專利名稱：利用鑒定纖維樣變性治療中使用的化合物的ctgf和trka受體的篩選方法
該要求保護的發(fā)明涉及鑒定和/或制備用于減少和/或防止纖維變性的化合物的方法。本發(fā)明還涉及用于降低和/或防止纖維變性的化合物和該化合物的用途。
當生物學組織損傷時，損傷和相關的炎癥反應都可引起細胞死亡。當細胞死亡發(fā)生時，合成新組織代替死亡的或垂死的細胞。新組織的合成可分成兩種類型，特化細胞的再生和結締組織的增加。在一些病理情況下，結締組織的增加在愈合過程中占優(yōu)勢，導致形成纖維變性組織。在纖維變性中，新組織修復組織中的任何結構缺損，但是由結締組織和結締組織生產細胞取代特化細胞損害了其自身的功能。
纖維變性是否發(fā)生，或者實際纖維變性的程度，受到各種因素的影響，包括待愈合的損傷的性質，嚴重性和位置。纖維變性最常見的是皮膚表面的瘢痕，除了大面積的瘢痕形成外，它是相對不令人討厭的。然而，纖維變性也可在諸如肝臟，肺和腎的內部器官的組織中發(fā)生。在大多數(shù)情況下，最嚴重的是在這些區(qū)域的纖維變性，因為該器官的特化活性受到損害。在最極端的情況中，由于該損害可出現(xiàn)器官衰竭或死亡。
纖維變性在疾病狀態(tài)中的重要性的一個例子可通過在糖尿病，即在全世界現(xiàn)在達到流行比例的一種疾病中出現(xiàn)的腎纖維變性(糖尿病性腎病)來證實。
糖尿病的發(fā)病率在最近幾年經(jīng)歷了一個全球性的增長。特別是它歸功于2型糖尿病(晚期發(fā)作(late-onset)的糖尿病)的顯著增長(Silink M(2002)，Horm.Res.57(Suppl 1)第1-5頁)。糖尿病與許多繼發(fā)型并發(fā)癥，特別是微血管相關性并發(fā)癥密切聯(lián)系。這些并發(fā)癥，包括纖維變性情況的腎病，通常在糖尿病開始后的許多年形成。
糖尿病性腎病的特征在于細胞外基質蛋白質在腎小球膜和腎小球基底膜中和在小管間質中細胞外基質蛋白的過多沉積。
在確定糖尿病性腎病(DN)易感性中認為遺傳背景是重要的(Quinn M等，(1996)Diabetologica 39第940-945頁)，但是據(jù)信關鍵性起動因素是組織暴露于慢性高血糖中(UKPDS Group，(1998)Lancet352，第837-853頁)。腎病的流行隨地理位置，糖尿病類型，和診斷后時間的長度而變化。盡管有影響因素，但是預期糖尿病性腎病的流行在前十年中會增長(Bagust A等，(2002)Diabetes Med19(Suppl4)第1-5頁)。糖尿病性腎病是末期腎病的主要原因，且需要新的治療方法來限制其發(fā)展。
糖尿病性腎病的病理學在1和2型糖尿病中相似。兩種類型的糖尿病都與腎小球中存在的相似超微結構改變相關聯(lián)(Osterby R，(1992)Diabetologica 35第803-812頁)。腎小球基膜厚度增加，且腎小球膜細胞外基質擴張。
據(jù)認為是糖尿病性腎病中腎功能下降的主要原因是腎小球膜擴張(Steffes M等(1989)Diabetes 38第1077-1081頁)。由于腎小球膜基質擴張，影響腎小球毛細血管，減少了可用于過濾的表面并變窄或阻塞管腔。除了腎小球硬化癥外，小管間質纖維變性也在糖尿病性腎病中發(fā)生。腎功能的進行性喪失與其它腎病中出現(xiàn)的進行性間質纖維變性相關聯(lián)(Risdon R等，(1968)Lancet2 7564第363-366頁)。
纖維變性疾病通常與生長因子和激素的不平衡相關聯(lián)，后者又接著影響蛋白質表達的產量。異常蛋白質表達接著又導致纖維變性形成。例如，纖維變性通常受到纖維變性組織中存在的轉化生長因子-β的增加的影響。
纖維變性是無有效療法的最大疾病群體之一，部分原因是這些疾病的機制受到各種因素的影響且準確的細胞機制未被闡明。因此，對纖維變性或其可提供的靶的分子靶特性缺乏了解，而圍繞該靶可作為抗纖維變性療法的基礎。
對于糖尿病性腎病，研究表明葡萄糖可至少部分通過轉化生長因子-β(TGF-β)的作用誘導基質合成(Ziyadeh F等，(2000)Proc Natl Acad Sci USA97第8015-8020頁)。
然而，TGF-β具有許多生理學作用，包括涉及免疫和上皮增生(McCartney-Francis N等，(1998)Int.Rev.Immunol.16第553-580頁)。這些變化的生理學作用意味著TGF-β不可能是臨床上有利的靶。抑制TGF-β的作用可能對生物體具有多種影響，引起不需要的和潛在的嚴重副作用。
轉化生長因子-β通過直接誘導膠原蛋白和基質合成引起纖維變性。另外，TGF-β也能誘導參與和/或影響該途徑的其它分子的表達引起纖維變性。一個該蛋白是結締組織生長因子(CTGF)，它誘導增生，膠原蛋白合成和間充質細胞的趨化性(Moussad E等，(2000)Molec Genet Metab.71第276-292頁)。CTGF(CCN2)是具有多個結構域的38kDa的分泌蛋白質，它由立即早期基因編碼且是CCN蛋白質家族的一個成員(Bork等，(1993)Febs Lett.327第125-130頁；Perbal等，(2001)Mol.Pathol.54第57-79頁)。然而，其發(fā)揮功能的分子機制尚未充分闡明。CTGF中存在多個結構域表明它與多個其它因子相互作用。已表明CTGF通過其von Willebrand型C結構域直接結合BMP4和TGF-β，導致抑制BMP和增強TGF-β信號傳導(Abreu等，(2002)Nat.Cell.Biol.4第599-604頁)。
已表明CTGF結合整聯(lián)蛋白(Babic等，(1999)Mol.Cell Biol.19第3811-3815頁)且有可能該相互作用在介導CTGF誘導的一些細胞現(xiàn)象中是重要的。
CTGF在包括糖尿病性腎病的各種纖維變性疾病中過量表達(Wahab N等，(2001)Biochem J 359第77-87頁)。事實上，已表明CTGF表達水平增加與糖尿病性腎病的嚴重性和進行速度增加相關聯(lián)(Ito Y等，(1998)KidneyInt.53第853-886頁)。
因此，CTGF可以是潛在有用的纖維變性反應的分子指標。尚未證實CTGF直接誘導體內腎纖維變性，但是，當與TGF-β一起皮下注射時，在大鼠中誘導持續(xù)皮膚纖維化(Mori T等(1999)J.Cell.Physiol.181第153-159頁)。
在本發(fā)明的形成過程中，本發(fā)明人證實了CTGF與細胞受體，即TrkA受體相互作用，以誘導與纖維變性形成相關的細胞內信號傳導級聯(lián)。
有三種Trk受體酪氨酸激酶基因(TrkA，TrkB和TrkC)。與其配體結合時，Trk受體二聚化并自身磷酸化，導致包括Ras，Rap-1，和Cdc 42-Rac-Rho家族的一些小G蛋白，以及受MAP激酶，PI3-激酶，和磷脂酶C-γ(PLCγ)調節(jié)的途徑活化(Segal，2003)?；罨腡rk受體也可與各種細胞質銜接(adaptor)蛋白直接或間接相互作用以產生許多生物學反應，包括，細胞增殖和存活；軸突和樹突生長，和改型；細胞骨架的裝配和改型；膜運輸和融合；和突觸的形成，功能，和可塑性(Huang E和Reichardt L，(2003)Annu.Rev.Biochem.72第609-642頁)。
在實施例中描述的本發(fā)明人的工作證實了Trk酪氨酸激酶活性是涉及纖維變性的細胞內信號分子的CTGF-依賴型誘導所必需的。該工作導致形成了鑒定和制備可與CTGF受體和/或CTGF受體激動劑(agonist)相互作用以減少或防止纖維變性的化合物的方法。
因此，在本發(fā)明的一個方面提供了一種鑒定和/或制備用于減少和/或防止纖維變性的化合物的方法，包括步驟(a)提供CTGF受體(b)提供試驗樣品(c)提供CTGF受體激動劑(d)將CTGF受體與試驗樣品接觸(e)隨后或同時將CTGF受體與CTGF受體激動劑接觸(f)檢測和/或測量CTGF受體的活化量(g)比較存在試驗樣品時CTGF受體活化量與不存在試驗樣品時檢測和/或測量的CTGF受體活化量(h)根據(jù)其不導致CTGF受體活化增加或減少來確定化合物是否降低和/或防止纖維變性。
對于“CTGF受體激動劑”，我們是指作用于CTGF受體以產生和CTGF與該受體相互作用產生的效果基本上相同的效果的化合物。我們還包含能夠產生和CTGF與CTGF受體的相互作用基本上相同的效果的CTGF受體激動劑的衍生物，類似物和片斷。非CTGF本身的CTGF受體激動劑使用實施例1提供的方法通過測量和/或檢測CTGF受體自身磷酸化，受體誘導的蛋白質磷酸化和TIEG表達可容易地鑒定。
對于“衍生物”，我們是指還具有對一個或多個其氨基酸側鏈基團，α-碳原子，末端氨基，或末端羧酸基團的至少一種化學修飾的CTGF受體激動劑化合物?；瘜W修飾包括添加化學基團，產生新鍵，和去掉化學基團。在氨基酸側鏈基團上的修飾包括賴氨酸e-氨基的?；?，精氨酸，組氨酸或賴氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基團的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰胺。末端氨基的修飾包括脫氨基，N-低級烷基，N-雙低級烷基，和N-酰基修飾。末端羧基的修飾包括酰胺，低級烷基酰胺，二烷基酰胺，和低級烷基酯修飾。低級烷基是C1-C4的烷基。另外，通過蛋白質化學領域的普通技術人員已知的保護基團可保護一個或多個側鏈基團，或末端基團。氨基酸的α-碳可以被單或雙甲基化。
對于“類似物”，我們是指具有包括一個或多個氨基酸取代，缺失，倒置，或添加的修飾且能夠產生與CTGF與受體相互作用產生的效果基本上相同的效果的CTGF受體激動劑。
對于“片斷”，我們是指能夠產生與CTGF與受體相互作用產生的效果基本上相同的效果的CTGF受體激動劑的一部分。
任選該方法還包含分離能夠減少和/或防止纖維變性的化合物的步驟。然后該分離的化合物任選可配制成還包含藥用上可接受的載體，賦形劑和/或稀釋劑的組合物。
優(yōu)選的是，通過檢測和/或測量至少一種下列活性來檢測和/或測量CTGF受體活化CTGF受體自身磷酸化，CTGF受體誘導的蛋白質磷酸化或CTGF誘導的TIEG表達。測量這些活性的典型方法在實施例1和2中提供。
優(yōu)選的是CTGF受體激動劑是CTGF。
優(yōu)選的是CTGF受體是TrkA受體。
合適的是該化合物直接影響CTGF受體與其激動劑之間的相互作用。換句話說，該化合物與CTGF受體或其激動劑直接相互作用以減少CTGF受體的活化。
另外，該化合物可間接影響CTGF受體與其激動劑之間的相互作用。換句話說，該化合物通過至少一種其它化合物與CTGF受體或其激動劑間接相互作用以減少CTGF受體的活化。
合適的是，通過上述方法鑒定和/或制備的化合物是酪氨酸激酶的拮抗劑。
對于“拮抗劑”，我們是指作用于CTGF受體以抑制和/或防止CTGF或CTGF受體激動劑與該受體相互作用產生的作用的化合物。我們還包括能夠防止和/或抑制CTGF和/或CTGF受體激動劑與CTGF受體相互作用產生的作用的CTGF受體拮抗劑的衍生物，類似物和片斷。使用實施例1提供的方法通過測量和/或檢測CTGF受體自身磷酸化，受體誘導的蛋白質磷酸化和TIEG表達可容易地鑒定CTGF受體拮抗劑。
在本發(fā)明的第二個方面，提供了一種用于減少和/或防止纖維變性的化合物，其特征在于它抑制和/或防止CTGF受體活化；且更優(yōu)選的是抑制和/或防止至少一種下列活性CTGF受體自身磷酸化；CTGF受體誘導的蛋白質磷酸化；和/或TIEG的誘導。
優(yōu)選的是通過本發(fā)明第一個方面的方法鑒定和/或制備該化合物。
合適的是，該化合物是選自多肽，抗體分子和反義核苷酸的至少一種。優(yōu)選的是，該化合物是抗體分子。
術語“抗體分子”用于指任何一種抗體，抗體片斷，或抗體衍生物。它打算包含野生型抗體，合成抗體，重組抗體或抗體雜合體，例如，但不限于，免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈可變和/或恒定區(qū)的噬菌體展示產生的單鏈修飾的抗體分子，或在本領域的技術人員已知的免疫測定方式中能夠與抗原結合的其它免疫活性分子。
術語“抗體衍生物”是指在本領域的技術人員已知的免疫測定方式中能夠與抗原結合的任何修飾的抗體分子，例如抗體的片斷(例如Fab或Fv片斷)，或者通過添加一個或多個氨基酸或其它分子以幫助將抗體偶連到另一肽或多肽，大型載體蛋白或固相支持物上(例如，氨基酸酪氨酸，賴氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸及其衍生物，NH2-乙?；鶊F或COOH-末端氨基基團，等等)進行修飾的修飾抗體分子。
對于“反義寡核苷酸”，我們是指能夠與互補核酸序列特異性結合的單鏈核酸。通過與合適的靶序列結合，形成RNA-RNA，DNA-DNA，或RNA-DNA雙鏈。這些核酸通常稱為“反義”，因為它們與該基因的有義或編碼鏈互補。最近，證實了寡核苷酸與DNA雙鏈結合時形成三螺旋是可能的。發(fā)現(xiàn)了寡核苷酸可識別DNA雙螺旋大溝中的序列。從而形成三螺旋。這表明可以合成通過識別大溝氫結合位點特異性結合雙鏈DNA的序列特異性分子。
通過與靶核酸結合，上述寡核苷酸可抑制靶核酸的功能。這可能是例如，抑制轉錄，加工，poly(A)添加，復制，翻譯，或者促進細胞的抑制機制，例如促進RNA降解的結果。
反義寡核苷酸可在實驗室制備，然后通過例如，顯微注射或從細胞培養(yǎng)基吸收進細胞中導入細胞，或者可用攜帶反義基因的質?；蚰孓D錄病毒或其它載體轉染后在細胞中表達它們。
或者，該化合物是酪氨酸激酶受體抑制劑。優(yōu)選的是，該酪氨酸激酶抑制劑選自BSF-466895，AP-23451，AP-23464，AP-23485，AZD-0530，AP-22408，RG-13022，RG-13291，RG-14620，RP53801，CEP-075，CEP-2563，二氫氯化物，CHIR-200131，CHIR-258，c-jun激酶，KST-638，KF-250706，MNAC-13，抗-EphA2Mabs，MLN-608，AG-957，薰草菌素A類似物，NSC-330507，NSC-680410，苯丙氨酸衍生物，SH2抑制劑，AG-1295，EGF-染料木黃酮，制表菌素，染料木黃酮，neuT Mab，PP1，TT-232，CGP-52411，CGP-53716，CGP-57148，imatinib，NVP-AAK980-NX，NV-50，phenoxodiol，F(xiàn)AK抑制劑，IGF-1，Met受體抑制劑，TIE-2抑制劑，CP-564959，PN-355，CP-127374，F(xiàn)CE-26806，F(xiàn)GFR-3抑制劑，Met RTK拮抗劑，PD-171026，PD-173956，PD-180970，Src非-RTK拮抗劑，kahalalide F，CCX2，南蛇藤醇，TAK-165，TG-100-13，TG-100-96，desmal，U3-1566和SKI-606。
優(yōu)選的化合物是CTGF受體拮抗劑。
在本發(fā)明的第三個方面，提供了本發(fā)明第二個方面的化合物在治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病中的用途。
優(yōu)選的是，本發(fā)明第二個方面的化合物用于制備治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病的藥物。
合適的是，該纖維變性疾病是選自糖尿病性腎病，非糖尿病性腎纖維變性，肺纖維變性，肝纖維變性(肝硬化)，骨骼肌纖維變性，心肌纖維變性，動脈粥樣硬化，全身性硬化(systemic sclerosis)，硬皮病，視網(wǎng)膜纖維變性，輻射纖維變性，瘢痕疙瘩瘢痕形成(keloid scar formation)和癌癥相關性纖維變性中的一種。
優(yōu)選的是，該疾病是糖尿病性腎病。
在本發(fā)明的第四個方面，提供了一種治療和/或預防纖維變性疾病的方法，包含施用治療上或預防上有效劑量，或多個劑量的根據(jù)本發(fā)明第一個方面的方法鑒定和/或制備的化合物。
合適的是，該纖維變性疾病是選自糖尿病性腎病，非糖尿病性腎纖維變性，肺纖維變性，肝纖維變性(肝硬化)，骨骼肌纖維變性，心肌纖維變性，動脈粥樣硬化，全身性硬化，硬皮病，視網(wǎng)膜纖維變性，輻射纖維變性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌癥相關性纖維變性中的一種。
優(yōu)選的是，該疾病是糖尿病性腎病。
在本發(fā)明的第五個方面，提供了能夠結合CTGF受體激動劑的試劑在治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病中的用途。
在本發(fā)明的第六個方面，提供了能夠結合CTGF受體激動劑的試劑在制備用于治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病的藥物中的用途。
優(yōu)選的是，該纖維變性疾病選自糖尿病性腎病，非糖尿病性腎纖維變性，肺纖維變性，肝纖維變性(肝硬化)，骨骼肌纖維變性，心肌纖維變性，動脈粥樣硬化，全身性硬化，硬皮病，視網(wǎng)膜纖維變性，輻射誘導的纖維變性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌癥相關性纖維變性中的一種或多種。
在本發(fā)明的第七個方面，提供了能夠結合CTGF受體激動劑的試劑在減少和/或防止CTGF受體激動劑與CTGF受體的體內或體外結合的方法中的用途。
對于“能夠結合CTGF受體激動劑的試劑”，我們包括能夠與CTGF受體激動劑自然締合的化合物，核酸，多肽或抗體。該試劑與CTGF受體激動劑之間的結合可通過離子，靜電和/或共價相互作用發(fā)生。優(yōu)選的是，試劑與CTGF受體激動劑的結合會減少和/或防止CTGF受體激動劑結合和/或締合和/或活化CTGF受體的能力。
優(yōu)選的是，在本發(fā)明的第七個方面，能夠結合CTGF受體激動劑的試劑是CTGF受體。作為選擇，能夠結合CTGF受體激動劑的試劑是與免疫球蛋白Fc-區(qū)連接的CTGF受體。
對于“Fc-區(qū)”，我們包括抗體的“片斷可結晶”區(qū)。對于“免疫球蛋白”，我們包括含有一個或多個免疫球蛋白互補決定區(qū)(CDR)的多肽，例如抗體，B細胞受體或T細胞受體，或其片斷。優(yōu)選的是，免疫球蛋白是抗體。更優(yōu)選的是，免疫球蛋白是IgG。
優(yōu)選的是，在本發(fā)明的第七個方面，提供了一種用途，其中CTGF受體是TrkA受體。作為選擇，CTGF受體是TrkA受體的可溶形式。
應明白術語“可溶形式”包括與細胞膜不結合或不插入其中且可存在于溶液中不聚集的多肽形式。
優(yōu)選的是，在本發(fā)明的第五，六和七方面中，CTGF激動劑是CTGF。
在本發(fā)明的第八個方面，提供了編碼與免疫球蛋白Fc-區(qū)連接的TrkA受體的核酸。
在本發(fā)明的第九個方面，提供了含有根據(jù)本發(fā)明第八方面的核酸的載體。
在本發(fā)明的第十個方面，提供了含有與免疫球蛋白Fc-區(qū)連接的TrkA受體的多肽。
在本發(fā)明的第十一個方面，提供了含有根據(jù)本發(fā)明的第八方面的核酸和/或根據(jù)本發(fā)明的第九方面的載體和/或根據(jù)本發(fā)明的第十方面的多肽的細胞。
在本發(fā)明的第十二個方面，提供了含有根據(jù)本發(fā)明的第八方面的核酸和/或根據(jù)本發(fā)明的第九方面的載體和/或根據(jù)本發(fā)明的第十方面的多肽和/或根據(jù)本發(fā)明的第十一方面的細胞，和藥用上可接受的載體或賦形劑的藥用組合物，該核酸和/或載體和/或多肽和/或細胞以治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病有效的量存在。
對于“有效量”，我們包括足以治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病的量。使用本領域的技術人員已知的方法可測定有效量。
實施本發(fā)明的某些優(yōu)選方面的例子現(xiàn)在將參照下面附圖進行描述，其中-

圖1-CTGF活化細胞內信號途徑血清饑餓的人腎小球膜細胞(HMC)在CTGF/V5融合蛋白存在的條件下培養(yǎng)所示的時間。對等量的細胞裂解物蛋白進行SDS-PAGE并使用抗(A)MAPK途徑，(B)JNK，和(C)PKB和CamKII的組成型蛋白的磷酸-特異性抗體通過Western印跡分析。β-肌動蛋白顯示為等量蛋白上樣的標記。D)細胞在蓋玻片上生長并血清饑餓48小時，之后在不存在，(a)和(c)，或存在40ng/ml CTGF-融合蛋白，(b)和(d)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)30分鐘。固定細胞，透化處理，用抗-磷酸PKCδ(a)和(b)和PKCα(c)和(d)第一抗體，且然后用熒光素偶連的第二抗體進行探測。結果代表了三個不同的實驗。
圖2-CTGF誘導不同蛋白的酪氨酸磷酸化血清饑餓的HMC在40ng/ml CTGF/V5融合蛋白存在的條件下培養(yǎng)所示的時間期限。對等量的細胞溶胞產物蛋白進行SDS-PAGE并使用抗磷酸酪氨酸抗體通過Western印跡進行分析。結果代表了三個不同實驗。
圖3-CTGF與HMC表面蛋白相互作用允許CTGF/V5融合蛋白與細胞表面結合，然后用BS3與其配體化學交聯(lián)，然后從該細胞制備膜富集成份。使用兔抗-CTGF抗體免疫沉淀交聯(lián)的CTGF復合物，以SDS-PAGE鑒別，使用雞抗-CTGF抗體通過Western印跡進行分析(泳道2)。對于一些培養(yǎng)物省去了交聯(lián)步驟(泳道1)。結果代表了三個不同的實驗。
圖4-CTGF與TrkA和p75NTR在HMC中相互作用(A)在沒有(泳道1)或存在(泳道2)CTGF/V5融合蛋白(40ng/ml)的條件下培養(yǎng)血清饑餓的HMC15分鐘，之后在RIPA緩沖液中制備細胞溶胞產物。等量的溶胞產物蛋白使用抗磷酸酪氨酸珠免疫沉淀。結合的蛋白質通過SDS-PAGE分辨并使用抗TrkA抗體通過Western印跡進行分析。
(B)HMC在沒有(泳道1)或存在(泳道2)組氨酸標記的-CTGF/V5融合蛋白(200ng/ml)的條件下4℃溫育2小時以允許結合細胞表面受體，之后與該蛋白質用DTSSP化學交聯(lián)。制備膜富集成份并溶解。等量的溶解蛋白與金屬親和珠溫育。結合的蛋白在還原條件下進行SDS-PAGE，并使用抗TrkA抗體進行Western印跡。
(C)HMC與200ng/ml rCTGF(FibroGen Inc.)在4℃下溫育2小時。結合的CTGF按上述交聯(lián)，制備膜富集成份并溶解。在溶解成份中的交聯(lián)的CTGF-復合物捕捉到抗-C-末端-CTGF抗體親和珠上(泳道1)，或用對照IgG親和珠溫育該成份(泳道2)。使用抗-TrkA抗體通過Western印跡分析結合的蛋白質。
(D)圖4C泳道1所示的樣品煮沸更長的時間，然后使用抗-TrkA抗體進行Western印跡。
(E)剝離印跡(D)并使用抗-p75NTR抗體再探測。結果代表了4個不同的實驗。
圖5-HMC表達Trk受體從HMC提取總RNA并用于RT-PCR。擴增后，10μl各PCR反應產物通過含溴化乙錠(0.5μg/ml)的1.2％(w/v)瓊脂糖凝膠進行電泳。結果代表了3個不同的實驗。
圖6-CTGF活化HMC中的TrkA在沒有(泳道1)或存在(泳道2)CTGF/V5(40ng/ml)的條件下培養(yǎng)血清饑餓的HMC15分鐘。對等量的細胞溶胞產物蛋白進行SDS-PAGE并通過Western印跡進行分析。印跡A用抗-TrkA抗體進行探測。印跡B用抗磷酸-TrkA(Tyr490)抗體進行探測，而印跡C用抗磷酸-TrkA(Tyr674/675)進行探測。結果代表了3個不同的實驗。
圖7-HMC中的CTGF刺激TIEG水平血清饑餓的HMC與rCTGF/V5融合蛋白接觸不同的時間期限，之后制備細胞溶胞產物并通過Western印跡分析TIEG和β-肌動蛋白水平。顯示了進行的3個獨立實驗的代表性印跡(每個實驗每種條件重復3份培養(yǎng)物)。
圖8-TIEG介導Smad7表達水平的CTGF-依賴型下調血清饑餓的HMC接受圖中所示的條件。24小時后，制備細胞溶胞產物，通過Western印跡分析TIEG，Smad7，和β-肌動蛋白水平。顯示了進行的3個獨立實驗的代表性印跡(每個實驗每種條件重復3份培養(yǎng)物)。
實施例實施例1-CTGF-TrkA相互作用的鑒定材料和方法細胞培養(yǎng)物，抗體和試劑原代正常成人腎小球膜細胞(HMC)(CC-2259，lot 3F1510)(Biowhittaker，Wokingham，Berkshire，U.K.)按以前所述在培養(yǎng)基中維持(Wahab N等，(1996)Biochem J.316，第985-992頁)。
匯合長滿的指數(shù)期后的HMCs培養(yǎng)物(6-8代)在含10％(v/v)胎牛血清和4mM(正常血糖)，11，15或30mM(高血糖)d-葡萄糖的培養(yǎng)基中維持達4周。在每周末，用PBS充分洗滌培養(yǎng)物并用于RNA提取或在無血清時在補充了葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。
使用Phospho-Akt抗體(P-Ser 472/473/474)(Pharmingen，San Diego，CA，USA)，Phospho-Akt(P-Thr 308)(Sigma，Gillingham，Dorset，UK)和ERK5抗體(Sigma，Gillingham，Dorset，UK)。
Phospho-ERK1/2途徑采樣器，phospho-JNK途徑采樣器，phospho P38MAPK途徑采樣器，phospho-PKCδ，phospho-PKCα，phospho-TrkA(Tyr674/675)，phospho-TrkA(Tyr490)抗體來自New EnglandBioLabs(Hitchen，Herts.，UK)。Phospho-CaMKII(P-Thr286)抗體來自Promega(Southampton，Hants.，UK)且抗磷酸酪氨酸抗體來自SantaCruz(Autogen Bioclear，Calne，Wilts.，UK)?？?TrkA 抗體從UpstateBiotechnology(Milton Keynes，UK)獲得?？?TIEG-1抗體由Dr.StevenJohnson(Mayo Foundation，Minnesota，USA)惠贈。K-252a購自Calbiochem(Nottingham，UK)。重組CTGF(CTGF/V5融合蛋白)在轉化的HMC中表達且使用Talon金屬親和樹脂從培養(yǎng)基中純化(Wahab N等，(2001)Biochem J.359，第77-87頁)。作為選擇，r-CTGF(非融合蛋白)在桿狀病毒系統(tǒng)中表達且由FibroGen Inc.惠贈(South San Francisco，CA，USA)。兔抗-CTGF(pAb2)和雞抗-CTGF(pIgY3)也由FibroGen Inc.提供。
交聯(lián)和膜制品細胞層用冷的結合緩沖液(PBS和0.5％葡萄糖)洗滌兩次并在結合緩沖液中用CTGF在4℃下溫育2小時。溫育后，細胞層用冷結合緩沖液洗滌5次并用1mM 3，3′-二硫基雙(磺基琥珀酰亞胺基丙酸酯)(DTSSP)或二琥珀酰亞胺辛二酸酯(DSS)(Pierce Biotechnology，Tattenhall，Cheshire，UK)在PBS中室溫下溫育30分鐘。通過加入50mM Tris緩沖液pH7.5室溫下終止反應15分鐘。
細胞層用洗滌緩沖液(10mM Tris緩沖液(pH7.5)，5mM MgCl，150mMNaCl))洗滌，在勻漿緩沖液(10mM Tris緩沖液(pH7.5)，250mM蔗糖，1mM EDTA，5mM MgCl，150mM NaCl，和1x蛋白酶抑制劑混合劑(RocheApplied Science Mannheim，Germany))中刮碎，通過25號針頭，并在Dounce勻漿器中以30-40轉在冰上勻漿。
勻漿產物在4℃下以2500xg離心10分鐘。所得的上清在4℃下以45000xg離心90分鐘。膜富集沉淀在溶解緩沖液(10mM Tris緩沖液(pH7.5)，5mM MgCl，150mM NaCl，1％Triton-X100，1x蛋白酶抑制劑混合劑(Roche，見上文))中溶解1小時。在4℃下以45000xg再離心1小時后收集可溶性膜蛋白。
如果使用rCTGF/V5融合蛋白，CTGF-交聯(lián)蛋白用兔抗CTGF抗體免疫沉淀，或者捕捉到Pull-Down PolyHis柱(Pierce Biotechnology，Tattenhall，Cheshire，UK)上。
如果使用rCTGF，將CTGF-交聯(lián)蛋白捕捉到山羊抗-CTGF-C末端結構域-瓊脂糖免疫親和柱上，使用IgG-瓊脂糖柱作為對照(FibroGen Inc.)。用溶解緩沖液充分洗滌柱后，在還原的SDS-PAGE上樣緩沖液中溶解結合的蛋白質，煮沸5分鐘并通過SDS-PAGE在4-12％梯度凝膠上分辨。凝膠用考馬斯藍染色，或者用于Western印跡。
RNA提取和RT-PCR分析使用RNAzol B方法(AMS Biotechnology(UK)Ltd.，Oxfordshire，UK)從6×106個腎小球膜細胞提取總RNA。來自各樣品的等量總RNA(2μg)使用SuperScript II RNase H+逆轉錄酶(Gibco BRL，Paisley，Scotland，UK)和隨機引物逆轉錄成cDNAs。
等量(0.5μl)的逆轉錄反應物(20μl)在含有10μl的10xPCR緩沖液，16μldNTPs(各1.25mM)，2mM MgCl2，5M甜菜堿(Sigma)，0.5μM各特定引物和1.25U Amplitaq DNA聚合酶(Gibco BRL)的100μl體積中進行PCR擴增。在94℃下變性5分鐘開始擴增，接著對所有基因進行30個PCR循環(huán)。每個循環(huán)由94℃下60秒，55℃下60秒和72℃下60秒組成。最后在72℃下延伸10分鐘。擴增TrkA，TrkB和TrkC p75NTR，NGF，BDGF的引物序列按Anderson等，(2002)J Clin.Endocrinol.Metab.87，第890-897頁所述且在表1中給出(對Anderson等(2002)表1的修改)。
表1
Western印跡細胞在還原SDS-PAGE上樣緩沖液中裂解且立即從平板上刮下。細胞溶胞產物超聲處理10秒以剪切DNA。然后樣品煮沸5分鐘并通過SDS-PAGE在4-12％梯度凝膠上分辨。使用BioRad轉移裝置將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯濾膜(Immobilin-P，Millipore，Bedford，UK)上。印跡在含有1xTBS，0.1％Tween-20且含5％(w/v)脫脂奶粉的封閉緩沖液中溫育1小時。
通過在抗體稀釋緩沖液(1xTBS，0.1％Tween-20且含5％BSA)中適當稀釋的第一抗體中4℃下溫育印跡過夜進行免疫檢測。然后用洗滌緩沖液(1xTBS，0.1％Tween-20)洗滌印跡3次并用第二辣根過氧化物酶(HRP)-偶連的抗體室溫下溫育1小時。
結合的抗體使用增強的化學發(fā)光試劑Luminol(Autogen Bioclear UKLtd，Wiltshire，UK)顯色。預染的分子量標準(Amersham International PLC，Amersham，UK)用于監(jiān)測蛋白質遷移。
免疫熒光染色細胞用3.7％低聚甲醛固定并用含0.5％Triton X-100的PBS室溫下透化處理10分鐘。然后用與產生第二抗體相同物種的血清(5％溶于PBS)4℃下溫育蓋玻片過夜。第一次溫育后，用第一抗體(在含3％BSA的PBS中最佳稀釋)在37℃下溫育蓋玻片1小時。
然后洗滌蓋玻片并用熒光素偶連的第二抗體(Sigma Aldrich，Dorset，UK)在黑暗中溫育1小時。染色后，用抗退色封固介質(Vector Labs，Peterborough，U.K.)將蓋玻片封固在玻璃片上并使用熒光顯微鏡檢查。
結果CTGF活化一些細胞內信號途徑使用純化的rCTGF-V5融合蛋白鑒定與HMC中的生長因子反應活化的細胞內信號途徑。發(fā)現(xiàn)CTGF迅速觸發(fā)傳統(tǒng)MAPK(ERK1/2)和JNK途徑(圖1A和B)的活化但不能活化p38MAPK。圖1顯示了CTGF刺激15分鐘后這些激酶的最大活化。
CTGF刺激還導致Akt，也稱為蛋白激酶B(PKB)在兩個已知的磷酸化位點Thr-308和Ser-473的活化(圖1C)。Thr-308的活化與ser-473的活化相比似乎更迅速且持久。
Thr-308的活化受到磷酸肌醇依賴型激酶1，或PDK1的影響，PDK1的活性嚴格依賴于3-磷酸化肌醇脂類(Downward J(1998)Curr.Opin.CellBiol.10第262-267頁)。Ser-473的磷酸化通過整聯(lián)蛋白連接的激酶(ILK)進行(Attwell等，(2000)Oncogene 19第3811-3815頁)，且似乎在15分鐘時瞬時具有最大水平，且在接觸CTGF30分鐘內返回到接近基礎的水平。
CTGF刺激還導致Cam KII的瞬時活化(圖1C)。與CTGF反應活化的其它激酶是PKCδ和PKCα(圖1D)。
CTGF與受體的相互作用圖1證實了CTGF通過活化上述激酶的受體給下游信號蛋白提供信號。這些激酶正常情況下由受體酪氨酸激酶(RTK)活化。
通過將HMC與CTGF接觸不同的時間檢測CTGF通過受體酪氨酸激酶(RTK)起作用的可能性。從HMC細胞制備細胞溶胞產物并使用抗磷酸酪氨酸抗體進行Western印跡分析。
結果表明CTGF融合蛋白(40ng/ml)在10分鐘內刺激HMC中至少兩種表觀分子量為大約75-80和140-150kDa的主要蛋白的酪氨酸磷酸化(圖2)。
在對照細胞溶胞產物中檢測到另一磷酸酪氨酸蛋白質(MW45 kDa)但是響應CTGF處理而減少。
CTGF與人腎小球膜細胞(HMC)表面蛋白相互作用通過允許CTGF結合到該細胞表面來考察CTGF與HMC表面蛋白的相互作用。接著進行交聯(lián)操作并從細胞分離膜富集成份。溶解后用兔抗-CTGF抗體免疫沉淀該成份。然后通過PAGE和用雞抗-CTGF抗體進行Western印跡來分析共價交聯(lián)的CTGF復合物。
在圖3中，CTGF似乎與膜蛋白交聯(lián)形成表觀分子量為85kDa，180kDa和＞220kDa的復合物，后者是大型擴散帶(泳道2)。當刪除交聯(lián)步驟時這些復合物沒有從膜富集成份中免疫沉淀(泳道1)。
為了確定CTGF是否活化RTK，將血清饑餓的HMC在存在和沒有CTGF的條件下培養(yǎng)15分鐘。將細胞裂解并免疫沉淀磷酸酪氨酸蛋白。使用抗多種已知酪氨酸激酶受體的抗體通過Western印跡分析免疫沉淀的蛋白質。
圖4A顯示了交叉反應的抗-TrkA抗體(大約140kDa的帶)。當用CTGF培養(yǎng)細胞時該帶的強度更強(泳道2)，表明通過CTGF活化。
通過不同的實驗證實CTGF與TrkA受體的相互作用，其中允許His-標記的CTGF/V5融合蛋白，或在桿狀病毒系統(tǒng)中表達的rCTGF結合到細胞表面，然后使用可逆交聯(lián)劑DTSSP與其配體交聯(lián)。后者隨后通過還原試劑裂解。
隨后，制備膜成份并將任何交聯(lián)的CTGF復合物捕捉到親和金屬珠，或抗-C末端CTGF抗體親和珠上。捕捉的復合物在還原條件下進行SDS-PAGE并通過Western印跡進行分析。
圖4B，4C，和4D證實了CTGF與TrkA受體相互作用。
以前已經(jīng)證實了Trk受體與泛(pan)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體p75NTR相互作用。因此，剝離印跡并使用抗-p75NTR抗體再探測。圖4E顯示了該抗體與具有P75NTR的正確分子量的蛋白質交叉反應。
因此該結果證實了CTGF與TrkA和p75NTR受體相互作用。
HMC表達Trk受體通過從HMC提取總RNA對其進行RT-PCR分析來考察HMC的Trk受體表達。圖5顯示了HMC表達Trk受體家族的所有三個成員TrkA，TrkB，和TrkC，以及泛受體p75NTR。
CTGF活化HMC中的TrkATrkA與其配體結合時自身磷酸化一些酪氨酸殘基，導致締合和活化多種效應物分子。Tyr490的磷酸化是Shc締合和活化Ras-MAP激酶級聯(lián)所必需的。Tyr674/675的磷酸化位于催化域內且反映了Trk激酶活性。因此我們試驗了用CTGF刺激細胞是否會導致TrkA在這些殘基上磷酸化。圖6中的結果清楚地表明CTGF誘導該受體在這些殘基上磷酸化。
K252a抑制CTGF-誘導的信號傳導K252a是已知選擇性抑制酪氨酸激酶的生物堿樣激酶抑制劑。在CTGF刺激的HMC細胞中K252a抑制ERK1/2，JNK和ERK5的蛋白質磷酸化。這表明這些激酶的磷酸化可通過酪氨酸激酶受體trkA誘導，且酪氨酸激酶抑制劑能夠抑制CTGF介導的信號傳導。
CTGF誘導TIEG的表達圖7顯示了CTGF接觸引起TIEG表達水平的迅速增加。
通過用TIEG反義和對照寡核苷酸處理細胞來考察TIEG直接介導Smad7水平的CTGF-依賴型下調的能力。圖8顯示HMC中TIEG和Smad7蛋白的組成型水平低(泳道1)。
用CTGF培養(yǎng)細胞24小時顯著增加TIEG水平而將Smad7降低到幾乎不能檢測的水平(泳道2)。在TIEG反義寡核苷酸存在的條件下該影響被完全消除(泳道5)，但是對照寡核苷酸不能(泳道6)。
單獨用TGF-b培養(yǎng)細胞相同的時間導致TIEG和Smad7都適度增加(泳道3)。然而，在CTGF反義寡核苷酸存在的條件下用TGF-b培養(yǎng)細胞完全消除TIEG的適度誘導并導致Smad7的誘導增加(泳道7)。在對照反義寡核苷酸存在的條件下沒有觀察到該結果(泳道8)且與導致觀察到TIEG表達水平適度增加的TGF-b-誘導的CTGF一致。
通過用TIEG反義和對照反義寡核苷酸處理細胞也獲得了相似的結果(泳道9和10)。用TGF-b和CTGF培養(yǎng)細胞(泳道4)顯著增加TIEG的表達水平而減少Smad7的表達水平。這些結果清楚地表明TIEG介導Smad7表達的CTGF-依賴型下調。
實施例2-用于鑒定抑制CTGF誘導的纖維變性的化合物的篩選方法通過在用CTGF處理的HMC中試驗各化合物抑制，例如，TIEG誘導的能力實施篩選具有依賴于CTGF-CTGF受體相互作用的纖維變性抑制特性的化合物。
使用含有或不含潛在抑制劑預培養(yǎng)30分鐘的人腎小球膜細胞(HMC)實施該篩選方法。然后在存在或沒有潛在抑制劑的條件下用CTGF-V5融合蛋白(40ng/ml)刺激這些細胞2小時。用冷PBS洗滌細胞層后，在RIPA緩沖液中裂解細胞并通過ELISA測定溶胞產物的TIEG。
對于ELISA試驗(Voller A等，(1976)，in Manual of Clinical Immunology(Rose，N和Fishman H，編)第506-512頁，American Society of Microbiology，Washington，DC.)，用溶胞產物或提供標準曲線的r-TIEG標準稀釋液在4℃下覆蓋NUNC微量滴定板過夜。
去掉覆蓋溶液并用PBS簡單洗滌孔后，通過用含1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS在37℃下溫育孔1小時封閉非特異性蛋白。然后用最佳稀釋的抗-TIEG抗體溫育孔60分鐘，接著用過氧化物酶偶連的第二抗體在37℃下溫育60分鐘。用PBS洗滌孔3次后，用底物2，2′-連氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉6-磺酸(2，2′-azinobis-3-ethylbenzthazoline 6-sulphonic acid)檢測結合的抗體并讀取405nm下的吸光度。
通過克隆進PcDNA 3.1/V5-His Topo載體(InVitrogen)從全長TIEGcDNA產生重組TIEG蛋白。該載體可轉染進哺乳動物細胞系以表達TIEG-融合蛋白。
使用預結合的鎳螯合樹脂從細胞溶胞產物純化TIEG融合蛋白?？?TIEG抗體可從Dr.Steven Johnson(Mayo Foundation，Minnesota，USA)獲得或者可使用常規(guī)方法在兔中針對TIEG融合蛋白產生。
實施例3-通過抑制(blocking)CTGF激動劑(agonist)接近細胞表面受體減少糖尿病小鼠中糖尿病性腎病的形成通過抑制CTGF激動劑接近細胞表面受體，可預防和/或減少糖尿病小鼠中糖尿病性腎病的形成。通過使用能夠結合CTGF受體激動劑的試劑，從而防止該激動劑與細胞表面受體的結合可做到這點。例如，可使用可溶性小鼠TrkA受體(sTrkA)。
代表CTGF受體細胞外區(qū)域的cDNA序列可使用從小鼠腎提取的總RNA和特別設計的寡核苷酸引物通過RT-PCR產生。將該PCR產物克隆進設計成有效分泌表達蛋白的pSecTag2哺乳動物表達載體(Invitrogen)閱讀框中。已經(jīng)表明免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的融合延緩了其它可溶性受體的體內清除(Zhou A，Ueno H，Shimomura M，Tanaka R，Shirakawa T，NakamuraH，Matsuo M，Iijima K.Kidney Int.2003，6492-101)，因此可通過RT-PCR擴增小鼠IgG的Fc部分的cDNA并與CTGF 3′端(with the 3′-end of CTGF)克隆進閱讀框中。
小鼠Fc的反義引物含有防止其與存在于pSecTag2載體中的myc表位融合的終止密碼子。這些構建體可用于按照標準技術，通過使用存在于pSecTag2載體中用于選擇的Zeocin抗性基因產生穩(wěn)定轉染的小鼠成纖維細胞系。
有效表達和分泌該受體的細胞系可按常規(guī)大規(guī)模培養(yǎng)(T150瓶)。使用FPLC Mono S(Pharmacia)可從培養(yǎng)基中純化表達的重組蛋白質，通過考馬斯藍染色的SDS-PAGE檢查純化的蛋白質并用磷酸鹽緩沖液(PBS)透析。透析的蛋白質可通過Detox-igel柱(Pierce)，通過使用鱟阿米巴樣細胞試驗(Sigma)檢查內毒素，并過濾滅菌(0.2μm)。
為了進行體內試驗，設置4組小鼠(a)，(b)和(c)db/db小鼠(每組n＝10)，和(d)db/m小鼠(n＝10)。對于這些實驗，我們使用糖尿病型db/db和非糖尿病型db/m小鼠(Jackson Laboratory)。db/db小鼠是遺傳改造的小鼠模型，代表2型糖尿病且在出生后幾周形成與肥胖和胰島素抗性相關的高血糖。我們選擇該模型是因為它在16周大之前表現(xiàn)出腎小球膜擴張(Chen H，Charlat O，Tartaglia LA，Woolf EA，Weng X，Ellis SJ，Lakey ND，Culpepper J，MooreKJ，Breitbart RE，Duyk GM，Tepper RI，Morgenstern JP.Cell.1996，84491-5；Like AA，Lavine RL，Poffenbarger PL，Chick WL.Am J Pathol.1972，66193-224.)。
在糖尿病發(fā)作后立即對(a)組每天接受50μg sTrkA的皮下注射。我們根據(jù)其它研究人員同樣設計的成功實驗選擇該劑量(Park L，Raman KG，LeeKJ，Lu Y，F(xiàn)erran LJ Jr，Chow WS，Stem D，Schmidt AM.Nat Med.1998，41025-31；Wendt TM，Tanji N，Guo J，Kislinger TR，Qu W，Lu Y，Bucciarelli LG，Rong LL，Moser B，Markowitz GS，Stein G，Bierhaus A，Liliensiek B，Arnold B，Nawroth PP，Stern DM，D′Agati VD，Schmidt AM.Am J Pathol.2003，1621123-37；Holash J，Davis S，Papadopoulos N，Croll SD，Ho L，Russell M，Boland P，Leidich R，Hylton D，Burova E，Ioffe E，Huang T，Radziejewski C，Bailey K，F(xiàn)andl JP，Daly T，Wiegand SJ，Yancopoulos GD，Rudge JS.Proc NatlAcad Sci U S A.2002，9911393-8.)。
皮下注射的VEGF的s-受體-Fc捕捉劑(decoy)具有大約2天的血清半壽期(t1/2)。(b)組接受等體積的載體。(c)和(d)組不接受治療。在20周大時處死小鼠以評估糖尿病性腎病的形成。
糖尿病性腎病的形成可通過尿白蛋白，血清和尿肌酸酐，腎小球組織學改變和腎小球ECM積聚來評估。小鼠在獨立代謝籠中圈養(yǎng)以進行24小時尿收集?？墒褂檬笪⒘堪椎鞍啄?microalbuminuria)試劑盒(Albuwell M；Exocell，Philadelphia)用ELISA測定尿白蛋白濃度。可通過計算肌酸酐清除率(ml/min/100g體重)評估腎功能。血清和尿肌酸酐水平可通過酶法使用苦味酸比色方法測量(Sigma)。
實施例4-藥物制劑和給藥本發(fā)明的化合物正常情況下通過口服或通過任一腸胃外途徑以包含活性成份的藥物制劑形式，任選以無毒有機，或無機，酸，或堿，加成鹽的形式，以藥用上可接受的劑型給藥。依賴于所治療的疾病和患者，以及給藥途徑，該組合物可按各種劑量給藥。
在人類治療中，本發(fā)明的化合物可單獨給藥，但是一般與根據(jù)目的給藥途徑和標準藥學實踐選定的合適的藥用賦形劑，稀釋劑或載體混合給藥。
例如，本發(fā)明的化合物可通過口服，含服或舌下以可含有調味或染色劑的片劑，膠囊，卵狀體，酏劑，溶液或懸液的形式給藥用于立即-，延遲-或控制-釋放應用。本發(fā)明的化合物也可通過海綿體內注射給藥。
該片劑可含有諸如微晶纖維素，乳糖，檸檬酸鈉，碳酸鈣，磷酸氫鈣和甘氨酸的賦形劑，諸如淀粉(優(yōu)選玉米，馬鈴薯或木薯淀粉)，淀粉乙醇酸鈉，croscarmellose sodium和某些復合硅酸鹽的崩解劑，和諸如聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基甲基纖維素(HPMC)，羥丙基纖維素(HPC)，蔗糖，明膠和阿拉伯膠的顆粒粘合劑。另外，可包含諸如硬脂酸鎂，硬脂酸，榆樹酸甘油酯(glyceryl behenate)和滑石的潤滑劑。
也可采用相似類型的固體組合物作為明膠膠囊的填充物。在這方面優(yōu)選的賦形劑包括乳糖，淀粉，纖維素，乳糖或高分子量聚乙二醇。對于水懸液和/或酏劑，本發(fā)明的化合物可與各種甜味劑或調味劑，染色物質或染料，與乳化劑和/或懸浮劑和與諸如水，乙醇，丙二醇和甘油，及其組合的稀釋劑混合。
本發(fā)明的化合物也可通過腸胃外，例如，靜脈內，動脈內，腹膜內，鞘內，心室內，胸骨內，顱內，肌肉內或皮下給藥，或者它們可通過輸注技術給藥。它們最好以可含有其它物質，例如，足夠的鹽或葡萄糖使得該溶液與血液等滲的無菌水溶液的形式使用。如果需要，該水溶液應當是適當緩沖的(優(yōu)選pH從3到9)。在無菌條件下制備合適的腸胃外制劑可通過本領域的技術人員熟知的標準制藥技術容易地完成。
適合于腸胃外給藥的制劑包括可含有抗氧化劑，緩沖劑，制菌劑和使得該制劑與目的受體血液等滲的溶質的含水和無水無菌注射液；和可包含懸浮劑和增稠劑的含水和無水無菌懸液。該制劑可存在于單劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，且可在冷凍干燥(凍干)條件下貯存，使用前僅需即時加入無菌液體載體，例如注射用水。臨時注射溶液和懸液可從以前描述的無菌粉末，顆粒和片劑類型制備。
對于病人的口服和腸胃外給藥，本發(fā)明的化合物的日劑量水平通常從1mg/kg到30mg/kg。因此，例如，本發(fā)明的化合物的片劑或膠囊可含有一個劑量的活性化合物，如果合適可一次施用單個或兩個或多個。在任何情況下醫(yī)生可確定最適合于任一患者個體的實際劑量且它可隨年齡，體重和特定患者的反應而變化。上述劑量是平均情況的舉例。當然，存在應接受更高或更低劑量范圍的個體情況且它在本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明的化合物也可通過鼻內或通過吸入給藥且可方便地以干粉吸入器的形式給藥或使用合適的推進劑，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，氟代烷烴，例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134A3或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227EA3)，二氧化碳或其它合適的氣體從加壓容器，泵，噴霧器或霧化器提供氣溶膠噴霧。對于加壓的氣溶膠，通過提供閥門給予標定量可測定劑量單位。加壓的容器，泵，噴霧器或霧化器可含有活性化合物的溶液或懸液，例如使用乙醇和推進劑的混合物作為溶劑，它還可含有潤滑劑，例如山梨聚糖三油酸酯。用于吸入器或吹入器的膠囊和藥筒(由例如，明膠制成)可配制成含有本發(fā)明化合物的粉末混合物和諸如乳糖或淀粉的合適粉末基質。
優(yōu)選排列氣溶膠或干粉制劑使得每次標定的劑量或“噴出”給予合適劑量的本發(fā)明的化合物用于患者的給藥?？深A料到氣溶膠的總日劑量可隨患者而變化，且在全天可用單次劑量或者，更常見的是，用分開的劑量給藥。
作為選擇，本發(fā)明的化合物可作為栓劑或陰道栓的形式給藥，或者它們可作為洗劑，溶液，乳膏，軟膏，撲粉的形式局部應用。本發(fā)明的化合物也可經(jīng)過皮膚給藥，例如，通過使用皮膚膏藥。它們也可通過眼途徑給藥，特別是用于治療眼病。
對于眼科用途，本發(fā)明的化合物可在等滲，調節(jié)了pH的，無菌鹽水中配制成微粉化的懸液，或者，優(yōu)選的是，作為在等滲，調節(jié)了pH的，無菌鹽水中的溶液，任選與諸如benzylalkonium chloride的防腐劑混合。作為選擇，它們可在諸如凡士林的軟膏中配制。
為了局部應用于皮膚，本發(fā)明的化合物可配制成含有懸浮于或溶于，例如一種混合物中的活性化合物的合適軟膏，該混合物具有一種或多種下列物質礦物油，液體凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯化合物，乳化蠟和水。作為選擇，它們可配制成懸浮于或溶于，例如，一種混合物中的合適的洗劑或乳膏，該混合物含有一種或多種下列物質礦物油，山梨聚糖單硬脂酸酯，聚乙二醇，液體石蠟，聚山梨醇酯60，鯨蠟基酯蠟，cetearyl alcohol，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。
適合于在口中局部給藥的配制品包括在調味基質，通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠中含有活性成份的錠劑；在諸如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠的惰性基質中含有活性成份的錠劑；和在合適的液體載體中含有活性成份的漱口水。
一般來說，在人類，本發(fā)明化合物的口服或局部給藥是優(yōu)選的途徑，因為它最方便。在接受者患有吞咽障礙或口服給藥后藥物吸收受損的情況下，該藥物可通過非腸道，例如，舌下或含服給藥。
對于獸醫(yī)用途，本發(fā)明的化合物可根據(jù)正常獸醫(yī)實踐以合適的可接受的劑型給藥且獸醫(yī)醫(yī)生會確定最適合于特定動物的給藥方案和給藥途徑。
權利要求
1.一種鑒定和/或制備用于減少和/或防止纖維樣變性的化合物的方法，包括步驟(a)提供CTGF受體；(b)提供試驗樣品；(c)提供CTGF受體激動劑；(d)將CTGF受體與試驗樣品接觸；(e)隨后或同時將CTGF受體與CTGF受體激動劑接觸；(f)檢測和/或測量CTGF受體的活化量；(g)比較存在試驗樣品時CTGF受體活化量與不存在試驗樣品時檢測和/或測量的CTGF受體活化量；和(h)根據(jù)其引起CTGF受體活化沒有增加或減少來確定化合物是否降低和/或防止纖維變性。
2.權利要求1的方法，還包含步驟(i)分離能夠減少和/或防止纖維變性的化合物。
3.權利要求2的方法，還包含步驟(j)將該分離的化合物配制成還包含藥用上可接受的載體，賦形劑和/或稀釋劑的組合物。
4.任一上述權利要求的方法，其中通過檢測和/或測量至少一種下列活性來測量和/或檢測CTGF受體活化CTGF受體自身磷酸化；受體誘導的蛋白質磷酸化；和/或CTGF受體誘導的TIEG表達。
5.任一上述權利要求的方法，其中CTGF受體激動劑是CTGF。
6.任一上述權利要求的方法，其中CTGF受體是TrkA受體。
7.任一上述權利要求的方法，其中該化合物直接影響CTGF受體和其激動劑之間的相互作用。
8.權利要求1至6中任一項的方法，其中該化合物間接影響CTGF受體和其激動劑之間的相互作用。
9.任一上述權利要求的方法，其中該化合物是CTGF受體拮抗劑。
10.用于減少和/或預防和/或診斷纖維變性的化合物，其特征在于它抑制和/或防止CTGF受體活化。
11.以權利要求1至9中任一項的方法鑒定和/或制備的化合物，用于減少和/或預防和/或診斷纖維變性。
12.權利要求10或11要求保護的化合物，它是選自多肽，抗體分子，反義核苷酸的至少一種。
13.權利要求12要求保護的化合物，其中該化合物是抗體分子。
14.權利要求12要求保護的化合物，其中該化合物是CTGF受體拮抗劑。
15.以權利要求1至9中任一項鑒定和/或制備的化合物在治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病中的用途。
16.以權利要求1至9中任一項鑒定和/或制備的化合物在制備用于治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病的藥物中的用途。
17.權利要求10或11要求保護的化合物在治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病中的用途。
18.權利要求10或11要求保護的化合物在制備用于治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病的藥物中的用途。
19.權利要求15至18中任一項要求保護的用途，其中該纖維變性疾病是選自糖尿病性腎病，非糖尿病性腎纖維變性，肺纖維變性，肝纖維變性(肝硬化)，骨骼肌纖維變性，心肌纖維變性，動脈粥樣硬化，全身性硬化(systemicsclerosis)，硬皮病，視網(wǎng)膜纖維變性，輻射誘導的纖維變性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌癥相關性纖維變性中的一種或多種。
20.權利要求19要求保護的用途，其中該疾病是糖尿病性腎病。
21.一種治療和/或預防纖維變性疾病的方法，包含施用治療上或預防上有效劑量，或多個劑量的以權利要求1至9中任一項的方法鑒定和/或制備的化合物。
22.一種治療和/或預防纖維變性疾病的方法，包含施用治療上或預防上有效劑量，或多個劑量的在權利要求10至14中任一項要求保護的化合物。
23.權利要求21或22要求保護的方法，其中該纖維變性疾病是選自糖尿病性腎病，非糖尿病性腎纖維變性，肺纖維變性，肝纖維變性(肝硬化)，骨骼肌纖維變性，心肌纖維變性，動脈粥樣硬化，全身性硬化(systemicsclerosis)，硬皮病，視網(wǎng)膜纖維變性，輻射誘導的纖維變性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌癥相關性纖維變性中的一種或多種。
24.權利要求23要求保護的方法，其中該纖維變性疾病是糖尿病性腎病。
25.能夠結合CTGF受體激動劑的試劑在治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病中的用途。
26.能夠結合CTGF受體激動劑的試劑在制備用于治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病的藥物中的用途。
27.權利要求25或26要求保護的用途，其中該纖維變性疾病是選自糖尿病性腎病，非糖尿病性腎纖維變性，肺纖維變性，肝纖維變性(肝硬化)，骨骼肌纖維變性，心肌纖維變性，動脈粥樣硬化，全身性硬化(systemicsclerosis)，硬皮病，視網(wǎng)膜纖維變性，輻射誘導的纖維變性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌癥相關性纖維變性中的一種或多種。
28.能夠結合CTGF受體激動劑的試劑在減少和/或防止CTGF受體激動劑與CTGF受體的體內或體外結合的方法中的用途。
29.權利要求26至28中要求保護的用途，其中能夠結合CTGF受體激動劑的試劑是CTGF受體。
30.權利要求26至28中要求保護的用途，其中能夠結合CTGF受體激動劑的試劑是與免疫球蛋白Fc-區(qū)連接的CTGF受體。
31.權利要求29或30要求保護的用途，其中CTGF受體是TrkA受體。
32.權利要求29或30要求保護的用途，其中CTGF受體是TrkA受體的可溶形式。
33.編碼與免疫球蛋白Fc-區(qū)連接的TrkA受體的核酸。
34.含有根據(jù)權利要求33的核酸的載體。
35.含有與免疫球蛋白Fc-區(qū)連接的TrkA受體的多肽。
36.含有根據(jù)權利要求33的核酸和/或根據(jù)權利要求34的載體和/或根據(jù)權利要求35的多肽的細胞。
37.一種藥用組合物，它含有根據(jù)權利要求33的核酸和/或根據(jù)權利要求34的載體和/或根據(jù)權利要求35的多肽和/或根據(jù)權利要求36的細胞，和藥用上可接受的載體或賦形劑，該核酸和/或載體和/或多肽和/或細胞以治療和/或預防和/或診斷纖維變性疾病有效的量存在。
全文摘要
本發(fā)明提供了鑒定和/或制備用于減少和/或防止纖維變性的化合物的方法，包含步驟提供CTGF受體；提供試驗樣品；提供CTGF受體激動劑(agonist)；將CTGF受體與試驗樣品接觸；隨后或同時將CTGF受體與CTGF受體激動劑接觸；檢測和/或測量CTGF受體活化量；比較存在試驗樣品時檢測和/或測量的CTGF受體活化量與不存在試驗樣品時檢測和/或測量的CTGF受體活化量；根據(jù)其引起CTGF受體活化沒有增加或減少來確定化合物是否降低和/或防止纖維變性。
文檔編號A61K39/00GK1906491SQ200480040637
公開日2007年1月31日 申請日期2004年11月15日 優(yōu)先權日2003年11月18日
發(fā)明者羅杰·M·馬森, 納迪亞·A·韋哈布 申請人:帝國大學改革有限公司