專利名稱：阿魏酸川芎嗪在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及阿魏酸川芎嗪的用途，尤其涉及在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿魏酸川芎嗪為反式-4-羥基-3-甲氧基肉桂酸川芎嗪。結(jié)構(gòu)式為 分子式及分子量C28H32N2O8524.56該化合物由合成制得。
將2重量份的阿魏酸，加入乙醇，加熱溶解。另取1重量份的川芎嗪加入乙醇加熱溶解，在攪拌下，趁熱將此溶液加入阿魏酸乙醇溶液中，冷卻，過濾，乙醇洗。用乙醇重結(jié)晶得阿魏酸川芎嗪晶體，干燥、粉碎得精制阿魏酸川芎嗪。mp169～170℃，1H-NMR(DMSO-d6)9.54(2H，Ar-OH)，7.45(2H，d，-CH＝C＜＝，6.73～7.24(6H，m，Ar-H)，6.32(2H，d＞C＝CH-)，3.77(6H，S，Ar-OCH3)，2.32(12H，S，-CH3)。13C-NMR(DMSO-d6)168.0，149.1，147.9，147.7，144.5，125.8，122.9，115.6，115.5，111.2，55.7，30.7，20.9。元素分析，C28H32N2O8，計算值(％)C64.12，H6.11，N5.34；測量值C64.18，H6.06，N5.32。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供阿魏酸川芎嗪在制藥中的應(yīng)用。
實際上本發(fā)明涉及阿魏酸川芎嗪用于制備治療各種原因所致的腎小球疾病，如在腎炎、慢性腎炎，腎病綜合癥和尿毒癥等的藥物中的應(yīng)用。
涉及阿魏酸川芎嗪用于制備治療心腦血管疾病，如在冠心病、脈管炎、腦供血不全、腦血栓形成、腦栓塞、腦血管病、腦卒中等的藥物中的應(yīng)用。
阿魏酸川芎嗪具有抗血小板聚集，擴(kuò)張微血管，解除血管痙攣，改善微循環(huán)，活血化瘀作用，并對已聚集的血小板有解聚作用。正是這些作用，使其可用于制備治療上述疾病的藥物。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面用阿魏酸川芎嗪的藥理試驗及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的用途。
采用阿魏酸川芎嗪結(jié)晶作為原料，用溶解方法制成注射劑或口服制劑備用。
一.阿魏酸川芎嗪對阿霉素引起的大白鼠腎病的影響試驗動物成年健康SD大鼠，體重200～220g，隨機(jī)分為正常對照組，腎病模型組，阿魏酸川芎嗪口服高、中、低三個劑量組、阿魏酸川芎嗪注射高、低劑量組，阿魏酸哌嗪陽性對照組共8組，每組10只動物。
腎病模型組、阿魏酸川芎嗪口服三個劑量組及注射兩個劑量組、陽性對照組均給予0.1％阿霉素(生理鹽水配制)7.5mg/Kg經(jīng)尾靜脈注射，注射一周后，經(jīng)尿蛋白試紙法測定尿樣，均為++++，模型成立。正常對照組給予等量生理鹽水尾靜脈注射。
阿魏酸川芎嗪口服高劑量組(200mg/Kg)、中劑量組(100mg/Kg)、低劑量組(50mg/Kg)和陽性對照組(阿魏酸哌嗪50mg/Kg)每日灌胃給藥，模型組及正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。阿魏酸川芎嗪注射高劑量組(10mg/ml，0.2ml/100g)、低劑量組(10mg/ml，0.1ml/100g)每日尾靜脈注射。8周后處死，處死前1天，將大鼠置于代謝籠中收集24h尿液。觀察指標(biāo)為24h尿蛋白、血清尿素氮、肌酐；并取腎臟進(jìn)行HE、PAS染色，切片分析，進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀察腎組織的病理變化。
試驗結(jié)果阿魏酸川芎嗪口服給藥高、中劑量組對尿蛋白有明顯降低作用，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)；對尿素氮、血肌酐也有顯著降低作用，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。阿魏酸川芎嗪口服給藥低劑量組對尿蛋白有明顯降低作用，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)；對尿素氮、血肌酐作用不明顯(P＞0.05)。
阿魏酸川芎嗪注射高、低劑量組對尿蛋白有明顯減低作用，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)；但僅阿魏酸川芎嗪注射高劑量組對尿素氮、血肌酐有顯著降低作用(P＜0.05)，而阿魏酸川芎嗪注射低劑量組對尿素氮、血肌酐無明顯降低作用(P＞0.05)。見表1表1 各組大鼠尿蛋白及腎功能組別尿蛋白(mg/d)尿素氮(mmol/L)血肌酐(umol/L)正常對照組 18.2±0.9 6.2±0.6 26.7±4.5腎病模型組 130±18.47*** 13.8±1.5*41.6±3.2*口服高劑量組33.6±8.97ΔΔ7.4±0.6Δ25.3±1.9Δ口服中劑量組42.7±11.24ΔΔ9.8±1.1Δ28.4±2.3Δ口服低劑量組54.83±17.33ΔΔ12.1±0.5 35.0±2.1注射高劑量組45.8±13.4ΔΔ10.7±1.4Δ31.4±2.7Δ注射低劑量組58.46±15.64ΔΔ11.9±0.7 38.2±4.3陽性藥物組 69.50±27.25ΔΔ12.6±1.8 23.1±2.1Δ注與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01腎組織病理變化光鏡下，腎病大鼠可見腎小球空泡變性，系膜外基質(zhì)增多，偶見局灶節(jié)段性硬化，腎小管管腔內(nèi)大量蛋白管型。阿魏酸川芎嗪治療后，與腎病模型組比較，上述改變明顯減輕。試驗結(jié)果提示，阿魏酸川芎嗪對腎病有治療作用。
二.阿魏酸川芎嗪對家兔C-BSA(牛血清白蛋白)腎炎的影響試驗動物日本大耳白家兔，體重2.0～2.5Kg，隨機(jī)分為正常對照組，腎病模型組，阿魏酸川芎嗪口服高、中、低三個劑量組、阿魏酸川芎嗪注射高、低劑量組，阿魏酸哌嗪陽性對照組共8組，每組10只動物。
腎病模型組、阿魏酸川芎嗪口服三個劑量組及注射兩個劑量組、陽性對照組均給予250mg/Kg牛血清白蛋白，經(jīng)耳緣靜脈注入，間隔一周后再次注入，經(jīng)尿蛋白試紙法測定尿樣，均為++++，模型成立。正常對照組給予等量生理鹽水耳緣靜脈注。
阿魏酸川芎嗪口服高劑量組(200mg/Kg)、中劑量組(100mg/Kg)、低劑量組(50mg/Kg)和陽性對照組(阿魏酸哌嗪50mg/Kg)每日灌胃給藥，模型組及正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。阿魏酸川芎嗪注射高劑量組(10mg/ml，0.2ml/100g)、低劑量組(10mg/ml，0.1ml/100g)每日尾靜脈注射。4周后處死，處死前1天，將家兔置于代謝籠中收集24h尿液。觀察指標(biāo)為24h尿蛋白、血清尿素氮、肌酐；并取腎臟進(jìn)行HE、PAS染色，切片分析，進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀察腎組織的病理變化。
試驗結(jié)果阿魏酸川芎嗪口服給藥高、中劑量組對尿蛋白有明顯降低作用，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.001)；對尿素氮、血肌酐也有顯著降低作用，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01；P＜0.05)。阿魏酸川芎嗪口服給藥低劑量組對尿蛋白有明顯降低作用，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)；對血肌酐也有顯著降低作用，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)；對尿素氮作用不明顯(P＞0.05)。
阿魏酸川芎嗪注射高、低劑量組對尿蛋白有明顯減低作用，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.001，P＜0.01)；對尿素氮、血肌酐也有顯著降低作用(P＜0.01，P＜0.05)。見表2表2 各組家兔尿蛋白及腎功能組別尿蛋白(mg/d)尿素氮(mmol/L) 血肌酐(umol/L)正常對照組 35.7±11.5 26.3±7.546.2±9.1腎病模型組 397.4±27.3*** 73.5±11.9** 142.3±26.7***口服高劑量組53.6±6.47ΔΔΔ27.4±0.6ΔΔ48.3±10.5ΔΔ口服中劑量組82.1±11.32ΔΔΔ39.8±12.1Δ54.6±11.8ΔΔ口服低劑量組120.6±25.41ΔΔ52.1±14.3 72.5±14.7Δ注射高劑量組79.8±12.34ΔΔΔ41.6±11.2Δ53.8±13.3ΔΔ注射低劑量組102.3±15.87ΔΔ58.4±12.5Δ74.6±17.2Δ陽性藥物組 119.50±27.25ΔΔ59.8±12.4 83.4±12.5Δ注與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.01腎組織病理變化光鏡下，在腎小球系膜區(qū)可見免疫復(fù)合物和補體的沉積，系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增生，腎小球和腎間質(zhì)內(nèi)，炎性細(xì)胞浸潤，阿魏酸川芎嗪治療后與模型組比較，上述改變明顯減輕。試驗結(jié)果提示阿魏酸川芎嗪對腎炎有治療作用。
三.阿魏酸川芎嗪對家兔血小板聚集性的影響試驗動物日本大耳白家兔，體重2.0～2.5Kg，隨機(jī)分為正常對照組，阿魏酸川芎嗪口服高、中、低三個劑量組、阿魏酸川芎嗪注射高、低劑量組，阿魏酸哌嗪陽性對照組共7組，每組10只動物。
兔實驗前自心臟取血測定血小板活性和聚集性，于耳緣靜脈注射和灌胃藥物，阿魏酸川芎嗪口服高劑量組(200mg/Kg)、中劑量組(100mg/Kg)、低劑量組(50mg/Kg)和陽性對照組(阿魏酸哌嗪50mg/Kg)，阿魏酸川芎嗪注射高劑量組(10mg/ml，0.2ml/100g)、低劑量組(10mg/ml，0.1ml/100g)耳緣靜脈注射，正常對照組給予等量生理鹽水耳緣靜脈注。1h后復(fù)查血小板活性和聚集性。
試驗結(jié)果由表3可見，①當(dāng)ADP二磷酸腺苷誘導(dǎo)聚集時，給藥前各組間血小板聚集率無明顯差異；給藥后，阿魏酸川芎嗪口服給藥高、中劑量組，阿魏酸川芎嗪注射高劑量組，陽性藥物對照組的血小板聚集率顯著低于正常對照組(P＜0.001；P＜0.01)，阿魏酸川芎嗪口服給藥低劑量組，阿魏酸川芎嗪注射低劑量組的血小板聚集率明顯低于正常對照組(P＜0.05)。②當(dāng)AA花生四烯酸誘導(dǎo)聚集時，給藥前各組間血小板聚集率無明顯差異；給藥后，阿魏酸川芎嗪口服給藥高、中劑量組，阿魏酸川芎嗪注射高劑量組，陽性藥物對照組的血小板聚集率顯著低于正常對照組(P＜0.001；P＜0.01)，阿魏酸川芎嗪口服給藥低劑量組的血小板聚集率明顯低于正常對照組(P＜0.05)。
表3 阿魏酸川芎嗪對家兔血小板聚集率的影響血小板聚集率(％，x±SD)誘導(dǎo)劑 組別給藥前 給藥后 差值正常對照組 65.89±7.57 65.59±6.47-0.30±9.54口服高劑量組65.04±6.87 41.56±9.74-23.48±11.73***口服中劑量組62.86±5.38 50.80±9.71-12.06±8.20**ADP 口服低劑量組67.78±6.19 59.25±6.36-8.53±7.05*注射高劑量組66.42±8.33 52.24±8.26-14.18±6.71**注射低劑量組69.18±8.19 60.27±8.02-8.91±8.03*陽性藥物組 65.10±7.87 52.68±5.78-12.42±6.58**正常對照組 66.87±6.69 65.39±11.42 -1.48±11.52口服高劑量組67.45±3.12 32.97±3.94-34.48±4.45***口服中劑量組62.33±5.54 50.08±5.65-12.25±6.88**AA 口服低劑量組71.23±8.03 61.69±9.97-9.54±5.45*注射高劑量組68.31±5.96 56.37±9.13-11.94±8.04**注射低劑量組69.66±7.53 61.60±5.74-8.06±5.75陽性藥物組 67.06±7.95 35.01±8.65-32.04±9.32***注與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；四.阿魏酸川芎嗪對大鼠動-靜脈旁路血栓形成的影響試驗動物成年健康SD大鼠，體重250～300g，隨機(jī)分為正常對照組，阿魏酸川芎嗪口服高、中、低三個劑量組、阿魏酸川芎嗪注射高、低劑量組，阿魏酸哌嗪陽性對照組共7組，每組10只動物。
將麻醉后的大鼠仰臥位，分離氣管并插入塑料軟管，以便及時吸出分泌物。分離右頸總動脈及左頸外靜脈。在聚乙烯管的中段放入一根長6cm已稱重的4號手術(shù)絲線，將生理鹽水充滿管腔，聚乙烯管一端插入左頸外靜脈，另一端插入右頸總動脈，按組別劑量給藥阿魏酸川芎嗪口服高劑量組(200mg/Kg)、中劑量組(100mg/Kg)、低劑量組(50mg/Kg)和陽性對照組(阿魏酸哌嗪50mg/Kg)，阿魏酸川芎嗪注射高劑量組(10mg/ml，0.2ml/100g)、低劑量組(10mg/ml，0.1ml/100g)，正常對照組給予等量生理鹽水。給藥2分鐘后，打開動脈夾，血液從右頸總動脈流至聚乙烯管內(nèi)返回左頸外靜脈。15分鐘后中斷血流，迅速取出絲線稱重，用總重量減去絲線重量即得血栓濕重。各給藥組血栓濕重與正常對照組比較。
試驗結(jié)果由表4可看出阿魏酸川芎嗪口服給藥高、中劑量組，阿魏酸川芎嗪注射高劑量組，阿魏酸哌嗪陽性藥物組的血栓濕重與正常對照組比較有顯著差異(P＜0.001；P＜0.01)，阿魏酸川芎嗪口服給藥低劑量組和阿魏酸川芎嗪注射低劑量組的血栓濕重與正常對照組比較有明顯差異(P＜0.05)。
表4 阿魏酸川芎嗪對大鼠動-靜脈旁路血栓形成的影響(X±SD)組別血栓濕重(mg) 血栓抑制率(％)正常對照組 32.6±11.6口服高劑量組12.3±3.1***62.27口服中劑量組14.5±9.1**55.52口服低劑量組22.6±7.4*30.67注射高劑量組18.0±9.5**44.97注射低劑量組23.7±6.5*27.30陽性藥物組 13.4±4.5***58.90注與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；五.阿魏酸川芎嗪對大鼠動脈血栓的溶栓作用試驗動物Wistar種大鼠，雄性，250～300g，隨機(jī)分為7組模型組，口服高、中、低劑量組(200，100，50mg/Kg)、注射高、低劑量組(10mg/ml，0.2ml/100g；10mg/ml，0.1ml/100g)、陽性對照藥阿魏酸哌嗪組(50mg/Kg)，每組10只。
各組動物用戊巴比妥鈉麻醉，分離右側(cè)頸總動脈，頸總動脈近端置刺激電極，遠(yuǎn)端置溫度探頭。刺激電流為1.5mA，刺激時間為7min，至血栓形成儀報警為血栓形成，即刻給藥，動物縫合傷口。于給藥后24hr，動物麻醉、分離并取電刺激處血管約0.5cm，置福爾馬林中固定，經(jīng)脫水、包埋、垂直切片、染色，倒置顯微鏡下觀察血栓及血管形態(tài)，經(jīng)多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)(MPIAS-500，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)清平影象工程公司)求出血栓占血管腔總面積的百分比。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
試驗結(jié)果見表5表5 阿魏酸川芎嗪對大鼠動脈血栓的溶解作用(X±SD)組別 動物數(shù) 血栓占血管腔總面積百分比(％)模型組 10 86.5±6.9口服高劑量組 10 51.1±19.5***口服中劑量組 10 68.3±17.7**口服低劑量組 10 76.2±12.5*注射高劑量組 10 59.8±14.5***注射低劑量組 10 77.3±12.7阿魏酸哌嗪組 10 60.8±18.6***注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
由表5可見，模型組動物頸總動脈經(jīng)電刺激形成血栓口服高劑量組和注射高劑量組血栓占血管總面積百分比顯著小于模型組動物(P＜0.001)，口服中、低劑量組血栓占血管總面積百分比明顯小于模型組動物(P＜0.05，0.01)；注射低劑量組血栓占血管總面積百分比有所縮小，但無統(tǒng)計學(xué)意義，陽性對照藥阿魏酸哌嗪組血栓占血管腔總面積百分比小于模型組(P＜0.001)。
上述試驗結(jié)果表明，阿魏酸川芎嗪對已聚集的血小板有明顯的解聚作用，可用于溶解血栓。
六.阿魏酸川芎嗪對大鼠血液粘度的影響試驗動物健康雄性Wistar大鼠，體重238.3±11.6g，隨機(jī)分為正常對照組、口服高、中、低劑量組(200，100，50mg/Kg)、注射高、低劑量組(10mg/ml，0.2ml/100g；10mg/ml，0.1ml/100g)、陽性對照藥阿魏酸哌嗪組(50mg/Kg)，共7組，每組10只。
各組動物按所述劑量口服給藥或經(jīng)尾靜脈注射給藥，每日一次，連續(xù)給藥3日，末次給藥后30min，各組動物用水合氯醛麻醉(0.35g/Kg)，從腹主動脈取血取血3ml(肝素抗凝)用于血液粘度測定。
血液粘度測定從3ml血(肝素抗凝)中取0.8ml用于全血粘度測定，余血于650xg離心10min，取上清0.8ml用于血漿粘度測定。
試驗結(jié)果與對照組比較，口服高劑量組和注射高劑量組大鼠的全血粘度在低切變率(5S-1)下明顯降低(P＜0.05)，在中切變率(30S-1、100S-1)及高切變率(200S-1)下均顯著降低(P＜0.01；0.05)；口服中劑量組大鼠的全血粘度在切變率5S-1、30S-1及100S-1下均明顯降低(P＜0.05)；口服低劑量組和注射低劑量組大鼠的全血粘度在各切變率下均無明顯變化。陽性藥物(阿魏酸哌嗪)組大鼠的全血粘度在各切變率下均明顯低于對照組(P＜0.05；0.01)。各給藥組血漿粘度與對照組比較均無明顯差異。結(jié)果見表6。
表6 阿魏酸川芎嗪對大鼠血液粘度的影響(X±SD)動物數(shù)全血粘度(CP) 血漿粘度組別(n) 高切(200S-1) 中切(100S-1) 中切(30S-1)低切(5S-1)(100S-1)對照組 10 4.76±1.24 5.83±1.52 8.65±2.95 14.47±6.481.41±0.12口服高劑量組10 3.50±0.24**4.09±0.33*5.69±0.65**8.78±1.40*1.40±0.24口服中劑量組10 4.05±0.72 4.66±0.81*6.27±1.07* 9.05±2.23*1.36±0.07口服低劑量組10 4.42±0.44 5.15±0.56 7.12±0.91 10.91±1.641.33±0.12注射高劑量組10 3.74±0.35* 4.23±0.41** 5.87±0.59**8.96±1.72*1.39±0.17注射低劑量組10 4.07±0.79 5.10±1.27 7.97±2.79 13.37±6.471.35±0.10阿魏酸哌嗪組10 3.74±0.90* 4.37±1.05*5.85±1.44* 8.19±1.28** 1.33±0.12注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
上述試驗結(jié)果表明連續(xù)3天給藥，阿魏酸川芎嗪口服高劑量和注射高劑量明顯降低各切變率下的全血粘度(P＜0.05；0.01)，口服中劑量明顯降低切變率5S-1、30S-1及100S-1下的全血粘度(P＜0.05)。該結(jié)果提示阿魏酸川芎嗪具有降低血液粘度的作用。
七.阿魏酸川芎嗪對大鼠局灶性腦缺血的影響試驗動物成年健康SD大鼠，體重200～350g，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，阿魏酸川芎嗪口服高、中、低三個劑量組、阿魏酸川芎嗪注射高、低劑量組，阿魏酸哌嗪陽性對照組共8組，每組10只動物。
按Tamura氏方法，動物用3.5％水合氯醛腹腔注射麻醉(35mg/100g體重)，經(jīng)顳下入路，打開顱窗，剝開軟腦膜，暴露右側(cè)大腦中動脈，電凝嗅束與大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈(電凝輸出功率為4W)，假手術(shù)組只開顱窗，不電凝大腦中動脈。手術(shù)后即刻口服或靜脈注射受試藥物(模型組、假手術(shù)組靜脈給予等量生理鹽水)，傷口縫合后回籠飼養(yǎng)。試驗及飼養(yǎng)室溫均為25.0±1.0℃。
術(shù)后4h，參考文獻(xiàn)，采用單盲法按下列標(biāo)準(zhǔn)觀測各組動物神經(jīng)癥狀，進(jìn)行行為綜合評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為(1)提起鼠尾離開地面，觀察兩前肢活動情況，左前肢屈曲、左肩內(nèi)收者按程度評為0-4分，(正常大鼠)兩前肢對稱伸向前方者評為0分；(2)輕提鼠尾，推動左肩向右移動10cm，再推動右肩向左移動10cm，以左側(cè)阻力下降程度，評為0-3分；(3)牽拉兩前肢，視左側(cè)肌力下降程度評為0-3分。三項分?jǐn)?shù)相加，分?jǐn)?shù)越高則動物行為障礙越嚴(yán)重。術(shù)后24h，按上述標(biāo)準(zhǔn)再對各組動物進(jìn)行行為綜合評分。結(jié)果按等級序值法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
末次評分后，動物經(jīng)腹主動脈取血，斷頭取腦、稱重，手術(shù)顯微鏡下確認(rèn)中動脈已阻斷后置冰生理鹽水中，將大腦冠狀切4刀，平均切成5個腦片，置TTC染液中(每100ml染液中含4％TTC 30ml，1M K2HP042ml)，37℃避光溫孵，經(jīng)染色后非缺血區(qū)為玫瑰紅色，梗塞區(qū)為白色，染色后置10％福爾馬林避光保存。用多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)(MPIAS-500)(固定取像的放大倍數(shù))計算大鼠腦的缺血范圍及腦梗塞區(qū)重量(腦梗塞區(qū)重量＝腦濕重×腦梗塞范圍)，此后取第二腦片常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，進(jìn)行病理學(xué)檢查；測定血清丙二醛(MDA)含量。以上數(shù)據(jù)均進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
試驗結(jié)果1.對大鼠神經(jīng)癥狀的影響(結(jié)果見表7)由表7可見，手術(shù)后4hr、24hr假手術(shù)組動物神經(jīng)行為未發(fā)現(xiàn)異常，模型組動物可見明顯的行為障礙，主要表現(xiàn)為左肩內(nèi)收、屈曲，前肢無力等，與假手術(shù)組比較差異顯著(P＜0.01)?？诜?、中劑量組(200，100mg/Kg)，注射高劑量組(10mg/ml，0.2ml/100g)藥后4hr、24hr動物行為障礙明顯改善，與模型組比較有明顯差異(P＜0.05，0.01)；口服低劑量組(50mg/Kg)，注射低劑量組(10mg/ml，0.1ml/100g)藥后4hr、24hr動物行為障礙均未見明顯改善。陽性對照組(阿魏酸哌嗪50mg/Kg)動物行為障礙于藥后4hr、24hr均有明顯改善(P＜0.05，0.01)。
表7 阿魏酸川芎嗪對大鼠腦中動脈阻斷后神經(jīng)癥狀的影響分級藥后 組別動物數(shù)P值0 I II III假手術(shù)組10 10 0 0 0 ＜0.01模型組 10 0 0 4 6口服高劑量組10 0 4 2 4 ＜0.05口服中劑量組10 0 3 5 2 ＜0.054hr口服低劑量組10 0 1 5 4 ＞0.05注射高劑量組10 0 4 3 3 ＜0.05注射低劑量組10 0 2 5 3 ＞0.05阿魏酸哌嗪組10 1 3 4 2 ＜0.05假手術(shù)組10 10 0 0 0 ＜0.01模型組 10 0 0 3 7口服高劑量組10 0 5 3 2 ＜0.01口服中劑量組10 0 3 5 2 ＜0.0524hr口服低劑量組10 0 1 5 4 ＞0.05注射高劑量組10 0 5 2 3 ＜0.01注射低劑量組10 0 2 5 3 ＜0.05阿魏酸哌嗪組10 2 4 2 2 ＜0.01注分級標(biāo)準(zhǔn)0級綜合評分0分；I級綜合評分1-3分；II級綜合評分4-6分；III級綜合評分7-10分。
2.對腦梗塞范圍的影響(結(jié)果見表8)表8 阿魏酸川芎嗪對大鼠腦梗塞范圍的影響(X±SD)腦指數(shù)梗塞范圍 梗塞區(qū)重量組別 n(g/100g體重) (％) (g)假手術(shù)組 10 0.548±0.046 - -模型組 10 0.592±0.034Δ11.0±4.0 0.148±0.051口服高劑量組 10 0.579±0.024 6.6±3.5* 0.089±0.051*口服中劑量組 10 0.578±0.033 7.3±4.3 0.096±0.055*口服低劑量組 10 0.581±0.030 9.8±4.8 0.134±0.067注射高劑量組 10 0.587±0.045 7.0±4.3* 0.104±0.071注射低劑量組 10 0.592±0.035 8.2±4.7 0.116±0.053阿魏酸哌嗪組 10 0.570±0.035 6.8±4.6* 0.090±0.062*注與假手術(shù)組比較ΔP＜0.05；與模型組比較*P＜0.05
由表8可見，手術(shù)后24hr，模型組大鼠大腦水腫，腦指數(shù)明顯增加，并且術(shù)側(cè)局部缺血嚴(yán)重，形成明顯的梗塞灶；與模型組比較，口服高劑量組、注射高劑量組腦梗塞范圍明顯縮小(P＜0.05)，梗塞區(qū)重量明顯減輕(P＜0.05)；口服高、中劑量組梗塞區(qū)重量明顯減輕(P＜0.05)；口服低劑量組、注射低劑量組則作用不明顯；陽性對照藥阿魏酸哌嗪組腦梗塞范圍明顯縮小(P＜0.05)，梗塞區(qū)重量明顯減輕(P＜0.05)?？诜齻€劑量組、注射兩個劑量組及陽性對照藥阿魏酸哌嗪組腦指數(shù)均未見明顯降低。
3.對血清SOD活性及MDA含量的影響(結(jié)果見表9)表9 阿魏酸川芎嗪對血清SOD活性及MDA含量的影響(X±SD)SODMDA組別n(NU/ml)(μmol/L)假手術(shù)組10 470.5±64.911.3±2.6模型組 10 353.2±86.2ΔΔ14.3±2.4Δ口服高劑量組10 443.3±79.5* 11.0±2.6**口服中劑量組10 401.4±92.212.1±3.2口服低劑量組10 384.3±87.514.0±2.6注射高劑量組10 427.3±63.2* 12.7±1.7注射低劑量組10 373.4±71.513.9±2.5阿魏酸哌嗪組10 457.7±95.2* 11.8±2.1*注與假手術(shù)組比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
由表9可見，在腦梗塞24hr后，模型組血清SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P＜0.05，0.01)；給藥后，口服高劑量組及陽性對照藥阿魏酸哌嗪組血清SOD活性明顯增加、MDA含量明顯降低，與模型組比較均有明顯差異(P＜0.05，0.01)；口服中、低劑量組、注射低劑量組對SOD活性及MDA含量的影響與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。試驗結(jié)果提示，阿魏酸川芎嗪對局灶性腦缺血有治療作用。
八.阿魏酸川芎嗪對大鼠實驗性腦缺血的影響實驗動物SD種大鼠，雄性，220～270g，隨機(jī)分為7組(每組10只)假手術(shù)組、模型組、口服高、中、低劑量組(200，100，50mg/Kg)、注射高、低劑量組(10mg/ml，0.2ml/100g；10mg/ml，0.1ml/100g)、陽性對照藥阿魏酸哌嗪組(50mg/Kg)。假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。
大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，股靜脈注射肝素全身抗凝，結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，左側(cè)頸總動脈插管，連接壓力換能器，用二道生理記錄儀監(jiān)視血壓變化，放血使大鼠血壓恒定在50～55mmHg，持續(xù)30min后結(jié)扎(假手術(shù)組不放血、不結(jié)扎)，形成大鼠實驗性腦缺血模型，即刻口服或靜脈給予所試藥，再維持3.5hr，斷頭取腦，稱重，計算腦指數(shù)，取右側(cè)腦組織勻漿，測定腦組織SOD活性及MDA含量，左側(cè)腦組織置80℃烘箱24hr至恒重，計算腦含水量。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
試驗結(jié)果1.對腦指數(shù)、腦含水量的影響(結(jié)果見表10)表10 對腦指數(shù)、腦含水量的影響(X±SD)動物數(shù) 腦指數(shù) 腦含水量分組(n)(g/100g體重) (％)假手術(shù)組10 0.524±0.028 0.803±0.011模型組 10 0.576±0.042ΔΔ0.822±0.009ΔΔ口服高劑量組10 0.529±0.045* 0.807±0.018*口服中劑量組10 0.535±0.042* 0.812±0.013*口服低劑量組10 0.546±0.037 0.816±0.014注射高劑量組10 0.531±0.039* 0.809±0.016*注射低劑量組10 0.554±0.024 0.815±0.015阿魏酸哌嗪組10 0.537±0.019* 0.808±0.015*注與假手術(shù)組比較ΔΔP＜0.01；與模型組比較*P＜0.05由表10可見，結(jié)扎頸總動脈并放血后，模型組動物腦指數(shù)及腦含水量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)；口服高、中劑量組，注射高劑量組腦指數(shù)均明顯低于模型組(P＜0.05)，腦含水量均明顯低于模型組(P＜0.05)；陽性對照藥阿魏酸哌嗪組腦指數(shù)及腦含水量均明顯低于模型組(P＜0.05)。
2.對腦組織SOD活性及MDA含量的影響(結(jié)果見表11)
表11 對腦組織SOD活性及MDA含量的影響(X±SD)動物數(shù)SOD MDA分組(n) (NU/mgprot) (nmol/mgprot)假手術(shù)組10116.5±34.9 9.55±2.24模型組 1081.9±17.2Δ11.46±1.19Δ口服高劑量組10104.0±24.5* 9.17±1.65**口服中劑量組1099.1±18.3* 9.62±1.72*口服低劑量組1094.7±17.89.81±1.89*注射高劑量組10104.7±28.9* 9.95±1.61*注射低劑量組1093.2±35.810.94±2.14阿魏酸哌嗪組10115.8±33.2* 8.06±2.99**注與假手術(shù)組比較ΔP＜0.05；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01由表11可見，腦缺血后模型組動物腦組織中SOD活性降低、MDA含量增加，與假手術(shù)組比較均有明顯差異(P＜0.05)。與模型組比較，口服高、中劑量組，注射高劑量組SOD活性明顯增加(P＜0.05)，口服低劑量組，注射低劑量組SOD活性無明顯變化，陽性對照藥阿魏酸哌嗪組SOD活性明顯增加(P＜0.05)；口服高、中、低劑量組，注射高劑量組MDA含量均明顯降低(P＜0.05，0.01)；陽性對照藥阿魏酸哌嗪組MDA含量顯著降低(P＜0.01)。
上述結(jié)果表明，大鼠靜脈注射該藥后，腦指數(shù)、腦含水量均明顯降低，腦組織SOD活性明顯增加，MDA含量明顯降低，與模型組比較差異顯著(P＜0.05，0.01)。提示阿魏酸川芎嗪對腦缺血有保護(hù)作用。
九、阿魏酸川芎嗪對小鼠急性腦缺血的保護(hù)作用試驗動物昆明種小鼠，18～20克，雌雄各半，隨機(jī)分為6組(每組12只)模型組、口服高、中、低劑量組(200，100，50mg/Kg)、注射高、低劑量組(10mg/ml，0.2ml/100g；10mg/ml，0.1ml/100g)、陽性對照藥阿魏酸哌嗪組(50mg/Kg)。
給藥后30min，于小鼠耳后1mm處迅速斷頭，造成急性腦缺血，表現(xiàn)為張口呼吸由強變?nèi)酰院粑螖?shù)及呼吸維持時間作為小鼠耐缺氧指標(biāo)，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
試驗結(jié)果見表12
表12 阿魏酸川芎嗪對小鼠急性腦缺血的影響(X±SD)分組動物數(shù) 呼吸次數(shù) 呼吸時間(s)模型組 12 12.1±2.8 19.7±2.3口服高劑量組12 12.4±2.7 22.3±2.3*口服中劑量組12 12.2±2.7 21.9±2.2*口服低劑量組12 12.1±3.0 20.9±3.1注射高劑量組12 12.3±2.4 22.1±2.5*注射低劑量組12 12.1±3.0 19.8±3.0阿魏酸哌嗪組12 12.4±3.6 22.4±2.9*注與模型組比較*P＜0.05由表12可見，口服高、中劑量和注射高劑量阿魏酸川芎嗪有明顯延長小鼠呼吸時間的作用，與模型組比較差異顯著(P＜0.05)，但對呼吸次數(shù)沒有明顯影響；口服低劑量和注射低劑量阿魏酸川芎嗪對小鼠呼吸次數(shù)及呼吸時間未見明顯影響；陽性對照阿魏酸哌嗪可明顯延長小鼠呼吸時間(P＜0.05)，對呼吸次數(shù)亦無明顯影響。
上述試驗結(jié)果表明，口服或靜脈靜脈給予阿魏酸川芎嗪，小鼠呼吸時間明顯延長，呼吸次數(shù)未見明顯改變，提示該藥對急性腦缺血有保護(hù)作用。
十.阿魏酸川芎嗪對大鼠軟腦膜微循環(huán)障礙的影響試驗動物Wistar大鼠，雌雄兼用，體重236.6±8.4g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、口服高、中、低劑量組(200，100，50mg/Kg)、注射高、低劑量組(10mg/ml，0.2ml/100g；10mg/ml，0.1ml/100g)、陽性對照藥阿魏酸哌嗪組(50mg/Kg)，共8組，每組10只；假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。
各組動物用水合氯醛麻醉(0.35g/kg)，切開腦部皮膚，打開左側(cè)顱窗，剝離硬腦膜，暴露軟腦膜，用體表微循環(huán)觀測儀選定觀察位置，經(jīng)股靜脈按5ml/kg注射15％高分子右旋糖苷(假手術(shù)組注射等體積0.9％氯化鈉注射液)，各給藥組按所述劑量給藥，觀察、記錄藥后5min、15min、30min各組大鼠軟腦膜微循環(huán)血液流速及流態(tài)的變化，采用參比差值法對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
血液流速分級I級，快速；II級，中速；III級，慢速。
血液流態(tài)分級-，直線狀，紅細(xì)胞呈單個狀；+，虛線狀，紅細(xì)胞呈二、三個聚集狀；++，紅細(xì)胞呈團(tuán)狀聚集。試驗結(jié)果見表13。
表13 阿魏酸川芎嗪對大鼠軟腦膜微循環(huán)的影響(n＝10)

注(1)與模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
(2)統(tǒng)計學(xué)處理采用參比差值法。
由表13可見，假手術(shù)組大鼠軟腦膜微循環(huán)血液流速和流態(tài)均未見異常。模型組注射高分子右旋糖苷后，可見大鼠軟腦膜微循環(huán)障礙，5min、15min、30min三個時間點大鼠軟腦膜微循環(huán)血液流速明顯減慢，多為II級以上，紅細(xì)胞聚集多為二、三個聚集狀或團(tuán)絮狀，與假手術(shù)組比較均有顯著差異(p＜0.01)?？诜邉┝拷M和注射高劑量組，注射高分子右旋糖苷后大鼠軟腦膜微循環(huán)障礙明顯減輕，5min、15min、30min三個時間點的血液流速加快，多為II級以下，紅細(xì)胞聚集明顯減輕，多呈單個或二、三個聚集狀，與模型組比較均有明顯差異(p＜0.05，0.01)?？诜袆┝拷M，注射高分子右旋糖苷后可見大鼠軟腦膜微循環(huán)障礙，5min時的血液流速和流態(tài)均未見明顯改善；15min時血液微循環(huán)障礙明顯減輕，血液流速加快，多為II級以下，與模型組比較有明顯差異(p＜0.05)，紅細(xì)胞聚集有改善趨勢；30min時微循環(huán)障礙進(jìn)一步明顯減輕，血液流速加快，多為II級以下，紅細(xì)胞聚集明顯減輕，多呈單個或二、三個聚集狀，與模型組比較均有明顯差異(p＜0.05)?？诜蛣┝拷M和注射低劑量組，注射高分子右旋糖苷后，可見大鼠軟腦膜微循環(huán)障礙，5min、15min兩個時間點的血液流速和血液流態(tài)與模型組比較均無明顯差異，30min時的微循環(huán)障礙與模型組比較有減輕趨勢。陽性對照藥阿魏酸哌嗪組，注射高分子右旋糖苷后，大鼠軟腦膜微循環(huán)障礙程度相對較輕，5min、15min、30min三個時間點的血液流速均較快，多為II級以下，紅細(xì)胞聚集明顯減輕，多呈單個或二、三個聚集狀，與模型組比較均有明顯差異(p＜0.05，0.01)。
上述試驗結(jié)果表明口服或靜脈注射給藥后5min、15min、30min均可觀察到阿魏酸川芎嗪明顯減輕大鼠軟腦膜微循環(huán)障礙，其主要表現(xiàn)為增加血液流速(p＜0.05，0.01)，改善血液流態(tài)(p＜0.05，0.01)。提示阿魏酸川芎嗪具有改善軟腦膜微循環(huán)障礙的作用。
十一.阿魏酸川芎嗪的藥代動力學(xué)研究用大鼠進(jìn)行了H3-阿魏酸川芎嗪給藥途徑的藥物動力學(xué)研究，肌注及口服的血藥峰值分別為21分及33分?？诜?小時經(jīng)胃腸道吸收68.9％。肌注及口服的分布相半衰期分別為21分及30分，消除半衰期分別為2小時及5.5小時。以上結(jié)果說明該藥通過上述兩個給藥途徑都容易吸收，很快進(jìn)入血液，并在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移也快，不易導(dǎo)致蓄積。肌注給藥后在肺、肝、腎、腦及血液中分布較多，口服給藥后在肝、腎、心及血液中分布較多，這種分布狀況有利于該藥對心、腦血管疾病及肺、腎病患的治療。血漿蛋白結(jié)合率口服為30.5％，肌注為36.4％，說明該藥大部分以游離形式存在，易于透過生物膜。
十二.毒性觀察1.給小鼠灌食或注射最大給藥濃度和劑量都不致死，不能測出阿魏酸川芎嗪的半數(shù)致死量。
2.用阿魏酸川芎嗪進(jìn)行了大鼠致畸胎試驗、Ames試驗、小鼠骨髓微核試驗和染色體畸變試驗，證明該藥無致畸和致突作用。
3.用阿魏酸川芎嗪按設(shè)定劑量給SD大鼠(800、400、200mg/Kg)和Beagle犬(400、200、100mg/Kg)注射，隔日一次，共給藥3個月，并繼續(xù)觀察3個月，共計進(jìn)行了半年的長毒試驗觀察。觀察大鼠和犬只的體重情況，并對紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白、白細(xì)胞分類計數(shù)，測量血清轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、血液過氧化物酶、膽固醇、甘油三脂、血總脂、非蛋白氮、蛋白電泳、總蛋白、清蛋白、A/G比值等；并與正常對照組比較，均無顯著性差異，病理組織觀察也未見異常病變。
從以上實驗結(jié)果可以看出本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)本發(fā)明發(fā)掘出阿魏酸川芎嗪的醫(yī)療用途，開拓其應(yīng)用領(lǐng)域。
(2)本發(fā)明的阿魏酸川芎嗪經(jīng)動物試驗證明無明顯毒副作用，藥理作用強，有很好的藥用前景。
(3)本發(fā)明的物質(zhì)原料來源豐富；藥物制備工藝可行，可作成口服劑型或注射劑型，使用方便。
(4)本發(fā)明合成的藥物具有抗凝、抗血小板聚集、擴(kuò)張微血管、解除血管痙攣、增加冠脈流量等作用，適用于各種原因多致腎小球疾病，如腎炎、慢性腎炎、腎病綜合癥、尿毒癥；以及閉塞性心腦血管疾病如冠心病、脈管炎、腦供血不全、腦血栓形成、腦栓塞、腦血管病、腦卒中等。


圖1-圖3為阿魏酸川芎嗪的分析測試圖。
具體實施例方式下述為
具體實施例方式1、阿魏酸川芎嗪原料的制備方法將1-2重量份的阿魏酸，加入乙醇，加熱溶解。另取1重量份的川芎嗪加入乙醇加熱溶解，在攪拌下，趁熱將此溶液加入阿魏酸乙醇溶液中，冷卻，過濾，乙醇洗。用水或乙醇重結(jié)晶得阿魏酸川芎嗪晶體，干燥、粉碎得精制阿魏酸川芎嗪。
2、阿魏酸川芎嗪口服片劑的制備方法阿魏酸川芎嗪原料的制備同實施例1。
阿魏酸川芎嗪 100g淀粉 60g乳糖 30g 硬酯酸鎂 10g阿魏酸川芎嗪、淀粉、乳糖混勻，制粒，加硬酯酸鎂整一粒，壓片，共制成1000片，每片含主藥100mg3、阿魏酸川芎嗪膠囊的制備方法阿魏酸川芎嗪原料的制備同實施例1。
阿魏酸川芎嗪 100g淀粉 60g乳糖 30g 硬酯酸鎂 10g阿魏酸川芎嗪、淀粉、乳糖混勻，制粒，加硬酯酸鎂整一粒，裝膠囊，共制成1000粒，每粒含主藥100mg4、阿魏酸川芎嗪注射液的制備方法阿魏酸川芎嗪原料的制備同實施例1。
阿魏酸川芎嗪 100g吐溫80 0.2g 乙醇 1000g羥甲基纖維素鈉1g 注射用水10000ml共制成1000支 每支含主藥 100mg將阿魏酸川芎嗪加入注射用水中，配成所需的濃度，再加入處方量的輔料，充分溶解，濾過，灌封，滅菌，即得。
5、阿魏酸川芎嗪注射用無菌粉末的制備方法阿魏酸川芎嗪原料的制備同實施例1。
阿魏酸川芎嗪100g吐溫40 2g甘露醇1 40g對羥基苯甲酸乙酯0.2g注射用水5000ml共制成1000支每支含主藥 100mg阿魏酸川芎嗪注射用無菌粉末的制備為將精制的阿魏酸川芎嗪原料藥與處方量的輔料混合均勻，冷凍干燥，分裝(分裝前將小瓶及膠塞滅菌)，補充滅菌，包裝得阿魏酸川芎嗪注射用無菌粉末。
600.、阿魏酸川芎嗪輸液的制備方法阿魏酸川芎嗪原料的制備同實施例1。
阿魏酸川芎嗪 200g 吐溫20 200g 注射用水100Kg苯甲醇1000g 甘氨酸 1500g制成100ml/瓶阿魏酸川芎嗪輸液的制備為將精制的阿魏酸川芎嗪原料藥溶解在配液中，添加處方量的輔料混合均勻，濾過，灌封，滅菌，包裝得阿魏酸川芎嗪輸液。
權(quán)利要求
1.所有含阿魏酸川芎嗪及其所有藥學(xué)上可接受形式的化合物的藥物制劑在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪用于治療各種原因所致的腎小球疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪在治療腎炎藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪在治療慢性腎炎藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪在治療腎病綜合癥藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪在治療尿毒癥藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪用于治療心腦血管疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪在治療冠心病藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪在治療脈管炎藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪在治療腦供血不全藥物中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪在治療腦血栓藥物中的應(yīng)用。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪在治療腦栓塞藥物中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其特征在于阿魏酸川芎嗪在治療腦卒中藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及阿魏酸川芎嗪在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用。阿魏酸川芎嗪具有抗血小板聚集，擴(kuò)張微血管，解除血管痙攣，改善微循環(huán)，活血化淤作用，并對已聚集的血小板有解聚作用。用于治療各種原因所致的腎小球疾病，如腎炎、慢性腎炎，腎病綜合癥和尿毒癥等，還用于治療閉塞性以及閉塞性心腦血管疾病如冠心病、脈管炎、腦供血不全、腦血栓形成、腦栓塞、腦血管病、腦卒中等。
文檔編號A61P13/12GK1555803SQ20041002163
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者陳耀明, 李順蘭, 何以, 江南, 李杜鵑, 江云 申請人:成都世紀(jì)聯(lián)合生物醫(yī)藥有限公司