專利名稱：高純度植物磷脂酰肌醇化合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是以豆科植物種子為原料，建立一套簡便有效、提取、分離純化，大批量制備高純度植物磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol(簡稱PI)的生產(chǎn)工藝，并用此工藝制備的化合物，制成針劑及口服液乳劑、微囊或脂質(zhì)體。
我們是國內(nèi)外第一次將PI進(jìn)行了荷瘤動(dòng)物抑瘤注射及口服試驗(yàn)，并與環(huán)磷酰胺、紫杉醇等做了聯(lián)合用藥，均取得非常顯著的抑瘤效果(見附表1，2，3)。我們多年科研實(shí)踐證明，本發(fā)明的生產(chǎn)方法正確、合理，產(chǎn)品安全有效。
背景技術(shù)：
植物PI是磷脂類化合物最重要的成分之一，它不僅是細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，而且具有重要的生物活性，美國科學(xué)家(1983)首次發(fā)現(xiàn)高純度植物PI具有靶向、廣譜、殺傷多種癌細(xì)胞的活性[1]，2003年日本科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)植物PI化合物，還可能用于治療、預(yù)防老年癡呆癥(AD)[2]。
United States Patent 4，999.344Jett-Tilton，et al.March 12，1991(包括美國科學(xué)家1983第一篇文獻(xiàn))。
Neuros Lett.350105-8，2003.
至今，在PI的研究專利中，尚無大批量制備高純度PI的方法專利。
二十多年來，科研工作所用PI化合物，不論天然或化學(xué)合成的，幾乎都是從大型生化試劑公司購買，PI化合物商品已知都是用制備型TLC或與之相當(dāng)?shù)母芍鶎游黾夹g(shù)，再經(jīng)分離純化獲取小量產(chǎn)品(mg級(jí))，僅限于癌細(xì)胞和腦細(xì)胞科研用，至今尚無大批量制備高純度PI化合物的技術(shù)，也沒有用于動(dòng)物，更無口服實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，根據(jù)植物磷脂類各組分化合物的物理、化學(xué)性質(zhì)的差異，建立了一套簡便有效的提取工藝；再用新型大孔樹脂柱層析技術(shù)，建立制備PI化合物的精制工藝，使之能達(dá)到大批量工業(yè)化生產(chǎn)PI純品的目的。
本發(fā)明的主要目的是，應(yīng)用該方法生產(chǎn)PI化合物，為制備適于臨床口服或注射用藥物制劑提供基本原料。
本發(fā)明制備生產(chǎn)PI化合物的方法的特征是，應(yīng)用植物豆科種子，經(jīng)粉碎，有機(jī)溶劑浸提、水洗、有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)溶、酒精沉淀、離心、再經(jīng)大孔樹脂分離純化、在惰性氣體環(huán)境中，減壓干燥即可獲得PI化合物純品，純度大于96％。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)本發(fā)明的生產(chǎn)工藝簡便、有效，不需特殊設(shè)備；(2)生產(chǎn)中使用的大部分有機(jī)溶劑，尚可回收、套用，污染極小，大大降低成本；(3)應(yīng)用本發(fā)明的生產(chǎn)方法所制備的PI化合物與SIGMA標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同；(4)抑瘤生物活性極顯著，聯(lián)合用藥增效也極顯著；(5)應(yīng)用本發(fā)明的生產(chǎn)方法所制備的PI化合物符合針劑制劑的標(biāo)準(zhǔn)；(6)證明本發(fā)明工藝設(shè)計(jì)方法科學(xué)、合理，產(chǎn)品質(zhì)量、生物活性都達(dá)到藥用制劑標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式通過下述實(shí)例，可有助于理解本發(fā)明的基本內(nèi)容一.PI化合物初級(jí)純品的制備本發(fā)明是利用生物細(xì)胞膜總磷脂的各組分的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的差異，在不同溶劑(氯仿、甲醇、乙醇、水)，在不同溫度下(-20～50℃)，利用各化合物溶解度選擇性的差異，可有效分離出植物PI初級(jí)純品(TLC檢查，PI含量大于85％)。
實(shí)施例1.優(yōu)質(zhì)黑豆粉1Kg，加入氯仿∶甲醇∶水(1∶1∶1v/v)，(1∶2∶1v/v)，5-20倍體積，50C°以下浸泡24-72小時(shí)時(shí)，分出提取液，分層后減壓濃縮，若溶劑顯灰色，可加入藥業(yè)活性炭(3-5g)回流一小時(shí)，脫色、過瀘，瀘液再減壓濃縮，回收溶劑，得黑豆總磷脂(純度約85％)。
實(shí)施例2.優(yōu)質(zhì)黃豆粉1Kg，加入氯仿∶甲醇∶水(1∶1∶1v/v)，(1∶2∶1v/v)，5-20倍體積，50C°以下浸泡24-72小時(shí)時(shí)，分出提取液，分層后減壓濃縮，過瀘，瀘液再減壓濃縮，回收溶劑，得黃豆總磷脂(純度約85％)。黃豆得率高于黑豆。
二.PI化合物精品的制備實(shí)施例3.初級(jí)純品進(jìn)一步精制本發(fā)明是根據(jù)PI化合物總磷脂的組成、結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)的不同，為了進(jìn)一步提高PI純度，首次選用新型大孔樹脂柱層析技術(shù)，包括大孔強(qiáng)酸型樹脂，也可用大孔弱堿型樹脂，進(jìn)一步進(jìn)行純化，溶劑用氯仿∶甲醇(1∶1v/v)，(1∶2v/v)，或(2∶1v/v)；洗脫液在惰性氣體環(huán)境中，進(jìn)行減壓濃縮、真空干燥，即可有效分離、純化，獲得PI化合物純品，其純度大于96％。每Kg黃豆粉PI得率大于500mg，每克成本約200元RMB。
鑒別方法取上述方法獲得的PI純品，與SIGMA公司PI純品進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，使用高效硅膠板，溶劑系統(tǒng)為氯仿∶甲醇∶水∶氨水(65∶25∶4∶0.5v/v)，用磷鉬酸顯色劑噴霧顯色，結(jié)果顯示，本方法制備的PI純品，與進(jìn)口PI標(biāo)準(zhǔn)品Rf值一致。
對(duì)本發(fā)明制備的PI純品做了多次抑瘤生物活性驗(yàn)證，現(xiàn)列舉三個(gè)有代表性的抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果，列表如下
附表1，2，3，表1PI對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用 2001/12

PI給藥劑量為1500mg/Kg表2紫杉醇、PI及二者合用對(duì)小鼠S180抑瘤實(shí)驗(yàn) 2002/3/12

1.紫杉醇5mg/Kg×7d ip2.PI500mg/Kg×7dip3.聯(lián)合用藥紫杉醇 5mg/Kg+PI 500mg/Kg×7d ip表3環(huán)磷酰胺、PI對(duì)小鼠宮頸癌U14實(shí)體瘤的抑制作用 2003/1

(1)對(duì)照組給蒸餾水0.2ml只，PO×7d；(2)PI口服組500mg/kg×7d；*(3)PI腹腔注射組500mg/kg×3d(第三天意外死亡5只)；(4)CTX組20mg/kg×1d；(5)聯(lián)合用藥組PI 500mg/kg Po×7d+CTX 20mg/kgi p×1d*第(3)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物僅給PI三天，七天后檢查抑瘤效果，P值仍＜0.05，證明PI活性在體內(nèi)可維持很長時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種適于大批量、提取、分離、純化，制備磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)的方法，其特征是，植物豆科種子為原料，經(jīng)粉碎、有機(jī)溶劑浸提、分溶，有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)換，乙醇沉淀、離心，真空干燥，即可獲得PI化合物初級(jí)純品，純度約90％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PI制備方法，其特征是，由此制備方法所獲得的初級(jí)純品，再經(jīng)大孔樹脂處理，選用不同溶劑系統(tǒng)，達(dá)到進(jìn)一步分離、純化的目的，所制備的產(chǎn)品為高純度PI，純度大于96％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2.其特征是，我們首次應(yīng)用高純度PI制成乳劑、脂質(zhì)體，用于荷瘤動(dòng)物抑瘤實(shí)驗(yàn)，口服、注射抑瘤效果極顯著，與臨床常用抗癌藥聯(lián)合使用，增效作用也極顯著(見附表1，2，3)。
全文摘要
本發(fā)明以大豆為原料，經(jīng)溶劑提取、分離純化，制備磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)，初級(jí)品純度約85％，再利用大孔樹脂柱層析技術(shù)，建立一套簡便、高效、低成本、少污染，大批量制備高純度PI的新工藝，PI純度大于96％。大量實(shí)驗(yàn)證明，已知PI具有極顯著的選擇性殺傷多種人源癌細(xì)胞的活性(文獻(xiàn)1)，最新報(bào)道PI有望成為預(yù)防、治療老年癡呆癥的有效天然化合物(文獻(xiàn)2)。本發(fā)明可為開發(fā)危害人類健康的新藥研究提供基本原料。我們首次應(yīng)用本發(fā)明制備的高純度PI，制成乳劑、脂質(zhì)體，對(duì)荷瘤動(dòng)物進(jìn)行注射、口服抑瘤實(shí)驗(yàn)，證明單獨(dú)使用PI或與臨床常用抗癌藥物紫杉醇、環(huán)磷酰胺等聯(lián)用，皆顯示安全、有效、靶向、廣譜及增效的優(yōu)異特性。
文檔編號(hào)A61K9/50GK1727351SQ20041002010
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2004年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月26日
發(fā)明者商宗一 申請(qǐng)人:商宗一