專利名稱：促黑色素生成劑及促黑色素生成組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及山萵苣提取物及其活性成分十六烷酸羽扇醇酯為代表的脂肪酸羽扇醇酯的應(yīng)用，還涉及既可促進(jìn)黑素細(xì)胞的黑色素生成、又能預(yù)防和改善白發(fā)、美黑皮膚的促黑色素生成劑及化妝品、醫(yī)藥品和食品等促黑色素生成組合物。
背景技術(shù)：
毛發(fā)和皮膚顏色的深淺取決于毛發(fā)和皮膚內(nèi)存在的黑色素量。而黑色素在毛發(fā)的毛球部和表皮基底層的色素生成細(xì)胞(黑素細(xì)胞)內(nèi)，經(jīng)酪氨酸到多巴的過(guò)程，通過(guò)酪氨酸酶的催化作用被合成。
因此，如果由于黑素細(xì)胞的機(jī)能亢進(jìn)或酪氨酸酶的活化，黑色素的生成量增加，則毛發(fā)顏色加深，進(jìn)而防止白發(fā)發(fā)生，或改善白發(fā)。至今為止，作為使白發(fā)變黑發(fā)的方法，已有不少預(yù)防或改善白發(fā)的成分等的報(bào)道(參考例如專利文獻(xiàn)1、2、3)，但依然缺乏有效性和安全性。
此外，若增加皮膚黑色素量，則皮膚的顏色加深。跟著流行的趨勢(shì)，有不少人喜歡棕色皮膚，一般通過(guò)日光浴或曬黑美容等接受紫外線照射、或者通過(guò)以二氫丙酮為主成分的皮膚曬黑劑達(dá)到目的。但這些方法在安全性上存在很多問(wèn)題。
綜上所述，如果發(fā)現(xiàn)增加毛發(fā)和皮膚黑色素量的安全的成分，就能實(shí)現(xiàn)安全、有效地防止和改善白發(fā)，使皮膚變?yōu)樽厣?br> 至今為止的促黑色素物質(zhì)的研究中，和本發(fā)明有關(guān)的研究有例如，發(fā)明人所作的菊科蒲公英屬藥用蒲公英(Taraxacum officinale)的根部的甲醇提取物在細(xì)胞培養(yǎng)水平的實(shí)驗(yàn)中、具有促黑色素生成的活性的報(bào)道，并且所述提取物的有效成分鑒定為羽扇醇及其類似物質(zhì)(參考非專利文獻(xiàn)1、2)。此外，類似地在細(xì)胞培養(yǎng)水平的實(shí)驗(yàn)中，菊科苣屬繼斷菊(Sonchus asper)和苦苣菜(Sonchus oleraceus)的各自提取物中檢測(cè)出了促黑色素生成的活性，但同樣菊科的蟹甲草屬紅葉傘(Cacalia delphiniiforia)和同樣菊科的千里光屬歐洲千里光(Senecio vulgaris)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相同活性(參考非專利文獻(xiàn)1)。但是，即使有促黑色素生成的活性，其效力也不充分。另外，還有含有二氫羽扇醇衍生物的促黑色素生成劑的報(bào)道(參考例如專利文獻(xiàn)4)，但該物質(zhì)不是天然物質(zhì)，效力也仍然不強(qiáng)。
專利文獻(xiàn)1日本專利特開(kāi)2000-169348號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本專利特開(kāi)2002-47130號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3日本專利特開(kāi)2002-212039號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4日本專利特開(kāi)2002-3381號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1畠惠司(Keishi Hata)等，Biological and PharmaceuticalBulletin.2000年，23卷，8號(hào)，p.962～967非專利文獻(xiàn)2畠惠司(Keishi Hata)等，Journal of Natural Products.2002年，65卷，p.645～648發(fā)明的揭示發(fā)明要解決的課題本發(fā)明是鑒于上述情況而進(jìn)行的，其目的在于提供促黑色素生成作用好、又能用于預(yù)防和改善白發(fā)、美黑皮膚的物質(zhì)及有效應(yīng)用該物質(zhì)的組合物。
為解決上述課題，本發(fā)明人進(jìn)行了認(rèn)真研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山萵苣提取物有很強(qiáng)的促黑色素生成作用，進(jìn)一步研究其提取物的活性成分后發(fā)現(xiàn)，特定結(jié)構(gòu)的脂肪酸羽扇醇酯有很強(qiáng)的促黑色素生成作用，它們能用于預(yù)防和改善白發(fā)、美黑皮膚，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明包括由山萵苣提取物、或者以下通式
(式中，R表示碳原子數(shù)12～22的酰基)表示的脂肪酸羽扇醇酯或其異構(gòu)體構(gòu)成的促黑色素生成劑。
此外，本發(fā)明還包括含有所述山萵苣提取物、或含有以下通式
(式中，R表示碳原子數(shù)12～22的?；?表示的脂肪酸羽扇醇酯和/或其異構(gòu)體作為有效成分的促黑色素生成劑。
所述促黑色素生成劑中，所述通式所表示的脂肪酸羽扇醇酯中的R較好是碳原子數(shù)14～18的?；?。更好是含有飽和烴的碳原子數(shù)14～18的?；?，特別好是十六烷?；?br> 此外，本發(fā)明還包括含有所述促黑色素生成劑的促黑色素生成組合物。
此外，本發(fā)明還包括含有上述山萵苣提取物、或者以下通式
(式中，R表示碳原子數(shù)12～22的?；?表示的脂肪酸羽扇醇酯和/或其異構(gòu)體的促黑色素生成組合物。
所述促黑色素生成組合物中，所述通式所表示的脂肪酸羽扇醇酯中的R較好是碳原子數(shù)14～18的酰基。更好是含有飽和烴的碳原子數(shù)14～18的?；貏e好是十六烷?；?。
所述促黑色素生成組合物可以作為預(yù)防白發(fā)用的組合物或美黑皮膚用的組合物。
所述組合物適合用作包括的非藥品類的化妝品、醫(yī)藥品或食品。
采用本發(fā)明可得到新型的促黑色素生成劑及具有促黑色素生成作用的組合物。特別是，可得到通過(guò)促黑色素生成作用，具有良好的預(yù)防和改善白發(fā)、美黑皮膚效果的化妝品、醫(yī)藥品和食品。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。
本發(fā)明的山萵苣提取物可以使用山萵苣，以植物提取中常用的方法，即通過(guò)溶劑對(duì)山萵苣進(jìn)行提取的方法等得到。
本發(fā)明中所用的山萵苣是菊科萵苣屬(Lactuca indica)的植物。所述山萵苣為一年生草本，廣泛分布于東亞及東南亞，在日本各地也都能發(fā)現(xiàn)。而且是高達(dá)60cm～2m左右的大型植物。所述山萵苣生長(zhǎng)在荒野、河邊、荒廢的旱田、原野中陽(yáng)光充足的地方。9～10月，莖的上部開(kāi)黃白色花。山萵苣的日本名帶“苣”字，但在分類學(xué)上，與同為菊科的苦苣和繼斷菊不同種不同屬。因?yàn)殚_(kāi)非常相似的花，所以被取了相似的名字。山萵苣是長(zhǎng)期以來(lái)被用作家畜的飼料的、安全性很高的植物，但其促黑色素生成作用還不為人所知。
山萵苣的提取部位可以使用整株、葉、莖、根、花和種子等。尤其，從有效性、提取效率等方面考慮，較好是使用整株。此外，獲得提取物時(shí)山萵苣的形態(tài)可采用例如采集的新鮮植株、切碎了的植株、干燥了的植株、干燥后切細(xì)粉碎的植株等，但是并不局限于此，在不破壞本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)，也可以使用其他的形態(tài)。本發(fā)明中，較好是制成干燥、粉末等提取效率高的形態(tài)后，供溶劑提取。
用于提取的溶劑沒(méi)有特別限定，可以例舉例如乙醇、甲醇、異丙醇、1，3-丁二醇等醇類，己烷、庚烷、環(huán)己烷等烴類，乙酸乙酯等酯類，丙酮等酮類，水等，這些溶劑可以單獨(dú)或2種以上混合使用。所述溶劑中，乙醇、甲醇或它們的混合溶劑可以發(fā)揮本發(fā)明的有效性，所以是理想的。
提取時(shí)，可以使用在溶劑中浸滲、溶劑回流等方法。此外，提取溫度沒(méi)有特別限定，在從室溫到常壓下溶劑的沸點(diǎn)的范圍內(nèi)進(jìn)行。提取時(shí)間沒(méi)有特別限定，以任意時(shí)間進(jìn)行。用溶劑提取后，用過(guò)濾或離心分離等方法從提取液中除去提取的殘?jiān)?，通過(guò)除去提取溶劑得到提取物。
本發(fā)明所述的下述通式
所示的脂肪酸羽扇醇酯及其異構(gòu)體的R是碳原子數(shù)12～22的?；?，較好是碳原子數(shù)14～18的?；?。構(gòu)成?；臒N基可以含雙鍵等不飽和鍵，也可以是直鏈狀或分支鏈狀。所述酰基的具體例子可以例舉十二烷?；耐轷；?，十六烷?；?，硬脂酰基，油酰基，異硬脂?；?，二十二烷酰基，亞麻酰基等。本發(fā)明中，R更好是具有飽和烴基的碳原子數(shù)14～18的?；?，所述烴基可以是直鏈狀或分支鏈狀，較好是直鏈狀的。特別好是具有飽和烴基的碳原子數(shù)16的酰基。最好是十六烷酰基。
上述通式表示的脂肪酸羽扇醇酯(以下，簡(jiǎn)稱脂肪酸羽扇醇酯)及其異構(gòu)體可以用例如酰化羽扇醇的方法得到。酰化的方法中以常用的方法進(jìn)行，也可對(duì)含有羽扇醇的植物或其提取物進(jìn)行酯化反應(yīng)。提取物除了以從植物的溶劑提取液中除去溶劑的提取干燥物，即提取物的形態(tài)使用之外，還可以直接使用以溶劑提取得到的提取液的形態(tài)，或者制成以溶劑以任意比例稀釋得到的提取稀釋液或除去任意量的溶劑濃縮的提取濃縮液使用。此外，在不破壞本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)，也可以再進(jìn)行脫臭等操作后使用。
本發(fā)明中，具有十六烷?；鳛樗龅闹舅嵊鹕却减サ腞的十六烷酸羽扇醇酯(以下，簡(jiǎn)稱十六烷酸羽扇醇酯)是所述山萵苣中所含的成分，可以以公知的方法從本發(fā)明的所述山萵苣提取物中分離得到?？梢酝ㄟ^(guò)例如對(duì)山萵苣的提取物反復(fù)進(jìn)行使用柱層析等的分離，分離得到，但并不局限于此。本發(fā)明人第一次發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中的十六烷酸羽扇醇酯存在于山萵苣中。
用于分離所述十六烷酸羽扇醇酯的山萵苣的提取物除了以從植物的溶劑提取液中除去溶劑的提取干燥物，即提取物的形態(tài)使用之外，還可以直接使用以溶劑提取得到的提取液的形態(tài)，或者制成以溶劑以任意比例稀釋得到的提取稀釋液或除去任意量的溶劑濃縮的提取濃縮液使用。此外，在不破壞本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)，也可以再進(jìn)行脫臭等操作后使用。
本發(fā)明中優(yōu)選使用的十六烷酸羽扇醇酯，除了從所述的山萵苣提取外，也可以通過(guò)例如從除山萵苣外的含有十六烷酸羽扇醇酯的植物中分離等其他方法得到。
本發(fā)明所述的山萵苣提取物和脂肪酸羽扇醇酯及其異構(gòu)體，如后所述，具有良好的促黑色素生成作用。因此，可以將它們用作促黑色素生成劑。該促黑色素生成劑是基于所發(fā)現(xiàn)的山萵苣提取物和脂肪酸羽扇醇酯及其異構(gòu)體的所述新功能的新的應(yīng)用，并通過(guò)含有山萵苣提取物或脂肪酸羽扇醇酯和/或其異構(gòu)體作為有效成分發(fā)揮作為促黑色素生成劑的作用。所述促黑色素生成劑具有促進(jìn)黑色細(xì)胞中的黑色素生成，預(yù)防或改善白發(fā)、即美黑頭發(fā)，使皮膚變成褐色等功能。
本發(fā)明的促黑色素生成劑的應(yīng)用范圍極廣，可以應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。所述領(lǐng)域可以列舉例如包括非藥品類的化妝品、藥品、食品等，這些是理想的。
應(yīng)用本發(fā)明的促黑色素生成劑時(shí)，山萵苣提取物和脂肪酸羽扇醇酯及其異構(gòu)體的使用形式，在山萵苣提取物中，除了以從植物的溶劑提取液中除去溶劑的提取干燥物，即提取物的形態(tài)使用之外，還可以直接使用以溶劑提取得到的提取液的形態(tài)，或者制成以溶劑以任意比例稀釋得到的提取稀釋液或除去任意量的溶劑濃縮的提取濃縮液使用。此外，在不破壞本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)，也可以再進(jìn)行脫臭(脫臭物)、純化(純化物)等操作后使用。另外，也可用溶劑以任意濃度溶解干燥物后制成提取干燥物的溶液使用。此外，還可使用柱層析等純化，制成分離物、甚至活性成分使用。
此外，脂肪酸羽扇醇酯及其異構(gòu)體，可以以含有脂肪酸羽扇醇酯和/或其異構(gòu)體作為有效成分的、而且含有能有效發(fā)揮促黑色素生成作用的濃度的脂肪酸羽扇醇酯和/或其異構(gòu)體的植物或其提取物的形式使用。只要滿足所述條件，該提取物可以是以下的任意一種形態(tài)溶劑提取液的形態(tài)、其濃縮液、通過(guò)純化提取物(提取液)制成含有脂肪酸羽扇醇酯和/或其異構(gòu)體的任意的分離物。
本發(fā)明的促黑色素生成劑作為促黑色素生成的成分配制成組合物中，可以形成具有促黑色素生成作用的新的、有用的組合物，即促黑色素生成組合物。所述本發(fā)明中的促黑色素生成組合物對(duì)毛發(fā)和皮膚作用特別明顯。在毛發(fā)中，使毛發(fā)變黑，可以用作預(yù)防白發(fā)用的組合物。此外，在皮膚中，使皮膚變黑(變棕色)，可以用作美黑皮膚用的組合物。所述組合物沒(méi)有特別限定，可以是任意的，可以例舉例如包括非藥品類的化妝品、醫(yī)藥品、食品等，這些是理想的。具體的組合物可以例舉促黑色素生成用化妝品、促黑色素生成用醫(yī)藥品、促黑色素生成用的食品、預(yù)防白發(fā)用的化妝品、預(yù)防白發(fā)用的醫(yī)藥品、預(yù)防白發(fā)用的食品、美黑皮膚用的化妝品、美黑皮膚用的醫(yī)藥品、美黑皮膚用的食品等。
將本發(fā)明的促黑色素生成劑配制成組合物從而得到促進(jìn)黑色素生成組合物時(shí)，山萵苣提取物(由提取干燥物換算)和脂肪酸羽扇醇酯及其異構(gòu)體的含量根據(jù)用途、劑型、配制目的等而不同，但一般較好為組合物總量的0.00001～20重量％，更好為0.0001～10重量％。
關(guān)于作為醫(yī)藥品時(shí)的給藥量，根據(jù)患者的年齡及體重、給藥方式、病情的進(jìn)展及同時(shí)進(jìn)行的治療可以適當(dāng)改變，沒(méi)有特別限定，但一般可以以每天1～10ml(液體)或1～20mg(膏狀，軟膏狀)左右，每天分1次或2～3次給藥，但并不局限于此。
本發(fā)明所述的促黑色素生成組合物中的化妝品、醫(yī)藥品、食品等中，在不破壞本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)，可以添加化妝品、醫(yī)藥品、食品中常用的其他成分。
例如，作為化妝品相關(guān)的其他成分，其中所含的具體成分有同時(shí)具有多種的情況，可以例舉例如油性成分、表面活性劑、保濕劑、多元醇、增粘劑、水溶性高分子、被膜形成劑、水不溶性高分子、粉末、顏料、染料、沉淀色料、低級(jí)醇、紫外線吸收劑、金屬離子螯合劑、有機(jī)胺類、pH調(diào)節(jié)劑、藥效成分、糖類、其他毛發(fā)或皮膚美黑成分、防腐劑、抗氧化劑、香料、水等。
油性成分可以例舉例如荷荷芭油(Jojoba oil)、橄欖油、鱷梨油、蓖麻油、椰子油、牛脂、硬化油等天然油脂及其衍生物，液狀羊毛脂、巴西棕櫚蠟、蜂蠟、羊毛脂等蠟類，液態(tài)石蠟、三十碳烷、凡士林、微晶臘、固態(tài)石蠟等烴類，硬脂酸、二十二烷酸等高級(jí)脂肪酸類，十六烷醇、硬脂醇、十六/十八混合醇(cetostearyl alcohol)等高級(jí)脂肪醇類，三辛酸甘油酯、十四烷酸異丙酯、蘋果酸二異硬脂醇酯、2-三乙基己酸甘油酯、二異硬脂酸二甘油酯、2-三乙基己酸三羥甲基丙酯、三辛酸三羥甲基丙酯、癸二酸2-二乙基己酯等酯類，二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、十甲基環(huán)戊硅氧烷等硅油類等。
粉末成分可以例舉例如滑石、云母、高嶺土、二氧化硅、鋅白、云母鈦、氧化鈦、氧化鐵、尼龍粉末等。
表面活性劑可以例舉例如聚環(huán)氧乙烷(以下簡(jiǎn)稱POE)烷基醚、POE脂肪酸酯、POE山梨糖醇酐脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯、POE硬化蓖麻油、POE山梨糖醇脂肪酸酯、聚環(huán)氧烷改性聚硅氧烷等非離子型表面活性劑、十六烷酸鈉等陰離子表面活性劑，氯化硬脂酰三甲基銨等陽(yáng)離子表面活性劑，甜菜堿、氨基甜菜堿、咪唑啉化合物、磺基甜菜堿等兩性表面活性劑。
保濕劑的例子可以例舉甘油、1，3-丁二醇、聚乙二醇(以下簡(jiǎn)稱PEG)、一縮二丙二醇、山梨糖醇等。
增粘劑的例子可以例舉聚羧基乙烯、羧甲基纖維素、聚乙烯醇等水溶性高分子、膨潤(rùn)土等礦物質(zhì)粘土。
紫外線吸收劑的例子可以例舉對(duì)氨基苯甲酸(以下簡(jiǎn)稱PABA)、PABA甘油酯、PABA乙基二羥基丙酯、甲氧基肉桂酸辛酯、對(duì)甲氧基肉桂酸-2-乙氧基乙酯、2，4-二羥基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4-甲基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4-甲基二苯甲酮磺酸鹽、咪唑丙烯酸乙酯、2-苯基-5-甲基苯并唑、4-甲氧基-4-叔丁基二苯酰甲烷、對(duì)甲氧基肉桂酸乙基己酯等。
金屬離子螯合劑的例子可以例舉乙二胺四乙酸四鈉、檸檬酸等。低級(jí)醇的例子可以例舉乙醇等。有機(jī)胺類的例子可以例舉乙醇胺、三乙醇胺等。pH調(diào)節(jié)劑的例子可以例舉乳酸-乳酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉等緩沖劑。
藥效成分的例子可以例舉泛酰乙醚(pantotenyl-ethyl ether)、甘草次酸鹽(glycyrrhetinic acid)、煙酸酯等?？寡趸瘎┑睦涌梢岳e維生素E類、二丁基羥基甲苯、沒(méi)食子酸丙酯等。
糖類的例子可以例舉赤蘚醇、蔗糖、透明質(zhì)酸等。防腐劑的例子可以例舉對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、苯甲酸鈉等。另外，還可以從后述醫(yī)藥品和食品中能夠添加的成分中選擇添加。
接著，作為醫(yī)藥品相關(guān)的其他成分，其中所含的具體成分有同時(shí)具有多種的情況，可以例舉例如賦形劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、稀釋劑、載體、助溶劑、調(diào)味劑、保存劑、芳香劑、著色劑、糖衣劑等各種添加成分和水等。這些添加成分的具體例子可以例舉淀粉、乳糖等糖類，硫酸鎂、滑石、明膠、羥丙基纖維素等纖維素衍生物，大豆油和芝麻油等植物油、動(dòng)物油或合成油，樹(shù)膠類，乙醇、1，3-丁二醇、聚亞烷基二醇(poly alkylene glycol)等醇類。另外，還可以從上述化妝品和后述食品中能夠添加的成分中選擇添加。
接著，作為食品相關(guān)的其他成分，其中所含的具體成分有同時(shí)具有多種的情況，可以例舉例如甜味劑、酸味劑、保存劑、香料、著色劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、稀釋劑、載體等各種添加成分和水等。這些添加成分的具體例子可以例舉例如人參提取液、生姜提取液、蜂蜜等各種提取液，環(huán)狀低聚糖，還原麥芽糖、海藻糖、乳糖、蔗糖脂肪酸酯等糖類。另外，可以從上述的化妝品和藥品中能夠添加的成分中選擇添加。
本發(fā)明中的所述組合物可配制成各種形式的制劑。
例如，化妝品可以在例如乳膏、洗液、乳液、軟膏劑、溶液、化妝水、凝膠、泡沫、精華液(美容液)、粉底、面膜、噴霧等的很廣的范圍內(nèi)適用。
此外，化妝品的劑型可采用溶液類、可溶化類、乳化類、粉末類、粉末分散類、油液類、凝膠類、軟膏類、噴霧類、泡沫類、唇膏類、水-油2層類、水-油-粉末3層類等多種劑型。
此外，醫(yī)藥品可采用口服或非口服給藥方式，可以采用分別相應(yīng)的醫(yī)藥制劑的形態(tài)。醫(yī)藥制劑可以例舉例如液型型、糖漿劑型、注射劑型、液體吸入劑型、乳劑型等液狀劑型，片劑型、粉劑型、顆粒劑型、膠囊劑型、軟膏劑型、固體吸入劑型、栓劑型等固體劑型等。
此外，作為食品，可用于所謂功能性食品，可以作為例如點(diǎn)心、清涼飲料等飲料、蔬菜或水果加工制品、畜肉制品、調(diào)味品等廣泛適用。其形態(tài)有粉末、固態(tài)制品、溶液等。
本發(fā)明的所述組合物特別適合用作化妝品、醫(yī)藥品等外用制劑。例如，預(yù)防白發(fā)的組合物較好是以例如乳膏、洗液、乳液、軟膏、溶液、凝膠、噴霧、泡沫等形式，制成發(fā)膏、養(yǎng)發(fā)素(hair tonic)、整發(fā)水、洗發(fā)液(hair rinse)、洗發(fā)香波、焗油膏(hair treatment)、護(hù)發(fā)素(hair conditioner)等產(chǎn)品。美黑皮膚的組合物較好是以例如乳膏、洗液、乳液、軟膏劑、凝膠物、面膜、泡沫、溶液、精華液、唇膏、粉末等形式制成產(chǎn)品。
本發(fā)明的所述組合物可以按常規(guī)方法配制成任意的形式、劑型。
以下，例舉實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明。組合物的添加量中，沒(méi)有特別說(shuō)明的均為重量％。
將山萵苣的全草冷凍干燥，用纖維粉碎器(fiber mixer)粉碎。向10g該粉末中加入100ml甲醇，室溫下靜置30分鐘后提取。提取后，通過(guò)過(guò)濾、減壓干燥得到0.26g提取粉末(提取干燥物)。
將山萵苣的全草冷凍干燥，用纖維粉碎器粉碎。向300g該粉末加入3L甲醇，室溫下靜置90分鐘，將其濾液減壓干燥得到提取粉末。過(guò)濾后的山萵苣粉末中再加入3L甲醇，室溫下靜置90分鐘，將其濾液減壓干燥再次得到提取粉末。重復(fù)該提取操作5次，一共得到33.7g提取粉末。
接著，用氯仿∶甲醇∶水＝4∶4∶3的體積比的溶劑體系進(jìn)行分配萃取，從氯仿層(下層)中得到13.6g干燥物。對(duì)該干燥品用4階段的硅膠柱層析分離、純化。即，各階段中收集有活性的部分并干燥，再進(jìn)行下一階段層析。所用的溶劑體系依次為氯仿∶甲醇＝5∶1，正己烷∶乙酸乙酯＝5∶1，正己烷∶乙酸乙酯＝20∶1和正己烷∶氯仿＝10∶1。最后分離得到99.4mg末鑒定的活性化合物。
用1H-NMR(400MHz，

圖1)和13C-NMR(100MHz，圖2)分析所述化合物，鑒定為羽扇醇。此外，用高分辨率EI-MS分析(表1)，分子量664.6125和665.6163的位置檢測(cè)出明顯的峰值。該數(shù)據(jù)與根據(jù)羽扇醇的C-3位置上結(jié)合十六烷酸而成的化合物十六烷酸羽扇醇酯的分子式C46H80O2計(jì)算得到的分子量(碳原子都是12C時(shí))664.6158即一個(gè)碳原子為13C時(shí)的分子量665.6192非常接近。結(jié)合旋光度測(cè)定、IR光譜測(cè)定的結(jié)果，知道所述化合物是羽扇醇的C-3位置上結(jié)合脂肪酸而成的酯，認(rèn)為是十六烷酸羽扇醇酯。再堿水解所述化合物的酯鍵，并用FID-GC分析游離的脂肪酸，鑒定為十六烷酸。此外，用硅膠柱層析純化三萜稀部分，用NMR等也確認(rèn)為羽扇醇。


根據(jù)以上分析，得到的化合物鑒定為十六烷酸羽扇醇酯。
實(shí)施例1促進(jìn)黑色素生成效果-1用以下方法評(píng)價(jià)B16黑素瘤細(xì)胞中的促黑色素生成作用。
(方法)將從小鼠黑素瘤細(xì)胞株B16中篩選、建立的黑素細(xì)胞刺激激素高感受性細(xì)胞株B16 2F2，使用含10％牛胎血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基在37℃、5％/空氣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。用胰蛋白酶分離預(yù)先培養(yǎng)的B16 2F2細(xì)胞，回收、計(jì)數(shù)，用于以下的培養(yǎng)。將前述制備例1中制備的山萵苣提取物或蒲公英根提取物(用與山萵苣相同方法處理從ウチダ和漢藥株式會(huì)社購(gòu)買的蒲公英根得到的提取粉末)配制成濃度為20mg/ml的甲醇溶液，并按下述方式添加到培養(yǎng)基中。
向B16 2F2細(xì)胞(1×105細(xì)胞/ml)的培養(yǎng)液中添加并混合山萵苣的提取物或蒲公英根提取物，使其濃度為20μg/ml，在24孔培養(yǎng)板(0.5ml/孔)中培養(yǎng)72小時(shí)后，用于測(cè)定細(xì)胞數(shù)和黑色素含量。B16 2F2細(xì)胞的黑色素含量，通過(guò)在向4孔培養(yǎng)板內(nèi)添加1N NaOH溶液(300μl/孔)，室溫下放置60分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的黑色素溶解，測(cè)定470nm的吸收，從而定量。作為對(duì)照，用相同量的甲醇代替山萵苣的提取物或蒲公英根提取物添加，同樣地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示。
(結(jié)果)由圖3可知，山萵苣的提取物與蒲公英根提取物相比，使B16 2F2細(xì)胞誘導(dǎo)約3倍的黑色素。即使增加蒲公英根提取物的添加量時(shí)，黑色素的生成量也幾乎沒(méi)有改變。
實(shí)施例2促黑色素生成效果-2[B16黑素瘤細(xì)胞中的促黑色素生成作用](方法)和實(shí)施例1相同，使用小鼠黑素瘤細(xì)胞B16 2F2評(píng)價(jià)十六烷酸羽扇醇酯的促黑色素生成作用。用制備例2中分離得到的十六烷酸羽扇醇酯代替實(shí)施例1中使用的山萵苣提取物，以10μM、20μM或30μM的濃度添加到培養(yǎng)基中。其結(jié)果如圖4所示。
(結(jié)果)由圖4可知，十六烷酸羽扇醇酯強(qiáng)烈地誘導(dǎo)B16 2F2細(xì)胞中黑色素的生成。
以下，例舉以常用方法制備的各種配方的組合物的實(shí)施例。配方成分中的山萵苣提取物，除有特殊說(shuō)明外，均為所述制備例1中得到的山萵苣提取物(提取干燥物)。山萵苣全草的乙醇提取物也是按所述制備例的方法制備的。此外，所有的實(shí)施例中都顯示出良好的促黑色素生成效果，在用于毛發(fā)時(shí)，表現(xiàn)出防止毛發(fā)變白，對(duì)白發(fā)有改善白發(fā)的效果，用于皮膚時(shí)，表現(xiàn)出美黑皮膚的效果。
實(shí)施例3乳膏成分 配比量(重量％)硬脂醇 6.0硬脂酸 2.0含水羊毛脂 4.0三十碳烷 9.0辛基十二烷醇 10.01，3-丁二醇6.0PEG15004.0POE(25)十六烷醇醚 3.0一硬脂酸甘油酯 2.0山萵苣提取物 5.0防腐劑 適量抗氧化劑 適量香料 適量離子交換水 余量實(shí)施例4乳膏成分 配比量(重量％)硬脂醇 6.0硬脂酸 2.0含水羊毛脂 4.0三十碳烷 9.0辛基十二烷醇 10.01，3-丁二醇6.0PEG15004.0POE(25)十六烷醇醚 3.0
一硬脂酸甘油酯2.0十六烷酸羽扇醇酯 0.003防腐劑適量抗氧化劑 適量香料 適量精制水余量實(shí)施例5乳液成分 配比量(重量％)硬脂酸2.0十六烷醇 1.5凡士林4.0三十碳烷 5.0三辛酸甘油酯 2.0山梨糖醇酐一油酸酯2.0甘油 5.0PEG1500 3.0三乙醇胺 1.0山萵苣提取物 0.08防腐劑適量抗氧化劑 適量香料 適量精制水余量實(shí)施例6凝膠成分配比量(重量％)雙丙甘醇 7.0PEG1500 8.0聚羧基乙烯0.4甲基纖維素0.2
POE(25)油醚1.0氫氧化鉀 0.1山萵苣提取物 1.0防腐劑 適量抗氧化劑 適量螯合劑 適量香料 適量精制水 余量實(shí)施例7凝膠成分 配比量(重量％)雙丙甘醇 7.0PEG15008.0聚羧基乙烯 0.4甲基纖維素 0.2POE(25)油醚1.0氫氧化鉀 0.1十六烷酸羽扇醇酯 0.1防腐劑 適量抗氧化劑 適量螯合劑 適量香料 適量精制水 余量實(shí)施例8洗液成分 配比量(重量％)1，3-丁二醇6.0甘油 4.0異硬脂醇 0.1透明質(zhì)酸鈉 0.3
POE(20)山梨糖醇酐一十二烷酸酯 0.5POE(20)十二烷醚0.5乙醇 10.0山萵苣全草的乙醇提取液 0.5(以提取干燥物重量計(jì))防腐劑 適量抗氧化劑 適量香料 適量精制水 余量實(shí)施例9洗液成分 配比量(重量％)1，3-丁二醇6.0甘油 4.0異硬脂醇 0.1透明質(zhì)酸鈉 0.3POE(20)山梨糖醇酐一十二烷酸酯 0.5POE(20)十二烷醚0.5乙醇 10.0十六烷酸羽扇醇酯 0.5防腐劑 適量抗氧化劑 適量香料 適量精制水 余量實(shí)施例10發(fā)膏成分 配比量(重量％)液態(tài)石蠟 15.0凡士林 15.0蜂蠟 2.0
聚羧基乙烯0.1氧雜蒽樹(shù)膠0.11，3-丁二醇 5.0POE(20)一二十二烷醚 2.0POE(40)四油酸山梨糖醇酯 1.0山萵苣提取物 4.0防腐劑適量抗氧化劑 適量香料 適量精制水余量實(shí)施例11護(hù)發(fā)洗液(hair treatment lotion)成分 配比量(重量％)甘油 2.01，3-丁二醇1.0氯化硬脂酰三甲基銨 0.5甲基苯基聚硅氧烷 1.0膠原蛋白水解產(chǎn)物 1.0乙醇 50.0山萵苣提取物 0.1精制水 余量香料 適量實(shí)施例12護(hù)發(fā)洗液成分配比量(重量％)甘油2.01，3-丁二醇 1.0氯化硬脂酰三甲基銨 0.5甲基苯基聚硅氧烷1.0膠原蛋白水解產(chǎn)物1.0
乙醇50.0十六烷酸羽扇醇酯0.5精制水 余量香料適量實(shí)施例13養(yǎng)發(fā)素成分配比量(重量％)乙醇70.0POE(60)硬化蓖麻油 0.5L-薄荷醇0.05乙酸dl-α-維生素E 0.05甘草次酸二鈣0.051，3-丁二醇 0.5甘油0.5山萵苣全草的乙醇提取液 1.5(以提取干燥物重量計(jì))精制水 余量香料適量實(shí)施例14養(yǎng)發(fā)素成分配比量(重量％)乙醇70.0POE(60)硬化蓖麻油 0.5L-薄荷醇0.05乙酸dl-α-維生素E 0.05甘草次酸二鈣0.051，3-丁二醇 0.5甘油0.5十六烷酸羽扇醇酯0.5精制水 余量香料適量實(shí)施例15生發(fā)劑成分配比量(重量％)乙醇60.0日扁柏醇適量當(dāng)藥提取物 適量維生素B6適量維生素E衍生物 適量1，3-丁二醇 2.0甘油0.5POE(60)硬化蓖麻油 0.5山萵苣提取物0.5精制水 余量香料適量實(shí)施例16生發(fā)劑成分配比量(重量％)乙醇60.0日扁柏醇適量當(dāng)藥提取物 適量維生素B6適量維生素E衍生物 適量1，3-丁二醇 2.0甘油0.5POE(60)硬化蓖麻油 0.5十六烷酸羽扇醇酯3.0精制水 余量香料適量實(shí)施例17口服液成分 配比量(30ml中)山萵苣全草的乙醇提取干燥物 0.085mg人參提取液 50mg冬蟲(chóng)夏草提取液 100mg生姜提取液 300mg蜂蜜 150mg環(huán)狀低聚糖 300mg甜味劑 適量酸味劑 適量保存劑 適量香料 適量水 余量實(shí)施例18口服液成分 配比量(30ml中)山萵苣全草的乙醇提取干燥物 0.5mg人參提取液 50mg冬蟲(chóng)夏草提取液 100mg生姜提取液 300mg蜂蜜 150mg環(huán)狀低聚糖 300mg甜味劑 適量酸味劑 適量保存劑 適量香料 適量水 余量實(shí)施例19口服液成分配比量(30ml中)十六烷酸羽扇醇酯0.05mg人參提取液 50mg冬蟲(chóng)夏草提取液 100mg生姜提取液 300mg蜂蜜150mg環(huán)狀低聚糖 300mg甜味劑 適量酸味劑 適量保存劑 適量香料適量水 余量實(shí)施例20食品片劑成分配比量(300mg中)山萵苣全草的乙醇提取干燥物 0.025mg還原麥芽糖 87.8mg海藻糖 41.2mg乳糖16.5mg蔗糖脂肪酸酯6.2mg糊精148.275mg實(shí)施例21食品片劑成分配比量(300mg中)山萵苣全草的乙醇提取干燥物 0.5mg還原麥芽糖 87.8mg海藻糖 41.2mg乳糖16.5mg蔗糖脂肪酸酯6.2mg糊精147.8mg
實(shí)施例22食品片劑成分配比量(300mg中)十六烷酸羽扇醇酯0.05mg還原麥芽糖 87.8mg海藻糖 41.2mg乳糖16.5mg蔗糖脂肪酸酯6.2mg糊精147.8mg產(chǎn)業(yè)上利用的可能性可以得到新的促黑色素生成劑和具有促進(jìn)黑色素生成作用的組合物，尤其可應(yīng)用于通過(guò)促黑色素生成作用，具有良好的預(yù)防和改善白發(fā)、美黑皮膚的效果的化妝品、醫(yī)藥品和食品等。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明[圖1]圖1是十六烷酸羽扇醇酯的1H-NMR圖譜。
圖2是十六烷酸羽扇醇酯的13C-NMR圖譜。
圖3是山萵苣提取物的促黑色素生成效果的示意圖。
圖4是十六烷酸羽扇醇酯的促黑色素生成效果的示意圖。
權(quán)利要求
1.促黑色素生成劑，其特征在于，所述促黑色素生成劑由山萵苣提取物構(gòu)成。
2.促黑色素生成劑，其特征在于，所述促黑色素生成劑含有山萵苣提取物作為有效成分。
3.促黑色素生成劑，其特征在于，所述促黑色素生成劑由以下通式 表示的脂肪酸羽扇醇酯或其異構(gòu)體構(gòu)成，式中，R表示碳原子數(shù)12～22的?；?br> 4.促黑色素生成劑，其特征在于，所述促黑色素生成劑含有以下通式 表示的脂肪酸羽扇醇酯和/或其異構(gòu)體作為有效成分，式中，R表示碳原子數(shù)12～22的?；?。
5.如權(quán)利要求3或4所述的促黑色素生成劑，其特征還在于，R是碳原子數(shù)14～18烷?；?br> 6.如權(quán)利要求3或4所述的促黑色素生成劑，其特征還在于，R是具有飽和烴基的碳原子數(shù)14～18的酰基。
7.如權(quán)利要求3或4所述的促黑色素生成劑，其特征還在于，R是十六烷?；?。
8.促黑色素生成用組合物，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求1～7中所述的任一種促黑色素生成劑。
9.促黑色素生成用組合物，其特征在于，所述組合物含有山萵苣提取物。
10.促黑色素生成用組合物，其特征在于，所述組合物含有以下通式 表示的脂肪酸羽扇醇酯和/或其異構(gòu)體，式中，R表示碳原子數(shù)12～22的?；?br> 11.如權(quán)利要求10所述的促黑色素生成用組合物，其特征還在于，R是碳原子數(shù)14～18的?；?。
12.如權(quán)利要求10所述的促黑色素生成用組合物，其特征還在于，R是具有飽和烴基的碳原子數(shù)14～18的酰基。
13.如權(quán)利要求10所述的促黑色素生成用組合物，其特征還在于，R是十六烷?；?br> 14.如權(quán)利要求8～13中的任一項(xiàng)所述的促黑色素生成用組合物，其特征還在于，所述組合物為預(yù)防白發(fā)用組合物。
15.如權(quán)利要求8～13中的任一項(xiàng)所述的促黑色素生成用組合物，其特征還在于，所述組合物為美黑皮膚用組合物。
16.如權(quán)利要求8～15中的任一項(xiàng)所述的促黑色素生成用組合物，其特征還在于，所述組合物為化妝品、醫(yī)藥品或食品。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供促進(jìn)黑色素生成作用良好、可以預(yù)防和改善白發(fā)與美黑皮膚的物質(zhì)及有效應(yīng)用該物質(zhì)的組合物。解決課題的途徑有，含有山萵苣提取物、或者脂肪酸羽扇醇酯和/或其異構(gòu)體作為有效成分的促黑色素生成劑。還有含有山萵苣提取物、或者脂肪酸羽扇醇酯和/或其異構(gòu)體作為有效成分的促黑色素生成組合物。所述促黑色素生成組合物作為預(yù)防白發(fā)用的組合物或美黑皮膚用的組合物，適合用于化妝品、醫(yī)藥品或食品中。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1784215SQ200480012349
公開(kāi)日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月14日
發(fā)明者坂本賢二, 向山俊之, 畠惠司, 堀一之, 高橋砂織 申請(qǐng)人:坂本生物科技有限公司, 秋田縣