，8，10，20，30min股動(dòng)脈抽血0.3ml，分離血清檢測(cè)血糖值，胰島素敏感性以10min內(nèi)血糖下降速度來衡量，對(duì)數(shù)線性回歸(Loglinear regression)程序計(jì)算，以擬合曲線的平均斜率K值表示。
1.4.3.3測(cè)定上述指標(biāo)后，每組大鼠各5只，斷頭處死，迅速取胰腺、心臟、主動(dòng)脈，一部分液氮保存，一部分備病理檢查(包括本部分大鼠的形態(tài)學(xué)分析)。另外，留取A組大鼠全身不同組織液氮保存以備基因組織分布表達(dá)譜分析。
1.4.3.4胰腺的病理學(xué)觀察。胰腺用10％中性甲醛溶液固定，常規(guī)包埋，5μm切片，免疫組化采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶法，經(jīng)由過氧化酶阻斷、正常非免疫動(dòng)物血清封閉、目的抗體濕盒內(nèi)4℃過夜、生物素二抗標(biāo)記、鏈親和素-過氧化物酶孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分色、脫水、二甲苯透明，中型樹膠封片等步驟，詳見試劑手冊(cè)。采用多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)(KS400)，在分辨率、對(duì)比度、亮度等相同條件下測(cè)胰島Ins免疫組化染色陽性部分的平均吸光度。
1.5大鼠心血管系統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察。
1.5.1A、C、D、E各組大鼠喂養(yǎng)至4.5、5.5-6、10月齡即C、D大鼠糖尿病模型建立后半個(gè)月、1.5-2個(gè)月、6個(gè)月，分別斷頭處死，迅速分離心臟組織(心尖部)、主動(dòng)脈置液氮保存，并各留取適當(dāng)大小置10％中性甲醛溶液固定以備HE染色光鏡觀察、1mm×1mm組織塊置4℃預(yù)冷的戊二醛固定液以備電鏡觀察。
1.5.2透射電鏡標(biāo)本的制備。經(jīng)2％戊二醛和1％鋨酸雙固定，乙醇逐級(jí)脫水，環(huán)氧丙烷兩次置換，環(huán)氧樹脂618包埋液包埋浸透，LKB機(jī)切片，鹽酸鉛染，HITACHI，H-500透射電鏡觀察。
1.5.3掃描電鏡標(biāo)本的制備。經(jīng)2％戊二醛和1％鋨酸雙固定，乙醇和醋酸乙戊酯逐級(jí)脫水，HCP-2臨界點(diǎn)干燥，BAL-TEC離子濺射，PHILIPS，XL30 ESEM掃描電鏡觀察。
1.6數(shù)據(jù)處理。測(cè)定指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用方差分析。數(shù)據(jù)由SPSS(10.0)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理并制圖，以P＜0.05為有顯著性意義。
實(shí)施例2大鼠2型糖尿病早期心肌病變相關(guān)基因篩選2.1材料2.1.1主要儀器設(shè)備Genomyx LRS熒光差異顯示分析系統(tǒng)(Beckman)，該系統(tǒng)包括(1)Genomyx LR電泳儀，含自動(dòng)干膠裝置(2)Genomyx SC掃描儀(3)分析軟件系統(tǒng)包括Acquire SC，Clarity SC，Extend LRS，Virtual Grid System等(4)切膠工作站。分光光度儀(Beckman DU650)，9700型PCR儀(PE)，F(xiàn)luor-sTMmultilmager凝膠圖像分析儀(Bia-RAD)，低溫高速離心機(jī)(Beckman)，雜交爐(Robbins Scientific 2000)。
2.1.2主要試劑HIEROGLPH mRNA Profile試劑盒(Beckman)包括(1)12個(gè)3’端未標(biāo)記熒光的T7(dT12)錨定引物(Anchored Primer，AP)(2)20個(gè)5′M13r隨機(jī)引物(Arbitrary Primer，ARP)。Fluoro-DDRT-PCR試劑盒(Beckman)包括(1)12個(gè)含與上述錨定引物相應(yīng)的四甲基羅丹明(TMR)標(biāo)記引物(2)dNTP混合物(3)TMR標(biāo)記的DNA分子量標(biāo)記(4)fluoro-DD上樣緩沖液。
TRIZOL總RNA抽提試劑為Gibco-BRL公司產(chǎn)品；不含RNA酶的DNA酶I為Promega公司產(chǎn)品；pMD18-T Vector、DNA Markers2000、Ex Taq酶及RT-PCR Kit(該試劑盒包括AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Oligo(dT)-Adaptor引物，10×RNA PCR緩沖液，MgCl2等)為TaKaRa公司產(chǎn)品；柱離心瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒及柱離心質(zhì)粒微量回收試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；GST Purification Kit購自PIERCE公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I、中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)購自Promega公司；Exp TaqDNA聚合酶、DNA Marker2000、IPTG購自TaKaRa公司，羊抗人GST多克隆抗血清為Phamacia公司產(chǎn)品；HRP二抗為華美生物工程公司產(chǎn)品；聯(lián)苯二胺(DAB)顯色劑為邁新公司產(chǎn)品。
2.1.3質(zhì)粒和菌種GST蛋白融合表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-1為Phamacia公司產(chǎn)品；常規(guī)的大腸桿菌DH5α(E.coli DH5α)及BL21(E.coli BL21)購自北京博大泰克。
2.1.4動(dòng)物同實(shí)施例1。
2.2方法2.2.1動(dòng)物分組及標(biāo)本采集。
大鼠分組同實(shí)施例1糖尿病大鼠模型制備。
DD-PCR分析的標(biāo)本來自本研究第一部分液氮保存的組織。E組(2型糖尿病模型組)建模后半個(gè)月所取的心肌、主動(dòng)脈組織，分別以A組相應(yīng)組織為對(duì)照。免疫組化標(biāo)本來自來自正常對(duì)照及E組模型建立后0.5、2和6個(gè)月的心肌組織。
2.2.2樣品總RNA的提取。
組織搗碎后置TRIZOL液中徹底勻漿，加入氯仿、異丙醇分離RNA，乙醇洗滌沉淀，DEPC水溶解，-20℃保存?zhèn)溆?。具體按試劑手冊(cè)操作。
2.2.3不含RNA酶的DNA酶處理以去除少量基因組DNA，10×PCR緩沖液 5.0μl50mmol/L MgCl21.5μlRNasin50uDNA酶I(RNase-Free)45u總RNA 20μg加DEPC處理過的雙蒸水至50μl
混勻→37℃，30min→加DEPC處理過的雙蒸水至500μl→酚/氯仿抽提后溶解于20μlDEPC水中。
2.2.4采用比色法和電泳法鑒定總RNA的質(zhì)量。
2.2.4.1比色法上述RNA溶液稀釋100倍后于260nm和280nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)，分析RNA濃度和A260/A280比值。RNA的定量根據(jù)下列公式求出其濃度。
RNA溶液的濃度(μg/ml)＝A260×40×稀釋倍數(shù)。
2.2.4.2電泳法2.2.4.2.1凝膠的制備稱取瓊脂糖1.2g，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液12ml，DEPC處理過的雙蒸水37.3ml，加熱溶解。待溶液冷卻至60℃時(shí)加入12.3mol/L的甲醛貯存液10.7ml，10mg/ml的溴乙錠3.0μl，混勻，于室溫中靜置0.5h使凝膠凝固。
2.2.4.2.2樣品的制備及電泳。在一滅菌的Eppendorf管中加入下述各成分混勻后65℃溫育15min后迅速置于冰浴中，加2μl滅菌的并經(jīng)EDPC處理的10×甲醛凝膠上樣緩沖液，混勻。凝膠預(yù)電泳5min(5V/cm)后上樣。在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中以4V/cm的場(chǎng)強(qiáng)電泳。紫外燈下觀察電泳結(jié)果。
RNA樣品 4.5μl5×甲醛凝膠電泳緩沖液2.0μl甲醛 3.5μl甲酰胺 10.0μl2.2.5樣品RNA的DDRT-PCR反應(yīng)。
各組RNA樣品以T7(dt12)AP作為3’端引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系20μl25mmol/L MgCl24μl，10×PCR緩沖液2μl，250μM dNTP混合物2μl，RNase抑制劑0.5μl，0.25U/μl反轉(zhuǎn)錄酶1μl，T7(dt12)AP各4μl，Total RNA 0.8ug，剩余容積以H2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件如下42℃30min，50℃30min，70℃15min，反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。以M13rARP為隨機(jī)引物，TMR-T7(dt12)AP為錨定引物，對(duì)各組cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系10μl10×PCR緩沖液1.0μl，25mM MgCl21.5μl，250mM dNTPs 2.0μl，M13r-ARP各1.75μl，TMR-T7(dt12)AP各0.7μl，RT mix 1.0μl，EX Taq酶0.1μl，H2O1.95μl。條件如下(1)95℃2min(2)4個(gè)循環(huán)92℃15s，50℃30s，72℃2min(3)30個(gè)循環(huán)92℃15s，60℃30s，72℃2min(4)72℃7min(5)4℃保存。
2.2.6DD-PCR電泳流程2.2.6.1蒸餾水反復(fù)沖洗玻璃板、墊片和梳子。將無切跡玻璃板的內(nèi)面用4mol/LNaOH處理，將有切跡玻璃板的內(nèi)面用Glass Shield硅化，隨后用乙醇處理，自然晾干。將無切跡玻璃板的內(nèi)面朝上置灌膠工作臺(tái)上，墊片緊貼于玻板的兩側(cè)，將另一塊玻板的處理面朝下覆蓋在上述玻璃板上。在70ml 5.6％變性HR-1000膠中加入560μl新鮮制備的10％APS和56μl TEMED，水平灌膠，并將梳子的水平一側(cè)插入凝膠內(nèi)，玻板的兩邊用夾子固定，使膠充分聚合。
2.2.6.2在200μl薄壁管中加入4.0μl DD-PCR產(chǎn)物和1.5μl上樣緩沖液，95℃變性2min，迅速置于冰內(nèi)。上樣前，將膠放在掃描儀上預(yù)掃描，以減少背景干擾。
2.2.6.3DD-PCR電泳條件如下電壓3000V，時(shí)間5h。
1.2.6.4電泳結(jié)束后，打開Acquire SC程序并啟動(dòng)掃描儀，相關(guān)分析軟件進(jìn)行差異條帶的定位。
2.2.6.5將膠板從掃描儀取下，移走有切跡的玻璃板，干膠并用蒸餾水沖洗15min，反復(fù)操作3次。割膠工作臺(tái)上操作，差異條帶浸泡于50μl TE中，37℃溫育1h。切割完畢后將玻璃板放入掃描儀重新掃描，檢測(cè)割膠的準(zhǔn)確性。
2.2.7差異條帶的再擴(kuò)增，通用引物為T7 promoter(22-mer)，5’gtaatacgactcactatagggc 3’(SEQ ID NO3)M13 reverse(24-mer)，5’agcggataacaatttcacacagga 3’(SEQ ID NO4)其它PCR條件同DD-PCR過程。
反應(yīng)結(jié)束后，用2％瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增出的特異條帶。
2.2.8割膠和膠回收(Qiagen)按實(shí)際手冊(cè)說明進(jìn)行每100g瓊脂糖凝膠加入300μl比例加入S1液，置55℃水浴10min每2min顛倒混勻一次；加入1/3 S1液體積的異丙醇，混勻，55℃溫浴1min；將溶化后的Agarose液移入吸附柱，W1液反復(fù)沖洗；在吸附膜中央加入30μl T1液后高速離心1min；過柱液-20℃保存。
2.2.7RDCR3的組織分布。
以GAPDH作為內(nèi)參照，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳及輝度掃描初步預(yù)測(cè)RDCR3在不同組織中表達(dá)的差異。
RDCR3-p15’GGACCAGCACTGGGAGAATA3’(SEQ ID NO5)，RDCR3-p25’CGGCTCATGAGGTACAATGA3’(SEQ ID NO6)；GAPDH-p15’ATGATTCTACCCACGGCAAG3’(SEQ ID NO7)，GAPDH-p25’TTCAGCTCTGGGATGACCTT3’(SEQ ID NO8)。
PCR產(chǎn)物RDCR3為605bp，GAPDH為529bp。25μl反應(yīng)體系如下10×PCR緩沖液2.5μl，25mM MgCl22μl，2.5μM dNTPs 2μl，引物RDCR3各1.5μl、GAPDH各0.5μl，RT mix 1.5μl，EX Taq酶0.2μL，H2O12.8μl。經(jīng)1cycles95℃反應(yīng)3min；28cycles94℃變性反應(yīng)45sec，56℃退火反應(yīng)45sec，72℃延伸反應(yīng)1min；1cycle72℃反應(yīng)7min，4℃保存。
2.2.8RDCR3基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)2.2.8.1RDCR3序列的PCR擴(kuò)增按RDCR3序列(Genebank登錄號(hào)AY095481)設(shè)計(jì)并合成引物，上游引物PG15’-cgGGATCCATTGTGGACTACAAGGCAT-3’(SEQ ID NO9)，引入BamH I酶切位；下游引物PG2
5’-ccgCTCGAGTCAGTCCCATGGGACCT-3’(SEQ ID NO10)，引入Xho I酶切位，擴(kuò)增可獲得633bp的RDCR3序列，編碼211個(gè)氨基酸；按文獻(xiàn)設(shè)計(jì)5’端pGEX-4T-1(869-891)測(cè)序引物5’-GGGCTGGCAAGCCACCTTTGGTG-3’(SEQ ID NO11)。
反應(yīng)參數(shù)為94℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，28個(gè)循環(huán)；最后72℃7min。反應(yīng)體系如下將抽提的大鼠心肌組織總mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA作為模板約0.1μg，Exp Taq酶1.5μl，PG1 50pmol，PG2 50pmol，dNTP終濃度200μmol/L，Mg2+終濃度1.5mM，10×Buffer 5μl，加H2O至50μl。
2.2.8.2重組質(zhì)粒pGEX-4T-RDCR3的構(gòu)建，見圖1。
2.2.8.3差異片斷的亞克隆2.2.8.4連接反應(yīng)16℃過夜按生產(chǎn)商的說明書，將PCR擴(kuò)增獲得的DNA片段與PMD 18-T載體(購自TAKARA公司)在16℃連接過夜。
2.2.8.5轉(zhuǎn)化2.2.8.6感受態(tài)細(xì)菌的制備無鉑絲蘸取-70℃凍存的E.coli(DH52)，在LB平板上劃線接種，平板置于37℃ 16h；挑取單菌落置于5ml LB培養(yǎng)基中，37℃振搖16h；取1ml上述培養(yǎng)液接種到一含有50mlLB培養(yǎng)基的燒瓶中，37℃振搖培養(yǎng)3h，測(cè)A600，待其值達(dá)到0.3-0.4時(shí)將燒瓶取出，立即置冰浴10min；在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一消毒過的預(yù)冷的50ml離心管；4℃4000rpm離心10min，棄去上培養(yǎng)液，將離心管倒立于濾紙上1min使培養(yǎng)液流盡；向離心管中加入10ml預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液，重懸沉淀的菌體，置冰浴30min；4℃ 4000rpm離心10min，棄去上清液，將離心管倒立于濾紙上1min；加入2ml預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液，輕輕重懸菌體；將上述菌體置于4℃冰箱中12～24h，然后分裝保存于15％的甘油中-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.2.8.7質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物5μl+感受態(tài)細(xì)菌200μl→冰浴30min→42℃水浴90s→加入800μlLB培養(yǎng)基，混勻→37℃振搖90min(120rpm)→將菌液接種于含有10μg/ml氨芐青霉素及IPTG/X-Gal的LB培養(yǎng)板上→培養(yǎng)板于37℃正放30min→37℃倒放20h→挑取白色菌斑，接種于5ml含有10μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中→37℃振搖(120rpm)將PCR產(chǎn)物用BamH I和Xho I雙酶切獲得RDCR3，定向插入載體pGEX-4T-1的MCS。用BamH I和Xho I雙酶切鑒定，選取酶切鑒定的質(zhì)粒送DNA測(cè)序。
2.2.8.8GST-RDCR3融合蛋白的表達(dá)純化按PIERCE公司和Phamacia公司產(chǎn)品手冊(cè)所述，對(duì)GST融合蛋白進(jìn)行親和純化。
2.2.8.9.1表達(dá)鑒定及條件優(yōu)化(1)將篩選獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取新鮮單個(gè)菌落于5ml2×YT液(含100μg/ml Amp)中，37℃ 200rpm振搖過夜；(2)將飽和菌液以1∶100比例轉(zhuǎn)接于5ml 2×YT液中，37℃振搖培養(yǎng)3-4h至A6000.5；(3)加入IPTG至終濃度為300μM，37℃，250rpm下繼續(xù)培養(yǎng)4h。4℃、7000g離心收集菌體沉淀，細(xì)菌裂解液破碎，按誘導(dǎo)前全菌、誘導(dǎo)后全菌、上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE。電泳膠的配制底層使用12％分離膠(10ml含30％聚丙烯胺4ml、1.5mM Tris(pH 8.8)2.5ml、10％SDS 0.1ml、10％過硫酸胺0.1ml、TEMED 4μl、ddH2O 0.1ml)，灌注適當(dāng)高度后，覆蓋一層飽和正丁醇，膠聚合后ddH2O洗數(shù)次，吸干；配制5％成層膠(2ml含30％聚丙烯胺0.33ml、1.0mM Tris(pH 6.8)0.25ml、10％SDS 0.02ml、10％過硫酸胺0.02ml、TEMED 1μl、ddH2O 1.4ml)，聚合后拔出梳子，電泳緩沖液沖洗上樣孔。蛋白樣品與2×SDS凝膠加樣緩沖液等體積混勻，置100℃5min后上樣，于4℃，100V恒壓在1×Tris-甘氨酸緩沖液中電泳0.5h后，將電壓改為150V至結(jié)束。
(4)電泳結(jié)束后取出凝膠，考馬斯亮蘭染色，脫色。根據(jù)電泳結(jié)果，取表達(dá)最佳的單個(gè)克隆接入3ml 2×YT/Amp培養(yǎng)液中，37℃，250rpm培養(yǎng)4-5h至A6001.5，加入終濃度為15％的甘油，混勻后分裝于0.5ml離心管，-70℃保存。
(5)取上述菌落，同法進(jìn)行表達(dá)分析，分別在33℃、35℃、37℃三個(gè)溫度段，IPTG誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)4、6、8h，取少量樣品，制備電泳樣品，按全菌、上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE。選擇最佳表達(dá)條件(包括可溶性及表達(dá)產(chǎn)量)。
2.2.8.9.2.原核表達(dá)及融合蛋白的純化(1)取10ul復(fù)融的甘油菌種接入10ml 2×YT培養(yǎng)液于100ml三角瓶中，30℃、250rpm，振蕩培養(yǎng)過夜；(2)按2％比例接種入250ml的2×YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A600為0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度0.3mM；(3)改35℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后收獲菌體，7000rpm離心10min沉淀菌體；(4)將菌體重懸于細(xì)菌裂解液10ml中直至液相均一，室溫下輕微振蕩10min。
(5)將裂解液14000rpm離心15min，菌液上清加入1mL固化谷胱苷肽樹脂室溫震蕩10min，2500rpm離心10min；(6)棄上清，加入0.25ml洗滌緩沖液重懸樹脂，將其移入B-PERTM純化柱中，10000rpm離心2min；(7)加入0.5ml洗滌緩沖液，孵育5min，10000rpm離心2min；(8)另取0.5ml洗滌緩沖液，配制洗脫緩沖液(含還原型谷胱苷肽15mg)；(9)將洗脫液加入B-PERTM純化柱，孵育5min，10000rpm離心2min；收集離心洗脫液，其中含有表達(dá)產(chǎn)物GST-RDCR3。取10ul樣品與誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后全菌樣品進(jìn)行SDS-PAGE，灰度掃描分析目的蛋白并計(jì)算其在總蛋白中的含量。
2.2.9.表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡鑒定2.2.9.1.融合蛋白GST-RDCR3進(jìn)行SDS-PAGE。
2.2.9.2.轉(zhuǎn)膜電泳完畢，取下凝膠，切一張和凝膠等大的硝酸纖維素膜(NC膜)和2張Whatman3MM濾紙，按濾紙、凝膠、NC膜、方向排好，排除各層氣泡，前后端用海棉和多孔有機(jī)玻璃板加緊，置電轉(zhuǎn)移槽中。在轉(zhuǎn)移緩沖液中恒壓100V，電轉(zhuǎn)移1.5h，SDS-PAGE分離后的凝膠中蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。
2.2.9.3.免疫印跡實(shí)驗(yàn)(1)將NC膜放入可熱密封塑料袋，加5ml封閉液(TTBS，0.1％(v/v)Tween20，100mM Tris.Cl(pH 7.5)，0.9％(w/v)NaCl)，室溫置搖床1h；(2)將NC膜放入用封閉液以1∶1000稀釋的羊抗人GST多克隆抗血清中[12]，37℃孵育1h；(3)TTBS緩沖液洗膜，5min×3次；(4)將NC膜移入用TTBS以1∶1000稀釋的IgG-HRP二抗中，37℃孵育1h；(5)TBS洗膜，5min×3次；(6)置DAB(50mg DAB/100ml PBS緩沖液+10ul 30％H2O2)中顯色；(7)條帶顯示清楚后自來水沖洗，終止反應(yīng)。
結(jié)果1、基因基本信息獲得的序列RDCR3經(jīng)nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢、尋找ORF、進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA的識(shí)別及染色體定位。
新基因RDCR3全長(zhǎng)1219bp，GenBank登錄號(hào)為AY095481，序列如SEQ ID NO1所示，其中ORF位于166-798位。
與2001年底公布的大鼠部分基因序列(長(zhǎng)104429bp)98％同源，該基因跨度至少＞40kb，包含6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子，部分比較結(jié)果見圖9所示。由于大鼠基因組草圖尚未竣工，無法進(jìn)一步染色體的精確定位。
RDCR3 cDNA序列所編碼的211個(gè)氨基酸蛋白，命名為RDCR3(Rat DiabeticCardiomyopathy Related Gene 3)。序列如下MIVDYKAFIP NGPSPGSRVL TILEQIPGMV VVADKTAELY KTTYWASYNI PYFESVFNPS 60GLQALVAQYG DWFSYTRNPR AKIFQRDQSL VEDVDTMVRL MRYNDFLHDP PSLCEACSPK 120PNAENAISAR SDLNPANGSY PFQALRQRAH GGIDVKVTSV ALAKYMSMLA ASGPTWDQLP 180PFQWSKSPFH NMLHMSQPDL WMFSPVKVPW D 2112對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析2.1同源性分析與RDCR3蛋白同源性相對(duì)高的蛋白是lysosomal/endosomal membrane protein p67(溶酶體/內(nèi)體膜蛋白p67，來自錐蟲，同源性37％)，和serine/threonine kinase(絲氨酸/蘇氨酸，來自Arabidopsis thaliana，同源性27％)。
2.2理化特性分析RDCR3的211個(gè)氨基酸中含有73個(gè)疏水性氨基酸、59個(gè)極性氨基酸及53個(gè)帶電氨基酸。RDCR3分子量為23827.26m.w，等電點(diǎn)為6.74(圖2)。
2.3結(jié)構(gòu)域及基序的功能預(yù)測(cè)。
2.3.1Spscan預(yù)測(cè)RDCR3蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽，因此它屬于膜蛋白或分泌蛋白的可能性不大，很有可能是一種胞漿蛋白。
2.3.2結(jié)構(gòu)域的檢索。發(fā)現(xiàn)RDCR3蛋白含Rhodopsin-like GPCR超家族特征結(jié)構(gòu)域，在下列序列中以下劃線標(biāo)示。
MIVDYKAFIP NGPSPGSRVL TILEQIPGMVVVADKTAELY KTTYWASYNI PYFESVFNPS60GLQALVAQYGDWFSYTRNPR AKIFQRDQSL VEDVDTMVRL MRYNDFLHDP PSLCEACSPK 120PNAENAISAR SDLNPANGSY PFQALRQRAH GGIDVKVTSV ALAKYMSMLA ASGPTWDQLP180PFQWSKSPFH NMLHMSQPDL WMFSPVKVPW D 211(SEQ ID NO2)2.3.3基序分析結(jié)果表明存在以下基序

2.3.4蛋白修飾位點(diǎn)DCR-3有多個(gè)蛋白修飾位點(diǎn)1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)。
N-糖基化位點(diǎn)符合N[^P][ST][^P]模式，具體序列為SEQ ID NO2中137-140位的NGSY蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)符合[ST].[RK]模式，具體序列為SEQ ID NO2中第118-120為的SPK和第128-130位的SAR。
酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)符合[ST].{2}[DE]模式，具體序列為SEQ ID NO2中第21-24位的TILE、第89-92位的SLVE、第112-115位的SLCE、第196-199位的SQPD。
2.4蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)2.4.1RDCR3蛋白可能出現(xiàn)的α、β及混合型蛋白結(jié)構(gòu)域的比例分別為10.4％、19.9％和69.7％。根據(jù)α型％H＞45、％E＜5；β型％H＜5、％E＞45；α-β型％H＞30、％E＞20；其余為混合型的標(biāo)準(zhǔn)，RDCR3應(yīng)屬于一種混合型蛋白。見圖3A和3B。
2.4.2二級(jí)結(jié)構(gòu)的免疫原性分析將編碼RDCR3的N端第1個(gè)殘基定義為1，以此類推，C末端的殘基為211。親水性、表面可及性、可塑性及抗原指數(shù)結(jié)果如下RDCR3的親水性區(qū)域主要有1-18，36-52，70-92，99-109，117-153，173-198等。
可及性較高的區(qū)域有12-17，35-45，74-89，101-106，119-124，145-151，175-180，183-189等。
可塑性較高的主要區(qū)域有9-19，75-81，84-94，117-124，129-139，171-181等。
可能的蛋白質(zhì)抗原表位區(qū)域12-20，75-99，102-114，117-140，145-159，173-191等。
3.RDCR3的組織分布以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，半定量RT-PCR初步預(yù)測(cè)RDCR3在正常大鼠不同組織中的分布。2％瓊脂糖凝膠電泳見圖4。
經(jīng)3次半定量RT-PCR及輝度掃描，以目的基因與內(nèi)標(biāo)GAPDH產(chǎn)物輝度比值×10表示表達(dá)豐度，柱型圖表示，圖5。
4.PCR產(chǎn)物的克隆及重組子鑒定通過PCR獲得了650bp的RDCR3特異帶(圖6)，回收的PCR產(chǎn)物與pGEX-4T-1載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，在LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，用BamH I、Xho I雙酶切鑒定，獲得預(yù)期大小的DNA片段。DNA測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)克隆片段確實(shí)為RDCR3序列且無發(fā)生堿基突變。
5.RDCR3蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)pGEX-4T-1載體編碼產(chǎn)生26kDa的GST蛋白，外源基因以融合蛋白形式表達(dá)。攜有RDCR3融合表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-RDCR3在宿主菌E.coli BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，菌體裂解物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示攜有重組表達(dá)質(zhì)粒的工程菌在約50kD(GST-RDCR3)位置處有一特異條帶。薄層掃描顯示表達(dá)量約占菌體總蛋白的30％(圖7)。表達(dá)產(chǎn)物約50％存在上清液中，經(jīng)GST親和層析后得到純化的GST-RDCR3。
6.Western印跡分析結(jié)果如圖8所示，表明得到單一帶GST標(biāo)簽的RDCR3融合蛋白。
實(shí)施例3RDCR3在高糖培養(yǎng)條件下的表達(dá)高于低糖培養(yǎng)條件在本實(shí)施例中，對(duì)新生鼠原代心肌細(xì)胞，在高糖(濃度25mmol/l)和低糖(5.6mmol/l)條件下，于DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。在培養(yǎng)4天后，抽提心肌細(xì)胞的總mRNA，用SEQ ID NO5和6所示的引物，進(jìn)行常規(guī)RT-PCR檢測(cè)RDCR3的表達(dá)量。
結(jié)果表明，在高糖情況下，RDCR3基因的表達(dá)高于低糖(p＜0.05)實(shí)施例4抗RDCR3蛋白抗體的產(chǎn)生將實(shí)施例1中獲得的重組大鼠RDCR3蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀大鼠RDCR3蛋白基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。
實(shí)施例5篩選影響RDCR3蛋白表達(dá)的物質(zhì)在本實(shí)施例中，重復(fù)實(shí)施例3的培養(yǎng)，不同點(diǎn)在高糖條件下，在培養(yǎng)液中加入0.001mg/L、0.01mg/L黃連素，作為測(cè)試組。另外，在無黃連素存在下，培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞作為對(duì)照組；在培養(yǎng)3天，用RT-PCR法測(cè)定測(cè)試組和對(duì)照組中RDCR3蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，測(cè)試組中RDCR3蛋白的表達(dá)量低于對(duì)照組，這表明黃連素是抑制RDCR3蛋白表達(dá)的物質(zhì)。
實(shí)施例6RDCR3在成心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的表達(dá)變化在本實(shí)施例中，大鼠成心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株(購自ATCC，編號(hào)CRL-1446)在低糖DMEM 10％胎牛血清中(5.6mmol/l)中培養(yǎng)近融合時(shí)，降低血清濃度為1％加終濃度為10nM的全反式維甲酸(Sigma公司)，誘導(dǎo)七天，分別研究第1，3，5，7天的RDCR3和心肌細(xì)胞成熟的特異標(biāo)志物L(fēng)CAD和ANF的表達(dá)情況。
結(jié)果顯示，隨著ANF和LCAD表達(dá)增高，RDCR3表達(dá)也逐日增高。說明RDCR3在促進(jìn)心肌誘導(dǎo)分化中起一定作用?？纱偈剐募」δ芩ソ咔闆r下心肌的自我修復(fù)的代償功能的發(fā)揮。
討論序列的生物信息分析是從理論邁向?qū)嶒?yàn)或臨床研究的重要部分，如果想對(duì)感興趣的基因投入研究，那么基于生物信息學(xué)獲得盡可能多的關(guān)于該基因的信息就十分必要，往往能對(duì)后繼的工作起到事半功倍的效果。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)RDCR3的結(jié)構(gòu)/功能進(jìn)行一系列分析，以期對(duì)進(jìn)一步的研究工作提供有益的參考。
(a)新序列的同源性分析蛋白的不同部位其進(jìn)化速率可能不同，功能重要的部分如酶的活性位點(diǎn)進(jìn)化得慢，在不同序列中保守性好。因此在遠(yuǎn)緣的序列中有可能發(fā)現(xiàn)某種共同的保守序列片段，從而揭示某種結(jié)構(gòu)或功能聯(lián)系。RDCR3與低等動(dòng)物內(nèi)體/溶酶體膜蛋白、絲氨酸/蘇氨酸具一定同源性。內(nèi)體/溶酶體在外源性抗原的加工和遞呈中發(fā)揮作用，這一過程的順利進(jìn)行都需要內(nèi)體/溶酶體膜蛋白發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用Bonnerot C，Briken V，Amigorena S.Immunol Lett.1997，571；Hunziker W，Geuze HJ.Bioassays.1996，18379。尤為引人注目的是RDCR3與內(nèi)體/溶酶體膜蛋白均含視紫質(zhì)樣GPCRs(Rhodopsin-like GPCRsuperfamily signature)結(jié)構(gòu)域，后者是一種包括激素、神經(jīng)遞質(zhì)和光受體在內(nèi)的作用廣泛的蛋白質(zhì)亞家族，通過與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白相互作用轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)，與分泌素樣GPCRs、cAMP受體同屬G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)的蛋白大家族，發(fā)揮一系列涉及自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌過程的功能。這提示RDCR3蛋白功能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激酶密切相關(guān)。
另外在蛋白質(zhì)的基序檢索中，發(fā)現(xiàn)RDCR3與乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶、激酶P85調(diào)節(jié)亞單位信號(hào)、高絲氨酸激酶信號(hào)、脂質(zhì)-A-二糖合成酶、DAHP合成酶2以及TASK K+通道信號(hào)有著類似的基序。這些基序的發(fā)現(xiàn)，與預(yù)測(cè)得到的RDCR3多個(gè)磷酸化及糖基化修飾位點(diǎn)不謀而合，該蛋白可能接受多種信號(hào)的調(diào)控。
RDCR3在組織中分布廣泛，但mRNA水平在主動(dòng)脈及心臟、骨骼肌中的表達(dá)較低，似乎與這三種組織富含平滑肌細(xì)胞有關(guān)。RDCR3在糖尿病性主動(dòng)脈病變?cè)缙谥械谋磉_(dá)上調(diào)，這在高糖或高脂所導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能變化的多通路改變中究竟處于哪一環(huán)節(jié)，有待進(jìn)一步探討。
(b)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，親水性反映了殘基從水相轉(zhuǎn)移到非極性相的自由能變化，親水性殘基傾向于暴露在蛋白質(zhì)表面。但是，親水性部位與抗原表位并無很好的一致性，而且通常僅曲線的較高峰預(yù)測(cè)的抗原表位才相對(duì)可靠?？杉靶灾傅鞍卓乖袣埢蝗軇┓肿咏佑|的可能性，它反映了蛋白抗原內(nèi)、外各層各殘基的分布組成。可塑性指蛋白抗原構(gòu)象不是剛性不變的，其多肽骨架有一定程度的活動(dòng)性，由于蛋白質(zhì)的環(huán)區(qū)往往具有較大的自由度，用此方法預(yù)測(cè)的抗原表位多落于環(huán)區(qū)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也認(rèn)為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為凸出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白抗原表面，利于與抗體嵌合，較可能成為抗原表位。抗原指數(shù)系綜合了親水性、表面可及性、可塑性及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的線性組合，對(duì)于推測(cè)RDCR3蛋白質(zhì)的抗原表位較有價(jià)值，最常采用的方案為Jamson-Wolf方案，采用以下公式進(jìn)行計(jì)算抗原指數(shù)(A)＝0.3親水性值(H)+0.15表面特性值(S)+0.15可塑性值(F)+0.2(Chou&Fasman值+Garnier-Osguthorpe-Robson值)Webster DM.Protein structure predictionmethods andprotocols.New Jersey.USA.Humana Press Inc.2001；來魯華編著.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分子設(shè)計(jì).第一版，北京北京大學(xué)出版社.1993?？梢姡乖笖?shù)較其它算法有一定的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)RDCR3抗原表位的預(yù)測(cè)，其抗原表位分部均勻，因此可以考慮全長(zhǎng)表達(dá)該蛋白。
(c)蛋白表達(dá)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合表達(dá)載體pGEX-4T-1用于高效表達(dá)與GST融合的目的蛋白。菌體裂解物中的融合蛋白可通過親和柱中的谷胱甘肽親和純化。蛋白的洗脫條件比較溫和，較大限度地避免對(duì)蛋白的抗原性和生物活性造成不利的影響。本研究通過IPTG誘導(dǎo)的GST融合表達(dá)和親和層析純化得到了高純度的分子量為50KDa的GST-RDCR3融合蛋白。由于pGEX-4T-1是一種融合表達(dá)載體，載體本身表達(dá)26KDa的融合蛋白氨基端部分，故本實(shí)驗(yàn)插入片段實(shí)際編碼24KDa的重組蛋白，與RDCR3分子量的理論值相吻合。真核生物基因以融合蛋白形式在大腸桿菌中表達(dá)具有以下優(yōu)點(diǎn)Hockney RC.Recent development in heterologousprotein production in Escherichia coli.Trends in Biotech.1994，12456；Hering TM，Kollar J，Huynh TD，et al.Purification and characterization of decorin core proteinexpressed in Escherichia coli as a maltose-binding protein fusion.Anal Biochem.1996.240981.由于轉(zhuǎn)錄和翻譯過程起始所需的RNA聚合酶結(jié)合部位(即啟動(dòng)子)及核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列)由質(zhì)粒提供，因而融合蛋白通常得到高效表達(dá)；2.融合蛋白部分序列由原核細(xì)胞基因編碼，可保護(hù)重組蛋白不被細(xì)菌蛋白酶降解破壞，使其比天然外源蛋白更穩(wěn)定；3.表達(dá)出的融合蛋白以可溶性形式穩(wěn)定存在于細(xì)菌胞漿中，有利于蛋白肽鏈的正確折疊，保持其構(gòu)象及生物學(xué)功能；4.可通過已商品化的親和層析純化系統(tǒng)(如Amylose Resin、谷胱甘肽Sepharose等)方便地獲得高純度的非變性目的蛋白，可用于免疫動(dòng)物及建立免疫學(xué)診斷方法。
本發(fā)明采用GST融合蛋白系統(tǒng)成功地制備并純化新基因RDCR3表達(dá)的蛋白，為今后深入研究RDCR3的結(jié)構(gòu)與功能相互作用的機(jī)理以及免疫學(xué)測(cè)定提供條件。也為治療糖尿病性心血管病變藥物篩選提供新的靶點(diǎn)。例如，可以將候選物質(zhì)添加到高糖條件下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞培養(yǎng)物中，觀察其對(duì)RDCR3表達(dá)影響。
目前不斷新開發(fā)的糖尿病治療藥物的療效中都會(huì)有提及對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥的作用比如對(duì)于磺脲類藥物可能作用于心肌上類似胰島細(xì)胞的鉀離子通道而影響糖尿病患者的心臟功能，而噻唑皖二酮類又可能參與心肌的保護(hù)機(jī)制，任何與糖尿病性心血管病變相關(guān)的基因都可以作為糖尿病治療藥物對(duì)患者心臟影響的篩選指標(biāo)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市內(nèi)分泌代謝病研究所<120>糖尿病性心血管病變相關(guān)基因及其用途<130>050053<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1219<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>CDS<222>(166)..(798)<223>
<400>1accactgtcg gcaacaagaa cccagcgctg tggaagtacg tgcaacccca gggctgtgtg 60ctggagtgga ttcgaaacat tgtggccaac cgcctggcct tggatggggc cacctgggca120gatgtcttca ggcggttcaa tagtggcacg tataataacc agtgg atg att gtg gac177Met Ile Val Asp1tac aag gca ttc atc ccc aat ggg ccc agc cct gga agc cgg gtg ctc 225Tyr Lys Ala Phe Ile Pro Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg Val Leu5 10 15 20acc atc cta gaa cag atc ccg ggc atg gtg gtg gtg gcg gac aag act 273Thr Ile Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Lys Thr25 30 35gca gag ctc tac aag acg acc tac tgg gct agc tac aac atc ccg tac 321Ala Glu Leu Tyr Lys Thr Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Tyr40 45 50ttt gag agt gtt ttc aac cct agt ggt ctg cag gcc ctg gta gcc cag 369Phe Glu Ser Val Phe Asn Pro Ser Gly Leu Gln Ala Leu Val Ala Gln55 60 65tac gga gat tgg ttc tcc tac acc agg aac cct cga gcc aag atc ttc 417Tyr Gly Asp Trp Phe Ser Tyr Thr Arg Asn Pro Arg Ala Lys Ile Phe70 75 80cag agg gac caa tca cta gtg gag gac gta gac acc atg gtc cgg ctc 465Gln Arg Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Val Asp Thr Met Val Arg Leu85 90 95 100atg agg tac aat gac ttc ctt cat gac cct ccg tcg ttg tgt gag gcc 513Met Arg Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Pro Ser Leu Cys Glu Ala105 110 115tgc agc ccg aag ccc aac gca gag aac gcc atc tct gcc cgc tct gat 561Cys Ser Pro Lys Pro Asn Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp120 125 130ctc aac cct gct aat ggc tcc tac cca ttt cag gcc ctg cgt cag cgc 609Leu Asn Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu Arg Gln Arg135 140 145gcc cat ggc ggc att gat gtg aag gtg acc agc gtt gcg ctg gct aag 657Ala His Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser Val Ala Leu Ala Lys150 155 160tac atg agc atg ctg gca gcc agt ggc ccc acg tgg gac caa ttg cca 705Tyr Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro165 170 175 180
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1.一種分離的RDCR3多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進(jìn)心肌誘導(dǎo)分化功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中166-798位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1219位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出RDCR3蛋白多肽。
9.一種檢測(cè)樣品中是否存在RDCR3蛋白的方法，其特征在于，包括將樣品與RDCR3蛋白特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在RDCR3蛋白。
10.一種組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽或其拮抗劑或激動(dòng)劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的糖尿病性心血管病變相關(guān)蛋白－RDCR3(Rat Diabetic Cardiomyopathy Related Gene 3)蛋白，編碼RDCR3蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種RDCR3蛋白的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種RDCR3蛋白的多核苷酸的用途。RDCR3蛋白具有Laminin A結(jié)構(gòu)域，與心臟發(fā)育及心肌病發(fā)病相關(guān)。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1916022SQ20051002893
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2005年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日
發(fā)明者羅敏 申請(qǐng)人:上海市內(nèi)分泌代謝病研究所