專利名稱：：產(chǎn)生儲存穩(wěn)定病毒及其免疫原性組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及病毒學(xué)、病毒調(diào)配物和方法發(fā)展領(lǐng)域。更特定而言，本發(fā)明涉及產(chǎn)生儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法，其中所述組合物作為凍干固體組合物或冷凍液體組合物的形式儲存穩(wěn)定。
背景技術(shù)：
：副粘病毒科的成員人類呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒(PIV)為在嬰兒和幼兒中引起嚴(yán)重呼吸道疾病的主要病原體(Glezen等人，1981；Chanock等人，1992；Martin等人，1978)。兩個RSV群組A組(RSV-A)和B組(RSV-B)在每年的冬天流行病期間同時傳播，雖然通常注意到A組感染占主導(dǎo)地位(McConnochie等人，1990；Stark等人，1991)。3型PIV(PIV-3)為毛細(xì)支氣管炎、肺炎和哮喘的常見起因。在嬰兒和幼兒的呼吸道疾病的所有住院治療中，RSV和PIV-3一起占到高達(dá)30％(Crowe，1995)。1型和2型PIV(PIV-1和PIV-2)也是哮喘的常見起因。也已報導(dǎo)RSV引起免疫受損個體和老年人的顯著發(fā)病率。全球每年發(fā)生65,000,000例RSV感染，導(dǎo)致160,000例死亡(Robbins和Freeman，1988)。僅在美國，每年就有100,000名兒童因為由RSV感染所導(dǎo)致的肺炎和毛細(xì)支氣管炎的嚴(yán)重病例而住院治療(Glezen等人，1986；Katz，1985)。在1992年估計美國對于RSV感染兒童的住院和非臥床看護(hù)每年花費超過340,000,000美元(Wertz和Sullender，1992)。世界衛(wèi)生組織(WHO)(Crowe，1995)和過敏及感染疾病國際研究所(NIAID)疫苗顧問委員會在疫苗開發(fā)上已將RSV評定為僅次于HIV，同時將有效PIV(例如3型PIV)疫苗的制劑評定為屬于在疫苗開發(fā)上被視作優(yōu)先的前10種疫苗內(nèi)。因此，對設(shè)計能夠在嬰兒、幼兒、老年人和免疫受損者中預(yù)防嚴(yán)重呼吸道疾病的安全有效RSV和/或PIV疫苗的能力仍有強烈需求。使用活態(tài)減毒RSV和/或PIV控制呼吸道疾病為更有前途的方法之一。在過去20年里已開發(fā)出多種活態(tài)RSV菌株并在RSV-血清反應(yīng)陰性兒童中加以測試。用于活態(tài)減毒RSV的最受推崇的方法為冷繼代(cp)RSV、溫度敏感性(ts)RSV突變體和冷繼代溫度敏感性(cpts)RSV突變體(Kneyber和Kimpen，2002)。諸如cpts-248、cpts-248/404、cpts-530的RSV突變體和PIV-3突變體cp-45當(dāng)前正在實驗室和臨床試驗中進(jìn)行評估。除了需要確定和開發(fā)有效的活態(tài)減毒RSV、PIV或RSV/PIV組合免疫原性組合物之外，當(dāng)前還需要產(chǎn)生儲存穩(wěn)定RSV和/或PIV組合物及其免疫原性組合物的方法。例如，RSV為熱不穩(wěn)定性病毒，其在-65℃到-86℃下儲存期間于少于3個月內(nèi)失活(Hambling，1964；Wulff等人，1964；Gupta等人，1996)。因此高度需要確定產(chǎn)生儲存穩(wěn)定的RSV、PIV或RSV/PIV免疫原性組合物的方法。此外，增強其他病毒免疫原性組合物的儲存穩(wěn)定性長期以來已被視作改良疫苗對世界衛(wèi)生的影響的重要目標(biāo)(Melnick和Wallis，1963；Rasmussen等人，1973；Ayra，2001；Hilleman，1989；Lemon和Milstein，1994)。因此在病毒調(diào)配物和方法發(fā)展的技術(shù)中需要產(chǎn)生諸如以下各病毒的儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法單純皰疹病毒、細(xì)胞肥大病毒、Epstein-Barr病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、諾沃克病毒(Norwalkvirus)、披膜病毒、α病毒、風(fēng)疹病毒、狂犬病病毒、馬堡病毒(Marburgvirus)、伊波拉病毒(Ebolavirus)、乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、間質(zhì)肺炎病毒(metapneumovirus)、冠狀病毒、水皰性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelanequineencephalitisvirus)等等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明廣泛涉及產(chǎn)生儲存穩(wěn)定病毒組合物及其免疫原性組合物的方法。在某些實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)或其組合的儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法。更特定而言，在某些實施例中，本發(fā)明涉及一種或一種以上導(dǎo)致儲存穩(wěn)定病毒組合物的配方和方法步驟，其中所述病毒組合物作為凍干固體組合物或冷凍液體組合物的形式儲存穩(wěn)定。在一特定實施例中，本發(fā)明涉及一種或一種以上導(dǎo)致儲存穩(wěn)定RSV、PIV或RSV/PIV組合物的配方和方法步驟，其中所述RSV、PIV或RSV/PIV組合物作為凍干固體組合物或冷凍液體組合物的形式儲存穩(wěn)定。因此，在某些實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生小體積儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法。在一特定實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含RSV、PIV或其組合的小體積儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法，所述方法包含(a)于約60分鐘或更少的時間內(nèi)將病毒組合物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度，和(b)凍干病毒組合物，其中凍干病毒組合物在約1℃到約10℃的儲存溫度下可穩(wěn)定至少1年。在一實施例中，玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-45℃的溫度且在約60分鐘或更少的時間內(nèi)達(dá)到。在另一實施例中，玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-35℃的溫度且在約40分鐘或更少的時間內(nèi)達(dá)到。在另一實施例中，約-35℃的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度在約20分鐘或更少的時間內(nèi)達(dá)到。在一實施例中，病毒組合物的體積為約0.2mL到約1.0mL。在某些實施例中，病毒組合物包含在合適的容器構(gòu)件中，其中所述容器構(gòu)件被進(jìn)一步定義為小瓶、管或鼻噴霧裝置。在一實施例中，RSV被進(jìn)一步定義為A組RSV(RSV-A)、B組RSV(RSV-B)或包含一種或一種以上各群組A和B的抗原的嵌合重組RSV(RSV-AB)，且PIV被進(jìn)一步定義為1型PIV(PIV-1)、2型PIV(PIV-2)或3型PIV(PIV-3)。在某些實施例中，在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配小體積儲存穩(wěn)定病毒組合物。在其他實施例中，所述5.0到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMN-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)。在某些其他實施例中，所述5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。在某些實施例中，在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配小體積儲存穩(wěn)定病毒組合物。在其他實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES。在某些其他實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。在一實施例中，包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為約6.5到約7.8)進(jìn)一步包含蔗糖、L(+)-谷氨酸、L(+)-谷氨酸單鈉鹽、L(+)-谷氨酸與L(+)-谷氨酸單鈉鹽的混合物、人類白蛋白(HA)和/或大豆蛋白胨。在其他實施例中，包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為約6.5到約7.8)進(jìn)一步包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物和約1.0g/L到約10.0g/LHA。在另一實施例中，所述約1.0g/L到約10.0g/LHA由約50g/L大豆蛋白胨替換。在其他實施例中，pH值為約6.5到約7.8的所述5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂、約0.01mM到約1mM氯化鈣、約50g/L蔗糖、約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約1.0g/L到約10.0g/LHA和約50g/L大豆蛋白胨。在一實施例中，包含約0.25mM到約12.5mMHEPES、約0.01mM到約0.5mM氯化鎂和約0.01mM到約0.5mM氯化鈣的10mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為約6.5到約7.8)進(jìn)一步包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物和約1.0g/L到約10.0g/LHA。在其他實施例中，所述約1.0g/L到約10.0g/LHA由約50g/L大豆蛋白胨替換。在其他實施例中，pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液包含約0.25mM到約12.5mMHEPES、約0.01mM到約0.5mM氯化鎂、約0.0lmM到約0.5mM氯化鈣、約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約1.0g/L到約10.0g/LHA和約50g/L大豆蛋白胨。在一實施例中，小體積儲存穩(wěn)定病毒組合物的儲存溫度為約5℃。在某些其他實施例中，病毒組合物在約1℃到約10℃下儲存1年后具有小于約1.0log的PFU損失。在另一實施例中，病毒組合物在約1℃到約10℃下儲存1年后為每0.2mL至少4.0logPFU。在一實施例中，病毒組合物的凍干被進(jìn)一步定義為(a)將約0.5mL到0.6mL病毒組合物放置于小瓶中并冷卻到約5℃的溫度；(b)將小瓶放置在凍干架上并以每分鐘約-1.0℃到每分鐘約-2.0℃的速率將架子溫度從5℃降低到-50℃；(c)保持架子溫度為約-50℃持續(xù)60分鐘；(d)降低凍干室壓力到0.10托并保持架子溫度為約-50℃持續(xù)30-60分鐘；(e)在約0.10托下以每分鐘約1.0℃到約2.0℃的速率將架子溫度從-50℃升高到0℃，并保持架子溫度為約0℃持續(xù)約540分鐘到約720分鐘；(f)在約0.10托下以每分鐘約0.5℃的速率將架子溫度從0℃升高到15℃，并保持架子溫度為約15℃持續(xù)約600分鐘到約720分鐘；和(g)用氮氣充滿小瓶并密封小瓶。在另一實施例中，病毒組合物的凍干被進(jìn)一步定義為(a)將約0.5mL到0.6mL病毒組合物放置于小瓶中并冷卻到約5℃的溫度；(b)冷凍凍干架直到約-70℃的溫度；(c)將小瓶放置在凍干架上并保持溫度為約-70℃持續(xù)約60分鐘；(d)降低凍干室壓力到0.10托并以每分鐘約1.0℃的速率將架子溫度從-70℃升高到-50℃；(e)在約0.10托下以每分鐘約1.0℃到每分鐘約2.0℃的速率將架子溫度從-50℃升高到0℃，并保持架子溫度為約0℃持續(xù)約540分鐘到約720分鐘；(f)在約0.10托下以每分鐘約0.5℃的速率將架子溫度從0℃升高到15℃，并保持架子溫度為約15℃持續(xù)約600分鐘到約720分鐘；和(g)用氮氣充滿小瓶并密封小瓶。在另一實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生大體積凍干穩(wěn)定病毒組合物的方法。在一特定實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含RSV、PIV或其組合的大體積凍干穩(wěn)定病毒組合物的方法，所述方法包含(a)將體積為至少50mL的液體病毒組合物放置于凍干盤中；(b)在液氮浴中冷凍病毒組合物至少20分鐘；和(c)凍干病毒組合物，其中凍干病毒組合物相對于凍干前的病毒組合物具有小于約0.5log的PFU損失。在其他實施例中，大體積病毒組合物在凍干后每劑量為至少5.0logPFU。在一實施例中，玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-35℃的溫度。在另一實施例中，玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-30℃到約-40℃的溫度。在另一實施例中，凍干盤為Lyoguard凍干盤(W.L.GoreandAssociates；Newark，DE)。在一實施例中，病毒組合物的大體積為每凍干盤至少500mL。在其他實施例中，病毒組合物的大體積為每凍干盤至少1000mL。在一實施例中，RSV被進(jìn)一步定義為RSV-A、RSV-B或包含一種或一種以上各群組A和B的抗原的嵌合重組RSV(RSV-AB)，且PIV被進(jìn)一步定義為PIV-1、PIV-2或PIV-3。在一實施例中，在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配大體積病毒組合物。在其他實施例中，所述5.0到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約2.5mM到約25mMHEPES。在某些其他實施例中，所述5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.1mM到約1mM氯化鎂和約0.1mM到約1mM氯化鈣。在某些實施例中，在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配大體積病毒組合物。在其他實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約2.5mM到約25mMHEPES。在某些其他實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.1mM到約1mM氯化鎂和約0.1mM到約1mM氯化鈣。在一實施例中，包含約2.5mM到約25mMHEPES、約0.1mM到約1mM氯化鎂和約0.1mM到約1mM氯化鈣且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含蔗糖、L(+)-谷氨酸、L(+)-谷氨酸單鈉鹽、L(+)-谷氨酸與L(+)-谷氨酸單鈉鹽的混合物、人類白蛋白(HA)和/或大豆蛋白胨。在其他實施例中，包含約2.5mM到約25mMHEPES、約0.1mM到約1mM氯化鎂和約0.1mM到約1mM氯化鈣且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物和約1.0g/L到約10.0g/LHA。在一實施例中，所述約1.0g/L到約10.0g/LHA由約50g/L大豆蛋白胨替換。在其他實施例中，pH值為約6.5到約7.8的所述5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液包含約2.5mM到約25mMHEPES、約0.1mM到約1mM氯化鎂、約0.1mM到約1mM氯化鈣、約50g/L蔗糖、約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約1.0g/L到約10.0g/LHA和約50g/L大豆蛋白胨。在其他實施例中，包含約2.5mM到約12.5mMHEPES、約0.1mM到約0.5mM氯化鎂和約0.1mM到約0.5mM氯化鈣且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物和約1.0g/L到約10.0g/LHA。在其他實施例中，所述約1.0g/L到約10.0g/LHA由約50g/L大豆蛋白胨替換。在其他實施例中，pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液包含約2.5mM到約12.5mMHEPES、約0.1mM到約0.5mM氯化鎂、約0.1mM到約0.5mM氯化鈣、約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約1.0g/L到約10.0g/LHA和約50g/L大豆蛋白胨。在某些其他實施例中，大體積病毒組合物的凍干被進(jìn)一步定義為(a)在約-50℃的溫度下將包含冷凍病毒組合物的凍干盤放置于預(yù)冷卻到約-50℃的溫度的凍干架上，并保持所述溫度約60分鐘；(b)降低凍干室壓力到0.10托并在約0.10托下以每分鐘約0.23℃的速率將架子溫度從-50℃升高到-23℃；(c)保持架子溫度為約-23℃持續(xù)約80小時到約100小時；(d)降低凍干室壓力到0.02托并以每分鐘約0.23℃的速率將架子溫度從-23℃升高到15℃；(e)將架子溫度保持在約15℃并保持在約0.02托，持續(xù)約30小時到約40小時；(f)在0.02托下以每分鐘約0.17℃的速率將架子溫度從15℃升高到25℃；(g)將架子溫度保持在約25℃并保持在約0.02托，持續(xù)約10小時；和(h)用氮氣充滿凍干室并在氮氣下將凍干盤密封于鋁袋中。在其他實施例中，大體積病毒組合物的凍干被進(jìn)一步定義為(a)在約-70℃的溫度下將包含冷凍病毒組合物的凍干盤放置于預(yù)冷卻到約-70℃的溫度的凍干架上，并保持所述溫度約60分鐘；(b)降低凍干室壓力到0.10托并以每分鐘約0.23℃的速率將架子溫度從-70℃升高到-23℃；(c)在約0.10托下保持架子溫度為約-23℃持續(xù)約80到100小時；(d)降低凍干室壓力到0.02托并以每分鐘約0.23℃的速率將架子溫度從-23℃升高到15℃；(e)將溫度保持在約15℃并保持在約0.02托，持續(xù)約30到40小時；(f)在0.020托下以每分鐘約0.17℃的速率將架子溫度從15℃升高到25℃；(g)保持溫度為約25℃持續(xù)約10小時；和(h)用氮氣充滿凍干室并在氮氣下將凍干盤密封于鋁袋中。在一實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生儲存穩(wěn)定冷凍液體病毒組合物的方法。在一特定實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含RSV、PIV或其組合的儲存穩(wěn)定冷凍液體病毒組合物的方法，所述方法包含(a)在液氮浴中平衡金屬板；(b)將液體病毒組合物放置于合適的容器構(gòu)件中；(c)將步驟(b)的容器插入金屬固定器中；(d)將金屬固定器放置于步驟(a)的經(jīng)平衡金屬板上持續(xù)約10分鐘；(e)從金屬固定器移除容器；和(f)將容器在約-20℃到約-70℃的溫度下儲存，其中步驟(a)到(f)后的病毒組合物在儲存6個月后具有小于約0.5log的PFU損失。在某些實施例中，容器構(gòu)件為鼻噴霧裝置。在一實施例中，鼻噴霧裝置為BDAccusprayTM鼻噴霧裝置(BDMedicalPharmaceuticalSystems；FranklinLakes，NJ)。在另一實施例中，金屬固定器為鋁。在另一實施例中，金屬固定器為不銹鋼。在其他實施例中，病毒組合物在步驟(a)到(f)后為至少4.0logPFU/0.2mL。在另一實施例中，病毒組合物在-20℃的溫度下儲存6個月后為至少4.0logPFU/0.2mL。在其他實施例中，病毒組合物在-70℃的溫度下儲存6個月后為至少4.01ogPFU/0.2mL。在某些實施例中，在不存在蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的情況下調(diào)配液體病毒組合物。在一實施例中，RSV被進(jìn)一步定義為RSV-A、RSV-B或包含一種或一種以上各群組A和B的抗原的嵌合重組RSV(RSV-AB)，且PIV被進(jìn)一步定義為PIV-1、PIV-2或PIV-3。在某些其他實施例中，在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配液體病毒組合物。在其他實施例中，所述5.0到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES。在某些其他實施例中，所述5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。在某些實施例中，在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配液體病毒組合物。在其他實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES。在某些其他實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。在一實施例中，包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含蔗糖、L(+)-谷氨酸、L(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物。在其他實施例中，包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約75g/L蔗糖和約4.9mML(+)-谷氨酸或約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或L(+)-谷氨酸與L(+)-谷氨酸單鈉鹽的約4.9mM混合物。在其他實施例中，包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約75g/L蔗糖和約4.9mML(+)-谷氨酸或約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或L(+)-谷氨酸與L(+)-谷氨酸單鈉鹽的約4.9mM混合物。在另一實施例中，本發(fā)明涉及根據(jù)以下方法產(chǎn)生的小體積凍干病毒組合物于60分鐘或更少的時間內(nèi)將所述病毒組合物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度并凍干病毒組合物，其中凍干病毒組合物在約1℃到約10℃的儲存溫度下可穩(wěn)定至少1年。在另一實施例中，本發(fā)明涉及根據(jù)以下方法產(chǎn)生的大體積凍干病毒組合物將體積為至少50mL的液體病毒組合物放置于凍干盤中；在液氮浴中將所述病毒組合物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度至少約20分鐘；并凍干病毒組合物，其中凍干病毒組合物相對于凍干前的病毒組合物具有小于約0.5log的PFU損失。在另一實施例中，本發(fā)明涉及根據(jù)以下方法產(chǎn)生的儲存穩(wěn)定冷凍液體病毒組合物(a)在液氮浴中平衡金屬板；(b)將液體病毒組合物放置于合適的容器構(gòu)件中；(c)將步驟(b)的容器插入金屬固定器中；(d)將金屬固定器放置于步驟(a)的經(jīng)平衡金屬板上持續(xù)約10分鐘；(e)從金屬固定器移除容器；和(f)將容器在約-20℃到約-70℃的溫度下儲存，其中步驟(a)到(f)后的病毒組合物在儲存6個月后具有小于約0.5log的PFU損失。在某些其他實施例中，本發(fā)明涉及免疫原性組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的凍干方法產(chǎn)生的病毒組合物，其中病毒于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中溶解、稀釋或懸浮。在其他實施例中，本發(fā)明涉及免疫原性組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的冷凍液體病毒組合物。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢根據(jù)以下具體實施方式、其優(yōu)選實施例和權(quán)利要求將顯而易見。圖2顯示在-70℃冷凍器中冷凍調(diào)配物對比用液氮冷凍相同調(diào)配物的動力學(xué)。將液體調(diào)配物加入BDAccrsprayTM裝置中并通過將鋁固定器放置于經(jīng)液氮冷卻的金屬表面上或通過將鋁固定器放置于-70℃冷凍器的架子上來進(jìn)行冷凍。在某些其他實施例中，本發(fā)明是針對此項技術(shù)中對儲存穩(wěn)定病毒組合物的產(chǎn)生方法的需要，所述組合物包含一種或一種以上諸如單純皰疹病毒、細(xì)胞肥大病毒、Epstein-Barr病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、諾沃克病毒、披膜病毒、α病毒、風(fēng)疹病毒、狂犬病病毒、馬堡病毒、伊波拉病毒、乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、間質(zhì)肺炎病毒、冠狀病毒、水皰性口炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒等等的病毒，所述組合物用于預(yù)防或改善由這些病毒中的一種或一種以上所引起的疾病的免疫原性組合物中。因此，在某些實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生小體積凍干病毒組合物的方法。在一特定實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生小體積凍干病毒組合物的方法，其中所述凍干組合物在約1℃到約10℃的儲存溫度下可穩(wěn)定儲存至少1年。在某些其他實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生大體積凍干病毒組合物的方法。在特定實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生大體積凍干病毒組合物的方法，其中所述凍干組合物相對于凍干前的組合物具有小于約0.5log的空斑形成單位(PFU)損失。在另一實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生冷凍液體病毒組合物的方法。在某些實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生冷凍液體病毒組合物的方法，其中所述組合物在儲存6個月后具有小于約0.5log的PFU損失。在其他實施例中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的儲存穩(wěn)定病毒組合物。在其他實施例中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的免疫原性組合物。A.病毒組合物RSV屬于肺病毒(Pneumoviridae)屬，其歸類于副粘病毒(Paramyxoviridae)科中。病毒粒子含有編碼10種病毒蛋白質(zhì)的15,222個堿基對的單鏈反義RNA。所述10種蛋白質(zhì)包含三種包膜相關(guān)糖蛋白，其被稱為G、F和SH；兩種基質(zhì)蛋白M和M2；三種核衣殼蛋白L、N和P；和非結(jié)構(gòu)蛋白1B和1C。以G蛋白中的抗原差異且在較小程度上以F蛋白中的抗原差異為基礎(chǔ)來鑒別兩個RSV群組A組和B組?？稍趦蓚€群組中發(fā)現(xiàn)抗原差異。G蛋白顯示高度變異，其中A組與B組RSV之間僅有53％氨基酸同源性且A組RSV內(nèi)的G蛋白序列有高達(dá)20％差異。下文中“A組RSV”被表示為“RSV-A”且“B組RSV”被表示為“RSV-B”。根據(jù)本發(fā)明的方法之一產(chǎn)生的儲存穩(wěn)定RSV組合物(或RSV/PIV組合)為任何減毒RSV(例如減毒RSV-A和減毒RSV-B)，其包括(但不限于)冷繼代RSV突變體(cpRSV)、溫度敏感性RSV突變體(tsRSV)、冷繼代溫度敏感性RSV突變體(cptsRSV)、冷適應(yīng)RSV突變體(caRSV)、小空斑RSV突變體(spRSV)等等。例如，美國專利第5,882,651、5,932,222、5,993,824、6,077,514和6,284,254號(其各自以全文引用的方式并入本文中)描述產(chǎn)生各種減毒RSV表現(xiàn)型的方法。在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的減毒RSV為cptsRSV248/404(ATCCVR2452)，其也被稱作LRSV-404且所有重組修飾是由包括重組RSV-AB菌株的所述菌株產(chǎn)生。本發(fā)明的其他例示性RSV菌株包括(a)rA2cp248/404ΔSH(也被稱作LRSV-rA36)；(b)rA2cp248/404/1030ΔSH(也被稱作LRSV-rA38)；(c)rA2cp248/404/1030(也被稱作LRSV-rA39)；(d)rA2cp248/404ΔNS2(也被稱作LRSV-rA41)；(e)rABcp248/404/1030(也被稱作LRSV-rAB1)；(f)rABcp248/404ΔSH(也被稱作LRSV-rAB2)；(g)rABcp248/404ΔNS2(也被稱作LRSV-rAB4)；(h)cptsRSV530/1009(ATCCVR2451)和由包括諸如rA2cp530/1009ΔNS2(也被稱作LRSV-rA42)、rA2cp530/1009/404(也被稱作LRSV-rA43)、rABcp530/1009ΔNS2(也被稱作LRSV-rAB3)和rABcp530/1009/404(也被稱作LRSV-rAB6)的重組RSV-AB菌株的所述菌株產(chǎn)生的所有重組修飾。人類副流感3型病毒(PIV-3)為最近稱作副粘病毒科的呼吸道病毒屬的成員。其基因組為長度是15,462個核苷酸的單鏈反義RNA。PIV-3編碼至少8種蛋白質(zhì)核衣殼蛋白NP、磷蛋白P、非結(jié)構(gòu)蛋白C、D蛋白、基質(zhì)蛋白M、融合糖蛋白F、血球凝集素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN和大聚合酶蛋白L。HN和F蛋白為包膜相關(guān)表面糖蛋白，其為主要中和抗原和保護(hù)抗原。PIV類型(例如1、2和3型)中相當(dāng)?shù)腜IVHN或F蛋白之間的顯著序列分歧被認(rèn)為是保護(hù)性免疫力的型專一性的基礎(chǔ)。人類副流感1型病毒(PIV-1)為副粘病毒科的呼吸道病毒屬的另一成員。其基因組為長度是約15,600個核苷酸的單鏈反義RNA。由PIV-1編碼的基因產(chǎn)物依次包括核衣殼蛋白NP、磷蛋白P(和由P開放閱讀框編碼的多種其他基因產(chǎn)物)、基質(zhì)蛋白M、融合糖蛋白F、血球凝集素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN和大聚合酶蛋白L。人類副流感2型病毒(PIV-2)為副粘病毒科的風(fēng)疹病毒(Rubulavirus)屬的另一成員。其基因組為長度是約15,654個核苷酸的單鏈反義RNA。由PIV-2編碼的基因產(chǎn)物依次包括核衣殼蛋白NP、磷蛋白P、V蛋白、基質(zhì)蛋白M、融合糖蛋白F、血球凝集素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN和大聚合酶蛋白L。根據(jù)本發(fā)明的方法之一產(chǎn)生的儲存穩(wěn)定PIV組合物(或RSV/PIV組合)為任何減毒PIV，其包括(但不限于)冷繼代PIV突變體(cpPIV)、溫度敏感性PIV突變體(tsPIV)、冷繼代溫度敏感性PIV突變體(cptsPIV)、冷適應(yīng)PIV突變體(caPIV)、小空斑PIV突變體(spPIV)等等。在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的減毒PIV為被指定為cp-45(或JScp45)的JS野生型菌株的冷繼代PIV-3突變體。在其他優(yōu)選實施例中，使用美國專利第6,410,023和5,869,036號(各自以引用的方式并入本文中)中所述的減毒PIV-3突變的“菜單”將PIV-3cp-45突變體進(jìn)一步減毒。在其他實施例中，根據(jù)本發(fā)明的方法之一產(chǎn)生的儲存穩(wěn)定病毒組合物包括(但不限于)表1中所述的病毒或其載體中的一種或一種以上。表1病毒科表1(續(xù))病毒科B.小體積儲存穩(wěn)定病毒在某些實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生小體積儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法。在一實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含RSV、PIV或其組合的小體積儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法。本發(fā)明包含于60分鐘或更少的時間內(nèi)將病毒組合物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度(Tg)并凍干病毒組合物。為固體粉末或餅塊的凍干病毒組合物在約1℃到約10℃的儲存溫度下可穩(wěn)定至少1年。小體積儲存穩(wěn)定凍干病毒組合物作為單劑量或多劑量免疫原性組合物尤其有用，其中使凍干粉末儲存給定時間量。病毒組合物的“小體積”介于約100μL到約5mL之間。在某些實施例中，小體積病毒組合物介于約200μL到約1mL之間。在一實施例中，病毒組合物的體積為500μL。因此在某些實施例中，小體積病毒組合物在合適的容器構(gòu)件中冷凍并凍干。與小體積病毒組合物相關(guān)的合適容器構(gòu)件通常為可經(jīng)受住冷凍及凍干溫度和真空壓力的容器。例如，用于產(chǎn)生小體積儲存穩(wěn)定組合物的合適容器構(gòu)件為小瓶、管、注射器、兩階段注射器或鼻噴霧裝置。例如參見美國專利第5,489,266、5,732,837和4,084,330號，其各自以全文引用的方式并入本文中。用于凍干的額外容器構(gòu)件對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的且易于獲得。1.小體積病毒調(diào)配物如下文所定義的“RSV組合物”、“PIV組合物”或“RSV/PIV組合物”包含病毒(意即RSV、PIV或RSV/PIV)、通常為每毫升約103到107PFU的減毒病毒和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑包括緩沖液、鹽水溶液、水、注射用水(WFI)、蛋白穩(wěn)定劑、糖、氨基酸、防凍劑等等。在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配小體積病毒組合物。在某些調(diào)配物中，所述5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。在某些調(diào)配物中，在包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液(pH值為約6.5到約7.8)中調(diào)配的小體積病毒組合物進(jìn)一步包含蔗糖、L(+)-谷氨酸、L(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、人類白蛋白(HA)和/或大豆蛋白胨。在某些其他調(diào)配物中，包含約0.25mM到約12.5mMHEPES、約0.01mM到約0.5mM氯化鎂和約0.01mM到約0.5mM氯化鈣的10mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為約6.5到約7.8)進(jìn)一步包含約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約50g/L蔗糖和約1.0g/L到約10.0g/LHA。在其他某些調(diào)配物中，所述約1.0g/L到約10.0g/LHA由約50g/L大豆蛋白胨(也被稱作Hy-Soy；QuestInternational；Chicago，IL)替換。在另一調(diào)配物中，在包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂、約0.01mM到約1mM氯化鈣、約50g/L蔗糖、約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約1.0g/L到約10.0g/LHA和約50g/L大豆蛋白胨的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為約6.5到約7.8)中調(diào)配穩(wěn)定小體積病毒組合物。2.小體積病毒冷凍速率和凍干如上文所述，產(chǎn)生小體積儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法包含(a)于60分鐘或更少的時間內(nèi)將病毒組合物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度(Tg)和(b)凍干病毒組合物，其中凍干病毒組合物在約1℃到約10℃的儲存溫度下可穩(wěn)定至少1年。病毒組合物的Tg通常為約-35℃。病毒組合物的Tg在諸如氯化鈉的“存留”鹽存在下低于約-35℃(例如約-42℃)。例如，氯化鈉為病毒生長培養(yǎng)基的組份，但不是小體積調(diào)配物的組份。因此，某些病毒調(diào)配物將含有殘余數(shù)量(例如“存留”)的氯化鈉，且因此Tg可低于約-35℃，但通常不低于約-50℃。術(shù)語“玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度”或“Tg”指的是發(fā)生液態(tài)到玻璃態(tài)的轉(zhuǎn)化時所處的溫度范圍的大致中點。病毒組合物達(dá)到其Tg的速率對于凍干期間的病毒穩(wěn)定性(例如參見實例2)和長期病毒儲存穩(wěn)定性(例如參見實例3)是關(guān)鍵的。以另一種方式來說，較快的冷凍速率導(dǎo)致較穩(wěn)定的病毒組合物，從而導(dǎo)致病毒組合物較少的效力損失。術(shù)語“冷凍速率”指的是病毒組合物達(dá)到其Tg的速率。冷凍速率可作為冷凍期間溫度降低的大致速率來計算。例如，如果病毒組合物的起始溫度為5℃且其在40分鐘時間內(nèi)冷凍到其-35℃的Tg，那么“冷凍速率”為-1℃/分鐘。在類似條件下冷凍動力學(xué)可根據(jù)個別容器各異，或在大體積的情況下其在不同點展示偏差。因此，冷凍速率為在容器中所觀察到的或在托盤上所加載材料的不同位置處所測量的平均冷凍速率。小體積病毒組合物的冷凍速率為約-0.5℃/分鐘到約-2.5℃/分鐘。在一實施例中，Tg在60分鐘或更少的時間內(nèi)達(dá)到。在另一實施例中，Tg在40分鐘或更少的時間內(nèi)達(dá)到。在另一實施例中，Tg在20分鐘或更少的時間內(nèi)達(dá)到。病毒組合物的Tg易于由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員在不進(jìn)行不當(dāng)實驗的情況下例如使用諸如差示掃描量熱法(DSC)的熱力學(xué)測量法來測定(Hatley，1992；Franks，1992；Carpenter，2002)。在一實施例中，包含小體積病毒組合物的凍干瓶預(yù)冷卻到約5℃的溫度。含有預(yù)冷卻病毒組合物的小瓶然后放置于凍干架上并以約-1℃/分鐘到約-2℃/分鐘的速率冷凍到至少-50℃的溫度。在其他實施例中，含有預(yù)冷卻病毒組合物的小瓶直接放置于預(yù)冷凍到-70℃溫度的凍干架上。凍干(或冷凍干燥)為脫水技術(shù)，其中冷凍樣品溶液(例如RSV/PIV組合物)并通過施加高真空進(jìn)行升華來移除溶劑(例如水或緩沖液)。凍干技術(shù)對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的(Rey和May，1999)。在一實施例中，如下制備凍干小體積病毒組合物(a)將約0.5mL到0.6mL病毒組合物放置于小瓶中并冷卻到約5℃的溫度；(b)將小瓶放置在凍干架上并以每分鐘約-1.0℃到每分鐘約-2.0℃的速率將架子溫度從5℃降低到-50℃；(c)保持架子溫度為約-50℃持續(xù)60分鐘；(d)降低凍干室壓力到0.10托并保持架子溫度為約-50℃持續(xù)30-60分鐘；(e)在約0.10托下以每分鐘約1.0℃到約2.0℃的速率將架子溫度從-50℃升高到0℃，并保持架子溫度為約0℃持續(xù)約540分鐘到約720分鐘；(f)在約0.10托下以每分鐘約0.5℃的速率將架子溫度從0℃升高到15℃，并保持架子溫度為約15℃持續(xù)約600分鐘到約720分鐘；和(g)用氮氣充滿小瓶并密封小瓶。在另一實施例中，如下進(jìn)行病毒組合物的凍干(a)將約0.5mL到0.6mL病毒組合物放置于小瓶中并冷卻到約5℃的溫度；(b)冷凍凍干架直到約-70℃的溫度；(c)將小瓶放置在凍干架上并保持溫度為約-70℃持續(xù)約60分鐘；(d)降低凍干室壓力到0.10托并以每分鐘約1.0℃的速率將架子溫度從-70℃升高到-50℃；(e)在約0.10托下以每分鐘約1.0℃到每分鐘約2.0℃的速率將架子溫度從-50℃升高到0℃，并保持架子溫度為約0℃持續(xù)約540分鐘到約720分鐘；(f)在約0.10托下以每分鐘約0.5℃的速率將架子溫度從0℃升高到15℃，并保持架子溫度為約15℃持續(xù)約600分鐘到約720分鐘；和(g)用氮氣充滿小瓶并密封小瓶。凍干小體積病毒組合物(意即凍干餅)具有小于約1.0log的由凍干導(dǎo)致的PFU損失且在約1℃到約10℃下儲存1年后具有小于約1.0log的PFU損失(例如參見實例2、實例3、和表2及4-7)。在另一實施例中，凍干小體積病毒組合物在約1℃到約10℃下儲存1年后每0.2mL為至少4.0logPFU。C.大體積凍干穩(wěn)定病毒組合物在另一實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生大體積凍干穩(wěn)定病毒組合物的方法。在一實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含RSV、PIV或其組合的大體積凍干穩(wěn)定病毒組合物的方法。所述方法包含(a)將體積為至少50mL的液體病毒組合物放置于凍干盤中；(b)在液氮浴中于低于病毒組合物的Tg的溫度下冷凍病毒組合物至少約20分鐘；和(c)凍干病毒組合物。凍干病毒組合物相對于凍干方法之前的病毒組合物具有小于約0.5log的PFU損失。產(chǎn)生大體積凍干穩(wěn)定病毒組合物的方法在大規(guī)模生產(chǎn)/制造所述病毒組合物期間尤其有用。如下文所定義的病毒組合物的“大”體積介于每凍干盤約50mL到約2L之間。在某些實施例中，大體積介于每凍干盤約250mL到約1mL之間。在一特定實施例中，大體積病毒組合物為每凍干盤1L。1.大體積病毒調(diào)配物以醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑調(diào)配大體積病毒組合物，所述載劑包括緩沖液、鹽水溶液、水、注射用水(WFI)、蛋白穩(wěn)定劑、糖、氨基酸、防凍劑等等。在一實施例中，在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽的磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配大體積病毒組合物。磷酸鹽緩沖液的濃度為約5.0mM到約20mM且pH值范圍為約6.5到約7.8。在其他實施例中，所述5.0到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約2.5mM到約25mMHEPES。在某些其他實施例中，所述5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.1mM到約1mM氯化鎂和約0.1mM到約1mM氯化鈣。在某些實施例中，在10mM磷酸鹽緩沖液(pH值為約6.5到約7.8)中調(diào)配大體積病毒組合物且其進(jìn)一步包含約2.5mM到約12.5mMHEPES。在某些其他實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.1mM到約0.5mM氯化鎂和約0.1mM到約0.5mM氯化鈣。在一實施例中，所述5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為6.5到7.8，2.5-25mMHEPES，0.1-1.0mM氯化鎂，0.1-1.0mM氯化鈣)進(jìn)一步包含蔗糖、L(+)-谷氨酸、L(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、人類白蛋白(HA)和/或大豆蛋白胨。在另一實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為6.5到7.8，2.5-12.5mMHEPES，0.1-0.5mM氯化鎂，0.1-0.5mM氯化鈣)進(jìn)一步包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物和約1.0g/L到約10.0g/LHA。在一實施例中，所述約1.0g/L到約10.0g/LHA由約50g/L大豆蛋白胨替換。在其他實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為約6.5到約7.8)包含約2.5mM到約12.5mMHEPES、約0.1mM到約0.5mM氯化鎂、約0.1mM到約0.5mM氯化鈣、約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約1.0g/L到約10.0g/LHA和約50g/mL大豆蛋白胨。2.大體積病毒冷凍速率和凍干產(chǎn)生大體積凍干穩(wěn)定病毒組合物的方法包含(a)將體積為至少50mL的液體病毒組合物放置于凍干盤中；(b)在液氮浴中于低于病毒組合物的Tg的溫度下冷凍病毒組合物至少約20分鐘；和(c)凍干病毒組合物，其中凍干病毒組合物相對于凍干前的病毒組合物具有小于約0.5log的PFU損失。如章節(jié)B.2中所述，小體積病毒組合物達(dá)到其Tg的速率對于病毒儲存穩(wěn)定性是關(guān)鍵的。類似地，大體積病毒組合物達(dá)到其Tg的速率對于病毒儲存穩(wěn)定性也是關(guān)鍵的。因此，制備大體積病毒的重要步驟為在液氮浴中將病毒組合物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度至少約20分鐘。達(dá)成大體積快速冷凍速率的另一重要參數(shù)為熱傳遞性質(zhì)、組合物和凍干盤的構(gòu)造。例如，具有大表面積的凍干盤進(jìn)一步降低大體積病毒組合物達(dá)到其Tg所花費的時間量。凍干盤在此項技術(shù)中是熟知的且包括不銹鋼盤、玻璃盤、鋁盤、塑料盤和Lyoguard盤。在一實施例中，凍干盤為Lyoguard凍干盤。將托盤特別設(shè)計成具有良好熱傳遞性質(zhì)以用于大體積凍干。其是由經(jīng)設(shè)計用于防止固體顆粒在凍干循環(huán)中“滑出”托盤同時允許水蒸汽的良好質(zhì)量傳遞的微孔薄膜組成。病毒組合物的Tg為約-35℃的溫度。如先前所述，來自病毒生長培養(yǎng)基的殘余數(shù)量(或“存留”)的氯化鈉可進(jìn)一步降低Tg但不會低于-50℃。在某些其他實施例中，病毒組合物的凍干被進(jìn)一步定義為(a)在約-50℃的溫度下將包含冷凍病毒組合物的凍干盤放置于預(yù)冷卻到約-50℃的溫度的凍干架上，并保持所述溫度約60分鐘；(b)降低凍干室壓力到0.10托并在約0.10托下以每分鐘約0.23℃的速率將架子溫度從-50℃升高到-23℃；(c)保持架子溫度為約-23℃持續(xù)約80小時到約100小時；(d)降低凍干室壓力到0.02托并以每分鐘約0.23℃的速率將架子溫度從-23℃升高到15℃；(e)將架子溫度保持在約15℃并保持在約0.02托，持續(xù)約30小時到約40小時；(f)在0.02托下以每分鐘約0.17℃的速率將架子溫度從15℃升高到25℃；(g)將架子溫度保持在約25℃并保持在約0.02托，持續(xù)約10小時；和(h)用氮氣充滿凍干室并在氮氣下將凍干盤密封于鋁袋中。在其他實施例中，大體積病毒組合物的凍干被進(jìn)一步定義為(a)在約-70℃的溫度下將包含冷凍病毒組合物的凍干盤放置于預(yù)冷卻到約-70℃的溫度的凍干架上，并保持所述溫度約60分鐘；(b)降低凍干室壓力到0.10托并以每分鐘約0.23℃的速率將架子溫度從-70℃升高到-23℃；(c)在約0.10托下保持架子溫度為約-23℃持續(xù)約80到100小時；(d)降低凍干室壓力到0.02托并以每分鐘約0.23℃的速率將架子溫度從-23℃升高到15℃；(e)將溫度保持在約15℃并保持在約0.02托，持續(xù)約30到40小時；(f)在0.020托下以每分鐘約0.17℃的速率將架子溫度從15℃升高到25℃；(g)保持溫度為約25℃持續(xù)約10小時；和(h)用氮氣充滿凍干室并在氮氣下將凍干盤密封于鋁袋中。凍干大體積病毒組合物(意即凍干餅)具有小于約1.0log的由凍干導(dǎo)致的PFU損失且在約1℃到約10℃下儲存1年后具有小于約1.0log的PFU損失(例如參見實例4)。D.液體病毒組合物在另一實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生儲存穩(wěn)定液體病毒組合物的方法。在一實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含RSV、PIV或其組合的儲存穩(wěn)定液體病毒組合物的方法。所述方法包含(a)在液氮浴中平衡金屬板；(b)將液體病毒組合物放置于合適的容器構(gòu)件中；(c)將步驟(b)的容器插入金屬容器固定器中；(d)將金屬容器固定器放置于步驟(a)的經(jīng)平衡金屬板上持續(xù)約10分鐘；(e)從金屬容器固定器移除容器；和(f)將容器在約-20℃到約-70℃的溫度下儲存。1.液體病毒冷凍和解凍如步驟(f)中所述，包含冷凍病毒組合物的容器在約-20℃到約-70℃下儲存。在室溫下解凍病毒組合物可使病毒組合物返回液態(tài)，其中經(jīng)解凍液體病毒組合物在儲存6個月后具有小于約0.5log的PFU損失。在一實施例中，經(jīng)解凍液體病毒組合物為至少4.0logPFU/0.2mL。在另一實施例中，經(jīng)解凍液體病毒組合物在-20℃的溫度下儲存6個月后為至少4.0logPFU/0.2mL。在其他實施例中，經(jīng)解凍液體病毒組合物在-70℃的溫度下儲存6個月后為至少4.0logPFU/0.2mL。與液體病毒組合物相關(guān)的合適容器構(gòu)件通常為可經(jīng)受住約-20℃到約-70℃范圍內(nèi)的溫度的容器。例如，用于產(chǎn)生儲存穩(wěn)定液體組合物的合適容器構(gòu)件為小瓶、管、注射器或鼻噴霧裝置。在某些實施例中，容器為鼻噴霧裝置。在一實施例中，鼻噴霧裝置為購自BDPharmaceuticalSystems(FranklinLakes，NJ)的BDAccusprayTM鼻噴霧裝置或類似鼻噴霧裝置。液體病毒組合物冷凍的速率對病毒儲存穩(wěn)定性是關(guān)鍵的(例如參見實例5)。液氮浴用于快速冷凍病毒組合物。步驟(a)中的金屬板為將熱充分傳遞到液氮浴并從步驟(c)的金屬容器固定器傳遞出熱的任何金屬。類似地，步驟(c)中的金屬容器固定器為將熱傳遞到金屬板并從包含病毒的容器傳遞出熱的任何金屬。在一實施例中，金屬容器固定器為鋁。在另一實施例中，金屬容器固定器為不銹鋼。2.液體病毒調(diào)配物以醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑調(diào)配液體病毒組合物，所述載劑包括緩沖液、鹽水溶液、水、注射用水(WFI)、糖、氨基酸、防凍劑等等。在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配如上文所述的液體病毒組合物。在一實施例中，所述5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES。在其他實施例中，所述5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。在某些實施例中，在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配液體病毒組合物。在其他實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES。在某些其他實施例中，所述10mM磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)一步包含約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。在一實施例中，包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為約6.5到約7.8)進(jìn)一步包含蔗糖、L(+)-谷氨酸或L(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物和人類白蛋白(HA)。在其他實施例中，包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為約6.5到約7.8)進(jìn)一步包含約75g/L蔗糖和約4.9mML(+)-谷氨酸或約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物。在再其他實施例中，包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣的10mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為約6.5到約7.8)進(jìn)一步包含約75g/L蔗糖和約4.9mML(+)-谷氨酸或約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物。液體冷凍病毒組合物(意即在噴霧裝置或小瓶中冷凍)在“快速”冷凍后具有小于約0.5log的PFU損失，且在約-20℃到約-70℃下儲存6個月后具有小于約0.5log的PFU損失(例如參見實例5和表9-12)。在另一實施例中，液體冷凍病毒組合物在約-20℃到約-70℃下儲存6個月后為每0.2mL至少4.0logPFU。E.免疫原性病毒組合物在某些實施例中，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的包含RSV、PIV或其組合的儲存穩(wěn)定(冷凍)液體病毒組合物。在其他實施例中，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含包含單純皰疹病毒、細(xì)胞肥大病毒、Epstein-Barr病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、諾沃克病毒、披膜病毒、α病毒、風(fēng)疹病毒、狂犬病病毒、馬堡病毒、伊波拉病毒、乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、間質(zhì)肺炎病毒、冠狀病毒、水皰性口炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒等等的儲存穩(wěn)定(冷凍)液體病毒組合物。在某些實施例中，冷凍液體免疫原性組合物包含于鼻噴霧裝置中。通常使用本發(fā)明的液體配方和方法(例如參見章節(jié)D、實例1和實例5)調(diào)配并加工本發(fā)明的儲存穩(wěn)定(冷凍)液體病毒組合物以用于投與哺乳動物受檢者，以冷凍液體形式儲存并在投與所述哺乳動物受檢者之前解凍。在某些實施例中，本發(fā)明的儲存穩(wěn)定病毒組合物為凍干固體(或凍干餅)組合物。在特定實施例中，儲存穩(wěn)定凍干病毒組合物在醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中溶解、稀釋或懸浮并作為適于投與哺乳動物受檢者(例如人類)的免疫原性組合物形式提供。因此，所述凍干組合物通常包含“免疫原性”組合物(例如減毒RSV和/或減毒PIV病毒)和“醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑”。如下文所使用，術(shù)語“醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑”意欲包括此項技術(shù)中已知的與醫(yī)藥投與相容的任何和所有溶劑。所述介質(zhì)和藥劑用于醫(yī)藥學(xué)活性物質(zhì)在此項技術(shù)中是熟知的。除去與活性化合物(例如RSV或PIV)不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑，所述介質(zhì)都用于本發(fā)明的組合物中。因此，本發(fā)明的免疫原性組合物經(jīng)調(diào)配成與其意欲投與途徑相容。投與途徑的實例包括非經(jīng)腸(例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi))、經(jīng)粘膜(例如經(jīng)口、經(jīng)直腸、鼻內(nèi)、經(jīng)口腔、經(jīng)陰道、經(jīng)呼吸道)和經(jīng)皮(局部)。例如，有待作為鼻內(nèi)噴霧投與的儲存穩(wěn)定凍干病毒免疫原性組合物包括以下組份中的一種或一種以上無菌稀釋劑(諸如注射用水)、鹽水溶液、緩沖液(例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽)和用于調(diào)節(jié)張力的藥劑(諸如氯化鈉或右旋糖)。用諸如鹽酸或氫氧化鈉的酸或堿調(diào)節(jié)pH值。免疫原性組合物密封于噴霧裝置、安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的單劑量/多劑量小瓶中。以單位劑量形式調(diào)配非經(jīng)腸組合物以便于投與和劑量均勻性是特別有利的。本文中所使用的單位劑量形式指的是適于作為用于待治療受檢者的單一劑量的物理上離散的單位，各單位都含有經(jīng)計算用于與所需醫(yī)藥載劑聯(lián)合產(chǎn)生所要治療效果的預(yù)定數(shù)量的活性化合物。本發(fā)明的單位劑量形式的規(guī)格由活性化合物的獨特特征和待達(dá)成的特定治療效果以及用于治療個體的所述活性化合物的化合技術(shù)中固有的限制指定且直接取決于其。醫(yī)藥學(xué)上可接受的媒劑應(yīng)理解為表示具有以下特征的進(jìn)入醫(yī)藥或免疫原性組合物中的化合物的組合其不會引起副作用且例如使得有利于活性化合物的投與、增加其在體內(nèi)的壽命和/或功效、增加其在溶液中的溶解度或增強其保存成為可能。所述醫(yī)藥學(xué)上可接受的媒劑是熟知的且將由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所選活性化合物的性質(zhì)和投與模式加以調(diào)節(jié)。本文中所引用的所有專利和公開案都以引用的方式并入本文中。F.實例使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行以下實例，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)除其中另外詳細(xì)描述之處以外對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知且常規(guī)的。提供以下實例是用于說明目的，且不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明。實例1RSV和PIV調(diào)配物組份用如下被指定為“配方A1”到“配方E2”的以下磷酸鹽緩沖配方之一調(diào)配本文所述的RSV和/或PIV樣品配方A110mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含2.5mMHEPES、0.1mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、0.49mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和1.0g/LHA。HA為Grifols20％(w/v)人類白蛋白(GrifolsUSA，LosAngeles，CA；目錄號61953-0001-1)。配方A210mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含12.5mMHEPES、0.5mM氯化鎂、0.5mM氯化鈣、2.45mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和1.0g/LHA。配方A310mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含2.5mMHEPES、0.1mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、0.49mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和1.0g/L重組HA。重組HA為在酵母細(xì)胞中表達(dá)且以商品名Recombumin(DeltaBiotechnologyLtd.，Notttingham，UnitedKingdom)售賣的20％(w/v)人類白蛋白。配方A410mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含12.5mMHEPES、0.5mM氯化鎂、0.5mM氯化鈣、2.45mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和1.0g/L重組HA。配方B110mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含2.5mMHEPES、0.1mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、0.49mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和10g/LHA。配方B210mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含12.5mMHEPES、0.5mM氯化鎂、0.5mM氯化鈣、2.45mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和10g/LHA。配方B310mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含2.5mMHEPES、0.1mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、0.49mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和10g/L重組HA。配方B410mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含12.5mMHEPES、0.5mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、2.45mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和10g/L重組HA。配方C110mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含2.5mMHEPES、0.1mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、0.49mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖、50g/L大豆蛋白胨(HySoy)和1.0g/LHA。C210mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含2.5mMHEPES、0.1mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、0.49mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖、50g/L大豆蛋白胨和約1.0g/L重組HA。配方C310mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含2.5mMHEPES、0.1mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、0.49mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖、50g/L大豆蛋白胨和約1.0g/L重組HA。配方C410mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含12.5mMHEPES、0.5mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、2.45mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖、50g/L大豆蛋白胨和約1.0g/LHA。配方D110mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含2.5mMHEPES、0.1mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、0.49mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和50g/L大豆蛋白胨。配方D210mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，其包含12.5mMHEPES、0.5mM氯化鎂、0.5mM氯化鈣、2.45mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和50g/L大豆蛋白胨。實例2冷凍速率對凍干期間小體積RSV和/或PIV調(diào)配物的效力的影響在這個實例中，研究小體積RSV和/或PIV調(diào)配物的冷凍速率以測定使病毒效力損失降至最低所需的最佳冷凍條件。起初測試含有LRSV-404、PIV3-cp45和LRSV-404/PIV3-cp45組合的三種樣品(表2)。將所述調(diào)配物中所用的病毒塊制備成用于階段1和階段2人類臨床試驗的臨床材料。使用如實例1中所述的“配方A1”調(diào)配各病毒樣品。將樣品填充入2mL小瓶中(每瓶0.6mL)，預(yù)冷卻到約5℃的溫度并隨后放置于凍干機的預(yù)冷卻(-50℃)架子上。病毒組合物的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度(Tg)(約-35℃±5℃)在約40分鐘內(nèi)達(dá)到，其對應(yīng)于每分鐘約-1.0℃的冷凍速率。冷凍后應(yīng)用凍干循環(huán)，其包括在0℃下初級干燥隨后在15℃下二級干燥。表2小體積病毒調(diào)配物在凍干前后的效力(a)*＝以-1℃/分鐘冷凍的樣品。(b)LRSV-4041LRSV-4041的效力由組合LRSV-404/PIV-cp45調(diào)配物測定而來。(c)PIV-cp451PIV-cp451的效力由組合LRSV-404/PIV-cp45調(diào)配物測定而來。對初始病毒塊、冷凍步驟后小瓶中的病毒材料和凍干樣品(凍干后立即進(jìn)行)進(jìn)行病毒效力測試。使用空斑形成單位(PFU)檢定和Vero細(xì)胞(ATCC目錄號CCL-18)測試RSV。所述檢定包括(a)在24孔板中制備細(xì)胞單層，(b)制備參考樣品和測試樣品的10倍稀釋液，(c)感染細(xì)胞，(d)在32℃和5％CO2下將板培育約5天，和(e)固定細(xì)胞并免疫染色以顯現(xiàn)空斑。使用空斑形成單位(PFU)檢定和LCC-MK2細(xì)胞測試PIV，其包括(a)在24孔板中制備細(xì)胞單層，(b)制備參考樣品和測試樣品的10倍稀釋液，(c)感染細(xì)胞，(d)在32℃和5％CO2下將板培育約4天，和(e)固定細(xì)胞并免疫染色以顯現(xiàn)空斑。對于兩種檢定而言，如果自所述檢定測定的參考樣品的效力在登記值的+0.5logPFU內(nèi)，那么效力測試結(jié)果被認(rèn)為是可接受的。對RSV、PIV和RSV/PIV調(diào)配物進(jìn)行的效力測試的結(jié)果展示于表2中。所述數(shù)據(jù)表明以每分鐘約-1.0℃的速率冷凍的調(diào)配物的最小效力損失。所述實驗的結(jié)果也證實RSV與PIV在組合調(diào)配物中相容。以更快(-2℃/分鐘，表6)及更慢(-0.3℃/分鐘，表3)的冷凍速率和各種濃度的重組HA(rHA)、HA、大豆蛋白胨及其組合進(jìn)一步測試RSV和/或PIV穩(wěn)定性。病毒樣品包含經(jīng)制備用于階段1和階段2人類臨床試驗的LRSV-404、LRSV-rA38、LRSV-rA42或PIV3-cp45液體病毒塊。使用表3-6的第2列中所示的配方調(diào)配各病毒樣品。將病毒樣品填充至2mL小瓶中(每瓶0.5mL)，預(yù)冷卻到約5℃的溫度并隨后放置于凍干機的架子上。使用包括在0℃下初級干燥隨后在15℃下二級干燥的循環(huán)將冷凍樣品凍干。對初始病毒塊、冷凍后小瓶中的材料和凍干樣品(凍干后立即進(jìn)行)進(jìn)行效力測試。效力測試結(jié)果表明以每分鐘約-0.3℃(表3)冷凍的樣品中的RSV或PIV效力顯著降低且以每分鐘-1℃(表4和表5)和每分鐘-2℃(表6)的較快速率冷凍的調(diào)配物中的RSV或PIV穩(wěn)定性高。表3以-0.3℃/分鐘冷凍的小體積RSV調(diào)配物的效力配方1＝配方A1-A4、B1、B2、C3和D2在實例1中有所描述。表4以-1℃/分鐘冷凍的小體積PIV調(diào)配物的效力配方1＝配方A1、A3、B1、B3、C1、C3和D1在實例1中有所描述。表5以-1℃/分鐘冷凍的小體積RSV調(diào)配物的效力配方1＝配方A1、A2、B2、C1、C4和D2在實例1中有所描述。表6以-2℃/分鐘冷凍的小體積RSV和PIV調(diào)配物的效力配方1＝配方B1、B2和B4在實例1中有所描述。實例3包含RSV或PIV的小體積調(diào)配物的儲存穩(wěn)定性通過在不同時間點進(jìn)行效力測試來評估實例2中所述的調(diào)配物的儲存穩(wěn)定性，所述時間點包括在5℃下儲存3個月、6個月、9個月和12個月。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)概括于下表7中，其中所述數(shù)據(jù)證明在5℃下儲存長達(dá)1年的病毒組合物的最小效力損失。表7中的配方列表示實例1中所指定的配方。表7RSV和PIV組合物的配方、冷凍速率和儲存穩(wěn)定性Lyo＝凍干的縮寫mo＝月的縮寫S＝病毒在包含胎牛血清的培養(yǎng)基中生長SF＝使用“無血清”生長培養(yǎng)基繁殖病毒實例4冷凍速率對凍干期間大體積RSV和/或PIV調(diào)配物的效力的影響為最優(yōu)化包含RSV、PIV或其組合的免疫原性組合物的大規(guī)模生產(chǎn)的凍干方法，測試大體積RSV或PIV調(diào)配物的不同冷凍速率。制備包含pH7.0的10mM磷酸鹽緩沖液(2.5mMHEPES、0.1mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、0.49mML(+)-谷氨酸單鈉鹽、50g/L蔗糖和1g/LHA)的大體積RSV-404調(diào)配物并于1-LLyoguard凍干盤中凍干。通過在45分鐘內(nèi)將架子溫度從5℃降低到-45℃而在凍干機架子上進(jìn)行材料的冷凍。凍干盤在架子上(-45℃下)存留額外5小時以使調(diào)配物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度。達(dá)到玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度(約-35℃)的實際時間為約2小時，其對應(yīng)于每分鐘約-0.3℃的冷凍速率。隨后應(yīng)用90小時凍干循環(huán)，其包括在0℃下初級干燥隨后在15℃下二級干燥。通過PFU檢定來測試初始調(diào)配的塊狀物和凍干材料的效力。在另一實驗中，使用相同配方制備具有LRSV-rA39的調(diào)配物，例外為使用50mL容積的小尺寸鋁盤凍干材料。通過在60分鐘內(nèi)將溫度從5℃降低到-40℃而在凍干機架子上冷凍材料。達(dá)到材料的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度(約-35℃)的實際時間為約1.5小時，其對應(yīng)于每分鐘約-0.4℃的冷凍速率。隨后應(yīng)用24小時凍干循環(huán)，其包括在0℃下初級干燥隨后在15℃下二級干燥。通過PFU檢定來測試初始調(diào)配的塊狀物和凍干材料的效力?；蛘?，使用1-LLyoguard凍干盤中的大體積凍干來制備兩種其他RSV調(diào)配物。用包含12.5mMHEPES、0.5mM氯化鎂、0.5mM氯化鈣、2.45mML(+)-谷氨酸、50g/L蔗糖和10g/LHA的10mM磷酸鹽(pH7.0)分別調(diào)配LRSV-rA38和LRSV-404(在無血清培養(yǎng)基中生長)。通過將托盤沉入液氮浴中持續(xù)至少20分鐘來冷凍病毒組合物。隨后將凍干盤放置于預(yù)冷卻(-50℃)凍干架上并使用120小時循環(huán)進(jìn)行凍干，所述循環(huán)包括(a)在設(shè)定為0.10托的真空下開始初級干燥；(b)溫度呈斜線上升(0.23℃/分鐘)到-23℃的架子溫度；(c)保持溫度為-23℃持續(xù)80-100小時；(d)在設(shè)定為0.02托的真空下開始二級干燥；(e)溫度呈斜線上升(0.13℃/分鐘)到15℃的架子溫度；(f)保持溫度為15℃持續(xù)30-40小時；(g)使溫度呈斜線上升(0.17℃/分鐘)到25℃的架子溫度；和(h)保持溫度為25℃持續(xù)10小時。在PFU檢定中測試經(jīng)調(diào)配的病毒塊狀物樣品和凍干材料樣品的效力。證實冷凍速率對于凍干循環(huán)期間病毒效力的保持很關(guān)鍵的數(shù)據(jù)列于下表8中。在凍干架上冷凍托盤(“緩慢冷凍”)導(dǎo)致相對于以液氮冷凍托盤(“快速冷凍”)顯著的凍干材料的效力損失(表8，第2列)，在以液氮冷凍托盤時效力損失是可忽略的(表8，第3列)。表8冷凍速率對大體積凍干期間RSV效力的影響ND*＝未測定實例5填充入鼻噴霧裝置中的液體RSV調(diào)配物的快速冷凍在包含25mMHEPES、1.0mM氯化鎂、1.0mM氯化鈣、75g/L蔗糖和4.9mML(+)-谷氨酸的10mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH7.5)中制備LRSV-rA38(在無血清培養(yǎng)基中生長)的液體調(diào)配物。將調(diào)配物填充入BDAccusprayTM鼻噴霧裝置中(每裝置0.23mL)并將各鼻噴霧裝置插入由申請人設(shè)計和制造的鋁鼻噴霧固定器的孔中(例如參見圖1)。鼻噴霧固定器是由具有96個孔的鋁塊制得，其中孔徑比鼻噴霧裝置的直徑大0.5mm。所述孔足夠深以便允許各鼻噴霧裝置內(nèi)的病毒樣品低于固定器的上表面(圖1)。在填充鼻噴霧裝置時，將不銹鋼板(尺寸為0.3m×0.2m×0.02m)放置于充滿液氮的低溫容器內(nèi)并在液氮中平衡所述板(意即直到液氮停止沸騰)。平衡之后，調(diào)節(jié)低溫容器內(nèi)的液氮體積使得有足夠體積接觸金屬板，但不接觸鼻噴霧固定器。將含有充滿態(tài)鼻噴霧裝置的鼻噴霧固定器放置于低溫容器內(nèi)的“冷凍”板頂部，并使其“快速冷凍”至少10分鐘。隨后從鼻噴霧固定器移除鼻噴霧裝置，其中一半鼻噴霧裝置儲存在設(shè)定為-70℃的冷凍器中且另一半鼻噴霧裝置儲存在設(shè)定為-20℃的冷凍器中。也在包含2.5mMHEPES、0.1mM氯化鎂、0.1mM氯化鈣、75g/L蔗糖和4.9mML(+)-谷氨酸的10mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH7.5)中制備LRSV-404(在無血清培養(yǎng)基中生長)的液體調(diào)配物。如上所述將調(diào)配物填充入BDAccusprayTM鼻噴霧裝置中(每裝置0.23mL)，“快速”冷凍并儲存。或者，如上所述調(diào)配液體LRSV-rA38和液體LRSV-404樣品并填充入鼻噴霧裝置中，但通過將鼻噴霧固定器放置于在-70℃下冷卻的常規(guī)冷凍器的架子上來進(jìn)行冷凍并使其冷凍24小時(“緩慢”冷凍)。圖2中的數(shù)據(jù)顯示“快速”冷凍(圖2，實心方塊)和“緩慢”冷凍(圖2，空心方塊)的動力學(xué)。隨后，將一半鼻噴霧裝置儲存在設(shè)定為-70℃的冷凍器中且另一半鼻噴霧裝置儲存在設(shè)定為-20℃的冷凍器中。通過在第0個月、第1個月、第3個月、第4個月和第6個月時間點的效力測試來評估樣品的儲存穩(wěn)定性。在室溫下將鼻噴霧裝置(每各時間點3個裝置)解凍約1小時。將各鼻噴霧裝置的內(nèi)容物釋放入管中并隨后使用PFU檢定來測試效力。表9-12中所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)總結(jié)較快的冷凍速率對液體RSV調(diào)配物的穩(wěn)定性的影響。表9在-196℃下冷凍并在-20℃或-70℃下儲存的液體LRSV-rA38調(diào)配物的儲存穩(wěn)定性(效力)**在-196℃下冷凍之前液體LRSV-rA38調(diào)配物的效力為5.6(logPFU/mL)。表10在-70℃下冷凍并在-20℃或-70℃下儲存的液體LRSV-rA38調(diào)配物的儲存穩(wěn)定性(效力)**在-70℃下冷凍之前液體LRSV-rA38調(diào)配物的效力為5.6(logPFU/mL)。表11在-196℃下冷凍并在-20℃或-70℃下儲存的液體LRSV-404調(diào)配物的儲存穩(wěn)定性(效力)**在-196℃下冷凍之前液體LRSV-404調(diào)配物的效力為6.2(logPFU/mL)。表12在-70℃下冷凍并在-20℃或-70℃下儲存的液體LRSV-404調(diào)配物的儲存穩(wěn)定性(效力)**在-70℃下冷凍之前液體LRSV-404調(diào)配物的效力為6.2(logPFU/mL)。從這些數(shù)據(jù)觀察到用液氮(“快速”冷凍)冷凍的RSV調(diào)配物在兩種儲存溫度(-20℃和-70℃)下都穩(wěn)定(表9和表11)。在-70℃的冷凍器的架子上冷凍(“緩慢”冷凍)的RSV調(diào)配物顯示效力降低和不同時間點處效力的高可變性(表10和表12)。通過使用MalvernSprayTec粒度分析儀測量液滴尺寸分布來評估冷凍對噴霧性能的影響。對充滿上述液體LRSV-rA38調(diào)配物的噴霧裝置進(jìn)行所述分析。如下測量噴霧裝置的液滴尺寸分布(每測試10個裝置)(a)鼻噴霧裝置充滿RSV但不冷凍，(b)鼻噴霧裝置充滿RSV，在液氮中冷凍并在-70℃下儲存3個月，(c)鼻噴霧裝置充滿RSV，在液氮中冷凍并在-20℃下儲存3個月，(d)鼻噴霧裝置充滿RSV，在-70℃冷凍器下冷凍并在-70℃下儲存3個月，和(e)鼻噴霧裝置充滿RSV，在-70℃冷凍器下冷凍并在-20℃下儲存3個月。因為BDAccusprayTM鼻噴霧裝置是設(shè)計用于通過2次連續(xù)噴霧(獨立噴給各鼻孔)來進(jìn)行鼻內(nèi)接種，所以對各噴霧進(jìn)行分析。使用粒度小于10μm的液滴部分的值(％)作為標(biāo)準(zhǔn)(粒度小于10μm的部分的質(zhì)量增加是無法接受的)。分析結(jié)果總結(jié)于表13中。冷凍噴霧裝置的冷凍和3個月儲存并不影響噴霧性能。未觀察到直徑小于10μm的液滴的總質(zhì)量增加。表13BDACCUSPRAYTM裝置在不同條件下的噴霧性能參考文獻(xiàn)美國專利第4,084,330號美國專利第5,489,266號美國專利第5,732,837號美國專利第5,882,651號美國專利第5,932,222號美國專利第5,993,824號美國專利第6,077,514號美國專利第6,284,254號美國專利第6,410,023號Ayra，Vaccine，19595-597，2001.Carpenter等人，“Rationaldesignofstablelyophilizedproteinformulationstheoryandpractice”.Pharm.Biotechnol.，13109-33，2002.Chanock等人，Pediatrics，90137-142.，1992.Crowe，“CurrentApproachestotheDevelopmentofvaccinesagainstdiseaseCausedbyRespiratorySyncytialVirus(RSV)andParainfluenzaVirus(PIV)AmeetingreportfromtheWHOProgrammeforVaccineDevelopment”，Vaccine，13415-421，1995.Franks，“Freeze-dryingfromempiricismtopredictability.Thesignificanceofglasstransitions”.Dev.Biol.Stand.，749-18，1992.Glezen等人，Am.J.Dis.Child140，143-146，1986.Glezen等人，J.Pediatr.，98708-715，1981.Gupta等人，“StabilizationofRSVagainstthermalinactivationandfreeze-thawcyclesfordevelopmentandcontrolofRSVvaccinesandimmuneglobulin，”Vaccine，141417-1420，1996.Hambling，“SurvivaloftheRSVduringstorageundervariousconditions”，Br.J.Exp.Pathol.，45647-655，1964.Hatley，“Theeffectiveuseofdifferentialscanningcalorimetryintheoptimisationoffreeze-dryingprocessesandformulations”.Dev.Biol.Stand.，74105-119，1992.Hilleman，Rev.Infect.Dis.，11(增刊3)S613-616，1989.Katz，“Newvaccinedevelopmentestablishingpriorities″，第1卷，WashingtonNationalAcademicPress.，第397-409，1985頁.Kneyber和Kimpen，“CurrentConceptsonActiveImmunizationAgainstRespiratorySyncytialVirusForInfantsandYoungChildren”，Pediatr.Infect.Dis.J.，21685-696，2002.Lemon和Milstein，Int.J.Techno1.Assess.HealthCare，10177-184，1994.Martin等人，J.Lancet，1035-1038，1978.McConnochie等人，“Variationinseverityofrespiratorysyncytialvirusinfectionswithsubtype”，J.Pediatr.11752-62，1990.Mcintosh和Chanock，F(xiàn)ieldsVirology(Fields和Knipe編)1045-1075，RavenPress，Ltd.，NewYork，1990.Melnick和Wallis，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，112894-897，1963.Rasmussen等人，Am.J.Dis.Child126465-469，1973.Rey和May，“Freeze-Drying/LyophilizationofPharmaceuticalandBiologicalProducts”，NewYorkMarcelDekker，1999.Robbins和Freeman，Sci.Am.，259126-133，1988.Stark等人，“OccurrenceofrespiratorysyncytialvirussubtypesinhospitalizedchildreninCleveland，Ohiofrom1985to1988，”Pediatr.Pulmonol.，1198-102，1991.Wertz和Sullender，Biotech，20151-176，1992.Wulff等人，“RSVPropertiesofstrainspropagatedinmonkeykidneycellcultures”，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，115458-462，1964.權(quán)利要求1.一種用于產(chǎn)生包含呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)或其組合的儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法，所述方法包含(a)于60分鐘或更少的時間內(nèi)將所述病毒組合物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度；和(b)凍干所述病毒組合物，其中所述凍干病毒組合物在約1℃到約10℃的儲存溫度下可穩(wěn)定至少1年。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-40℃到約-50℃。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-30℃到約-40℃。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中在40分鐘或更少的時間內(nèi)達(dá)到約-35℃的所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中在20分鐘或更少的時間內(nèi)達(dá)到約-35℃的所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其進(jìn)一步包含蔗糖、L(+)-谷氨酸或L(+)-谷氨酸單鈉鹽或L(+)-谷氨酸/L(+)-谷氨酸單鈉鹽的混合物和人類白蛋白(HA)。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中HA為天然的或重組的。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其進(jìn)一步包含大豆蛋白胨。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其進(jìn)一步包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物和約1.0g/L到約10.0g/LHA。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中約1.0g/L到約10.0g/LHA由約50g/L大豆蛋白胨替換。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約1.0g/L到約10.0g/LHA和約50g/L大豆蛋白胨。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述儲存溫度為5℃。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒組合物在約1℃到約10℃下儲存1年后具有小于約1.0log的PFU損失。19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒組合物在約1℃到約10℃下儲存1年后為每0.2mL至少4.0logPFU。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)中凍干所述病毒組合物包含在合適容器構(gòu)件中約0.2mL到約1.0mL的所述病毒組合物。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中容器構(gòu)件被進(jìn)一步定義為小瓶、管或鼻噴霧裝置。22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中凍干所述病毒組合物被進(jìn)一步定義為(a)將約0.5mL到0.6mL的所述病毒組合物放置于小瓶中并冷卻到約5℃的溫度；(b)將所述小瓶放置在凍干架上并以每分鐘約-1.0℃到每分鐘約-2.0℃的速率將所述架子溫度從5℃降低到-50℃；(c)保持所述架子溫度為約-50℃持續(xù)60分鐘；(d)降低凍干室壓力到0.10托并保持所述架子溫度為約-50℃持續(xù)30-60分鐘；(e)在約0.10托下以每分鐘約1.0℃到約2.0℃的速率將所述架子溫度從-50℃升高到0℃，并保持所述架子溫度為約0℃持續(xù)約540分鐘到約720分鐘；(f)在約0.10托下以每分鐘約0.5℃的速率將所述架子溫度從0℃升高到15℃，并保持所述架子溫度為約15℃持續(xù)約600分鐘到約720分鐘；和(g)用氮氣充滿所述小瓶并密封所述小瓶。23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中凍干所述病毒組合物被進(jìn)一步定義為(a)將約0.5mL到0.6mL的所述病毒組合物放置于小瓶中并冷卻到約5℃的溫度；(b)冷凍凍干架到約-70℃的溫度；(c)將所述小瓶放置在所述凍干架上并保持溫度為約-70℃持續(xù)約60分鐘；(d)降低凍干室壓力到0.10托并以每分鐘約1.0℃的速率將所述架子溫度從-70℃升高到-50℃；(e)在約0.10托下以每分鐘約1.0℃到每分鐘約2.0℃的速率將所述架子溫度從-50℃升高到0℃，并保持所述架子溫度為約0℃持續(xù)約540分鐘到約720分鐘；(f)在約0.10托下以每分鐘約0.5℃的速率將所述架子溫度從0℃升高到15℃，并保持所述架子溫度為約15℃持續(xù)約600分鐘到約720分鐘；和(g)用氮氣充滿所述小瓶并密封所述小瓶。24.一種用于產(chǎn)生包含呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)或其組合的凍干穩(wěn)定大體積病毒組合物的方法，所述方法包含(a)將體積為至少50mL的液體病毒組合物放置于凍干盤中；(b)在液氮浴中將所述病毒組合物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度達(dá)至少約20分鐘；和(c)凍干所述病毒組合物，其中所述凍干病毒組合物相對于凍干前的所述病毒組合物具有小于約0.5log的PFU損失。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-45℃。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-35℃的溫度。27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述凍干盤為Lyoguard凍干盤。28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述病毒組合物的體積為至少500mL。29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述病毒組合物的體積為至少1000mL。30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其進(jìn)一步包含約2.5mM到約25mMHEPES。33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.1mM到約1mM氯化鎂和約0.1mM到約1mM氯化鈣。34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其進(jìn)一步包含約2.5mM到約25mMHEPES、約0.1mM到約1mM氯化鎂和約0.1mM到約1mM氯化鈣。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其進(jìn)一步包含蔗糖、L(+)-谷氨酸或L(+)-谷氨酸單鈉鹽和人類白蛋白(HA)。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中HA為天然的或重組的。37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其進(jìn)一步包含大豆蛋白胨。38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其進(jìn)一步包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物和約1.0g/L到約10.0g/LHA。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中約1.0g/L到約10.0g/LHA由約50g/L大豆蛋白胨替換。40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約1.0g/LHA和約50g/L大豆蛋白胨。41.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中凍干所述大體積病毒組合物被進(jìn)一步定義為(a)在約-50℃的溫度下將包含所述冷凍病毒組合物的凍干盤放置于預(yù)冷卻到約-50℃的溫度的凍干架上并保持所述溫度約60分鐘；(b)降低凍干室壓力到0.10托并在約0.10托下以每分鐘約0.23℃的速率將所述架子溫度從-50℃升高到-23℃；(c)保持所述架子溫度為約-23℃持續(xù)約80小時到約100小時；(d)降低凍干室壓力到0.02托并以每分鐘約0.23℃的速率將所述架子溫度從-23℃升高到15℃；(e)將所述架子溫度保持在約15℃并保持在約0.02托，持續(xù)約30小時到約40小時；(f)在0.02托下以每分鐘約0.17℃的速率將所述架子溫度從15℃升高到25℃；(g)將所述架子溫度保持在約15℃并保持在約0.02托，持續(xù)約10小時；和(h)用氮氣充滿所述凍干室并在氮氣下將所述凍干盤密封于鋁袋中。42.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中凍干所述大體積病毒組合物被進(jìn)一步定義為(a)在約-70℃的溫度下將包含所述冷凍病毒組合物的凍干盤放置于預(yù)冷卻到約-70℃的溫度的凍干架上并保持所述溫度約60分鐘；(b)降低凍干室壓力到0.10托并以每分鐘約0.23℃的速率將所述架子溫度從-70℃升高到-23℃；(c)在約0.10托下保持所述架子溫度為約-23℃持續(xù)約80到100小時；(d)降低凍干室壓力到0.02托并以每分鐘約0.23℃的速率將所述架子溫度從-23℃升高到15℃；(e)將溫度保持在約15℃并保持在約0.02托，持續(xù)約30到40小時；(f)在0.02托下以每分鐘約0.17℃的速率將所述架子溫度從15℃升高到25℃；(g)保持所述溫度為約25℃持續(xù)約10小時；和(h)用氮氣充滿所述凍干室并在氮氣下將所述凍干盤密封于鋁袋中。43.一種用于產(chǎn)生包含呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)或其組合的儲存穩(wěn)定液體病毒組合物的方法，所述方法包含(a)在液氮浴中平衡金屬板；(b)將液體病毒組合物放置于鼻噴霧裝置中；(c)將步驟(b)的所述鼻噴霧裝置插入金屬固定器中；(d)將所述金屬固定器放置于步驟(a)的所述經(jīng)平衡的金屬板上持續(xù)約10分鐘；(e)從所述金屬固定器中移除所述鼻噴霧裝置；和(f)將所述鼻噴霧裝置儲存在約-20℃到約-70℃的溫度下，其中步驟(a)到(f)后的所述病毒組合物在儲存6個月后具有小于約0.5log的PFU損失。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述金屬固定器為鋁。45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述金屬固定器為不銹鋼。46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述病毒組合物在步驟(a)到(f)之后為至少4.0logPFU/0.2mL。47.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述病毒組合物在-20℃的溫度下儲存6個月后為至少4.0logPFU/0.2mL。48.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述病毒組合物在-70℃的溫度下儲存6個月后為至少4.0logPFU/0.2mL。49.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中在不存在蛋白穩(wěn)定劑的情況下調(diào)配所述液體病毒組合物。50.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。51.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES。53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其進(jìn)一步包含蔗糖和L(+)-谷氨酸、L(+)-谷氨酸單鈉鹽或L(+)-谷氨酸與L(+)-谷氨酸單鈉鹽的混合物。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其進(jìn)一步包含約75g/L蔗糖和約4.9mML(+)-谷氨酸或約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物。57.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的儲存穩(wěn)定病毒組合物。58.一種根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法產(chǎn)生的凍干穩(wěn)定大體積病毒組合物。59.一種根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法產(chǎn)生的儲存穩(wěn)定冷凍液體病毒組合物。60.一種免疫原性組合物，其包含溶解于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中的通過權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的所述病毒組合物。61.一種免疫原性組合物，其包含溶解于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中的通過權(quán)利要求24所述的方法產(chǎn)生的所述病毒組合物。62.一種免疫原性組合物，其包含通過權(quán)利要求43所述的方法產(chǎn)生的所述鼻噴霧病毒組合物。63.一種用于產(chǎn)生儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法，所述病毒組合物包含選自由單純皰疹病毒(HSV)、細(xì)胞肥大病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、諾沃克病毒(Norwalkvirus)、披膜病毒、α病毒、風(fēng)疹病毒、狂犬病病毒、馬堡病毒(Marburgvirus)、伊波拉病毒(Ebolavirus)、乳頭狀瘤病毒、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、多瘤病毒、間質(zhì)肺炎病毒(metapneumovirus)、冠狀病毒、水皰性口炎病毒(VSV)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)組成的群組的病毒，所述方法包含(a)于60分鐘或更少的時間內(nèi)將所述病毒組合物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度；和(b)凍干所述病毒組合物，其中所述凍干病毒組合物在約1℃到約10℃的儲存溫度下可穩(wěn)定至少1年。64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-40℃到約-50℃。65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-30℃到約-40℃。66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中在40分鐘或更少的時間內(nèi)達(dá)到約-35℃的所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度。67.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中在20分鐘或更少的時間內(nèi)達(dá)到約-35℃的所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度。68.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)。71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。72.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其進(jìn)一步包含蔗糖、L(+)-谷氨酸或L(+)-谷氨酸單鈉鹽或L(+)-谷氨酸/L(+)-谷氨酸單鈉鹽的混合物和人類白蛋白(HA)。74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中HA為天然的或重組的。75.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其進(jìn)一步包含大豆蛋白胨。76.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其進(jìn)一步包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物和約1.0g/L到約10.0g/LHA。77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中約1.0g/L到約10.0g/LHA由約50g/L大豆蛋白胨替換。78.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約1.0g/L到約10g/LHA和約50g/L大豆蛋白胨。79.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述儲存溫度為5℃。80.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述病毒組合物在約1℃到約10℃下儲存1年后具有小于約1.0log的PFU損失。81.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述病毒組合物在約1℃到約10℃下儲存1年后為每0.2mL至少4.0logPFU。82.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中步驟(b)中凍干所述病毒組合物包含在合適容器構(gòu)件中約0.2mL到約1.0mL的所述病毒組合物。83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中容器構(gòu)件被進(jìn)一步定義為小瓶、管或鼻噴霧裝置。84.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中凍干所述病毒組合物被進(jìn)一步定義為(a)將約0.5mL到0.6mL的所述病毒組合物放置于小瓶中并冷卻到約5℃的溫度；(b)將所述小瓶放置在凍干架上并以每分鐘約-1.0℃到每分鐘約-2.0℃的速率將所述架子溫度從5℃降低到-50℃；(c)保持所述架子溫度為約-50℃持續(xù)60分鐘；(d)降低凍干室壓力到0.10托并保持所述架子溫度為約-50℃持續(xù)30-60分鐘；(e)在約0.10托下以每分鐘約1.0℃到約2.0℃的速率將所述架子溫度從-50℃升高到0℃，并保持所述架子溫度為約0℃持續(xù)約540分鐘到約720分鐘；(f)在約0.10托下以每分鐘約0.5℃的速率將所述架子溫度從0℃升高到15℃，并保持所述架子溫度為約15℃持續(xù)約600分鐘到約720分鐘；和(g)用氮氣充滿所述小瓶并密封所述小瓶。85.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中凍干所述病毒組合物被進(jìn)一步定義為(a)將約0.5mL到0.6mL的所述病毒組合物放置于小瓶中并冷卻到約5℃的溫度；(b)冷凍凍干架到約-70℃的溫度；(c)將所述小瓶放置在所述凍干架上并保持所述溫度為約-70℃持續(xù)約60分鐘；(d)降低凍干室壓力到0.10托并以每分鐘約1.0℃的速率將所述架子溫度從-70℃升高到-50℃；(e)在約0.10托下以每分鐘約1.0℃到每分鐘約2.0℃的速率將所述架子溫度從-50℃升高到0℃，并保持所述架子溫度為約0℃持續(xù)約540分鐘到約720分鐘；(f)在約0.10托下以每分鐘約0.5℃的速率將所述架子溫度從0℃升高到15℃，并保持所述架子溫度為約15℃持續(xù)約600分鐘到約720分鐘；和(g)用氮氣充滿所述小瓶并密封所述小瓶。86.一種用于產(chǎn)生凍干穩(wěn)定大體積病毒組合物的方法，所述病毒組合物包含一選自由HSV、CMV、Epstein-Barr病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、諾沃克病毒、披膜病毒、α病毒、風(fēng)疹病毒、狂犬病病毒、馬堡病毒、伊波拉病毒、乳頭狀瘤病毒、HPV、多瘤病毒、間質(zhì)肺炎病毒、冠狀病毒、VSV和VEE組成的群組的病毒，所述方法包含(a)將具有至少50mL體積的液體病毒組合物放置于凍干盤中；(b)在液氮浴中將所述病毒組合物冷凍至低于其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度達(dá)至少約20分鐘；和(c)凍干所述病毒組合物，其中所述凍干病毒組合物相對于凍干前的所述病毒組合物具有小于約0.5log的PFU損失。87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-45℃。88.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度為約-35℃的溫度。89.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述凍干盤為Lyoguard凍干盤。90.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述病毒組合物的體積為至少500mL。91.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述病毒組合物的體積為至少1000mL。92.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。93.根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其進(jìn)一步包含約2.5mM到約25mMHEPES。95.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.1mM到約1mM氯化鎂和約0.1mM到約1mM氯化鈣。96.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其進(jìn)一步包含約2.5mM到約25mMHEPES、約0.1mM到約1mM氯化鎂和約0.1mM到約1mM氯化鈣。97.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其進(jìn)一步包含蔗糖、L(+)-谷氨酸或L(+)-谷氨酸單鈉鹽和人類白蛋白(HA)。98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中HA為天然的或重組的。99.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其進(jìn)一步包含大豆蛋白胨。100.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其進(jìn)一步包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物和約1.0g/L到約10.0g/LHA。101.根據(jù)權(quán)利要求100所述的方法，其中約1.0g/L到約10.0g/LHA由約50g/L大豆蛋白胨替換。102.根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其包含約50g/L蔗糖、約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸或約0.049mM到約2.45mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物、約1.0g/LHA和約50g/L大豆蛋白胨。103.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中凍干所述大體積病毒組合物被進(jìn)一步定義為(a)在約-50℃的溫度下將包含所述冷凍病毒組合物的凍干盤放置于預(yù)冷卻到約-50℃溫度的凍干架上，并保持所述溫度約60分鐘；(b)降低凍干室壓力到0.10托并在約0.10托下以每分鐘約0.23℃的速率將所述架子溫度從-50℃升高到-23℃；(c)保持所述架子溫度為約-23℃持續(xù)約80小時到約100小時；(d)降低凍干室壓力到0.02托并以每分鐘約0.23℃的速率將所述架子溫度從-23℃升高到15℃；(e)將架子溫度保持在約15℃并保持在約0.02托，持續(xù)約30小時到約40小時；(f)在0.02托下以每分鐘約0.17℃的速率將所述架子溫度從15℃升高到25℃；(h)將架子溫度保持在約25℃并保持在約0.02托，持續(xù)約10小時；和(i)用氮氣充滿所述凍干室并在氮氣下將所述凍干盤密封于鋁袋中。104.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中凍干所述大體積病毒組合物被進(jìn)一步定義為(a)在約-70℃的溫度下將包含所述冷凍病毒組合物的凍干盤放置于預(yù)冷卻到約-70℃的溫度的凍干架上并保持所述溫度約60分鐘；(b)降低凍干室壓力到0.10托并以每分鐘約0.23℃的速率將所述架子溫度從-70℃升高到-23℃；(c)在約0.10托下保持所述架子溫度為約-23℃持續(xù)約80到100小時；(d)降低凍干室壓力到0.02托并以每分鐘約0.23℃的速率將所述架子溫度從-23℃升高到15℃；(e)將溫度保持在約15℃并保持在約0.02托，持續(xù)約30到40小時；(f)在0.02托下以每分鐘約0.17℃的速率將所述架子溫度從15℃升高到25℃；(g)保持所述溫度為約25℃持續(xù)約10小時；和(h)用氮氣充滿凍干室并在氮氣下將所述凍干盤密封于鋁袋中。105.一種用于產(chǎn)生儲存穩(wěn)定液體病毒組合物的方法，所述病毒組合物包含選自由HSV、CMV、Epstein-Barr病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、諾沃克病毒、披膜病毒、α病毒、風(fēng)疹病毒、狂犬病病毒、馬堡病毒、伊波拉病毒、乳頭狀瘤病毒、HPV、多瘤病毒、間質(zhì)肺炎病毒、冠狀病毒、VSV和VEE組成的群組的病毒，所述方法包含(a)在液氮浴中平衡金屬板；(b)將液體病毒組合物放置于鼻噴霧裝置中；(c)將步驟(b)的所述鼻噴霧裝置插入金屬固定器中；(d)將所述金屬固定器放置于步驟(a)的所述經(jīng)平衡的金屬板上持續(xù)約10分鐘；(e)從所述金屬固定器中移除所述鼻噴霧裝置；和(f)將所述鼻噴霧裝置儲存在約-20℃到約-70℃的溫度下，其中步驟(a)到(f)后的所述病毒組合物在儲存6個月后具有小于約0.5log的PFU損失。106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中所述金屬固定器為鋁。107.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中所述金屬固定器為不銹鋼。108.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中所述病毒組合物在步驟(a)到(f)之后為至少4.0logPFU/0.2mL。109.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中所述病毒組合物在-20℃的溫度下儲存6個月后為至少4.0logPFU/0.2mL。110.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中所述病毒組合物在-70℃的溫度下儲存6個月后為至少4.0logPFU/0.2mL。111.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中在不存在蛋白穩(wěn)定劑的情況下調(diào)配所述液體病毒組合物。112.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的5.0mM到約20mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。113.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中在包含鈉和/或鉀單堿價鹽和二堿價鹽且pH值為約6.5到約7.8的10mM磷酸鹽緩沖液溶液中調(diào)配所述病毒組合物。114.根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES。115.根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。116.根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法，其進(jìn)一步包含約0.25mM到約25mMHEPES、約0.01mM到約1mM氯化鎂和約0.01mM到約1mM氯化鈣。117.根據(jù)權(quán)利要求116所述的方法，其進(jìn)一步包含蔗糖和L(+)-谷氨酸、L(+)-谷氨酸單鈉鹽或L(+)-谷氨酸與L(+)-谷氨酸單鈉鹽的混合物。118.根據(jù)權(quán)利要求117所述的方法，其進(jìn)一步包含約75g/L蔗糖和約4.9mML(+)-谷氨酸或約4.9mML(+)-谷氨酸單鈉鹽或其混合物。119.一種根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法產(chǎn)生的儲存穩(wěn)定病毒組合物。120.一種根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法產(chǎn)生的凍干穩(wěn)定大體積病毒組合物。121.一種根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法產(chǎn)生的儲存穩(wěn)定冷凍液體病毒組合物。122.一種免疫原性組合物，其包含溶解于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中的通過權(quán)利要求63所述的方法產(chǎn)生的所述病毒組合物。123.一種免疫原性組合物，其包含溶解于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中的通過權(quán)利要求86所述的方法產(chǎn)生的所述病毒組合物。124.一種免疫原性組合物，其包含通過權(quán)利要求105所述的方法產(chǎn)生的所述鼻噴霧病毒組合物。全文摘要本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生儲存穩(wěn)定病毒組合物的方法。在某些實施例中，本發(fā)明涉及一種或一種以上產(chǎn)生儲存穩(wěn)定病毒組合物的配方和方法步驟，其中所述組合物作為凍干固體組合物或冷凍液體組合物的形式儲存穩(wěn)定。文檔編號A61K39/155GK1893973SQ200480037725公開日2007年1月10日申請日期2004年12月10日優(yōu)先權(quán)日2003年12月17日發(fā)明者吉·隆·盧克,弗拉迪米爾·G·弗洛羅夫,南迪尼·克納申請人:惠氏公司