專利名稱：一種人端粒酶活性抑制蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的人端粒酶活性抑制蛋白MCRS2(microspherule protein 2)及其編碼序列。本發(fā)明還涉及MCRS2多核苷酸和多肽的用途和制備。
背景技術(shù)：
已有的研究表明80％的腫瘤細(xì)胞具有端粒酶活性，抑制端粒酶活性可以使腫瘤細(xì)胞衰老并走向死亡。
LPTS是一種已知的人端粒酶抑制蛋白。LPTS基因定位于人第8號染色體8p23區(qū)段，該區(qū)段在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高頻缺失。研究表明LPTS在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中表達(dá)量極低或檢測不到，因此LPTS與肝癌相關(guān)[C.Liao，M.J.Zhao，H.Song，K.Uchida，K.K.Yokoyama，T.P.Li，Identification of the gene for a novelliver-related putative tumor suppressor at a high-frequency loss of heterozygosityregion of chromosome 8p23 in human hepatocellular carcinoma.Hepatology 32(2000)721-727]。
進(jìn)一步的研究表明LPTS基因可抑制腫瘤細(xì)胞的生長，并可以抑制端粒酶活力。在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)LPTS，引起細(xì)胞端粒變短，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞衰老，凋亡[C.Liao，M.J.Zhao，J.Zhao，D.Jia，H.Song，Z.P.Li，Over-expression of LPTS-L inhepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 induces crisis.World J Gastroenterol.8(2002)1050-1052.；X.Z.Zhou，K.P.Lu，The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is apotent telomerase inhibitor.Cell 107(2001)347-359.]。因此，LPTS是一個非常重要的端粒酶抑制蛋白，尋找與LPTS相互結(jié)合的蛋白有利于了解LPTS作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)新的作用于端粒酶活性抑制途徑的蛋白，并可協(xié)同LPTS在腫瘤治療中發(fā)揮作用。然而，迄今為止本領(lǐng)域已發(fā)現(xiàn)的與端粒酶抑制蛋白相關(guān)的蛋白極為有限，更沒有發(fā)現(xiàn)與LPTS相互作用且具有端粒酶抑制活性的蛋白。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的端粒酶活性抑制蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的端粒酶活性抑制蛋白MCRS2以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的MCRS2多肽，它包括具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制端粒酶活性的功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2中1-475位或1-162位氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸含有一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人MCRS2多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2中1-475位或1-162位所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中173-1597位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1953位的序列；或(c)具有SEQ ID NO1中173-658位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人MCRS2蛋白活性的多肽的方法，該方法含有(a)在適合表達(dá)人MCRS2蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人MCRS2蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人MCRS2多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人MCRS2多肽活性的化合物，以及抑制人MCRS2多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人MCRS2多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在MCRS2蛋白的方法，它包括將樣品與MCRS2蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在MCRS2蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人MCRS2多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如，本發(fā)明多肽可被用于制備用于治療腫瘤的藥物、用于制備抑制端粒酶活性的組合物，用于篩選促進(jìn)人MCRS2多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人MCRS2多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人MCRS2蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人MCRS2多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療與端粒酶活性過高有關(guān)的疾病，例如癌癥等病癥。還提供了抑制端粒酶活性的組合物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1是10％SDS-PAGE電泳顯示MCRS2重組表達(dá)蛋白。其中，6×His-MCRS2，GST-MCRS2-N和GST分別為大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白，并經(jīng)親和柱層析。電泳后膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色液染色。
圖2顯示了對抗MCRS2專一性抗體的檢測。其中，293T細(xì)胞表達(dá)的FLAG-MCRS2蛋白作為陽性對照，轉(zhuǎn)染空載體的293T細(xì)胞的蛋白提取液作為陰性對照。
圖3顯示了MCRS2蛋白與LPTS蛋白的相互結(jié)合。A.MCRS2與LPTS免疫共沉淀實驗。293T細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染FLAG-MCRS2表達(dá)質(zhì)粒，細(xì)胞裂解液用LPTS抗體免疫沉淀，用FLAG抗體檢測免疫沉淀復(fù)合物，其中，“input”表示陽性對照，即顯示LPTS免疫共沉淀前細(xì)胞裂解液中的FLAG-MCRS2蛋白。B，C.GST-pulldown檢測MCRS2與LPTS在體外的結(jié)合。D.考馬斯亮藍(lán)染色GST，GST-LPTS蛋白。E.免疫共沉淀及GST pulldown檢測MCRS2與hTERT的體內(nèi)結(jié)合。
圖4顯示了轉(zhuǎn)染MCSR2或MCRS2-N使SMMC-7721細(xì)胞的端粒變短。其中，A，穩(wěn)定表達(dá)MCRS2的細(xì)胞。B.穩(wěn)定表達(dá)MCRS2-N的細(xì)胞。
圖5顯示了MCRS2或者M(jìn)CRS2的N端在體外抑制端粒酶的活性。其中，TRAP方法分析顯示6His-MCRS2及GST-MCRS2-N具有體外抑制端粒酶的活性。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，利用酵母雙雜交篩選方法首次獲得的與人端粒酶抑制蛋白LPTS結(jié)合的蛋白MCRS2。MCRS2與LPTS在體內(nèi)與體外都有結(jié)合活性，并表達(dá)定位在細(xì)胞核仁和端粒上。MCRS2可以使肝癌細(xì)胞SMMC-7721的染色體端粒變短，并且體外實驗證明了MCRS2蛋白具有端粒酶抑制活性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語“MCRS2蛋白”、“MCRS2多肽”或“端粒酶活性抑制蛋白MCRS2”可互換使用，都指具有人端粒酶活性抑制蛋白MCRS2氨基酸序列(SEQ IDNO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的端粒酶活性抑制蛋白MCRS2。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的MCRS2蛋白或多肽”是指MCRS2多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化MCRS2蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。MCRS2多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人MCRS2蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人MCRS2蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人MCRS2多肽”指具有人MCRS2蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人MCRS2蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能，尤其是添加6His或GST等便于分離純化的元件而形成的融合蛋白。該術(shù)語還包括人MCRS2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人MCRS2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人MCRS2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如含有人MCRS2多肽或其片段的融合蛋白。
除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人MCRS2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人MCRS2多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。尤其是含有MCRS2的N端至少162個氨基酸的活性片段。
發(fā)明還提供人MCRS2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人MCRS2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人MCRS2蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NOl所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼MCRS2蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人MCRS2核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或MCRS2蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的MCRS2多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人MCRS2多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人MCRS2多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人MCRS2編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
含有上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人MCRS2蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療MCRS2蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)筂CRS2蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人MCRS2蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人MCRS2蛋白功能的多肽分子。此外，MCRS2可用于抑制端粒酶的活性，進(jìn)而用于治療各種與端粒酶活性過高有關(guān)的疾病，如各種腫瘤。
另一方面，本發(fā)明還包括對人MCRS2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人MCRS2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人MCRS2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人MCRS2蛋白的分子，也包括那些并不影響人MCRS2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人MCRS2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人MCRS2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人MCRS2蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人MCRS2蛋白功能的抗體以及不影響人MCRS2蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人MCRS2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人MCRS2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人MCRS2蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人MCRS2蛋白。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人MCRS2蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人MCRS2蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人MCRS2蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人MCRS2蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與MCRS2蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于與端粒酶活性過高有關(guān)的疾病，例如癌癥方面的治療。在使用本發(fā)明MCRS2蛋白時，還可同時使用其他腫瘤治療劑，如順鉑、TNF等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明MCRS2多肽以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的MCRS2蛋白施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人MCRS2蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于MCRS2蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的MCRS2蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達(dá)變異的MCRS2蛋白，以抑制內(nèi)源性的MCRS2蛋白活性。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將MCRS2基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶MCRS2基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人MCRS2基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制人MCRS2 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與人MCRS2蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時，必須對人MCRS2蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人MCRS2蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人MCRS2蛋白水平，可以用作解釋人MCRS2蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷MCRS2蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在MCRS2蛋白的方法是利用MCRS2蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與MCRS2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在MCRS2蛋白。
MCRS2蛋白的多聚核苷酸可用于MCRS2蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，MCRS2蛋白的多聚核苷酸可用于檢測MCRS2蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下MCRS2蛋白的異常表達(dá)。如MCRS2 DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷MCRS2蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用MCRS2蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測MCRS2蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測MCRS2基因的突變也可用于診斷MCRS2蛋白相關(guān)的疾病。MCRS2蛋白突變的形式包括與正常野生型MCRS2 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明MCRS2蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人肝cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它含有的多核苷酸序列全長為1757個堿基，其開放讀框位于173-1597位，編碼全長為475個氨基酸的人MCRS2蛋白(SEQ ID NO2)。鑒于80％的腫瘤細(xì)胞具有端粒酶活性，而抑制端粒酶活性可以使腫瘤細(xì)胞衰老并走向死亡，因此MCRS2蛋白可為治療與端粒酶活性過高有關(guān)的疾病，例如癌癥等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1MCRS2蛋白cDNA的克隆應(yīng)用常規(guī)的酵母雙雜交技術(shù)篩選LPTS的相互作用蛋白，將編碼LPTS的cDNA插入pGilda載體(購自Clontech公司)，用于篩選人腦cDNA文庫(Clontech)，方法根據(jù)公司提供的操作規(guī)程。將篩選到的陽性克隆驗證后測序，并將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較。
根據(jù)序列信息，設(shè)計引物，進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，PCR反應(yīng)引物為P1(SEQ ID NO3)，P2(SEQ ID NO4)，以肝臟的cDNA文庫質(zhì)粒(GIBCO BRL公司產(chǎn)品)為模板，PCR擴(kuò)增獲得MCRS2基因cDNA。PCR反應(yīng)條件為25μl體積，94℃4分鐘預(yù)變性，循環(huán)反應(yīng)為94℃30秒，50℃30秒，72℃2分鐘，共進(jìn)行35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收純化。
經(jīng)全序列測序(由博亞公司測定)，獲得的cDNA全長為1953bp(SEQ ID NO1)，包含了一個完整的蛋白編碼區(qū)(第173-1597位)，編碼了一個由475個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。
實施例2、MCRS2蛋白的重組表達(dá)和純化(a)MCRS2蛋白的重組表達(dá)將實施例1中獲得的MCRS2核苷酸序列，經(jīng)EcoRI和XhoI酶切后裝入相同酶切的6×His-融合表達(dá)載體pET-30((Novagen公司)，獲得表達(dá)載體6×His-MCRS2。
含有MCRS2 N端162個氨基酸的cDNA片段(對應(yīng)于SEQ ID NO1中173-658位)通過EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)裝入GST-融合表達(dá)載體pGEX-4T1(Amersham公司)中，獲得的質(zhì)粒命名為GST-MCRS2-N。
然后將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-DE3，獲得MCRS2/BL21-DE3，MCRS2-N/BL21-DE3轉(zhuǎn)化菌株。對于獲得的陽性轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)擴(kuò)增后，抽取質(zhì)粒并以相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶鑒定，并通過DNA測序確證。
經(jīng)鑒定的MCRS2/BL21-DE3，MCRS2-N/BL21-DE3轉(zhuǎn)化菌株，按照1∶20比例接種于LB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含有10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl)中，37℃培養(yǎng)3小時左右至OD600為0.6-0.8時，加入IPTG至終濃度0.5mM，誘導(dǎo)表達(dá)3～4小時，然后6000rpm，10分鐘離心收集菌體，用于以下的蛋白質(zhì)分離純化。
(b)分離純化6×His-MCRS2蛋白離心收集菌體，重懸于30ml NTA-0(20mmol/L Tris-HCLpH7.9，0.5mmol/L NaCL，10％甘油)中，加入苯甲基磺酰氟(PMSF)至0.5mmol/L，超聲破碎菌體后，加入Triton X-100至1％終濃度，4℃，13000rpm/min離心，20min，收集上清，轉(zhuǎn)移到事先用20mlNTA-0平衡的3S NTA樹脂親和層析柱上，然后用30ml NTA-0洗層析柱，接著依次用5mlNTA-20(20mmol/L Tris-HCl pH7.9，0.5mmol/L NaCL，10％甘油，20mmol/L咪唑)，NTA-40，NTA-80，NTA-100，NTA-200洗脫，收集洗脫液，每管1ml。SDS-PAGE分析蛋白分布，Bradford法測定蛋白濃度。
GST-MCRS2-N融合蛋白離心收集菌體，用10mL溶液A(20mM Tris/pH7.4，0.2mM EDTA，1mM DTT，0.5mM PMSF，1M NaCl)重懸菌體，超聲波破細(xì)胞，每次15秒，間隔45秒，共超生波10次，加入TritonX-100至1％終濃度，冰上放置30分鐘，9,500rpm，4℃離心10分鐘，重復(fù)離心一次。用20～30mL溶液A平衡谷胱甘肽-瓊脂糖裝柱，將菌體離心上清上柱，20～30mL溶液A洗柱子，然后用20～30mL溶液B(20mMTris/pH7.4，0.2mM EDTA，0.1M NaCl)洗柱子，用5mL含15mM終濃度的還原型谷胱苷肽的溶液C(15mM還原型谷胱苷肽于溶液B中)洗脫蛋白。
制備的純化蛋白，經(jīng)10％SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色液染色，結(jié)果如圖1所示。
實施例3、抗MCRS2蛋白抗體的制備取300μg純化的6×His-MCRS2融合蛋白，溶解于0.5mL PBS中，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分混勻，皮內(nèi)多點(diǎn)注射于2.0kg雄性新西蘭大白兔背部。第三天，再次以同樣蛋白量用弗氏完全佐劑充分混勻后，皮內(nèi)多點(diǎn)注射于背部。第28天，以同樣蛋白量用弗氏不完全佐劑混勻后，背部皮內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。在此一周后，頸動脈放血收集血液，37℃放置3小時，4℃放置過夜以使血清完全析出，離心收集血清，分裝，-70℃保存。抗體的特異性檢測方法如下將1.5μgFLAG-MCRS2質(zhì)粒用10μl Lipofectamine(GIBCOL BRL公司產(chǎn)品)混合后轉(zhuǎn)染在60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法見GIBCOL BRL公司提供的實驗操作規(guī)程。48小時后收集細(xì)胞，用300μl TritonX-100裂解液(10mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，10mM EDTA，10mM EGTA，1％TritonX-100，1mM PMSF，10mM DTT，5μg/ml aprotinin)裂解。取出50μl裂解物加入等量2×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10分鐘，細(xì)針頭剪切DNA，離心去沉淀。取10μl上樣于15％SDS聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠，進(jìn)行蛋白電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(NEN公司產(chǎn)品)。用MCRS2抗體進(jìn)行免疫印跡，再用辣根過氧化物酶(HRP)交聯(lián)的二抗(Santa Cruz公司產(chǎn)品)進(jìn)行雜交。最后用化學(xué)發(fā)光試劑檢測，壓X光片1分鐘。
結(jié)果如圖2所示，在轉(zhuǎn)染了FLAG-MCRS2的細(xì)胞中，檢測到一條專一性的蛋白條帶，而在轉(zhuǎn)染了空載體的細(xì)胞中，沒有檢測到蛋白帶，這說明得到了專一識別MCRS2的多克隆抗體。
實施例4、MCRS2與LPTS的相互作用的實驗驗證將各種質(zhì)粒的分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法如實施例3所述，培養(yǎng)48小時后收集細(xì)胞。細(xì)胞用裂解緩沖液[20mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1mMEDTA，0.5％ Nonidet-P40，1mM苯甲基磺酰氯(phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF)，1mM抑蛋白酶肽(aprotinin)和1mM亮抑蛋白酶肽(leupeptin)]在4℃裂解0.5h.，離心收集裂解液上清備用。
體外合成35S-MCRS2蛋白使用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液系統(tǒng)TNT試劑盒(Promega公司)。
蛋白質(zhì)相互結(jié)合實驗是在上述細(xì)胞裂解液或35S-Met標(biāo)記的蛋白中加入相應(yīng)的重組蛋白或抗體，4℃放置2h，接下來加入15μl蛋白A珠或者谷胱甘肽-瓊脂糖珠(Amersham)，4℃放置2h。珠用裂解緩沖液洗滌3-4次，重懸于30μl蛋白上樣緩沖液中(50mM Tris-HCl，pH6.8，100mM DTT，2％SDS，20％甘油，0.2mg/ml溴酚蘭)。10μl樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(NEN公司產(chǎn)品)，用相應(yīng)的抗體檢測，檢測方法如實施例3所述。
(1)免疫共沉淀實驗將表達(dá)FLAG-MCRS2的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48小時后制備細(xì)胞裂解液，在細(xì)胞裂解液中加入anti-LPTS抗體，進(jìn)行免疫共沉淀。在加入anti-LPTS抗體的免疫沉淀復(fù)合物中，檢測到FLAG-MCRS2蛋白，加入免疫前血清作為對照的免疫沉淀復(fù)合物中沒有檢測到FLAG-MCRS2蛋白(圖3A)，因此證明MCRS2在體內(nèi)與LPTS是結(jié)合的。
(2)GST-pull down實驗該試驗用于驗證MCRS2與LPTS在體外的結(jié)合。方法如下在體外合成的35S-MCRS2蛋白中加入GST-LPTS重組蛋白，如圖3B所示，35S-MCRS2與GST-LPTS能在體外結(jié)合，與作為對照的GST蛋白不結(jié)合。因此證明MCRS2與LPTS在體外也是結(jié)合的。為了確定LPTS與MCRS2作用的區(qū)域，將GST-LPTS-N(包含LPTS蛋白N端132個氨基酸)、GST-LPTS-C(包含LPTS蛋白C端133-328氨基酸殘基)，以及GST-LPTS融合蛋白加入到瞬時表達(dá)FLAG-MSCR2的細(xì)胞裂解液中，進(jìn)行GST-pull down實驗。結(jié)果表明LPTS的N端與C端都能與MCRS2結(jié)合(圖3C)。大腸桿菌表達(dá)純化的上述蛋白見圖3D。
(3)免疫共沉淀實驗該試驗用于驗證MCRS2與hTRET在體外的結(jié)合。將FLAG-MCRS2和GFP-hTERT表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，用anti-FLAG抗體進(jìn)行免疫共沉淀，然后用GFP抗體檢測GFP-hTERT。如圖3E所示，在FLAG免疫沉淀復(fù)合物中，可以檢測到GFP-hTERT，這說明在體內(nèi)MCRS2與端粒酶復(fù)合物是結(jié)合在一起的。
實施例5、體外細(xì)胞實驗證明MCRS2可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞端粒變短。
將MCRS2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞SMMC-7721，篩選表達(dá)FLAG-MCRS2及FLAG-MCRS2-N(包含MCRS2的N端162個氨基酸殘基)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(圖4A，B)。方法如下，在六孔板中，按照每孔2×105細(xì)胞量接種SMMC-7721肝癌細(xì)胞于2mL完全培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；制備溶液A溶解1.5μg細(xì)胞轉(zhuǎn)染級超純DNA(FLAG-MCRS2和FLAG-MCRS2-N)于100μL無血清無抗生素的培養(yǎng)基中；制備溶液B5μL LipofectAMIN(GIBCO BRL公司產(chǎn)品)試劑稀釋于100μL無血清無抗生素的培養(yǎng)基中?；旌先芤篈、B，室溫放置45分鐘，形成脂質(zhì)體顆粒。依次用PBS，無血清無抗生素的培養(yǎng)基潤洗細(xì)胞。在形成脂質(zhì)體顆粒的管中加入0.8mL無血清無抗生素的培養(yǎng)基，輕輕混勻后加到潤洗過的細(xì)胞上，37℃轉(zhuǎn)染5小時。在每個孔中加入含有10％新生牛血清的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時后，換為新鮮完全培養(yǎng)基。然后按1∶10細(xì)胞分瓶后加入適當(dāng)濃度的G418，篩選帶有Neo基因抗性的細(xì)胞。獲得的抗性細(xì)胞即為FLAG-MCRS2和FLAG-MCRS2-N穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。然后測定細(xì)胞端粒的長度。采用TRF(terminal restrictionfragment)Southern技術(shù)分析端粒的長度。將細(xì)胞的基因組DNA抽提出來，取10μgDNA用HinfI和RsaI酶切后，經(jīng)0.7％瓊脂糖分離。膠在0.5M NaOH/1.5M NaCl變性30min，在0.5M Tris-HCl/3M NaCl(pH7.5)中合30min，進(jìn)行Southern印跡分析。探針是32P末端標(biāo)記的單鏈(TTAGGG)6DNA。
實驗證明轉(zhuǎn)染空載體的對照用細(xì)胞其端粒長度是一致的，沒有變短。而表達(dá)FLAG-MCRS2及FLAG-MCRS2-N的穩(wěn)定細(xì)胞株，隨著不斷的傳代，它們的端粒在不斷的減少(圖4A和B)。說明MCRS2能在細(xì)胞體內(nèi)抑制端粒的合成。
實施例6、MCRS2體外抑制端粒酶活性用大腸桿菌表達(dá)的重組MCRS2蛋白進(jìn)行體外抑制端粒酶活性測定。將6×His-MCRS2及GST-MCRS2-N加入到細(xì)胞裂解液中，4℃孵育10分鐘，然后進(jìn)行端粒酶活性測定。采用通常的TRAP(telomeric repeat amplification protocol)方法檢測端粒酶活性。該方法是一種基于PCR技術(shù)的端粒酶活性檢測方法。具體操作如下培養(yǎng)細(xì)胞用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞；(1).用洗滌緩沖液(10mM Hepes-KOH(pH7.5)，1.5mMMgCl2，10mM KCl，1mM DTT(二硫蘇糖醇))再次洗一遍細(xì)胞；(2)用冰預(yù)冷的裂解緩沖液(10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.1mM PMSF，5mM巰基乙醇，0.5％CHAPS，10％甘油)重懸細(xì)胞，置冰上30分鐘，4℃高速離心30分鐘，上清細(xì)胞提取物可用來測定端粒酶活性。上清提取物可在-70℃保存，端粒酶活性可以經(jīng)受多次的凍溶仍保持穩(wěn)定；(3).反應(yīng)管內(nèi)加入1μL Ts引物(0.1μg/μL)，1μL細(xì)胞提取物上清，0.25μL 10mM dNTP，42μL反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，63mM KCl，0.005％Tween-20，1mM EGTA，0.1mg/mL BSA)。25℃延伸反應(yīng)30分鐘，90℃滅活3分鐘；(4)加入1μL Cx primer，0.5μL(2U)Taq酶；進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃2min；94℃40sec，50℃40sec，72℃1min，30cycles；(5)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行10％PAGE非變性膠電泳，緩沖液為0.5×TBE，電壓100V，6～8小時；6.PAGE膠銀染顯色，拍照。
Ts引物5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′(SEQ ID NO5)Cx引物5′-(CCCTTA)3CCCTAA-3′(SEQ ID NO6)實驗結(jié)果見圖5。實驗證明6×His-MCRS2及GST-MCRS2-N都具有端粒酶抑制活性，并呈現(xiàn)濃度依賴性，即端粒酶活性隨MCRS2蛋白濃度的增加而下降。對照GST蛋白沒有抑制活性。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>一種人端粒酶活性抑制蛋白及其應(yīng)用<130>041783<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1953<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(173)..(1597)<223>
<400>1cccctgggcc agcaccaccc atgtacctgt cggcagagcc acagttgact gacttgctgt 60tgagctgctg ctctttagca cggctgcatt ttgatggcag agggagcagt tatgcccaga120gcccagcgtg tcggcatcac cagtctgacc tgagcaccat gtgctgcacg ac atg aca178Met Thr1cgt ggc acc ggg gga act gcc cag cgt gga agg tct ggg cca gat tct 226Arg Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gln Arg Gly Arg Ser Gly Pro Asp Ser5 10 15cag ggg ctg cta gat tca tcc ctg atg gca tca ggc act gcc agc cgc 274Gln Gly Leu Leu Asp Ser Ser Leu Met Ala Ser Gly Thr Ala Ser Arg20 25 30tca gag gat gag gag tca ctg gca ggg cag aag cga gcc tcc tcc cag 322Ser Glu Asp Glu Glu Ser Leu Ala Gly Gln Lys Arg Ala Ser Ser Gln35 40 45 50gcc ttg ggc acc atc cct aaa cgg aga agc tcc tcc agg ttc atc aag 370Ala Leu Gly Thr Ile Pro Lys Arg Arg Ser Ser Ser Arg Phe Ile Lys55 60 65agg aag aag ttc gat gat gag ctg gtg gag agc agc ctg gca aaa tct 418Arg Lys Lys Phe Asp Asp Glu Leu Val Glu Ser Ser Leu Ala Lys Ser
70 75 80tct acc cgg gca aag ggg gcc agt ggg gtg gaa cca ggg cgc tgt tcg466Ser Thr Arg Ala Lys Gly Ala Ser Gly Val Glu Pro Gly Arg Cys Ser85 90 95ggg agt gaa ccc tcc tcc agt gag aag aag aag gta tcc aaa gcc ccc514Gly Ser Glu Pro Ser Ser Ser Glu Lys Lys Lys Val Ser Lys Ala Pro100 105 110agc act cct gtg cca ccc agc cca gcc cca gcc cct gga ctc acc aag562Ser Thr Pro Val Pro Pro Ser Pro Ala Pro Ala Pro Gly Leu Thr Lys115 120 125 130cgt gtg aag aag agt aaa cag cca ctt cag gtg acc aag gat ctg ggc610Arg Val Lys Lys Ser Lys Gln Pro Leu Gln Val Thr Lys Asp Leu Gly135 140 145cgc tgg aag cct gca gat gac ctc ctg ctc ata aat gct gtg ttg cag658Arg Trp Lys Pro Ala Asp Asp Leu Leu Leu Ile Asn Ala Val Leu Gln150 155 160acc aac gac ctg acc tcc gtc cac ctg ggc gtg aaa ttc agc tgc cgc706Thr Asn Asp Leu Thr Ser Val His Leu Gly Val Lys Phe Ser Cys Arg165 170 175ttc acc ctt cgg gag gtc cag gag cgt tgg tac gcc ctg ctc tac gat754Phe Thr Leu Arg Glu Val Gln Glu Arg Trp Tyr Ala Leu Leu Tyr Asp180 185 190cct gtc atc tcc aag ttg gcc tgt cag gcc atg agg cag ctg cac cca802Pro Val Ile Ser Lys Leu Ala Cys Gln Ala Met Arg Gln Leu His Pro195 200 205 210gag gct att gca gcc atc cag agc aag gcc ctg ttt agc aag gct gag850Glu Ala Ile Ala Ala Ile Gln Ser Lys Ala Leu Phe Ser Lys Ala Glu215 220 225gag cag ctg ctg agc aaa gtg gga tcg acc agc cag ccc acc ttg gag898Glu Gln Leu Leu Ser Lys Val Gly Ser Thr Ser Gln Pro Thr Leu Glu230 235 240acc ttc cag gac ctg ctg cac aga cac cct gat gcc ttc tac ctg gcc946Thr Phe Gln Asp Leu Leu His Arg His Pro Asp Ala Phe Tyr Leu Ala245 250 255cgt acc gcg aag gcc ctg cag gcc cac tgg cag ctc atg aag cag tat994Arg Thr Ala Lys Ala Leu Gln Ala His Trp Gln Leu Met Lys Gln Tyr260 265 270
tac ctg ctg gag gac cag aca gtg cag ccg ctg ccc aaa ggg gac caa1042Tyr Leu Leu Glu Asp Gln Thr Val Gln Pro Leu Pro Lys Gly Asp Gln275 280 285 290gtg ctg aac ttc tct gat gca gag gac ctg att gat gac agt aag ctc1090Val Leu Asn Phe Ser Asp Ala Glu Asp Leu Ile Asp Asp Ser Lys Leu295 300 305aag gac atg cga gat gag gtc ctg gaa cat gag ctg atg gtg gct gac1138Lys Asp Met Arg Asp Glu Val Leu Glu His Glu Leu Met Val Ala Asp310 315 320cgg cgc cag aag cga gag att cgg cag ctg gaa cag gaa ctg cat aag1186Arg Arg Gln Lys Arg Glu Ile Arg Gln Leu Glu Gln Glu Leu His Lys325 330 335tgg cag gtg cta gtg gac agc atc aca ggc atg agc tct ccg gac ttc1234Trp Gln Val Leu Val Asp Ser Ile Thr Gly Met Ser Ser Pro Asp Phe340 345 350gac aac cag aca ctg gca gtg ctg cgg ggc cgc atg gtg cgg tac ctg1282Asp Asn Gln Thr Leu Ala Val Leu Arg Gly Arg Met Val Arg Tyr Leu355 360 365 370atg cgc tcg cgt gag atc acc ctg ggc aga gca acc aag gat aac cag1330Met Arg Ser Arg Glu Ile Thr Leu Gly Arg Ala Thr Lys Asp Asn Gln375 380 385att gat gtg gac ctg tct ctg gag ggt ccg gcc tgg aag ata tcc cgg1378Ile Asp Val Asp Leu Ser Leu Glu Gly Pro Ala Trp Lys Ile Ser Arg390 395 400aaa caa ggt gtc atc aag ctg aag aac aac ggt gat ttc ttc att gcc1426Lys Gln Gly Val Ile Lys Leu Lys Asn Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ala405 410 415aat gag ggt cga cgg ccc atc tac atc gat gga cgg ccg gtg ctc tgt1474Asn Glu Gly Arg Arg Pro Ile Tyr Ile Asp Gly Arg Pro Val Leu Cys420 425 430ggc tcc aaa tgg cgc ctc agc aac aac tct gtg gtg gag atc gcc agc1522Gly Ser Lys Trp Arg Leu Ser Asn Asn Ser Val Val Glu Ile Ala Ser435 440 445 450ctg cga ttc gtc ttc ctt atc aac cag gac ctc att gcc ctc atc agg1570Leu Arg Phe Val Phe Leu Ile Asn Gln Asp Leu Ile Ala Leu Ile Arg455 460 465gct gag gct gcc aag atc aca cca cag tgaggagtgg tggcaggact 1617Ala Glu Ala Ala Lys Ile Thr Pro Gln
470 475cgtgggccct ctccggcctg tttcccctgc cactccagcc cccttgagct gggaactcag1677gctcctggaa aaacctgggc agtgggaggc tcagctgcgg gccattgatt tgagcctttg1737agggaggata gggctggcct ttgtgaagcc agcagaggct gagaacctca ggcttcccta1797gatccagagc ccctccccat cttcctctct ctaaaaacaa ccctaccccc cattgccacc1857ttcactcctg tgtctccagc tgattagcct cagactcttc ttttattgtt tttcttttgt1917aaataaaaag caccaggttc aaaaaaaaaa aaaaaa 1953<210>2<211>475<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Thr Arg Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gln Arg Gly Arg Ser Gly Pro1 5 10 15Asp Ser Gln Gly Leu Leu Asp Ser Ser Leu Met Ala Ser Gly Thr Ala20 25 30Ser Arg Ser Glu Asp Glu Glu Ser Leu Ala Gly Gln Lys Arg Ala Ser35 40 45Ser Gln Ala Leu Gly Thr Ile Pro Lys Arg Arg Ser Ser Ser Arg Phe50 55 60Ile Lys Arg Lys Lys Phe Asp Asp Glu Leu Val Glu Ser Ser Leu Ala65 70 75 80Lys Ser Ser Thr Arg Ala Lys Gly Ala Ser Gly Val Glu Pro Gly Arg85 90 95Cys Ser Gly Ser Glu Pro Ser Ser Ser Glu Lys Lys Lys Val Ser Lys100 105 110Ala Pro Ser Thr Pro Val Pro Pro Ser Pro Ala Pro Ala Pro Gly Leu115 120 125Thr Lys Arg Val Lys Lys Ser Lys Gln Pro Leu Gln Val Thr Lys Asp130 135 140Leu Gly Arg Trp Lys Pro Ala Asp Asp Leu Leu Leu Ile Asn Ala Val145 150 155 160Leu Gln Thr Asn Asp Leu Thr Ser Val His Leu Gly Val Lys Phe Ser165 170 175Cys Arg Phe Thr Leu Arg Glu Val Gln Glu Arg Trp Tyr Ala Leu Leu180 185 190Tyr Asp Pro Val Ile Ser Lys Leu Ala Cys Gln Ala Met Arg Gln Leu195 200 205His Pro Glu Ala Ile Ala Ala Ile Gln Ser Lys Ala Leu Phe Ser Lys210 215 220
Ala Glu Glu Gln Leu Leu Ser Lys Val Gly Ser Thr Ser Gln Pro Thr225 230 235 240Leu Glu Thr Phe Gln Asp Leu Leu His Arg His Pro Asp Ala Phe Tyr245 250 255Leu Ala Arg Thr Ala Lys Ala Leu Gln Ala His Trp Gln Leu Met Lys260 265 270Gln Tyr Tyr Leu Leu Glu Asp Gln Thr Val Gln Pro Leu Pro Lys Gly275 280 285Asp Gln Val Leu Asn Phe Ser Asp Ala Glu Asp Leu Ile Asp Asp Ser290 295 300Lys Leu Lys Asp Met Arg Asp Glu Val Leu Glu His Glu Leu Met Val305 310 315 320Ala Asp Arg Arg Gln Lys Arg Glu Ile Arg Gln Leu Glu Gln Glu Leu325 330 335His Lys Trp Gln Val Leu Val Asp Ser Ile Thr Gly Met Ser Ser Pro340 345 350Asp Phe Asp Asn Gln Thr Leu Ala Val Leu Arg Gly Arg Met Val Arg355 360 365Tyr Leu Met Arg Ser Arg Glu Ile Thr Leu Gly Arg Ala Thr Lys Asp370 375 380Asn Gln Ile Asp Val Asp Leu Ser Leu Glu Gly Pro Ala Trp Lys Ile385 390 395 400Ser Arg Lys Gln Gly Val Ile Lys Leu Lys Asn Asn Gly Asp Phe Phe405 410 415Ile Ala Asn Glu Gly Arg Arg Pro Ile Tyr Ile Asp Gly Arg Pro Val420 425 430Leu Cys Gly Ser Lys Trp Arg Leu Ser Asn Asn Ser Val Val Glu Ile435 440 445Ala Ser Leu Arg Phe Val Phe Leu Ile Asn Gln Asp Leu Ile Ala Leu450 455 460Ile Arg Ala Glu Ala Ala Lys Ile Thr Pro Gln465 470 475<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3atgacacgtg gcaccggggg aa 22<210>4<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4tcactgtggt gtgatcttgg ca 22<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5atccgtcgag cagagtt 17<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6cccttaccct tacccttacc ctaa 2權(quán)利要求
1.一種分離的人MCRS2多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制端粒酶活性的功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2中1-475位或1-162位氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2中1-475位或1-162位所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中173-1597位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1953位的序列；(c)具有SEQ ID NO1中173-658位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種多肽的制備方法，其特征在于，該方法含有(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出人MCRS2蛋白多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的人MCRS2蛋白特異性結(jié)合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的MCRS2多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的端粒酶活性抑制蛋白－MCRS2蛋白，編碼MCRS2蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種MCRS2蛋白的方法。本發(fā)明還公開了MCRS2蛋白及其編碼序列的用途。MCRS2蛋白具有使肝癌細(xì)胞SMMC－7721的染色體端粒變短、抑制端粒酶活性的功能。
文檔編號A61K38/17GK1670032SQ20041001705
公開日2005年9月21日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者趙慕鈞, 宋海, 李載平 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院