專利名稱：血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血液代用品及其制備方法，屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。特別涉及一種以具有良好生物相容性的可降解聚合物材料為殼材的微囊型血液代用品及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，臨床用血量迅速增加，世界范圍內(nèi)頻繁出現(xiàn)的血荒頻頻使得血液短缺已達(dá)到危機(jī)的程度。而血液交叉感染又使得這一供求矛盾日益加劇。國內(nèi)外的研究表明血液代用品是解決這一臨床危機(jī)的唯一出路。與常規(guī)血液相比，血液代用品具有無紅細(xì)胞表面抗原決定簇，可排除適配血型之麻煩，避免輸血反應(yīng)；避免了病原微生物污染血源和進(jìn)一步交叉感染；保質(zhì)期長、易儲(chǔ)存、運(yùn)輸方便；血源不用依賴穩(wěn)定供血人群，來源廣泛，取材方便，可保障充足供應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。為此，安全、有效、可大量生產(chǎn)的血液代用品的研究與開發(fā)已成為國際生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
作為人紅細(xì)胞代用品的血液代用品應(yīng)具有以下性能(1)首先應(yīng)具有理想的氧傳遞功能；(2)具有適宜的顆粒大小。大量研究表明，要使粒子不被肝臟和脾臟的竇狀小管截留且在體內(nèi)有足夠長的循環(huán)時(shí)間，其粒徑最好介于70～200nm；(3)能夠維持血液滲透壓和酸堿平衡及擴(kuò)充容量。
血紅蛋白是紅細(xì)胞攜氧—釋氧的載體，是其關(guān)鍵的組成部分。血紅蛋白分子是由2個(gè)α亞基和2個(gè)β亞基構(gòu)成的四聚體，直徑5.5nm。當(dāng)中間位置的Fe的化學(xué)位是Fe2+時(shí)，血紅蛋白便具有攜氧-釋氧功能；當(dāng)Fe的化學(xué)位是Fe3+時(shí)，血紅蛋白便失去了傳遞氧的能力。血紅蛋白結(jié)合和釋放氧是一個(gè)高度協(xié)同的變構(gòu)過程。P50，即血紅蛋白中氧達(dá)到半飽和程度所需的氧分壓是表征血紅蛋白攜氧—釋氧功能的重要指標(biāo)，人血紅蛋白在紅細(xì)胞中的P50為26mmHg。正是基于其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，血紅蛋白成為血液代用品研制中非常重要的組成部分。
如果直接以除去細(xì)胞膜等雜質(zhì)的無基質(zhì)血紅蛋白為血液代用品，雖然有很強(qiáng)的氧攜帶性，但會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腎毒性。當(dāng)四聚體的血紅蛋白分子從紅細(xì)胞中分離出來，很容易解離成二聚體α、β。這樣小分子在循環(huán)系統(tǒng)中很快通過腎小球而被排出體外。血紅蛋白從血漿進(jìn)入腎小管，遇酸性物質(zhì)變成結(jié)晶體，此過程還會(huì)對(duì)腎小球造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，臨床出現(xiàn)急性腎功能衰竭，嚴(yán)重的甚至可能導(dǎo)致死亡。
為此，以人紅細(xì)胞中血紅蛋白的P50為目標(biāo)，采用物理的、化學(xué)的或物理化學(xué)的方法對(duì)無基質(zhì)血紅蛋白進(jìn)行改性是目前血液代用品研究開發(fā)的關(guān)鍵和核心。改性血紅蛋白人工血液代用品通?？煞譃榈谝淮?、第二代和第三代血紅蛋白人工血液代用品。第一代改性血紅蛋白主要是通過分子內(nèi)和分子間交聯(lián)聚合制備交聯(lián)血紅蛋白或通過結(jié)合聚合物制備結(jié)合血紅蛋白。其中，對(duì)交聯(lián)血紅蛋白的研究時(shí)間較長，也比較成熟，基本已經(jīng)形成了一套基本上完善的研究方法，目前已有幾種產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。如美國Baxter公司研制的diaspirin交聯(lián)的人血紅蛋白，原預(yù)計(jì)1998年上市，但是由于III期臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)問題而暫時(shí)停止，推遲了其上市時(shí)間；美國Biopure公司研制的化學(xué)修飾牛血紅蛋白己進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。Northfield藥廠以人血紅蛋白為基礎(chǔ)生產(chǎn)的血液代用品PolyHeme，目前還在進(jìn)行III期臨床試驗(yàn)。Northfield獲準(zhǔn)進(jìn)行研究的產(chǎn)品在安全性和容量方面均處于領(lǐng)先地位。在北美的一些中心，應(yīng)用高達(dá)6個(gè)單位的PolyHeme進(jìn)行選擇性主動(dòng)脈瘤手術(shù)的III期臨床試驗(yàn)。加拿大多倫多市的Hemosol公司研制生產(chǎn)的HemoLink，是一種從過期的人血中提取的血紅蛋白制成的氧棉子糖聚血紅蛋白溶液。在完成了無數(shù)次的臨床前和期安全性試驗(yàn)之后，Hemosol開始進(jìn)行4項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照外科手術(shù)，目標(biāo)集中在安全性上。目前進(jìn)入臨床期。我國四通天壇生物技術(shù)有限公司所研制的人工血液代用品采用血紅蛋白的交聯(lián)聚合方法，目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。另外，陜西西大北美基因股份有限公司研制的人血液代用品，是以豬血紅蛋白為原料，選擇戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行聚合的血紅蛋白多聚體等。以酶為特征的第二代修飾血紅蛋白，在制備聚合血紅蛋白的過程中，交聯(lián)一定量的過氧化氫酶(CAT)和過氧化物歧化酶(SOD)，可制成PolyHb-SOD-CAT的修飾人工血液代用品。這個(gè)方案的基本目的是清除由血紅蛋白產(chǎn)生的自由基；減少高鐵血紅蛋白的形成；防止內(nèi)部氧化反應(yīng)。分子間聚合克服了天然SOD和CAT循環(huán)時(shí)間短而在治療上受限的缺點(diǎn)?？惯^氧化酶SOD，CAT酶能夠保證血紅蛋白細(xì)胞的氧化環(huán)境，保持其功能和結(jié)構(gòu)的完整性。第一代和第二代的修飾血紅蛋白制備方法相對(duì)較簡單，然而，采用這種交聯(lián)、聚合等方法使得血紅蛋白分子內(nèi)或分子間結(jié)合形成大分子或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動(dòng)物中表達(dá)并純化出具有活性的血紅蛋白，不存在包膜，雖然在血液循環(huán)中能模擬正常紅細(xì)胞中天然血紅蛋白的攜氧-釋氧的生理功能，但這種模擬的血液代用品沒有細(xì)胞膜的屏障，對(duì)純度要求極高，游離的血紅蛋白易于同血液中的許多活性分子作用，誘發(fā)一系列異常的副反應(yīng)。
為了克服上述缺點(diǎn)，出現(xiàn)了第三代血液代用品，即采用合適的殼材包裹血紅蛋白和酶形成類似于紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)的微囊型血液代用品。目前的研究主要集中在脂質(zhì)體微囊血紅蛋白和可降解高分子血紅蛋白的納米微囊兩類。關(guān)于脂質(zhì)體微囊型血紅蛋白的報(bào)道出現(xiàn)于七十年代末。1980年，Djordjevich等成功制備出了粒徑為0.2um的脂質(zhì)體微囊型血紅蛋白。之后關(guān)于這方面的研究報(bào)道頻頻出現(xiàn)。如WO2004047807、WO02087540、US5688526、US5674528、US5049391、US4911929、US4133874等專利均是采用以磷脂為主的脂質(zhì)體包埋血紅蛋白的方法。另外，為了控制微囊中高鐵血紅蛋白的含量，US20050025757以類脂為殼材，亞甲基藍(lán)、甲苯基藍(lán)、單核苷酸黃素或腺嘌呤二核苷酸為高鐵血紅蛋白還原催化劑，采用擠出法包埋血紅蛋白和催化劑制備微囊型血液代用品。然后以半胱氨酸、高半胱氨酸、巰基乙酸、吩嗪硫酸甲酯等為還原劑便可以有效地還原高鐵血紅蛋白。但所制備的微囊粒徑偏大。
盡管對(duì)脂質(zhì)體微囊型血紅蛋白的研究取得了許多有意義的結(jié)果，但大量的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示其在以下方面存在明顯不足(1)脂質(zhì)體包囊血紅蛋白進(jìn)入體內(nèi)后容易被肝和脾的巨噬細(xì)胞迅速清除，在血液中循環(huán)時(shí)間有限；(2)脂質(zhì)體還存在貯存穩(wěn)定性差、包埋血紅蛋白濃度低等缺點(diǎn)；(3)磷脂材料機(jī)械強(qiáng)度差，生成的微囊難以收集和儲(chǔ)存；(4)膜較致密，葡萄糖、高鐵血紅蛋白還原催化劑等不能進(jìn)行微囊內(nèi)外物質(zhì)交換等問題等等。
可降解高分子血紅蛋白微囊，即利用具有良好生物相容性的可降解高分子材料作為殼材料包埋血紅蛋白及酶，通過控制微膠囊表面的物化狀態(tài)和微結(jié)構(gòu)、粒徑大小等來滿足臨床對(duì)血液代用品的要求。與脂質(zhì)體包囊血紅蛋白相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)(1)聚合物材料機(jī)械強(qiáng)度好、通透性好、膜的用量少、血紅蛋白的含量高；(2)微膠囊表面呈多孔性，能夠透過葡萄糖和其他小分子能力，因此，可制備成含有整個(gè)高鐵血紅蛋白還原系統(tǒng)的微膠囊。反應(yīng)系統(tǒng)所需要的葡萄糖、還原劑等能夠滲透進(jìn)入微膠囊，反應(yīng)產(chǎn)物又能擴(kuò)散出來，所以不會(huì)因?yàn)榉磻?yīng)物在微膠囊內(nèi)的蓄積而抑制反應(yīng)。
對(duì)可降解高分子血紅蛋白微囊的深入研究始于九十年代。如N.Cedrati等采用復(fù)乳法制備得到大小為10～500um的聚乳酸血紅蛋白微囊(N.Ccedrati，Art.Cells，Blood Subs.and Immob.Biotech.1994，22(3)867～873)。之后又以聚乳酸和乙基纖維素為囊材制備粒徑為于200um的血紅蛋白微囊(N.Ccedrati，Art.Cells，Blood Subs.and Immob.Biotech.1997，25(5)457～462)。盡管該工藝過程簡單，蛋白活性高，但所制備的血紅蛋白微囊的粒徑偏大，遠(yuǎn)大于理想血液代用品小于200nm的要求，而且該血代品與氧氣之間親和性太強(qiáng)，P50僅為13.9mmHg。US5670170和US5670173報(bào)道了TMS Chang等人分別以聚異丁基丙烯氰酯、聚乳酸、聚乳酸聚乙醇酸等為囊材，采用乳液聚合法、聚合物沉聚法、乳化擴(kuò)散法等制備70～200nm的微囊血液代用品。但過程存在血紅蛋白易變性，包封率低(10～17％)、成本高等缺點(diǎn)。國內(nèi)CN1419936A報(bào)道了以聚乳酸單甲氧基聚乙二醇共聚物包埋血紅蛋白制備血液代用品，盡管該制備方法過程簡單、耗時(shí)短，但制備的產(chǎn)物粒徑小于4um，粒徑偏大。
除此之外，上述可降解高分子血紅蛋白微囊的研究過程均沒有考慮產(chǎn)物中高鐵血紅蛋白的含量。而高鐵血紅蛋白是影響血液代用品攜氧性能的重要因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品及其制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的以具有良好生物相容性的可降解聚合物為殼材，采用復(fù)乳法包裹血紅蛋白、酶、高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑等，制備粒徑大小為70～200nm、包封率高、高鐵血紅蛋白含量易控、功能和結(jié)構(gòu)更接近于天然紅細(xì)胞的第三代微膠囊血液代用品。聚合物微膠囊表面的多孔性使得其具有透過葡萄糖、還原劑和其他小分子的能力，滿足反應(yīng)系統(tǒng)的要求。同時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物又能擴(kuò)散出來，不會(huì)因?yàn)榉磻?yīng)物在微囊內(nèi)的蓄積而抑制反應(yīng)，從而有效地控制血液代用品中高鐵血紅蛋白的含量。
本發(fā)明的血液代用品，是一種以生物降解聚合物為殼材，血紅蛋白、過氧化氫酶、過氧化物歧化酶和高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑為芯材的微膠囊，粒徑為70～200nm；所說的殼材是由聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-乙交酯、聚己內(nèi)酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物中的一種或其混合物與卵磷脂和膽固醇組合而成的，其中聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-乙交酯、聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚己內(nèi)酯聚乙二醇共聚物等高分子材料已獲美國FDA許可，用作注射用微囊和醫(yī)用手術(shù)縫合線、埋植劑等；殼材∶卵磷脂∶膽固醇＝1∶0～0.7∶0～0.3，質(zhì)量比；所用的殼材聚合物的分子量在1.5萬～30.0萬。聚己內(nèi)酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物的組成為聚己內(nèi)酯、聚乳酸或聚乳酸-乙交酯∶聚乙二醇＝40∶60～90∶10，質(zhì)量比；所說的血紅蛋白選自牛血紅蛋白、羊血紅蛋白、豬血紅蛋白或人血紅蛋白等；所說的高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑為亞甲基藍(lán)、甲苯基藍(lán)或單核苷酸黃素；
殼材同芯材質(zhì)量比為1∶1～5；微囊內(nèi)血紅蛋白∶過氧化氫酶∶過氧化物歧化酶∶高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑＝1∶0～0.2∶0～0.2∶0～0.05，質(zhì)量比。
本發(fā)明的制備方法包括如下步驟(1)將殼材溶解在有機(jī)溶劑中，獲得有機(jī)溶液O1。在有機(jī)溶液O1中，殼材的質(zhì)量濃度以0.5％～5％為適宜；(2)將卵磷脂和膽固醇溶解在有機(jī)溶劑中，獲得有機(jī)溶液O2。在有機(jī)溶液O2中，卵磷脂的質(zhì)量濃度以0～10％為適宜，膽固醇的質(zhì)量濃度以0～10％為適宜；有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯等中的一種或其混合物；(3)將有機(jī)溶液O1和有機(jī)溶液O2混合，獲得有機(jī)相O，或者單獨(dú)使用步驟(1)配制的有機(jī)溶液O1；(4)將溶液W1加入步驟(3)所得的O或O1中，勻漿分散或超聲波分散，獲得W1/O或W1/O1初乳液；所說的溶液W1為血紅蛋白、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和氯化鈉的水溶液，血紅蛋白的質(zhì)量濃度為15％～35％，超氧化物歧化酶的質(zhì)量濃度為0.015％～3％，過氧化氫酶的質(zhì)量濃度為0.0075％～3％，氯化鈉的質(zhì)量濃度為0.5％～5.0％，高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑的質(zhì)量濃度為0.01～0.9％；(5)將步驟(4)所得的W1/O或W1/O1初乳液傾入W2外水相中，經(jīng)高速勻漿分散或超聲波分散，制成W1/O/W2或W1/O1/W2復(fù)乳液；所說的W2外水相為含有表面活性劑的氯化鈉水溶液，表面活性劑的質(zhì)量濃度為0.5％～10％，氯化鈉的質(zhì)量濃度為0.5％～5.0％，所用的表面活性劑選自Tween60、Tween80、Tween85、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407等中的一種或其混合物；(6)將步驟(5)所得的復(fù)乳液加入聚乙烯醇或明膠的水分散液或等滲溶液，揮去有機(jī)溶劑，獲得表面硬化成型的微囊；(7)從步驟(6)所得的分散液中收集納米微囊；(8)將上述納米微囊分散到生理鹽水或等滲溶液中；(9)在納米微囊分散液中直接加入高鐵血紅蛋白還原劑溶液或待納米微囊輸注體內(nèi)后加入適量高鐵血紅蛋白還原劑溶液進(jìn)行還原。
本發(fā)明制備納米血紅蛋白微囊的過程中，外水相多采用生理鹽水、等滲溶液等，最好采用等滲溶液，防止微囊靜脈輸注后，由于微囊內(nèi)外環(huán)境滲透壓的差別在注射部位附近就迅速破壞。
所說的等滲溶液的組分和質(zhì)量濃度為NaCl 6.8g/L；CaCl20.2g/L；KCl 0.4g/L；MgSO40.1g/L；NaHCO32.2g/L；Na2HPO4·12H2O 0.126g/L；NaH2PO4·2H2O 0.26g/L。
所說的高鐵血紅蛋白還原劑為半胱氨酸、高半胱氨酸、巰基乙酸或吩嗪硫酸甲酯中的一種。所說的高鐵血紅蛋白還原劑的溶液為高鐵血紅蛋白還原劑的水、生理鹽水或模擬體液溶液。
本發(fā)明制備的納米血紅蛋白微囊的粒徑范圍在70～200nm之間，粒徑分布較窄，微囊表面形貌為球形或橢球形。采用本發(fā)明的方法制備的納米血紅蛋白微囊的包封率為50～95％，P50為23～30mmHg，并可將微囊中高鐵血紅蛋白的含量控制在1～5％。因此本發(fā)明制備的血紅蛋白微囊具有良好的攜氧、釋氧的功能，粒徑小且分布均勻、包封率高、高鐵血紅蛋白的含量低，因而有望成為理想的血液代用品。采用本發(fā)明制備的血紅蛋白微囊型血液代用品在臨床上的使用方法包括(1)在體外事先將高鐵血紅蛋白還原，然后通過常規(guī)的方法輸注給需要輸血的患者；(2)首先通過常規(guī)的方法直接將制備的血液代用品輸注給需要輸血的患者，然后通過口服或注射高鐵血紅蛋白還原劑進(jìn)行體內(nèi)還原。


圖1為納米血紅蛋白微囊的電鏡照片。
圖2為納米血紅蛋白微囊的激光粒度分布圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將1克20％(質(zhì)量濃度)的牛血紅蛋白溶液加入到2克5％(質(zhì)量濃度)聚己內(nèi)酯的二氯甲烷溶液中，高速乳化15000rpm或超聲50W乳化30s，將制成的初乳液加入到100克外水相生理鹽水中，經(jīng)10000rpm高速乳化或400W超聲乳化1min后，加入500克分散液PVA水溶液中，室溫常壓下連續(xù)攪拌8小時(shí)以上，直至微囊表面硬化。離心、洗滌、凍干收集微囊。其包封率為85％，粒徑范圍在80～200nm。微囊表面形貌為球形或橢球形，粒徑分布較窄，見圖1。P50為28mmHg，高鐵血紅蛋白的含量為20％。
實(shí)施例2將1克含18％(質(zhì)量濃度)豬血紅蛋白加入到3.6克1％(質(zhì)量濃度)聚乳酸的二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶劑的溶液中，15000rpm高速乳化或50W超聲乳化30s，將制成的初乳液加入到100克由生理鹽水配制而成的外水相中，經(jīng)10000rpm高速乳化或400W超聲乳化1min后，加入500克分散液明膠水溶液中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，直至微囊表面硬化。離心、洗滌、凍干收集微囊。包封率為87％，粒徑范圍為70～200nm，如圖2。P50為23mmHg。
實(shí)施例3將1克含15％(質(zhì)量濃度)牛血紅蛋白，3％(質(zhì)量濃度)超氧化物歧化酶、3％(質(zhì)量濃度)過氧化氫酶及0.1％(質(zhì)量濃度)高鐵血紅蛋白還原催化劑的溶液加入到7.6克質(zhì)量濃度為2％的PLGA-PEG的二氯甲烷和丙酮的混合溶劑的溶液中，15000rpm高速乳化或50W超聲乳化30s，將制成的初乳液加入到100克由生理鹽水配制而成的外水相中，經(jīng)10000rpm高速乳化或400W超聲乳化1min后，再進(jìn)一步分散在500克PVA水分散溶液中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，直至微囊表面硬化。離心、洗滌、凍干收集微囊。微囊再分散至等滲溶液中，加入2mL 0.5％半胱氨酸的水溶液還原30分鐘。微囊中血紅蛋白的包封率為73％，粒徑范圍為70～200nm。微囊表面形貌為球形或橢球形。高鐵血紅蛋白的含量為4％，P50為26mmHg。
實(shí)施例4將3克1％(質(zhì)量濃度)聚乳酸的二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶劑的溶液和1克含0.6％卵磷脂、0.9％膽固醇的二氯甲烷溶液均勻混合，再將1克18％(質(zhì)量濃度)人血紅蛋白和2，3-DPG的復(fù)合物及0.9％(質(zhì)量濃度)高鐵血紅蛋白還原催化劑的水溶液加入到上述混合溶液中，15000rpm高速乳化或50W超聲乳化30s，將制成的初乳液加入到100克由等滲緩沖溶液配制而成的外水相中，經(jīng)10000rpm高速乳化或400W超聲乳化1min后，再進(jìn)一步分散在等滲緩沖溶液中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，直至微囊表面硬化。離心、洗滌、凍干收集微囊。微囊再分散至等滲溶液中，加入2mL 0.5％(質(zhì)量濃度)高半胱氨酸的水溶液還原30分鐘。微囊中血紅蛋白的包封率為80％，粒徑范圍為70～200nm。微囊表面形貌為球形或橢球形。高鐵血紅蛋白的含量為1％，P50為27mmHg。
實(shí)施例5將5克質(zhì)量濃度為2％的PLGA-PEG的二氯甲烷溶液與10克含0.7％卵磷脂、0.1％膽固醇的乙酸乙酯溶液均勻混合，然后再將1克含17％(質(zhì)量濃度)牛血紅蛋白，0.3％(質(zhì)量濃度)超氧化物歧化酶、0.1％(質(zhì)量濃度)過氧化氫酶及0.1％(質(zhì)量濃度)高鐵血紅蛋白還原催化劑的水溶液加入到上述有機(jī)溶液中，15000rpm高速乳化或50W超聲乳化30s，將制成的初乳液加入到100克由生理鹽水配制而成的外水相中，經(jīng)10000rpm高速乳化或400W超聲乳化1min后，再進(jìn)一步分散在500克PVA水分散溶液中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，直至微囊表面硬化。離心、洗滌、凍干收集微囊。微囊再分散至等滲溶液中，加入2mL 0.5％半胱氨酸的水溶液還原30分鐘。微囊中血紅蛋白的包封率為82％，粒徑范圍為70～200nm。微囊表面形貌為球形或橢球形。高鐵血紅蛋白的含量為3.5％，P50為26mmHg。
實(shí)施例6將1克35％(質(zhì)量濃度)羊血紅蛋白、0.015％(質(zhì)量濃度)超氧化物歧化酶、0.0075％(質(zhì)量濃度)過氧化氫酶和0.05％(質(zhì)量濃度)高鐵血紅蛋白還原催化劑加入到3.5克5％(質(zhì)量濃度)聚己內(nèi)酯聚乙二醇共聚物的二氯甲烷溶液中，15000rpm高速乳化或50W超聲乳化30s，將制成的初乳液加入到100克由等滲緩沖溶液配制而成的外水相中，經(jīng)10000rpm高速乳化或400W超聲乳化1min后，再進(jìn)一步分散在500克等滲緩沖溶液配制的分散液中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，直至微囊表面硬化。離心、洗滌、凍干收集微囊。微囊再分散至等滲溶液中，加入2mL 0.5％(質(zhì)量濃度)吩嗪硫酸甲酯水溶液還原30分鐘。微囊中血紅蛋白的包封率為50％，粒徑范圍為70～200nm。微囊表面形貌為球形或橢球形。高鐵血紅蛋白的含量為4％，P50為26mmHg。
實(shí)施例7將1克18％(質(zhì)量濃度)牛血紅蛋白和0.5％(質(zhì)量濃度)高鐵血紅蛋白還原催化劑加入到4.5克1％(質(zhì)量濃度)聚乳酸聚乙二醇共聚物的二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶劑的溶液中，15000rpm高速乳化或50W超聲乳化30s，將制成的初乳液加入到100克由等滲緩沖溶液配制而成的外水相中，經(jīng)高速乳化10000rpm或超聲400W乳化1min后，再進(jìn)一步分散在等滲緩沖溶液中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，直至微囊表面硬化。離心、洗滌、凍干收集微囊。微囊再分散至20mL等滲溶液中。微囊中血紅蛋白的包封率為80％，粒徑范圍為70～200nm。微囊表面形貌為球形或橢球形。
Wister大鼠體重200～280g，麻醉。分別通過頸動(dòng)脈輸注10mL上述微囊等滲溶液和吩嗪硫酸甲酯水溶液。6小時(shí)后，從頸動(dòng)脈處抽出1mL血液于血液收集試管中，離心(2000g，10min)，收集上清。紫外-可見分光光度計(jì)分析高鐵血紅蛋白含量為4％。
實(shí)施例8將1克35％(質(zhì)量濃度)羊血紅蛋白和0.05％(質(zhì)量濃度)高鐵血紅蛋白還原催化劑加入到3.5克5％(質(zhì)量濃度)聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物的二氯甲烷溶液中，高速乳化15000rpm或超聲50W乳化30s，將制成的初乳液加入到100克由等滲緩沖溶液配制而成的外水相中，經(jīng)10000rpm高速乳化或400W超聲乳化1min后，再進(jìn)一步分散在500克等滲緩沖溶液配制的分散液中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，直至微囊表面硬化。離心、洗滌、凍干收集微囊。微囊再分散至等滲溶液中。微囊中血紅蛋白的包封率為50％，粒徑范圍為70～200nm。微囊表面形貌為球形或橢球形。
Wister大鼠體重200～280g，麻醉。分別通過頸動(dòng)脈輸注10mL上述微囊等滲溶液和高半胱氨酸水溶液。6小時(shí)后，從頸動(dòng)脈處抽出1mL血液于血液收集試管中，離心(2000g，10min)，收集上清。紫外-可見分光光度計(jì)分析高鐵血紅蛋白含量為2％。
實(shí)施例9Wister大鼠體重200～280g隨機(jī)分為3組，I組為治療組，II組為生理鹽水治療組，III組為對(duì)照組，建立Wister大鼠缺血-再灌注模型，具體做法將Wister大鼠飼養(yǎng)3天左右，測(cè)正常血相，按每只大鼠全血量的30％放血，可造成失血模型。I組治療注射補(bǔ)充全血?jiǎng)┝康?0％的實(shí)施例4所制備的血代品，II組為注射同劑量的生理鹽水，III對(duì)照組不做任何治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下

。
結(jié)果表明，采用本發(fā)明制備的包埋血紅蛋白的納米微囊型血液代用品可以有效地用于缺血?jiǎng)游锬Ｐ停且环N較理想的血液代用品。
權(quán)利要求
1.一種以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品，其特征在于，以具有生物相容性的可降解聚合物為殼材，血紅蛋白、過氧化氫酶、過氧化物歧化酶和高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑為芯材的微膠囊，粒徑為70～200nm；所說的殼材是由聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-乙交酯、聚己內(nèi)酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物中的一種或其混合物與卵磷脂和膽固醇組合而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品，其特征在于，殼材同芯材質(zhì)量比為1∶1～5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品，其特征在于，殼材∶卵磷脂∶膽固醇＝1∶0～0.7∶0～0.3，質(zhì)量比。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品，其特征在于，所用的殼材聚合物的分子量為1.5萬～30.0萬。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品，其特征在于，微囊內(nèi)血紅蛋白∶過氧化氫酶∶過氧化物歧化酶∶高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑＝1∶0～0.2∶0～0.2∶0～0.05，質(zhì)量比。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品，其特征在于，所說的血紅蛋白選自牛血紅蛋白、羊血紅蛋白、豬血紅蛋白或人血紅蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品，其特征在于，聚己內(nèi)酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物的組成為聚己內(nèi)酯、聚乳酸或聚乳酸-乙交酯∶聚乙二醇＝40∶60～90∶10，質(zhì)量比。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品，其特征在于，所說的高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑為亞甲基藍(lán)、甲苯基藍(lán)或單核苷酸黃素。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將殼材溶解在有機(jī)溶劑中，獲得有機(jī)溶液O1；(2)將卵磷脂和膽固醇溶解在有機(jī)溶劑中，獲得有機(jī)溶液O2；(3)將有機(jī)溶液O1和有機(jī)溶液O2混合，獲得有機(jī)相O，或者單獨(dú)使用步驟(1)配制的有機(jī)溶液O1；(4)將溶液W1加入步驟(3)所得的O或O1中，勻漿分散或超聲波分散，獲得W1/O或W1/O1初乳液；所說的溶液W1為血紅蛋白、超氧化物歧化酶或過氧化氫酶、高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑和氯化鈉的水溶液；(5)將步驟(4)所得的W1/O或W1/O1初乳液傾入W2外水相中，經(jīng)高速勻漿或超聲波分散，制成W1/O/W2或W1/O1/W2復(fù)乳液；(6)將步驟(5)所得的復(fù)乳液加入到聚乙烯醇或明膠的水分散液或等滲溶液中，揮去有機(jī)溶劑，獲得表面硬化成型的微囊；(7)從步驟(6)所得的分散液中收集納米微囊；(8)將上述納米微囊分散到生理鹽水或等滲溶液中；(9)在納米微囊分散液中直接加入高鐵血紅蛋白還原劑溶液或待納米微囊輸注體內(nèi)后加入適量高鐵血紅蛋白還原劑溶液進(jìn)行還原。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所說的W2外水相為含有表面活性劑的氯化鈉水溶液，表面活性劑的質(zhì)量濃度為0.5％～10％，氯化鈉的質(zhì)量濃度為0.5％～5.0％，所用的表面活性劑選自Tween60、Tween80、Tween85、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407中的一種或其混合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯等中的一種或其混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，血紅蛋白的質(zhì)量濃度為15％～35％，超氧化物歧化酶的質(zhì)量濃度為0.015％～3％，過氧化氫酶的質(zhì)量濃度為0.0075％～3％，氯化鈉的質(zhì)量濃度為0.7％。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑的質(zhì)量濃度為0.01％～0.9％。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所說的高鐵血紅蛋白還原劑為半胱氨酸、高半胱氨酸、巰基乙酸或吩嗪硫酸甲酯中的一種或其混合。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所說的高鐵血紅蛋白還原劑的溶液為高鐵血紅蛋白還原劑的水、生理鹽水或模擬體液溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品及其制備方法。首先將殼材溶于有機(jī)溶劑形成有機(jī)相(O)，同時(shí)將血紅蛋白、過氧化氫酶、過氧化物歧化酶、高鐵血紅蛋白還原反應(yīng)催化劑和氯化鈉溶解于水中形成水相(W
文檔編號(hào)A61P7/08GK1733298SQ20051002884
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月16日
發(fā)明者劉昌勝, 袁媛, 趙健, 章曉蘭 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)