專利名稱：具有雌激素和抗增殖活性的啤酒花提取物的生產(chǎn)方法
根據(jù)第一個(gè)權(quán)利要求的前序部分，本發(fā)明涉及制備就6-異戊烯基柚皮素而言富含8-異戊烯基柚皮素(prenylnaringenin)的啤酒花提取物的方法。
啤酒花包含三種主要類型的次級(jí)代謝產(chǎn)物，即啤酒花(苦味)酸類、啤酒花精油和啤酒花多元酚類。啤酒花酸類和啤酒花精油和一定量的低分子量的多元酚類是用于啤酒釀造目的的最主要的啤酒花成分。為了得到包含想要比例的上述的次級(jí)代謝產(chǎn)物，用于釀酒目的的啤酒花提取物通常由用液體或超臨界CO2提取啤酒花或啤酒花產(chǎn)物來制備。
最近，重要的研究集中于異戊烯化的類黃酮類的生物活性上，其由特定類型的多元酚類構(gòu)成。存在于新鮮啤酒花中的最重要的異戊烯化的類黃酮類為查耳酮類，尤其是黃腐酚和脫甲基黃腐酚。這些查耳酮類是黃烷酮類的前體，例如異黃腐酚(來自黃腐酚)、8-異戊烯基柚皮素和6-異戊烯基柚皮素(這兩者都來自脫甲基黃腐酚)(參見

圖1)。已經(jīng)證實(shí)8-異戊烯基柚皮素是啤酒花的雌激素活性的主要成分，具有高于其它確定的植物雌激素活性(Milligan et al.，1999)。發(fā)現(xiàn)除了8-異戊烯基柚皮素，其它類似的源自啤酒花的化合物例如6-異戊烯基柚皮素、異黃腐酚、6，8-二異戊烯基柚皮素和8-香葉基柚皮素(geranylnaringenin)(Milligan et al.，2000)僅僅具有弱雌激素性。體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)了8-異戊烯基柚皮素的高雌激素活性(Milliganet al.，2002)。
另一方面，體外已經(jīng)表明黃腐酚是非常有效力的化學(xué)預(yù)防癌癥的化合物，另外，黃腐酚在癌發(fā)生的初始、增長(zhǎng)和進(jìn)展期具有廣譜抑制作用(Gerhauser etal.，2002)。與抗anti-initiating能力一致，黃腐酚有有效地調(diào)節(jié)參與致癌物代謝和解毒的酶的活性，所述酶例如CYP450-酶類(Henderson et al.，2000；Miranda et al.，2000c)和醌還原酶(Miranda et al.，2000a)。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃腐酚能清除包括羥基和過氧自由基類的活性氧(Miranda et al.，2000b；Rodriguez et al.，2001)，并抑制超氧陰離子自由基和一氧化氮產(chǎn)物(Zhao etal.，2003)。由于可能的抗腫瘤促進(jìn)活性，證實(shí)黃腐酚通過抑制環(huán)氧合酶-1和環(huán)氧合酶-2活性而具有抗炎活性(Gerhauseretal.，2002)。在進(jìn)展期(progression phase)中防止癌發(fā)生的抗增殖機(jī)理包括抑制DNA合成和誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在S-期、細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)細(xì)胞分化(Miranda et al.，1999；Gerhauser etal.，2002)。而且，證實(shí)黃腐酚以納摩爾(nanomolar)濃度就可預(yù)防小鼠乳腺器官培養(yǎng)物中致癌物誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生前損害，該模型可作體外短期和體內(nèi)長(zhǎng)期癌發(fā)生模型的連接(link)用(Gerhauser et al.，2002)。
上述描述的類黃酮類是在啤酒釀造中的非必需產(chǎn)品。在用液體或超臨界流體CO2提取想要的化合物后，他們大量存在于剩余的殘余物中。在其中使用整個(gè)啤酒花、啤酒花產(chǎn)物或具體的啤酒花成分的正常釀造條件下，異戊烯化的類黃酮類的總濃度可以達(dá)到4mg每升啤酒(Stevens et al.，1999)。
在DE199 39 350中，公開了制備富含黃腐酚的啤酒花提取物的方法，根據(jù)該方法，用有機(jī)溶劑或堿水提取啤酒花產(chǎn)物。在這種提取之前，可以用水提取啤酒花產(chǎn)物除去親水性物質(zhì)。其公開了水/醇溶液可作為適宜的有機(jī)溶劑。然而，在啤酒花的提取物中，根本沒有提到有關(guān)異戊烯化的黃烷酮類的存在。
根據(jù)WO03014287，啤酒花提取物的雌激素活性必須主要地歸于8-異戊烯基柚皮素的存在，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其是表現(xiàn)出最主要的雌激素活性的化合物。據(jù)報(bào)道，6-異戊烯基柚皮素也表現(xiàn)出雌激素活性，盡管其低于8-異戊烯基柚皮素，黃腐酚可干擾細(xì)胞代謝，可被認(rèn)為是預(yù)防癌癥的藥劑。在WO03014287中公開的啤酒花提取物適宜用于預(yù)防或治療由雌激素缺乏或性甾體激素尤其是雌激素代謝紊亂引起的疾病態(tài)。
WO03014287也公開了制備啤酒花提取物的方法，該啤酒花提取物富含查耳酮類和黃烷酮類，例如黃腐酚、異黃腐酚、6-異戊烯基柚皮素和8-異戊烯基柚皮素。該方法包括步驟(1)用C5-C7鏈烷或超臨界CO2提取啤酒花或啤酒花產(chǎn)物，用于除去包含在啤酒花中的疏水性物質(zhì)，(2)用水提取在步驟(1)中得到的殘余物，以便除去包含在啤酒花中的親水性物質(zhì)，和最后(3)用選自乙醇、水基乙醇、酮類、水基酮類或酯類或其混合物的有機(jī)溶劑提取步驟(2)中得到的殘余物。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在步驟(2)的水提取過程中，提高溫度可增加在這樣得到的啤酒花提取物中的異黃腐酚、6-異戊烯基柚皮素和8-異戊烯基柚皮素的濃度。然而，在所有的實(shí)施例中，8-PN/(8-PN+6PN)的重量比在18％-25％范圍內(nèi)。
據(jù)報(bào)道，在WO02/085393中公開的啤酒花提取物包含至少3wt.％的異戊烯化的類黃酮類，尤其是黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素。然而，當(dāng)與常規(guī)的、沒有富含的提取物相比，WO02/085393的主要提取物并沒有表現(xiàn)出增強(qiáng)的雌激素活性。因而，表明提取物組合物和雌激素活性之間不相關(guān)。而且，雌激素性不應(yīng)歸于8-異戊烯基柚皮素。進(jìn)一步斷定，當(dāng)提取物包含1-30wt.％的黃腐酚、0.01-50wt.％的異黃腐酚、0.0005-10wt.％的8-異戊烯基柚皮素時(shí)，提取物的雌激素性質(zhì)將特定表達(dá)。據(jù)說，WO02/085393啤酒花提取物適于制備具有雌激素性質(zhì)的藥物、化妝品組合物、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品和飲食制劑。
Hnsel和Schulz(1988)公開了在5％的乙醇化氫氧化鉀溶液中進(jìn)行從新鮮收割的啤酒花球果中分離的脫甲基黃腐酚和黃腐酚的異構(gòu)化。
黃腐酚異構(gòu)化為異黃腐酚，回收率為80％，然而脫甲基黃腐酚的異構(gòu)化得到6-異戊烯基柚皮素和8-異戊烯基柚皮素，或回收率分別為35％和30％。因此，可得到46％比例的8-PN/(8-PN+6-PN)，表明熱力學(xué)穩(wěn)定的6-異戊烯基柚皮素的生成是有利的。
另外，Milligan et al.(2002)公開了通過異黃腐酚的脫甲基制備8-異戊烯基柚皮素，其是在5％乙醇化氫氧化鉀溶液中異構(gòu)化干燥的啤酒花球果的二氯甲烷提取物的殘余物后分離得到的。在乙腈和二氯甲烷的混合物中使用三氯化硼進(jìn)行脫甲基過程，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率僅為53％。
大量專利，例如US 5.370.897、US 3.839.588和US 1.246.425公開了當(dāng)產(chǎn)生異-α-酸時(shí)，使用α-酸類進(jìn)行堿性異構(gòu)化的方法。然而，適宜用作這樣的異構(gòu)化反應(yīng)的提取物主要是通過用己烷、超臨界或液體二氧化碳作為提取溶劑獲得的。由于這樣的提取物不包含黃腐酚，也不包含脫甲基黃腐酚，異構(gòu)化的提取物不包含相應(yīng)的異戊烯化的黃烷酮類。而且，US 1.274.678公開了當(dāng)經(jīng)由苯提取得到包含α-酸的最初提取物時(shí)，發(fā)現(xiàn)必需除去異戊烯化的類黃酮類、黃腐酚和異黃腐酚，因?yàn)樗鼈兏蓴_制備方法。因此，在堿性介質(zhì)異構(gòu)化中的這些發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明沒有相關(guān)性。
雖然已經(jīng)研究了濃集包含異戊烯化的類黃酮類的啤酒花的方法，目前沒有發(fā)現(xiàn)獲得在其中主要存在與其異構(gòu)體6-異戊烯基柚皮素相比具有高雌激素8-異戊烯基柚皮素的啤酒花提取物的方法。
因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是提供用于制備具有提高的8-異戊烯基柚皮素的產(chǎn)率的啤酒花提取物的方法，尤其是制備在其中與其異構(gòu)體6-異戊烯基柚皮素相比，主要富含8-異戊烯基柚皮素的啤酒花提取物的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步主題是提供一種啤酒花提取物，考慮到它們的生物活性其具有特定和優(yōu)化的所有相關(guān)異戊烯化類黃酮類或其衍生物的組成。
用具有第一個(gè)權(quán)利要求的特征部分的技術(shù)特征的方法實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
本發(fā)明的方法的特征在于啤酒花或啤酒花產(chǎn)物進(jìn)行(1)在作為溶劑的水和一定量的堿的存在下進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)和(2)至少一種提取。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地在異構(gòu)化反應(yīng)中使用水作為溶劑。
應(yīng)當(dāng)理解啤酒花或酒花產(chǎn)物包含任意形式的處理的啤酒花，即palletised啤酒花或任意啤酒花提取物或任意包含異戊烯化的類黃酮類的啤酒花衍生的殘余物。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)在水作為溶劑的存在下進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)時(shí)，可得到進(jìn)一步富含異戊烯化的類黃酮類的啤酒花提取物。尤其是使用本發(fā)明可得到與現(xiàn)有技術(shù)相比富含高于6-異戊烯基柚皮素的8-異戊烯基柚皮素(和黃腐酚)的提取物，當(dāng)在異構(gòu)化反應(yīng)中僅使用水作為溶劑時(shí)，濃集是特定表達(dá)的。由于富含8-異戊烯基柚皮素，可得到具有高雌激素活性的啤酒花提取物，而且，其中8-異戊烯基柚皮素的存在引起的可能的增殖活性受到黃腐酚的抗增殖活性的抑制(參見圖2)。在這一方面，注意對(duì)所有的癌發(fā)生期即初始(initiation)，增長(zhǎng)(promotion)和進(jìn)展(progression)表現(xiàn)出特別廣譜的抑制機(jī)理的黃腐酚是很重要的(Gerhauser et al.，2002)。
進(jìn)行異構(gòu)化和至少一種提取的順序?qū)Ρ景l(fā)明并不重要。實(shí)際上，這意味著可首先進(jìn)行異構(gòu)化或至少一種提取的任一種。
異構(gòu)化反應(yīng)已知，在提高的溫度下，存在于啤酒花或啤酒花產(chǎn)品中的脫甲基黃腐酚和黃腐酚-最重要的異戊烯化的類黃酮類(查耳酮類)經(jīng)過Michael-類型的易做到的熱異構(gòu)化，分子內(nèi)環(huán)化成它們相應(yīng)的黃烷酮類。雖然黃腐酚實(shí)質(zhì)上專一性地異構(gòu)化為異黃腐酚，脫甲基黃腐酚的異構(gòu)化導(dǎo)致形成8-異戊烯基柚皮素(8-PN)和6-異戊烯基柚皮素(6-PN)的混合物，其中(8-PN×100％)/(8-PN+6-PN)的摩爾比例通常為15％至25％，這最可能地是由于8-PN比6-PN的熱穩(wěn)定性低。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在存在水和特定的堿性條件下進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)時(shí)，由于8-PN的熱力學(xué)不穩(wěn)定性，(8-PN×100％)/(8-PN+6-PN)的比例改變，(8-PN+6-PN)保持的總比例幾乎不受影響。由于當(dāng)與6-異戊烯基柚皮素或任意其它的衍生自啤酒花的化合物相比時(shí)，8-PN是具有較高雌激素活性的化合物，因此，與已知的啤酒花提取物(例如在提高的溫度下含水酒精的提取物)相比，得到的啤酒花提取物的雌激素活性可以增加3-5倍。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在異構(gòu)化反應(yīng)中，當(dāng)使用水作為唯一溶劑時(shí)，提高8-PN的濃集。
本發(fā)明的方法優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案特征在于，在相對(duì)于KOH水溶液濃度(w/v％)為至少0.5，優(yōu)選為至少1，更優(yōu)選為至少5的堿性條件下進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)。
如本領(lǐng)域已知的情況，當(dāng)使用水作為溶劑時(shí)，在提高的堿性條件進(jìn)行的異構(gòu)化反應(yīng)允許(8-PN×100％)/(8-PN+6-PN)的比例從15-25％改變?yōu)槌^50％，通常高于60和75％，或者8-PN的量更高，盡管(8-PN+6-PN)的總產(chǎn)率實(shí)質(zhì)上保持不受影響。結(jié)果是可得到其中富含8-PN的啤酒花提取物?；蛘邠Q句話說，根據(jù)本發(fā)明，6-PN/8-PN的比例可以逆轉(zhuǎn)，就本領(lǐng)域技術(shù)情況而言，可得到6-PN的選擇性濃集，本發(fā)明提供8PN的選擇性濃集，8-PN為具有較高雌激素活性的化合物。在本發(fā)明的方法中占優(yōu)勢(shì)的反應(yīng)條件下，存在于用于反應(yīng)的啤酒花產(chǎn)物中的高達(dá)約95％的黃腐酚可異構(gòu)化為異黃腐酚。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，也可以對(duì)提取物按這種方式進(jìn)行異構(gòu)化處理，其中所有的脫甲基黃腐酚之前就已經(jīng)定量地轉(zhuǎn)化為一定比例的(8-PN×100％)/(8-PN+6-PN)。
本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)注意，在回流的條件下，查耳酮類轉(zhuǎn)化成它們相應(yīng)的黃烷酮類的異構(gòu)化通常在5％氫氧化鉀乙醇溶液中(例如Hnsel和Schulz，1988)中進(jìn)行30分鐘，得到比例為40-46％的(8-PN×100％)/(8-PN+6-PN)。然而，根據(jù)本發(fā)明，可通過在水中，尤其是在室溫下，進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)可顯著性增加熱力學(xué)不穩(wěn)定的8-PN的濃集。
為了降低反應(yīng)物或反應(yīng)產(chǎn)物的氧化，異構(gòu)化反應(yīng)優(yōu)選在惰性大氣中進(jìn)行。反應(yīng)物尤其是黃腐酚和脫甲基黃腐酚以及反應(yīng)產(chǎn)物異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素包含雙鍵和酚基，其易于氧化。
對(duì)本發(fā)明而言，進(jìn)行異構(gòu)化的溫度并不重要，可以是反應(yīng)混合物的凝固點(diǎn)至沸點(diǎn)之間的任意溫度。最適宜的是，反應(yīng)在室溫進(jìn)行，包括40至60℃的溫度，尤其是約50℃也認(rèn)為是適宜的。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)異構(gòu)化反應(yīng)可以以高反應(yīng)速率進(jìn)行，可實(shí)際上在小于15分鐘內(nèi)完成，甚至在室溫下。為了有利于生成8-異戊烯基柚皮素，優(yōu)選進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)的時(shí)間段為0.25至4小時(shí)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將通常能調(diào)整異構(gòu)化反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間和溫度，以得到對(duì)想要的終產(chǎn)物的最適宜的轉(zhuǎn)換和選擇性，并最小化形成在異構(gòu)化反應(yīng)持續(xù)太長(zhǎng)時(shí)間的情形下可能存在不想要的副產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)。
提取方法在終止異構(gòu)化反應(yīng)之前或之后為了從啤酒花或啤酒花產(chǎn)物中分離想要的化合物，啤酒花或啤酒花產(chǎn)物進(jìn)行至少一次提取。
異戊烯化的類黃酮類的提取是通過用至少一種選自醇、水基醇、酮類、水基酮類或酯類或其混合物的有機(jī)溶劑或堿水提取啤酒花或啤酒花產(chǎn)物得到的。適宜使用的有機(jī)溶劑的實(shí)例包含中度的極性溶劑，例如乙酸乙酯或丙酮，或者高極性溶劑，例如乙醇或甲醇，或其混合物例如由90/10(v/v)乙酸乙酯/甲醇組成的混合物或含水酒精混合物(75/25(v/v)乙醇/水)。
優(yōu)選地，在啤酒花或啤酒花產(chǎn)物進(jìn)行至少一種提取之前或之后，或在啤酒花或啤酒花產(chǎn)物進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)之前或之后，用水和/或至少一種非極性溶劑對(duì)啤酒花或啤酒花產(chǎn)物進(jìn)行另外的提取步驟，接著回收富含異戊烯化的類黃酮類的殘余物或提取物。用水進(jìn)行的另外的提取是為了在富含啤酒花的提取物中得到異戊烯化的類黃酮類的高度富集，其是通過盡可能地除去存在于富含啤酒花的提取物中的非功能化親水性壓載物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。這樣的非功能化壓載物質(zhì)的實(shí)例包含蛋白質(zhì)。用至少一種非極性有機(jī)溶劑另外的提取使得非功能化疏水性(親脂性)壓載物質(zhì)的含量降低了，因而導(dǎo)致在富含異戊烯化的類黃酮類的提取物中異戊烯化的類黃酮類濃度的更高的富集。
在啤酒花或啤酒花產(chǎn)物起始物質(zhì)中進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)和提取的疏水性壓載物質(zhì)濃度太高的情況下，可采用至少一種非極性有機(jī)溶劑實(shí)施另外的提取。在非極限(non-exhaustive)(適度的溫度和壓力下)用液體或超臨界CO2對(duì)啤酒花的首次提取后的保留的主要是啤酒花殘余物的產(chǎn)物進(jìn)行另外的提取，以從含更多含有有關(guān)異戊烯化的類黃酮類的極性次級(jí)代謝物的殘余物分離啤酒釀造感興趣的化合物。
親水性和疏水性壓載物質(zhì)的提取可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意適宜的提取方法進(jìn)行。適宜的提取方法包括溶劑-溶劑提取法(例如水對(duì)乙酸乙酯、己烷對(duì)含水酒精混合物)或固相提取法(分別將親水性和疏水性物質(zhì)溶解在水和非極性溶劑中或使用硅石或衍生的硅石)。
在分別用水和非極性溶劑提取后，可通過例如傾析、過濾和/或離心法進(jìn)行包含異戊烯化的類黃酮類的組分的分離。
一種可能的提取方法例如包括使用液體或超臨界CO2提取啤酒花，并回收得到的產(chǎn)物，然后在堿條件中進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)。接著酸化包含煮沸的廢啤酒花的反應(yīng)混合物至中性pH，用水洗滌，之后例如通過過濾或離心回收殘余物。然后，可采用適宜的溶劑或其混合物從殘余物中選擇性提取異戊烯化的類黃酮類。
前處理為了提高本發(fā)明的經(jīng)濟(jì)可行性和進(jìn)一步濃集想要的化合物，在進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)和提取之前，在液體或超臨界CO2或者至少一種實(shí)質(zhì)上非極性有機(jī)溶劑中進(jìn)行提取啤酒花或啤酒花產(chǎn)物，接著回收包含異戊烯化的類黃酮類的殘余物。
實(shí)質(zhì)上，其意思是指當(dāng)殘余物富含異戊烯化的類黃酮類時(shí)，回收用于釀造目的的感興趣的提取物，并通過預(yù)提取除去絕大部分的疏水性壓載物質(zhì)。然后對(duì)這種富含前述物質(zhì)的殘余物進(jìn)行以任意順序的異構(gòu)化和至少一種提取。
另一個(gè)可行的方法包括使用乙醇性的稱之為“純樹脂提取”的液體或超臨界CO2提取，其是用載體(例如Kieselguhr)混合，再回收載體上的殘余物。然后對(duì)這種包含異戊烯化的類黃酮類的殘余物進(jìn)行任意順序的異構(gòu)化和至少一種提取。
適宜的制劑本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過在富含的提物中包含一定量的黃腐酚，則由8-異戊烯基柚皮素的雌激素活性導(dǎo)致的本發(fā)明的富含啤酒花提取物的可能的增殖可被抑制或抵消，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)黃腐酚具有抗增殖活性。然而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)僅僅在黃腐酚與8-異戊烯基柚皮素的重量比足夠高時(shí)才可得到這樣的抑制。特別地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)充分抑制需要黃腐酚對(duì)8-異戊烯基柚皮素的重量比為至少10，優(yōu)選至少30。該比例可通過給富含的提取物中加入過量黃腐酚來得到(參見圖2)。換句話說，黃腐酚與8-異戊烯基柚皮素以特定的比例存在，通過黃腐酚的抗增殖活性可得到與8-異戊烯基柚皮素的雌激素性相關(guān)的增殖活性的有效抑制。
一方面，圖2表明增加8-異戊烯基柚皮素的濃度導(dǎo)致MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖增加。本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，對(duì)于每種濃度的8-異戊烯基柚皮素，低濃度的黃腐酚(＜1μM)刺激8-異戊烯基柚皮素誘導(dǎo)的增殖，特別是那些濃度為黃腐酚與8-異戊烯基柚皮素的比例低于10，然而發(fā)現(xiàn)至少5μM較高濃度的黃腐酚可顯著地抑制8-異戊烯基柚皮素誘導(dǎo)的增殖。
遺憾的是，在能最有效地將脫甲基黃腐酚異構(gòu)化為8-異戊烯基柚皮素并同時(shí)有利于形成8-異戊烯基柚皮素的異構(gòu)化反應(yīng)條件下，黃腐酚幾乎定量地異構(gòu)化為異黃腐酚。另一方面，富含黃腐酚的啤酒花提取物可通過使啤酒花或啤酒花產(chǎn)物在非異構(gòu)條件下進(jìn)行至少一種提取得到(在室溫下和中性或酸性條件下提取)。因此，優(yōu)選的本發(fā)明的方法包含混合按上述描述的組合異構(gòu)化-提取步驟的方法得到的提取物和另一種富含黃腐酚的啤酒花提取物。這樣，可得到特定重量比例的包含黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的提取物。優(yōu)選地是，黃腐酚與8-異戊烯基柚皮素的重量比為至少10，更優(yōu)選至少30。當(dāng)在該范圍內(nèi)時(shí)，得到的混合物可表現(xiàn)出由于存在8-異戊烯基柚皮素引起的適宜的雌激素活性和由于存在黃腐酚引起的化學(xué)預(yù)防癌癥的活性。因此，由于黃腐酚異構(gòu)化為異黃腐酚，這種混合允許補(bǔ)償起始原料和隨后的至少一種異構(gòu)化反應(yīng)中任意黃腐酚含量的減少。通過混合從本發(fā)明的組合提取-異構(gòu)化中得到的富含8-異戊烯基柚皮素的提取物和富含黃腐酚的提取物，本發(fā)明能夠得到含有特定重量比8-異戊烯基柚皮素與黃腐酚的啤酒花提取物，而不受異構(gòu)化反應(yīng)中黃腐酚與異黃腐酚轉(zhuǎn)化度的影響。
因此，根據(jù)本發(fā)明，可得到包含至少0.15wt.％的8-異戊烯基柚皮素和至少3wt.％的黃腐酚，更優(yōu)選為至少0.33wt.％的8-異戊烯基柚皮素和至少10wt.％的黃腐酚的啤酒花提取物。
得到富含黃腐酚的提取物的適宜方法包含采用液體或超臨界CO2或至少一種實(shí)質(zhì)上非極性有機(jī)溶劑使啤酒花或酒花產(chǎn)物進(jìn)行至少一種提取，接著回收富含黃腐酚的殘余物，并為了進(jìn)一步濃集黃腐酚，采用適宜的溶劑或其混合物使殘余物進(jìn)行至少再一次提取的步驟。
另外，稱之為用乙醇化的液體或超臨界CO2提取的“純樹脂提取′”，其與載體(例如Kieselguhr)混合，導(dǎo)致載體上富含異戊烯化的類黃酮類的殘余物。然后，這種殘余物可用適宜的溶劑或其混合物進(jìn)行至少一種提取。
提高雌激素能力在本發(fā)明的用于制備啤酒花提取物的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括混合通過至少一種提取和異構(gòu)化反應(yīng)得到的提取物與一定量的富含具有高雌激素活性的化合物例如8-烷基柚皮素，優(yōu)選氫化的8-異戊烯基柚皮素的8-異戊基柚皮素的提取物。加入8-異戊烯基柚皮素的原因是由于本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)8-異戊基柚皮素顯示出雌激素活性，而這種雌激素活性僅僅比8-異戊烯基柚皮素的活性弱3-4倍(參見圖4)。發(fā)現(xiàn)與8-異戊基柚皮素相比，8-異戊烯基柚皮素顯示出高生物利用度和良好的穩(wěn)定性，由于它更不容易代謝。最可能地是，這可能應(yīng)歸于其在側(cè)鏈上不存在雙鍵。
可使用多種方法得到富含8-異戊基柚皮素的提取物。
一種可能的方法包括步驟a.使富含黃腐酚的啤酒花提取物進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)，將黃腐酚轉(zhuǎn)化為異黃腐酚；b.使步驟(a)中得到的提取物進(jìn)行催化氫化反應(yīng)，將異黃腐酚轉(zhuǎn)化為二氫異黃腐酚。所述的催化氫化優(yōu)選是通過使H2進(jìn)入在存在氫化催化劑例如載體化的Pt或Pd或其它催化劑下進(jìn)行的。適宜載體的實(shí)例例如活性碳。氫化反應(yīng)優(yōu)選在甲醇中進(jìn)行。
c.步驟(b)中的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行脫甲基反應(yīng)。這樣可將二氫異黃腐酚轉(zhuǎn)化為8-異戊基柚皮素。例如可以使用三溴化硼或其它適宜的甲基化試劑進(jìn)行脫甲基反應(yīng)。
因此，根據(jù)上述的方法，雌激素性鈍化(inactive)黃腐酚可轉(zhuǎn)化成具有高雌激素活性的化合物，即8-異戊基柚皮素。啤酒花中的黃腐酚濃度(0.3-1.2wt.％)高于8-異戊烯基柚皮素的前體脫甲基黃腐酚的濃度(0.005-0.2wt.％)是非常重要的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)上述的方法，得到的啤酒花提取物不僅富含8-PN，而且富含8-異戊基柚皮素，結(jié)果是雌激素活性顯著地增強(qiáng)。
得到包含8-異戊基柚皮素的另一個(gè)可能的方法是加入由合成方法得到的這種產(chǎn)品。盡管由于包含大量的反應(yīng)步驟，在8-位的取代通常具有低選擇性和產(chǎn)率，目前本發(fā)明人研究了一種用于合成8-異戊基柚皮素的高產(chǎn)率方法，其僅包含有限的反應(yīng)步驟。
根據(jù)該方法，在有機(jī)金屬試劑(例如異戊基鋰)存在下，2，4，6-三甲氧基-苯甲醛(參見圖3)進(jìn)行烷基化反應(yīng)，然后進(jìn)行脫氧，轉(zhuǎn)化成1-烷基-2，4，6-三甲氧基苯(例如1-異戊基-2，4，6-三甲氧基苯)。
脫氧優(yōu)選是在三氟乙酸中存在三乙基硅氧烷下進(jìn)行的。1-烷基-2，4，6-三甲氧基苯進(jìn)行乙?；磻?yīng)，然后進(jìn)行脫甲基反應(yīng)，最終得到3-烷基-2，4，6-三羥基苯乙酮(例如3-異戊基-2，4，6-三羥基苯乙酮)。乙酰化反應(yīng)優(yōu)選是在乙酰氯和四氯化錫下進(jìn)行的。脫甲基化優(yōu)選是在存在三溴化硼下進(jìn)行的。
在該合成途徑的過程中，優(yōu)選以甲氧基甲基醚(MOM)選擇性保護(hù)兩個(gè)酚基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于強(qiáng)的分子內(nèi)氫鍵，第三個(gè)酚基抵制反應(yīng)。
因此，得到的脫甲基反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行涉及MOM-保護(hù)的苯甲醛的混合羥醛反應(yīng)，形成查耳酮類，其經(jīng)過分子內(nèi)Michael-type環(huán)加成，成為相應(yīng)的黃烷酮類。通過在酸性環(huán)境中除去保護(hù)基，得到-8烷基柚皮素類(例如8-異戊基柚皮素)。
本發(fā)明還涉及啤酒花提取物本身，包含8-異戊烯基柚皮素和6-異戊烯基柚皮素的混合物，其中(8-異戊烯基柚皮素×100％)/(8-異戊烯基柚皮素+6-異戊烯基柚皮素)的比例為至少50％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少75％。因此，啤酒花提取物優(yōu)選包含一定量的黃腐酚，其中黃腐酚與8-異戊烯基柚皮素的重量比為至少10，優(yōu)選至少20，更優(yōu)選至少30。優(yōu)選地，啤酒花提取物包含至少0.15％(w/w)，優(yōu)選至少0.33％的8-異戊烯基柚皮素和至少3％，優(yōu)選至少10％(w/w)的黃腐酚。最優(yōu)選地，啤酒花提取物還包含一定量的異黃腐酚和一定量的8-烷基柚皮素，優(yōu)選8-異戊基柚皮素。
適應(yīng)癥本發(fā)明的啤酒花提取物或用本發(fā)明的方法得到的啤酒花提取物可用于制備具有雌激素和化學(xué)預(yù)防癌癥活性的藥物或植物藥，其中由于存在植物雌激素8-異戊烯基柚皮素而引起的可能的增殖活性被黃腐酚的抗增殖活性抵消。而且，本發(fā)明的啤酒花提取物或用本發(fā)明的方法得到的啤酒花提取物可用作用于治療或預(yù)防由雌激素性的激素平衡紊亂導(dǎo)致的病癥或癥狀或主訴或疾病的藥物或植物藥。
優(yōu)選地，由雌激素性的激素平衡紊亂導(dǎo)致的病癥或癥狀或主訴或疾病為絕經(jīng)相關(guān)的疾病(包括更年期)。因此，優(yōu)選地，所述疾病是骨質(zhì)疏松癥。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疾病選自性激素依賴性癌、心血管疾病、前列腺功能障礙和結(jié)腸癌。
本發(fā)明還涉及營(yíng)養(yǎng)組合物/補(bǔ)品，包含本發(fā)明的啤酒花提取物或用本發(fā)明的方法得到的啤酒花提取物。
本發(fā)明還涉及化妝品組合物，包含本發(fā)明的啤酒花提取物或用本發(fā)明的方法得到的啤酒花提取物。
為了得到最好的使用情況和生物利用度，來自本發(fā)明的啤酒花提取物可加入到多種制劑中，所述制劑包括丸劑、膠囊、gelules、溶液等，同時(shí)使用常規(guī)賦形劑。
在本發(fā)明的從屬權(quán)利要求中要求另外優(yōu)選的實(shí)施方案。
實(shí)施例和附圖本發(fā)明進(jìn)一步用下述的實(shí)施例和附圖闡述。
實(shí)施例1.提取為了從廢(Spent)啤酒花中選擇性提取黃腐酚和脫甲基黃腐酚，在室溫下，用1L的90/10(v/v)乙酸乙酯和甲醇的溶劑混合物浸漬提取廢啤酒花(啤酒花品種Nugget；202.74g)，即用液體或超臨界CO2對(duì)天然啤酒花提取后剩余的殘余物。濾出提取物，回收富含黃腐酚和脫甲基黃腐酚(720ml)的提取物。減壓蒸除溶劑后，將殘余物再溶解在100ml的己烷/甲醇1/1(v/v)混合物中，以便于提取親脂性壓載物質(zhì)，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。加入30ml酸性水溶液(1N HCl)后，棄去包含親脂性壓載物質(zhì)的己烷層。減壓蒸除剩余的甲醇層溶劑。加入水(70ml)和乙酸乙酯(100ml)，相分離，干燥包含最終啤酒花提取物的有機(jī)層。
產(chǎn)率-最終啤酒花提取物 4.64g(2.3％)-脫甲基黃腐酚 2.41wt.％(用HPLC測(cè)定)-黃腐酚33.62wt.％(用HPLC測(cè)定)實(shí)施例2.異構(gòu)化在含有各種含量的KOH(分別為0g、0.2g、0.4g和2g)中，在水中(40ml)攪拌實(shí)施例1中得到的0.5g的啤酒花提取物1小時(shí)。隨后，使用6N HCl酸化溶液至pH＝4-5。用乙酸乙酯提取回收的提取物，除去溶劑，干燥。定量HPLC分析的結(jié)果顯示在表1中。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，不加入堿攪拌得到的提取物包含非常類似于市售的啤酒花提取物比例的8-異戊烯基柚皮素和6-異戊烯基柚皮素，然而，加入增加量的堿有利于增加8-異戊烯基柚皮素，顯著提高了(8-異戊烯基柚皮素×100％)/(8-異戊烯基柚皮素+6-異戊烯基柚皮素)的比例。
表1.在各種堿性條件下，(8-異戊烯基柚皮素×100)/(8-異戊烯基柚皮素+6-異戊烯基柚皮素)的比例
實(shí)施例3在室溫下，于5％氫氧化鉀水溶液中，包含8-異戊烯基柚皮素和6異戊烯基柚皮素的啤酒花提取物進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)30分鐘。定量HPLC-分析的結(jié)果，顯示在表2中。如在表2中可看到的，在有利于8-異戊烯基柚皮素的異構(gòu)化后，(8-異戊烯基柚皮素×100％)/(8-異戊烯基柚皮素+6-異戊烯基柚皮素)的比例從最初提取物中的23％增加至73％。
比較例A重復(fù)實(shí)施例3的異構(gòu)化反應(yīng)，使用5％的氫氧化鉀乙醇溶液代替5％氫氧化鉀水溶液。定量HPLC-分析的結(jié)果，顯示在表2中，顯示出在異構(gòu)化產(chǎn)物中得到的提取物具有的(8-異戊烯基柚皮素×100％)/(8-異戊烯基柚皮素+6-異戊烯基柚皮素)比例從最初提取物中的23％僅增加至異構(gòu)化產(chǎn)物中的43％。
表2.在各種溶劑中異構(gòu)化之前或之后的啤酒花提取物組合物
適宜的制劑圖2顯示了8-異戊烯基柚皮素對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激和在增加黃腐酚濃度下這種增殖的抑制。
進(jìn)行生物試驗(yàn)來探測(cè)8-異戊烯基柚皮素對(duì)雌激素依賴性癌細(xì)胞的增殖，確定需要抑制該8-異戊烯基柚皮素誘導(dǎo)的增殖的黃腐酚濃度。因此，在96孔板上，在存在固定的生長(zhǎng)刺激濃度的8-異戊烯基柚皮素和各種濃度的黃腐酚下培養(yǎng)雌激素易感性MCF-7乳腺癌細(xì)胞。對(duì)于每種濃度的8-異戊烯基柚皮素(1nM、10nM和100nM)，黃腐酚的濃度分別為0μM、0.1μM、1μM、5μM、10μM和25μM。
提高雌激素能力圖4顯示了當(dāng)用雌激素誘導(dǎo)的酵母篩選(yeastscreen)(Saccharmomycescerevisiae)測(cè)定時(shí)17β-雌二醇(E2)、8-異戊烯基柚皮素(8PN)、8-異戊基柚皮素(8PN-H2)和中間體異黃腐酚(IsoXH2)的雌激素活性劑量反應(yīng)曲線，所述的yeast screen表達(dá)人類雌激素受體，并包含運(yùn)載控制受體基因Lac-Z的雌激素應(yīng)答序列的表達(dá)質(zhì)粒(Milligan et al.，2001)。所述酵母是在包含增加濃度的17β-雌二醇(陽(yáng)性對(duì)照)、8-異戊烯基柚皮素(8PN)、8-異戊基柚皮素(8PN-H2)或二氫異黃腐酚(IsoX-H2)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。用分光光度計(jì)檢測(cè)和定量Lac-Z受體基因的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.制備啤酒花提取物的方法，其特征在于該方法包括對(duì)啤酒花或啤酒花產(chǎn)物進(jìn)行(1)在作為溶劑的水和一定量的堿的存在下進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)，和(2)至少一種提取的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于異構(gòu)化反應(yīng)是在作為溶劑的水中進(jìn)行的。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于異構(gòu)化反應(yīng)是在堿性條件下進(jìn)行的，所述堿性條件相當(dāng)于KOH的濃度(w/v％)為至少0.1，優(yōu)選至少0.5，更優(yōu)選為至少1，最優(yōu)選為至少5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，在啤酒花或啤酒花產(chǎn)物進(jìn)行至少一種提取和異構(gòu)化反應(yīng)之前，在存在液體或超臨界CO2或至少一種實(shí)質(zhì)上非極性有機(jī)溶劑下進(jìn)行提取啤酒花或啤酒花產(chǎn)物，接著回收包含富含異戊烯化的類黃酮類的提取物的殘余物。
5.根據(jù)權(quán)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于該方法進(jìn)一步包括將一定量的通過至少一種提取和異構(gòu)化反應(yīng)得到的啤酒花提取物與一定量的富含黃腐酚的啤酒花提取物混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于異構(gòu)化反應(yīng)和至少一種提取是連續(xù)的，直到得到包含至少0.15wt.％、優(yōu)選至少0.33wt.％的8-異戊烯基柚皮素和至少3wt.％，優(yōu)選至少10wt.％的黃腐酚的提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其特征在于異構(gòu)化反應(yīng)和至少一種提取是連續(xù)的，直到得到包含黃腐酚/8-異戊烯基柚皮素比例為至少10，優(yōu)選至少30的提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其特征在于異構(gòu)化反應(yīng)和至少一種提取是連續(xù)的，直到得到包含6-異戊烯基柚皮素和8-異戊烯基柚皮素比例(8-異戊烯基柚皮素×100％)/(8-異戊烯基柚皮素+6-異戊烯基柚皮素)為至少50％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少75％的提取物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，使用的啤酒花產(chǎn)物由進(jìn)行了下述處理的啤酒花產(chǎn)物組成進(jìn)行了用水和/或至少一種非極性有機(jī)溶劑的另外的提取步驟，接著回收包含富含異戊烯化類黃酮類的提取物的殘余物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其特征在于至少一種提取用至少一種選自醇、水基醇、酮類、水基酮類或酯類或其混合物的有機(jī)溶劑或堿水進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其特征在于異構(gòu)化反應(yīng)是在反應(yīng)混合物的凝固點(diǎn)和沸點(diǎn)溫度間進(jìn)行的，優(yōu)選在室溫。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于異構(gòu)化反應(yīng)是在室溫至60℃之間進(jìn)行的，優(yōu)選在約為室溫的溫度下。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其特征在于異構(gòu)化反應(yīng)是在惰性大氣下進(jìn)行的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其特征在于異構(gòu)化反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間段為0.25至4小時(shí)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其特征在于該方法進(jìn)一步包括混合一定量的從至少一種提取和異構(gòu)化反應(yīng)得到的富含啤酒花提取物與一定量的富含8-烷基柚皮素，優(yōu)選8-異戊基柚皮素的啤酒花提取物的步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于富含8-異戊基柚皮素的啤酒花提取物是通過包括下述步驟的方法得到的(a)使富含黃腐酚的啤酒花提取物進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)，將黃腐酚轉(zhuǎn)化成異黃腐酚；(b)使步驟(a)中得到的提取物進(jìn)行催化氫化反應(yīng)，將異黃腐酚轉(zhuǎn)化為二氫異黃腐酚；(c)使步驟(b)中得到的提取物進(jìn)行脫甲基反應(yīng)，將二氫異黃腐酚轉(zhuǎn)化成8-異戊基柚皮素。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于步驟(a)中的異構(gòu)化反應(yīng)是在堿性條件下進(jìn)行的。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其特征在于富含8-烷基柚皮素的啤酒花提取物是通過加入一定量的合成的8-烷基柚皮素，優(yōu)選一定量的合成的8-異戊基柚皮素得到的。
19.啤酒花提取物，包含8-異戊烯基柚皮素和6-異戊烯基柚皮素的混合物，其中(8-異戊烯基柚皮素×100％)/(8-異戊烯基柚皮素+6-異戊烯基柚皮素)的比例為至少50％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少75％。
20.如權(quán)利要求19所述的啤酒花提取物，其特征在于提取物包含黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的混合物，黃腐酚與8-異戊烯基柚皮素的重量比為至少10，優(yōu)選至少20，更優(yōu)選至少30。
21.如權(quán)利要求19或20所述的啤酒花提取物，其特征在于啤酒花提取物包含至少0.15％(w/w)，優(yōu)選至少0.33％的8-異戊烯基柚皮素和至少3％，優(yōu)選至少10％(w/w)的黃腐酚。
22.如權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)所述的啤酒花提取物，其特征在于啤酒花提取物還包含異黃腐酚。
23.如權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的啤酒花提取物，其特征在于啤酒花提取物還包含一定量的8-烷基柚皮素，優(yōu)選8-異戊基柚皮素。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的啤酒花提取物或用權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法獲得的啤酒花提取物在制備藥物或植物藥的用途，其中8-異戊烯基柚皮素的雌激素活性引起的可能的增殖活性被黃腐酚的抗增殖活性抑制(阻礙)。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的啤酒花提取物用權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法獲得的啤酒花提取物用于制備治療或預(yù)防任意雌激素性質(zhì)的病癥、癥狀、主訴或平衡中的藥物或植物藥的用途。
26.如權(quán)利要求25所述的用途，其中所述的由雌激素性質(zhì)激素平衡失調(diào)引起的病癥、癥狀、主訴或疾病態(tài)是絕經(jīng)。
27.如權(quán)利要求25中所述的啤酒花提取物的用途，其中所述的疾病態(tài)為骨質(zhì)疏松癥。
28.如權(quán)利要求25中所述的啤酒花提取物的用途，其中所述的疾病態(tài)選自性激素依賴性癌癥、心血管疾病、前列腺功能障礙、結(jié)腸癌。
29.營(yíng)養(yǎng)組合物/補(bǔ)品，包含一定量的根據(jù)權(quán)利要求19-23的任一項(xiàng)的啤酒花提取物或一定量的用權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法得到的啤酒花提取物。
30.化妝品組合物，包含一定量的根據(jù)權(quán)利要求19-23的任一項(xiàng)的啤酒花提取物或一定量的用權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法得到的啤酒花提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備富含8－異戊烯基柚皮素高于6－異戊烯基柚皮素的啤酒花提取物的方法，該方法包含使啤酒花產(chǎn)物進(jìn)行(1)在作為溶劑的水和一定量的堿的存在下進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)，和(2)至少一種提取的步驟。用這種方法，得到提取的啤酒花提取物，其包含的6－異戊烯基柚皮素和8－異戊烯基柚皮素的比例(8－異戊烯基柚皮素×100％)/(8－異戊烯基柚皮素+6－異戊烯基柚皮素)為至少50％。所述提取物優(yōu)選還包含黃腐酚，黃腐酚與8－異戊烯基柚皮素的重量比為至少10。
文檔編號(hào)A61P19/10GK1893963SQ200480037757
公開日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2004年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月16日
發(fā)明者F·梅斯, D·德科伊克雷, A·海伊瑞克 申請(qǐng)人:生物動(dòng)力公司