專利名稱：一種丹參寡糖及其在抗艾滋病、調(diào)節(jié)免疫和升白細(xì)胞中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丹參寡糖混合物及其和有效部位及其制備方法和及其在抗艾滋病、免疫調(diào)節(jié)及升白細(xì)胞中的用途。
背景技術(shù)：
艾滋病以難以遏制的速度在全球范圍迅速蔓延，為21世紀(jì)人類面臨的最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。至今雖有20種抗HIV的藥物及高效抗逆轉(zhuǎn)錄的聯(lián)合療法，成功地降低了艾滋病病毒血漿病毒載量，升高CD4細(xì)胞，重建免疫功能，推遲發(fā)病，延長(zhǎng)生命和減少死亡，但因產(chǎn)生耐藥性和毒副作用，尚不能顯著提高機(jī)體的免疫功能，不能治愈病人，控制流行。目前趨勢(shì)向在聯(lián)合治療中增加免疫藥物如白介素2和干擾素等，但因出現(xiàn)毒副反應(yīng)，而限制其應(yīng)用。丹參長(zhǎng)期以來(lái)，丹參在臨床用于治療心腦血管疾病和肝炎。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)丹參寡糖混合物及其有效部位具有抗艾滋病病毒，、免疫調(diào)節(jié)和升高白細(xì)胞等藥功效，對(duì)免疫低下或白細(xì)胞減低的艾滋病病毒和機(jī)會(huì)性感染、乙型肝炎、心肌炎以及其他血液病和腫瘤等疾病可提高治療效果，有望發(fā)展成為有廣泛用途的新型藥物。
中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所陳鴻珊等于1989年發(fā)現(xiàn)丹參(Salviamiltiorrhiza)水提取物具有抗艾滋病病毒和乙型肝炎病毒的作用。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)艾滋病毒有抑制作用，小鼠及猴口服可抑制鼠白血病及猴艾滋病病毒感染，在2155細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制乙型肝炎病毒，并證明丹參素能抑制艾滋病病毒，于2000年獲中國(guó)專利(專利號(hào)ZL95105902.5)。該所陳鴻珊與美國(guó)Johns Hopkins大學(xué)合作發(fā)現(xiàn)丹參抗艾滋病病毒抑制HIV整合酶的成分紫草酸和紫草酸B，已于2002年申請(qǐng)國(guó)際專利(WO 02/26726)；該所2002年又發(fā)現(xiàn)迷迭香酸苷抑制艾滋病病毒及其整合酶，已于2003年12月申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)?00310117349.5)；至今自從丹參中已分離獲得了多種單體化合物，其中涉及水溶性物質(zhì)以如酚酸性化合物，如丹參素、咖啡酸、丹酚酸A～H以及紫草酸和迷迭香酸等及其聚合物和衍生物，對(duì)其制備工藝、抗心腦血管疾和肝炎的專利很多。對(duì)丹參注射液，復(fù)方膠囊等在小鼠體內(nèi)和臨床病人的免疫調(diào)節(jié)作用也有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。此外，還有不少關(guān)于合成寡糖類化合物具有抗艾滋病、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的報(bào)告和專利，其中2004年青島海洋研究院的專利闡述了系自從抗艾滋病病毒海藻多糖911中提取的寡糖具有抑制艾滋病病毒作用。但是迄今未見(jiàn)丹參寡糖及其有效部位抑制抗艾滋病病毒、免疫調(diào)節(jié)及升白細(xì)胞的有關(guān)報(bào)道和專利。
本發(fā)明制備了丹參有效部位A和B，分離鑒定了有效成分丹參寡糖混合物，其分子質(zhì)量數(shù)分別為504、666和944，其混合物含有甘露糖，半乳糖和葡萄糖三種糖基，其相對(duì)摩爾比為甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖為1∶8∶7。本發(fā)明對(duì)其藥理活性試驗(yàn)表明丹參寡糖混合物及其有效部位能抑制艾滋病病毒整合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活性及病毒復(fù)制，小鼠口服和腹腔注射后，血清有抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和升高白細(xì)胞作用。本發(fā)明的目的之一是提供抗艾滋病，免疫調(diào)節(jié)和升高白細(xì)胞的丹參寡糖及其有效部位和及其制備工藝；本發(fā)明的目的之二是提供丹參寡糖及其有效部位在制備抗艾滋病等病毒、提高免疫和升白細(xì)胞藥物中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所說(shuō)的丹參寡糖混合物，其分子質(zhì)量數(shù)分別為504、666和944，其混合物含有甘露糖，半乳糖和葡萄糖三種糖基，其相對(duì)摩爾比為甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖為1∶8∶7。
本發(fā)明所說(shuō)的丹參寡糖及其有效部位的制備方法，主要包括以下步驟A.水浸提取粗提物；B.粗提物經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱層析分離純化，獲取總有效部位A；C.有效部位的進(jìn)一步分離與純化，獲得有效部位B；D.進(jìn)一步純化后獲得有效成分丹參寡糖混合物。
步驟一水浸提取粗提物提取過(guò)程是把丹參根粉碎，采用無(wú)鹽水浸漬法，滲濾法提取，自然沉淀、離心或過(guò)濾方法初步除去固體雜質(zhì)，獲取粗提液。粗提液減壓濃縮后，干燥獲取粗提物。
步驟二大孔吸附樹(shù)脂柱層析純化分離獲取有效部位A采用填料制備色譜柱，填料為X-5，SP825，HP20等大孔吸附樹(shù)脂。
1)色譜柱活化采用水、稀酸水、稀酸性緩沖液充分洗滌、溶脹和平衡；2)把粗提液加入柱頂，用無(wú)鹽水洗滌后，用低級(jí)醇水解吸，收集解吸液。解吸液減壓濃縮、冷凍或噴霧干燥，獲有效部位A。
步驟三有效部位A分離與純化獲得有效部位B取有效部位A，用無(wú)鹽水溶解后，再用乙醇沉淀，沉淀部分用無(wú)鹽水溶解后上凝膠樹(shù)脂如sephadex LH-20進(jìn)行柱層析，無(wú)鹽水洗脫，分份收集，TLC檢查，相同部分合并。洗脫液減壓濃縮、冷凍或噴霧干燥，獲得有效部位B。
步驟四有效部位B分離與純化獲得丹參寡糖混合物有效部位B溶解后上sephadex G-50凝膠樹(shù)脂等進(jìn)行柱層析，無(wú)鹽水洗脫，分份收集，F(xiàn)eCl3和蒽酮試驗(yàn)檢查，相同部分合并。洗脫液減壓濃縮、冷凍或噴霧干燥，獲得丹參寡糖混合物。
有效部位和丹參寡糖混合物的鑒別有效部位A和B為棕黃色粉未，F(xiàn)eCl3試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)，蒽酮試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)，莫利希試驗(yàn)呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，而斐林試劑法檢測(cè)反應(yīng)為陰性反應(yīng)，茚三酮顯色反應(yīng)為陰性反應(yīng)。
丹參寡糖混合物也為棕黃色粉未，F(xiàn)eCl3試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)(藍(lán)褐色)，蒽酮試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)(棕藍(lán)色)。
經(jīng)MALDI-TOF MS測(cè)定，丹參寡糖混合物為一混合物，含有分子量分別為504，666和944的物質(zhì)(圖1)。紅外光譜分析，含有糖羥基成分(圖2)。樣品經(jīng)化學(xué)衍生，進(jìn)行氣相色譜分析顯示，丹參寡糖混合物含有甘露糖，半乳糖和葡萄糖三種糖基，其相對(duì)摩爾比為甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖為1∶8∶7(圖3)。
丹參寡糖混合物及其有效部位A和B抗人類免疫缺陷病毒(HIV)活性1.對(duì)HIV-1整合酶的抑制活性及其作用機(jī)制1.1抑制HIV-1整合酶的總活性將供體底物包被試驗(yàn)板，洗板后加入反應(yīng)緩沖液、不同濃度藥液和標(biāo)定濃度的基因工程HIV整合酶，37℃反應(yīng)1小時(shí)。加入靶底物，混合，37℃反應(yīng)1小時(shí)，洗板。加入BSA(牛血清蛋白)，室溫30分鐘，洗板。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素，室溫反應(yīng)1小時(shí)，洗板。加顯色底物顯色30分鐘，加0.1N NaOH終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀405nm測(cè)定OD值。同時(shí)設(shè)酶對(duì)照和空白對(duì)照，計(jì)算IC50。
1.2抑制HIV-1整合酶3′切割活性測(cè)定將包被了供體底物1的微孔板用PBS洗板2次，再用1×反應(yīng)緩沖液洗一次。分別加入2×反應(yīng)緩沖液、不同稀釋濃度藥液和基因工程HIV整合酶，混勻，37℃反應(yīng)1小時(shí)。PBS洗板，洗去未結(jié)合的酶及藥物。加入1×反應(yīng)緩沖液和靶底物，混勻，37℃水浴繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。后續(xù)步驟同上。
1.3抑制HIV-1整合酶鏈轉(zhuǎn)移活性測(cè)定將包被了供體底物2的微孔板用PBS洗板2次，再用1×反應(yīng)緩沖液洗一次。分別加入2×反應(yīng)緩沖液、水和基因工程HIV整合酶，混勻，37℃水浴反應(yīng)1小時(shí)。洗板，洗去未結(jié)合的酶。加入2×反應(yīng)緩沖液、水和不同濃度藥液，加入靶底物，混勻，37℃水浴繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。后續(xù)步驟同上。
1.4抑制HIV-1整合酶裝配活性測(cè)定將包被了供體底物2的微孔板用PBS洗板2次，再用1×反應(yīng)緩沖液洗一次，分別加入2×反應(yīng)緩沖液、不同濃度的藥液和基因工程HIV整合酶，混勻，37℃水浴反應(yīng)1小時(shí)。洗板，洗去未結(jié)合的酶及藥物，加入1×反應(yīng)緩沖液和靶底物，混勻，37℃水浴繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。后續(xù)步驟同上。
1.5丹參寡糖混合物及其有效部位A、B抑制HIV-1IN的作用結(jié)果見(jiàn)表1表1.丹參寡糖混合物和有效部位A、B抑制HIV-1IN的作用IC50(μg/ml)作用機(jī)制有效部位A 有效部位B 丹參寡糖混合物抑制HIV-1IN總活性2.86±1.99 1.18±0.04 0.89±0.13抑制HIV-1IN 3’-切割活性 - 1.59±0.28 -抑制HIV-1IN鏈轉(zhuǎn)移活性- ＜0.48 -抑制HIV-1IN裝配活性 - 1.79±0-注-為未做此項(xiàng)2.有效部位A、B和丹參寡糖混合物抑制HIV-1RT和PR活性2.13H標(biāo)記檢測(cè)方法測(cè)定提取物抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性將標(biāo)定濃度的基因工程HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(p66/51)、不同濃度的藥液、反應(yīng)緩沖液和3H-dTTP加入后，混合，37℃反應(yīng)30分鐘，0℃終止反應(yīng)。反應(yīng)液滴加于濾紙片上，冷三氯乙酸洗3次，乙醇脫水后烤干。液閃儀測(cè)定cpm值，同時(shí)設(shè)酶對(duì)照、空白對(duì)照和藥物對(duì)照，計(jì)算IC50活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2(RT)。
2.2ELISA檢測(cè)方法測(cè)定提取物抑制HIV蛋白酶活性微孔板加入反應(yīng)緩沖液和底物，加入適量基因工程HIV蛋白酶及不同濃度藥液，混勻，37℃反應(yīng)60分鐘。加DMSO終止反應(yīng)。加入碘乙酸鈉，混勻，37℃反應(yīng)45分鐘。加入Dig-NHS，混勻，37℃反應(yīng)50分鐘。加入甘氨酸中斷反應(yīng)。加入鏈親和素標(biāo)記的96孔板中，同時(shí)加入反應(yīng)緩沖液，混勻，室溫反應(yīng)60分鐘，將底物結(jié)合到酶標(biāo)板上，洗板。加阻斷劑室溫阻斷50分鐘。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體Fab片段，室溫1小時(shí)，洗板。加入底物pNPP顯色，酶標(biāo)儀405nm測(cè)OD值。同時(shí)設(shè)酶對(duì)照、空白對(duì)照和陽(yáng)性藥對(duì)照，計(jì)算IC50。活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2(PR)。
2.3.結(jié)果有效部位A、B和丹參寡糖混合物抑制HIV-1RT和PR活性結(jié)果見(jiàn)表2。
表2有效部位A、B和丹參寡糖混合物抑制HIV-1RT和PR活性IC50(μg/ml)藥物RT PR有效部位A 26.94±4.92＞200有效部位B 13.58±0.69＞200丹參寡糖混合物 11.12±2.50＞200上述體外實(shí)驗(yàn)表明，有效部位A、B和丹參寡糖混合物具有抗HIV整合酶的活性，其作用機(jī)制主要是抑制病毒整合于宿主細(xì)胞染色體的過(guò)程。有效部位A、B和丹參寡糖混合物同時(shí)還有抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
3對(duì)HIV-1在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)HIV-1的效果3.1MTT染色法測(cè)定提取物在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的毒性和對(duì)HIV-1IIIB的抑制作用將MT-4細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，同時(shí)分別加提取藥物或陽(yáng)性藥2倍稀釋共8個(gè)濃度的藥液，每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組。置37℃、5％CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變。加藥后第4天(96小時(shí))后吸棄上清100μl，每孔加10μl5mg/mlMTT染色，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，每孔加入100μl50％DMF-17％Triton X-100脫色液，37℃過(guò)夜，在酶聯(lián)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570nm的OD570nm值，計(jì)算藥物半數(shù)有毒濃度(TC50)。
將MT-4細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒株IIIB培養(yǎng)液，同時(shí)加最大無(wú)毒濃度以下稀釋的不同濃度提取物或陽(yáng)性對(duì)照藥AZT和NVP藥液，在37℃、5％CO2和飽和濕度下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，于第7天用MTT法染色，測(cè)定OD570nm，計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)，并計(jì)算治療指數(shù)(SI)。
3.2結(jié)果有效部位A、B和丹參寡糖混合物在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的毒性和抗HIV-1III的作用見(jiàn)表3。
表3有效部位A、B和丹參寡糖混合物在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的毒性和抗HIV-1IIIB的作用藥物 TC50(μg/ml) EC50(μg/ml) SI有效部位A5.8±1.36 0.767.6有效部位B10.6±1.81 0.7813.6丹參寡糖混合物 11.1±3.83 1.0610.5
細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)藥物試驗(yàn)表明，有效部位A、B和丹參寡糖混合物在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)均有明顯的抑制HIV-1的作用。
4有效部位A和B在小鼠體內(nèi)的急性毒性昆明種雌性小鼠(體重20±1.0g)，分別經(jīng)口服(給藥體積1.0ml/20g)、尾靜脈注射(給藥體積0.4ml/20g)和腹腔注射(給藥體積0.4ml/20g)，給藥1次，觀察10天，記錄小鼠死亡數(shù)情況。結(jié)果見(jiàn)表4。
表4提取物對(duì)昆明種雌性小鼠的急性毒性LD50(g/kg)給藥途徑有效部位A有效部位B灌胃 ＞20 -尾靜脈注射2.02 -腹腔注射 4.04 ＞0.125有效部位A和丹參寡糖混合物的小鼠血清活性測(cè)定5.1小鼠灌胃和腹腔注射后血清對(duì)HIV-1-RT的抑制作用昆明種小鼠(每組5只)經(jīng)口服有效部位A 5.0g/kg 1次，1小時(shí)后，眼眶取血后，經(jīng)56℃30分鐘滅活后稀釋60倍后測(cè)定小鼠血清抑制HIV-1RT的活性。結(jié)果見(jiàn)表5。有效部位A和丹參寡糖混合物經(jīng)腹腔注射30分鐘后，小鼠含藥血清經(jīng)不同稀釋倍數(shù)稀釋后，在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)用MTT染色法測(cè)定其血藥抑制HIV-1IIIB的活性，結(jié)果見(jiàn)表5。
表5小鼠灌胃和腹腔注射藥物后血清抑制HIV活性對(duì)HIV-1的抑對(duì)HIV-1RT抑藥物給藥方式 取血時(shí)間制率(％) 制率(％)有效部位A腹腔注射 30分鐘47.3±28.9 -500mg/kg丹參寡糖混合物腹腔注射 30分鐘23.1±20.6 -100mg/kg有效部位A灌胃 1小時(shí) - 12.3±5.15.0g/kg
5.2小鼠灌胃和腹腔注射后血清在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)HIV-1-的抑制作用昆明種小鼠經(jīng)不同途徑給有效部位A后1小時(shí)時(shí)血藥抑制HIV-1RT活性和在PBMC細(xì)胞中抗HIV-1的作用見(jiàn)表6。
表6昆明種小鼠給藥有效部位A 1小時(shí)后血清抗HIV活性給藥方式及劑量對(duì)HIV-RT的抑制百分率 在PBMC細(xì)胞中抗HIV-1活性正常對(duì)照 56.5 1.8灌胃1g/kg 50.0 49.4灌胃10g/kg64.2 68腹腔注射400mg/kg 77.8 58.2上述給藥后小鼠血清抗HIV活性試驗(yàn)顯示，有效部位和丹參寡糖混合物經(jīng)口服或腹腔注射后，在小鼠血清中可檢測(cè)出抑制HIV的活性。
6小結(jié)上述所有抗HIV試驗(yàn)結(jié)果表明，提取物既有抗HIV-1IN的活性，也有抗HIV-1RT的活性，在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)也有抑制HIV-1的作用；提取物毒性低，給藥后，小鼠血清中可以測(cè)定出其抑制HIV-1的活性。
丹參寡糖混合物及其有效部位A對(duì)小鼠免疫細(xì)胞地影響1方法選用18-20克BALB/C小鼠分12組，每組6只。6組為正常小鼠，免疫抑制小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg 1次。有效部位A和丹參寡糖混合物各2個(gè)劑量組丹參寡糖混合物50mg/kg和150mg/kg；有效部位A100mg/kg和300mg/kg。陽(yáng)性藥香菇多糖注射液2mg/kg；陰性對(duì)照用生理鹽水。給藥方法為腹腔注射分組給藥如下正常小鼠1.生理鹽水對(duì)照，2.香菇多糖2mg/kg；3.有效部位A100mg/kg；4.有效部位A300mg/kg；5.丹參寡糖混合物50mg/kg；6.丹參寡糖混合物150mg/kg；免疫抑制小鼠7.環(huán)磷酰胺100mg/kg；8.環(huán)磷酰胺100mg/kg+有效部位A100mg/kg；9.環(huán)磷酰胺100mg/kg+有效部位A 300mg/kg腹腔注射；10.丹參寡糖混合物50mg/kg腹腔注射；11.環(huán)磷酰胺100mg/kg+丹參寡糖混合物50mg/kg；12.環(huán)磷酰胺100mg/kg+丹參寡糖混合物150mg/kg。
各組小鼠腹腔注射給藥，每天1次7天。于給藥7天后摘眼球取外周血，用EDTA-K3抗凝劑制成血細(xì)胞懸液。測(cè)定血常規(guī)和流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光抗體標(biāo)記測(cè)定小鼠淋巴細(xì)胞作淋巴細(xì)胞亞群分析和NK細(xì)胞測(cè)定。采用SPSS10.0軟件進(jìn)行多組比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)以及兩兩之間比較的Mann-Whitney U檢驗(yàn)。
2.結(jié)果各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)總結(jié)于表7(其中CD3為總T淋巴細(xì)胞，CD4為輔助性Th淋巴細(xì)胞，CD8為殺傷/抑制性Tc/s淋巴細(xì)胞，CD19為B淋巴細(xì)胞)。
表7丹參寡糖和有效部位A對(duì)小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響

**與生理鹽水組相比P＜0.01，*與生理鹽水組相比P＜0.05++與環(huán)磷酰胺組相比P＜0.01，+與環(huán)磷酰胺組相比P＜0.052.1對(duì)正常小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響由表7可見(jiàn)，每天一次給藥7天后
(1)香菇多糖給藥7天，小鼠外周血T、Th、B細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量顯著升高。
(2)T6 100mg/kg使T、Th、Tc/s細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量和T、Th的比例顯著升高；T6 300mg/kg比值不變，T、Th、Tc/s、B的絕對(duì)數(shù)量均顯著升高。
(3)T6AC 50mg/kg使T、Th、Tc/s細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量和T、Th的比例顯著升高，B細(xì)胞比例下降，絕對(duì)值不變；T6AC 150mg/kg比值不變，T、Th、Tc/s、B的絕對(duì)數(shù)量均顯著升高。
2.2對(duì)環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響(1)環(huán)磷酰胺一次性給藥使T、Th、Tc/s比例升高，B細(xì)胞比例下降；Tc/s絕對(duì)數(shù)量升高，B細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量下降。
(2)環(huán)磷酰胺+香菇多糖組結(jié)果與單獨(dú)給環(huán)磷酰胺組基本相同。
(3)環(huán)磷酰胺+T6及T6AC各給藥組T6及T6AC使T、Th、Tc/s比例升高，B細(xì)胞比例下降，其中T、Th和B細(xì)胞的結(jié)果與環(huán)磷酰胺組均有顯著差別；T、Th、Tc/s絕對(duì)數(shù)量升高并與環(huán)磷酰胺組有顯著差別，B細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量下降，其中T6 100mg/kg組低于環(huán)磷酰胺組，而T6AC 150mg/kg組高于環(huán)磷酰胺組。
(4)各組的CD4/CD8比值不變。
丹參寡糖混合物及其有效部位A對(duì)正常和環(huán)磷酰胺小鼠血白細(xì)胞的影響1方法小鼠給藥方法同二。各小鼠血標(biāo)本進(jìn)行血常規(guī)測(cè)定，計(jì)算白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞以及紅細(xì)胞和血色素，觀察藥物對(duì)正常小鼠和環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠外周血白細(xì)胞的影響2結(jié)果見(jiàn)表8和9。
2.1對(duì)正常小鼠外周血白細(xì)胞的影響表8.藥物對(duì)正常小鼠外周血白細(xì)胞的影響


**與生理鹽水組相比P＜0.01，*與生理鹽水組相比P＜0.05由表8可見(jiàn)，正常小鼠腹腔注射藥物每天1次7天后(1)香菇多糖2mg/kg可以使小鼠白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著升高，血小板顯著下降。
(2)小鼠腹腔注射有效部位A 100，300mg/kg后，不僅白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞總數(shù)、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞總數(shù)也顯著升高，單核細(xì)胞增高的比例非常驚人。表明有效部位A對(duì)白細(xì)胞有非常顯著的促進(jìn)作用，且300mg/kg的作用大于100mg/kg。對(duì)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的促進(jìn)作用是香菇多糖所不具備的。有效部位A 100mg/kg組血小板升高。
(3)與有效部位A類似，小鼠腹腔注射丹參寡糖混合物150mg/kg后，白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞總數(shù)、單核細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞總數(shù)都顯著升高，作用優(yōu)于有效部位A 300mg/kg，本組紅細(xì)胞也顯著升高。丹參寡糖混合物50mg/kg的結(jié)果也有升高，但由于標(biāo)準(zhǔn)差過(guò)大沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.2對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠外周血白細(xì)胞的影響結(jié)果見(jiàn)表9。
表9.藥物對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠外周血白細(xì)胞的影響

以下通過(guò)臨床試驗(yàn)對(duì)該制劑治療視疲勞綜合癥的作用進(jìn)一步進(jìn)行證實(shí)。
本研究采用隨機(jī)試驗(yàn)，按病人就診序號(hào)，符合納入標(biāo)準(zhǔn)者，全部納入觀察，共觀察40例。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)丹參活性成分很多，但丹參寡糖類有效成分迄今尚無(wú)報(bào)道。本發(fā)明所述丹參寡糖混合物有三種藥理活性在體外既有抗HIV-1IN的活性也有抗HIV-1RT的活性，在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)有聯(lián)合用藥的效果；小鼠腹腔注射和灌胃30分鐘或1小時(shí)后，血清在體外可測(cè)出其抑制HIV RT活性和在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)測(cè)出其抑制HIV的活性。該寡糖混合物及其有效部位給小鼠腹腔注射有顯著升高CD4、CD8和NK細(xì)胞，保持B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。此外并有非常顯著的升高淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的升白細(xì)胞作用。這在治療艾滋病中可發(fā)揮重要作用，同時(shí)也可能用于治療其它免疫性疾病，目前尚無(wú)類似藥物。


圖1丹參寡糖混合物的質(zhì)譜譜2丹參寡糖混合物的紅外譜3丹參寡糖混合物的氣相色譜圖，其中1為內(nèi)標(biāo)物，2為苷露糖，3為葡萄糖，4為半乳糖
權(quán)利要求
1.一種丹參寡糖類混合物，其特征是所述混合物中，分子質(zhì)量數(shù)分別為504、666和904，含有甘露糖、半乳糖和葡萄糖三種糖基，其相對(duì)摩爾比甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖為1∶8∶7。
2.如權(quán)利要求1所述丹參寡糖混合物及其有效部位的制備方法，其特征是將提取物原料丹參粉用水(10～80℃)浸漬或滲濾提取，自然沉淀，離心或過(guò)濾初步除去固體雜質(zhì)，獲取粗提液；粗提液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱層析，用無(wú)鹽水洗滌，用低級(jí)醇水解吸，收集解吸液；解吸液減壓濃縮，冷凍或噴霧干燥，獲有效部位A；用無(wú)鹽水溶解有效部位A后，再用乙醇沉淀，沉淀部分用無(wú)鹽水溶解后上sephadex LH-20凝膠樹(shù)脂進(jìn)行柱層析，無(wú)鹽水洗脫，分份收集，TLC監(jiān)測(cè)，相同部分合并，洗脫液減壓濃縮，冷凍或噴霧干燥，獲得有效部位B；用無(wú)鹽水溶解有效部位B后上sephadex G-50凝膠樹(shù)脂進(jìn)行柱層析，無(wú)鹽水洗脫，分份收集，TLC監(jiān)測(cè)，相同部分合并，洗脫液減壓濃縮，冷凍或噴霧干燥，獲得丹參寡糖混合物。
3.如權(quán)利要求1所述丹參寡糖混合物及其有效部位在制備抗艾滋病病毒、調(diào)節(jié)免疫和升白細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種丹參寡糖混合物及其有效部位制備方法，所說(shuō)丹參寡糖混合物含分子質(zhì)量數(shù)分別為504、666和904，含有甘露糖、半乳糖和葡萄糖三種糖基，其相對(duì)摩爾比甘露糖半乳糖葡萄糖為1∶8∶7。分離純化后藥效學(xué)試驗(yàn)證明，該寡糖混合物及其有效部位具有較好的抗艾滋病、調(diào)節(jié)免疫和升白細(xì)胞的作用。
文檔編號(hào)A61K31/7042GK1628686SQ200410074360
公開(kāi)日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2004年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者陳鴻珊, 彭宗根, 張麗麗 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所