一種人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗體及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗體，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；且所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。本發(fā)明還公開了上述全分子IgG抗體的DNA分子、表達載體、宿主細胞和應用。
【專利說明】
一種人鼠嵌合抗MESO的全分子I gG抗體及其應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物免疫技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體， 還涉及上述全分子IgG抗體的DNA分子、表達載體、宿主細胞和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 間皮素 （m e s 〇 t h e 1 i η，Μ E S 0 )前體多肽是通過磷脂酰肌醇 (glycophosphatidylinositol，GPI)錨定的一種糖基化的細胞表面蛋白，可以被裂解為 30kDa N端的分泌多肽和40kDa C端多肽仍與細胞表面結(jié)合，GPI錨定方式，被命名為間皮素 連接蛋白。Mesothel in在某些腫瘤細胞中高表達，尤其是間皮瘤細胞、胰腺腫瘤細胞和卵巢 癌細胞，而在正常組織表達受限，因此成為腫瘤治療的理想靶標。mesothelin的功能是未知 的，在mesothelin缺陷型小鼠中，沒有明顯的復制，血液異?；蚴墙馄十惓?。
[0003] 已有實驗證實抗MES0的抗體可以阻止相關(guān)腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移等。所以制備抗 MES0的抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種人鼠嵌合抗MES0的全 分子IgG抗體。
[0005] 本發(fā)明的目的又在于提供一種編碼上述人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體的DNA 分子。
[0006] 本發(fā)明的目的又在于提供一種含有能編碼上述人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體 的DNA分子表達載體。
[0007] 本發(fā)明的目的又在于提供一種被上述的表達載體所轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
[0008] 本發(fā)明的目的還在于提供一種編碼人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體的應用。
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗研究，包括:人鼠嵌合Fab噬菌體抗 體庫的篩選，抗MES0特異性抗體的純化，抗MES0全分子抗體I gG的制備、表達及純化，抗MES0 全分子抗體IgG的特性分析;最終獲得了一種人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體，包含輕鏈 可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，
[0010] (1)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，或者是該序列經(jīng)一個或 多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；
[0011] 且(2)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或者是該序列經(jīng)一個 或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0012] 優(yōu)選地，所述的輕鏈可變區(qū)的三個抗原互補區(qū)⑶R的氨基酸序列為SEQ ID N0.5、 SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重鏈可變區(qū)的三個抗原互補區(qū)⑶R的氨基酸序列 SSEQIDN0.8，SEQIDN0.^PSEQIDN0.1(^；f*。
[0013] 本發(fā)明還提出的一種人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體，包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈 恒定區(qū)，所述的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0.11所示，所述的重鏈恒定區(qū)的氨基 酸序列為SEQ ID NO. 12所示。
[0014] 本發(fā)明還提出的一種DNA分子，其編碼上述的全分子IgG抗體的重鏈或/和輕鏈。 [0015] 優(yōu)選地，其編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO. 1所示，編碼重鏈可變區(qū)的核 酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0016] 本發(fā)明還提出的一種表達載體，包含有上述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相 連的表達調(diào)控序列。
[0017] 本發(fā)明還提出的一種宿主細胞，被上述的表達載體轉(zhuǎn)化。
[0018]優(yōu)選地，該宿主細胞可以是被上述的表達載體轉(zhuǎn)化的293Freestyle細胞。
[00?9 ]本發(fā)明還提出的上述的全分子I gG抗體在制備與MES0相關(guān)的腫瘤的診斷試劑或治 療藥物中的用途。
[0020] 本發(fā)明通過雜交瘤技術(shù)獲得對MES0具有高度親和力的鼠源IgG抗體，并獲取了賦 予所述抗體優(yōu)異特性的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列，并將所述抗體的重 鏈和輕鏈可變區(qū)與含有人IgGl抗體恒定區(qū)的表達載體連接，最終獲得了具有特異的抗原結(jié) 合性和在細胞學上證明抗體可以抑制腫瘤細胞的增殖。
[0021] 本發(fā)明提供了一種具有高特異性、良好親和力的抗MES0的人鼠嵌合單克隆抗體。 MES0在某些腫瘤細胞中高表達，尤其是間皮瘤細胞、胰腺腫瘤細胞和卵巢癌細胞，而在正常 組織表達受限，因此本發(fā)明的抗MES0抗體可應用于有關(guān)MES0陽性的腫瘤的診斷和治療。本 發(fā)明以MES0為靶分子，利用雜交瘤技術(shù)制備鼠源抗體，然后利用基因工程技術(shù)制備人鼠嵌 合抗體。對制備的人鼠嵌合抗MES0抗體做功能鑒定，顯示該抗體能夠與MES0特異性結(jié)合，體 外細胞實驗證實抗體能夠抑制MSE0陽性的腫瘤細胞的增殖。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明實施例1所得純化人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體的SDS-PAGE檢測 結(jié)果；其中Μ為蛋白分子量標準品，1為抗MES0抗體，2為細胞培養(yǎng)上清，3為流穿；可見使用 Pro. Α柱純化抗MES0抗體的純度高。
[0023]圖2為本發(fā)明實施例1所得抗MES0抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測結(jié)果，可見抗MES0 抗體與MES0蛋白的結(jié)合能力較強。
[0024]圖3為本發(fā)明實施例1所得抗MES0抗體的免疫印跡鑒定結(jié)果；其中1為抗MES0抗體 與MES0陽性人肺癌細胞NCI-H226;2為抗MES0抗體與MES0陰性的人正常上皮細胞BEAS-2B; 可見抗體與MES0蛋白有特異性結(jié)合能力。
[0025]圖4為本發(fā)明實施例1所得抗1^50抗體的親和力檢測結(jié)果，1(0值為5.561乂1〇4、。 [0026]圖5為本發(fā)明實施例1所得抗MES0抗體對MES0陽性人肺癌細胞NCI-H226的殺傷作 用，實驗結(jié)果顯示抗體濃度在15ymol/mL時可以使細胞存活率降低至25%，而對正常的肺上 皮細胞沒有影響。
【具體實施方式】
[0027]下面，通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。
[0028]實施例1人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體的制備
[0029] 1)用MES0抗原免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)獲得抗MES0的鼠源單克隆抗體，然后通 過PCR擴增測序獲得抗體的可變區(qū)序列。
[0030] 2)根據(jù)已獲得的抗體的重輕鏈可變區(qū)序列，設(shè)計引物。
[0031 ] 3)擴增抗MES0抗體重鏈、輕鏈。
[0032] 以上述制備的鼠源IgG為模板，分別以上述涉及的重鏈和輕鏈的上下游引物擴增 全分子人源抗體重鏈、輕鏈基因。
[0033] (l)PCR
[0034] 反應體系如下：
[0035]
[0036]
[0037]反應條件如下：
[0038]
[0039] (2)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下觀察目的條帶，切膠回收。
[0040] (3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。
[0041 ] 4)雙酶切IgG表達質(zhì)粒
[0042] IgG表達質(zhì)粒pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk(購自 Invivogen公司）包含IgGl型 人源的重鏈和輕鏈(Kappa)恒定區(qū)堿基編碼序列。
[0043] (1 )pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk 模板載體的雙酶切
[0044] 反應體系如下：
[0045]
[0046] 反應條件為:37 °C酶切過夜。
[0047] (2)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下切膠回收。
[0048] (3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。
[0049] 5)Infusion PCR重組表達質(zhì)粒
[0050] 反應體系如下：
[0051]
[0052] 反應條件為：5(TC孵育15min。
[0053]取5yL反應液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，鋪于相應抗性的平板上，次日挑克隆送測序。將測 序結(jié)果正確的克隆保存菌種并擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。
[0054] 6)抗MES0抗體的表達
[0055] (1)取50yg重組后的重鏈質(zhì)粒于lmL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，取50yg的輕鏈質(zhì)粒于 lmL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，取200yL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，將上述三種 混合液室溫靜置5min。
[0056] (2)然后將兩個質(zhì)?；旌弦夯旌暇鶆蚝螅a加500yL的Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻后 直接加入轉(zhuǎn)染試劑293Fectin的混合液，混合均勻后靜置20min。期間處理293F細胞，將293F 細胞離心后用293F Expression Medium重懸，然后計數(shù)以及用臺盼藍計算細胞活力比，吸 取1.00X108個細胞于培養(yǎng)瓶中，用293F Expression Medium定容為94mL。
[0057] (3)20min結(jié)束后將6mL的DNA、293Fectin的復合物加入準備好的293F細胞中。
[0058] (4)將細胞放在搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件8 %⑶2,120rmp，37 °C，6天后收集細 胞上清。
[0059] 7)抗MES0抗體的純化
[0060] 將收集的細胞上清用0.22μπι的濾膜過濾，同時將平衡液和洗脫液過濾膜。用AKATA 純化儀按照Protein Α純化的標準步驟純化，以lmL/min的速度上樣，以1.5mL/min的速度洗 脫。
[0061 ] 結(jié)果成功表達并純化抗MES0抗體。將純化抗MES0抗體進行SDS-PAGE檢測，其結(jié)果 如圖1所示，由圖1可知純化的抗體純度很高，且用Pro. A柱純化效果較好。
[0062]實施例2抗MES0抗體的功能活性鑒定 [0063] 1)酶聯(lián)免疫法
[0064]用包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6 )MES0蛋白至2yg/mL包被ELISA96孔板，每孔 加入100yL，4 °C過夜;PBST (PBS含0.5 % TWeen20) 5 %脫脂牛奶-洗滌緩沖液封閉，37 °C孵育 2h; PBST洗滌5次后，每個孔中加入100yLPA21抗體(2yg/mL起始濃度，14個濃度梯度稀釋)37 °C 2h;以1:4000稀釋的羊抗人二抗lOOyL/孔加入到孔內(nèi)，37 °C孵育lh;過氧化物酶底物顯色 液100μL7孔，室溫下10分鐘后用2M硫酸中止反應，上機檢測比色采用雙波長450nm/690nm。
[0065] 結(jié)果如圖2示所示，由圖2可知:抗MES0抗體能與MES0蛋白起抗原抗體反應。
[0066] 2)ffestern blot
[0067] 將MES0陽性人肺癌細胞NCI-H226和MES0陰性的人正常上皮細胞BEAS-2B，進行 10%SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，將此膜與2yg/mL PA21抗體室溫孵育lh，1:4000 稀釋HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司）和ECL發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司）曝光于凝膠成像 系統(tǒng)(Bio-Rad公司）。
[0068] 結(jié)果如圖3所示，由圖3可知：抗MES0抗體與人肺癌細胞NCI-H226表達的MES0蛋白 有特異性結(jié)合。
[0069] 3)親和力檢測
[0070] 根據(jù)MES0蛋白的等電點以及按照BiacoreXlOO control soft的protocol優(yōu)化偶 聯(lián)條件，斜率優(yōu)化選擇醋酸鈉作為偶聯(lián)稀釋緩沖液。用此緩沖液稀釋MES0樣品稀釋至25ug/ ml后偶聯(lián)到CM5芯片上。預設(shè)偶聯(lián)水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀釋MES0樣 品，稀釋一系列濃度至0uM、5nM、10nM 20碰、4〇11]\1、8〇11]\1。設(shè)置進樣時間為18〇8，解離時間 10min，再生緩沖液用50mMpH2 · 2Gly_HCl。按照BiacoreXlOO control soft的protocol進行 上機測試。
[0071] 親和力檢測結(jié)果如圖4所示，KD值為5.561X10-1()M。
[0072] 4)MES0抗體對MES0陽性腫瘤殺傷
[0073] 將被試人肺癌細胞NCI-H226和人正常上皮細胞BEAS-2B培養(yǎng)在含有10%小牛血清 (FBS)和1%抗生素(P/S)的DMEM培養(yǎng)基中，37°C5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)良好 后轉(zhuǎn)種在96微孔細胞培養(yǎng)板上，過夜培養(yǎng)當細胞生長在96微孔細胞培養(yǎng)板上達70 %時，無 菌條件下加入不同劑量的抗體，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，顯微鏡下觀察細胞死亡情況并照相，然后 加 Cell Titer 96 aqueous nonradioactive cell Proliferation assay(Promega MI)檢 查LDH，計算分析細胞死亡百分數(shù)，實驗重復三次。
[0074]抗MES0抗體與肺癌細胞的相互作用結(jié)果如圖5所示，由圖5可知:在抗體的作用下， MES0陽性的肺癌細胞，細胞存活率為25 %左右，而對MES0陰性人正常肺上皮細胞沒有殺傷 作用。
[0075] 上述文中Μ為mol/L的含義。
[0076] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗體，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其特征在 于， (1)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個 氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體； 且（2)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經(jīng)一個或多 個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述全分子IgG抗體，其特征在于，所述的輕鏈可變區(qū)的三個抗原互 補區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQIDN0.5、SEQIDN0.6和SEQIDN0.7所示 ；所述的重鏈可變 區(qū)的三個抗原互補區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQIDN0.8，SEQIDN0.9和SEQIDN0.10所示。3. -種人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體，包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)，其特征在 于，所述的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO. 11所示，所述的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序 列為SEQ ID NO. 12所示。4. 一種DNA分子，其編碼權(quán)利要求1-3任一項所述的全分子IgG抗體的重鏈或/和輕鏈。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQID NO. 1所示，編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO.2所示。6. -種表達載體，包含有權(quán)利要求4或5所述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相連的 表達調(diào)控序列。7. -種宿主細胞，被權(quán)利要求6所述的表達載體轉(zhuǎn)化。8. 權(quán)利要求1-3任一項所述的全分子IgG抗體在制備與MES0相關(guān)的腫瘤的診斷試劑或 治療藥物中的用途。
【文檔編號】C07K16/26GK106084044SQ201610483246
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】馮振卿, 唐奇, 許國貞, 劉振云, 朱進, 蒯興旺, 章明炯
【申請人】安徽未名細胞治療有限公司