神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腫瘤亞群中tert啟動(dòng)子突變的制作方法
【專利說明】神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腫瘤亞群中TERT啟動(dòng)子突變
[0001] 發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 該發(fā)明設(shè)及突變檢測(cè)領(lǐng)域。尤其設(shè)及人基因組的非編碼區(qū)的突變。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 端粒是位于真核染色體末端的核蛋白復(fù)合體，是保持染色體的完整性所需的。端 粒重復(fù)序列的數(shù)百個(gè)核巧酸在每一個(gè)染色體末端加帽，并且在缺乏端粒酶活性的情況下， 端粒隨著每一次細(xì)胞分裂縮短（1)。最終，未加帽的端粒引發(fā)細(xì)胞死亡或者衰老。癌細(xì)胞看 似永久分裂，因此它需要一些端粒維護(hù)機(jī)制去避免運(yùn)種命運(yùn)。因?yàn)榘┘?xì)胞中的端粒酶活性 一般比正常細(xì)胞中的端粒酶活性高，最初認(rèn)為癌細(xì)胞中的端粒酶會(huì)W某種方式被激活(2- 6)。但是，接下來意識(shí)到，端粒酶只在終極分化的細(xì)胞中沒有活性而自我更新組織的正常細(xì) 胞中保持了端粒酶活性（1、7-9)。因?yàn)檎８杉?xì)胞必須在貫穿哺乳動(dòng)物的長(zhǎng)的生命周期中 (在人類，其可W多于一個(gè)世紀(jì))進(jìn)行復(fù)制，明顯的是運(yùn)些細(xì)胞也必須要保持端粒酶活性。因 為正常干細(xì)胞被認(rèn)為是癌的祖細(xì)胞，所W沒有必要去特別地激活癌細(xì)胞中的端粒酶;該酶 的前體已經(jīng)具有活性，正如細(xì)胞增殖所正常需要的數(shù)百種其它的酶和蛋白質(zhì)一樣。
[0005] 運(yùn)種觀點(diǎn)受到維持端粒長(zhǎng)度的另一機(jī)制一一即，替代性端粒延長(zhǎng)（ALT) (10- 12)一一的發(fā)現(xiàn)的挑戰(zhàn)。ALT發(fā)生在端粒酶活性缺乏的情況下并且似乎依賴于同源重組。它 尤其高比例地發(fā)生在某些腫瘤類型中，例如肉瘤、膜腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和腦腫瘤，但很少發(fā) 生在最普通的腫瘤類型中，例如那些結(jié)腸、乳房、肺、前列腺或膜腺的腫瘤類型（13)。如果端 粒酶的前體已經(jīng)具有持續(xù)的端粒酶活性，為什么癌細(xì)胞需要ALT呢?該問題由運(yùn)樣的發(fā)現(xiàn)突 顯：許多ALT癌癥在α地中海貧血/智力遲緩綜合征X-連鎖(ATRX)或死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白 (DAXX)基因中具有突變，所述基因編碼在端粒處相互作用的蛋白質(zhì)（10、11)?？杉俣?，功能 性ATRX/DAXX復(fù)合體的缺乏允許同源重組造成ALT。在最低程度上，運(yùn)些數(shù)據(jù)與存在導(dǎo)致端 粒維持的基因改變的選擇性優(yōu)勢(shì)，W及端粒酶不是在癌癥的所有正常干細(xì)胞前體中被無(wú)限 地激活的觀點(diǎn)一致。
[0006] 另外一個(gè)對(duì)癌癥中端粒酶活化不需要基因改變的觀點(diǎn)的挑戰(zhàn)由運(yùn)樣的發(fā)現(xiàn)提出， 該發(fā)現(xiàn)為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)啟動(dòng)子的突變發(fā)生在~70%黑素瘤和少量源自各種組織 類型的腫瘤細(xì)胞系（14，15)。重要的是，源自肺、胃、卵巢、子宮或前列腺癌的110個(gè)細(xì)胞系中 僅有5個(gè)細(xì)胞系含有TERT啟動(dòng)子突變，然而源自其它不同腫瘤類型的37個(gè)細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)有 19種突變。該情況類似于ALT的情況，ALT很少在常見的上皮細(xì)胞癌中被觀察到，但是在源自 非上皮細(xì)胞的腫瘤尤其是肉瘤和腦瘤中常被觀察到（13)。
[0007] 本領(lǐng)域?qū)o助檢測(cè)、監(jiān)測(cè)、和表征腫瘤和輔助預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)患者的影響的生物標(biāo)志 物存在持續(xù)的需求。
[000引發(fā)明概述
[0009]根據(jù)發(fā)明的一個(gè)方面，提供了檢測(cè)人核酸樣本的方法。人核酸樣本被檢測(cè)并且在 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)基因的啟動(dòng)子中體細(xì)胞突變的存在被確定。核酸來自選自肉瘤、肝 細(xì)胞癌、尿道癌、頭頸癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤和少 突星形細(xì)胞瘤的癌癥。
[0010] 發(fā)明的另外一個(gè)方面是修飾的核酸探針。它含有人TERT啟動(dòng)子的至少18個(gè)核巧 酸。該18個(gè)核巧酸包括C228A或C229A。
[0011] 發(fā)明的另外一個(gè)方面是修飾的核酸引物。它含有人TERT啟動(dòng)子的至少18個(gè)核巧 酸。該18個(gè)核巧酸包括C228A或C229A。
[0012] 本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀說明書之后將會(huì)明顯的運(yùn)些和其它的實(shí)施方式為本領(lǐng)域 表征腫瘤和對(duì)癌癥患者進(jìn)行健康管理提供了新手段。
[0013] 附圖簡(jiǎn)述
[0014] 圖1.TERT啟動(dòng)子突變頻率;在26個(gè)腫瘤類型中分析了 15個(gè)或更多的腫瘤。神經(jīng)膠 質(zhì)瘤分為原發(fā)性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)、星形細(xì)胞瘤(包括星形細(xì)胞瘤II級(jí)和ΙΠ 級(jí)W及次級(jí) GBM)和少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[001引圖2.神經(jīng)膠質(zhì)瘤亞型中選擇的基因突變。(A)51個(gè)原發(fā)性GBM中TERT突變和其它基 因事件的分布。(B)TERT突變和其它基因事件在包括II級(jí)、III級(jí)和IV級(jí)次級(jí)GBM的40個(gè)星形 細(xì)胞瘤中的分布。（C)TERT突變和其它基因事件在45個(gè)少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的分布。（D)TERT 突變和其它基因事件在24個(gè)少突星形細(xì)胞瘤中的分布。世界衛(wèi)生組織腫瘤級(jí)別被顯示在每 一欄中?？瞻卓虮硎灸[瘤中的WT狀況。
[0016]圖3.患有TERT啟動(dòng)子突變腫瘤的原發(fā)性GBM患者的存活率。對(duì)依據(jù)TERT啟動(dòng)子突 變狀況而被分類的50位原發(fā)性GBM患者進(jìn)行的卡普蘭-邁耶分析。具有TERT啟動(dòng)子WT腫瘤的 患者(n = 13)比具有TERT啟動(dòng)子突變腫瘤的患者(n = 37)存活得更長(zhǎng);具有TERT啟動(dòng)子WT月中 瘤的患者中的中位數(shù)存活率是27mo (個(gè)月），相比之下，具有TERT啟動(dòng)子突變腫瘤的患者中 的中位數(shù)存活率是14mo(個(gè)月）。估計(jì)的危險(xiǎn)比率是0.38(95%的置信區(qū)間=0.18,0.81 ;P = 0.01，時(shí)序檢驗(yàn)）。
[0017] 發(fā)明詳述
[0018] 發(fā)明人研發(fā)出可用于表征腫瘤的分析法。分析法設(shè)及生物標(biāo)志物，該生物標(biāo)志物 是核酸突變，典型地在5號(hào)染色體的非編碼區(qū)中的單核巧酸突變。突變位于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (T邸T)啟動(dòng)子區(qū)域的特定位點(diǎn)，尤其在1，295,228;1，295,229和1，295,250化旨19)。運(yùn)樣的 突變具有增強(qiáng)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)的作用。
[0019] 可用于本方法的生物樣品包括但不局限于運(yùn)樣的樣品，包括組織、細(xì)胞、和/或從 對(duì)象中分離的生物流體。生物樣品的例子包括但不局限于，組織、細(xì)胞、活體組織切片、血 液、淋己、血清、血漿、尿液、唾液、黏液和淚。生物樣品可W是組織樣品（例如活體組織切 片）。生物樣品可W直接取自對(duì)象(例如通過血液或組織抽樣)或第Ξ方(例如從中介獲得， 比如醫(yī)療服提供者或?qū)嶒?yàn)室技術(shù)人員）。在分析前核酸可W被分離和/或純化。核酸不是從 在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)許多代的細(xì)胞系獲得，因?yàn)檫\(yùn)樣的細(xì)胞系在永生化和培養(yǎng)過程中產(chǎn)生突 變，所述過程沒有反映體內(nèi)腫瘤發(fā)生。
[0020] 可W利用諸如擴(kuò)增和雜交和核酸測(cè)序的技術(shù)分析核酸。引物和探針可W是突變特 異的?？蛇x地，引物可W是通用的并且可擴(kuò)增含有潛在突變區(qū)域的區(qū)域，無(wú)論是否是突變 體。然后可W利用第二種技術(shù)來鑒定突變。
[0021] 通過比較腫瘤DNA和來自人類患者正常組織中的DNA，突變可W被鑒定為體細(xì)胞 的。正常或?qū)φ誅NA可獲自與癌癥不相關(guān)的組織。突變?cè)谀[瘤DNA而不是對(duì)照DNA中的存在指 示突變是體細(xì)胞的，例如它不是遺傳的。
[0022] 在方法中使用的探針和引物可具有任何有用的化學(xué)性質(zhì)，只要它們?cè)诜治龇ㄖ杏?適合的堿基序列和功能W特異地雜交和/或引導(dǎo)合成。特定的探針和引物可任選性地具有 非自然存在的化學(xué)性質(zhì)，例如修飾的或替代性的骨架化學(xué)性質(zhì)，或者另外的部分例如標(biāo)記 或酶，或者另外的堿基序列，其在與探針或引物的TERT基因啟動(dòng)子雜交序列鄰近的TERT基 因啟動(dòng)子序列區(qū)域中未被發(fā)現(xiàn)。修飾或替代性的化學(xué)性質(zhì)相對(duì)于自然存在的核酸可例如增 強(qiáng)核巧酸的穩(wěn)定性或增強(qiáng)雜交。探針和/或引物也可與固體支持物結(jié)合，例如陣列或珠。
[0023] 通常，探針和引物足夠長(zhǎng)W至于實(shí)現(xiàn)與期望目標(biāo)序列的特異性雜交而不與其它非 目標(biāo)序列進(jìn)行假型雜交。通常，運(yùn)些核酸的尺寸為至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、 至少22、至少24、至少26、至少28、或至少30個(gè)核巧酸并且少于200、少于150、少于125、少于 100、少于75、少于50、或少于40個(gè)核巧酸。
[0024] 某些腫瘤中TERT啟動(dòng)子生物標(biāo)記物的高度普遍性使其可用于癌癥的早期檢測(cè)，并 且當(dāng)其被診斷之后，可跟蹤患者獲得癌癥進(jìn)展或復(fù)發(fā)的證據(jù)。運(yùn)種檢測(cè)和監(jiān)測(cè)可在樣本例 如血漿、腦脊液、尿液和其它體液或組織中進(jìn)行。作為分析物核酸來源的腫瘤可W是原發(fā)性 腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤。
[0025] -旦TERT啟動(dòng)子突變?cè)谄渲幸环N測(cè)試核酸中被鑒定出來，可W推薦和/或施用治 療或預(yù)防。TERT啟動(dòng)子突變的存在或不存在可將腫瘤亞型或腫瘤的細(xì)胞類型來源表征為一 組更加相似的腫瘤，為推薦的或開處方的治療或監(jiān)測(cè)計(jì)劃提供精細(xì)化。適合的治療可包括 觀察等待、化療、放射治療、生物治療、手術(shù)或其它合適的控制手段。當(dāng)TERT啟動(dòng)子突變被鑒 定后，抑制劑如抗體和抑制性RNA分子也可被使用。
[0026] 發(fā)明人闡明了關(guān)于負(fù)責(zé)癌癥中端粒酶活性機(jī)制的假設(shè)。發(fā)明人提出當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí) 存在兩種維持端粒長(zhǎng)度的方式（i)通過端粒酶活性的表觀遺傳調(diào)節(jié)，其發(fā)生在快速更新組 織的干細(xì)胞中，W及（i i )通過維持端粒長(zhǎng)度的體細(xì)胞突變，例如TERT啟動(dòng)子中的突變或 DAXX或ATRX中的突變。那些起源于持續(xù)自我更新組織的癌癥，例如胃腸道上皮細(xì)胞和皮膚 或骨髓的癌癥不可能具有維持端粒的突變，因?yàn)槎肆Ｃ敢呀?jīng)在它們的前體細(xì)胞中被表觀遺 傳地激活。相比之下，來自不持續(xù)自我更新的細(xì)胞例如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、 肝細(xì)胞、膜島細(xì)胞和膜腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的腫瘤可能常具有運(yùn)些突變。運(yùn)個(gè)假設(shè)的結(jié)果是顯 現(xiàn)高頻ALT的腫瘤類型將也顯現(xiàn)高頻TERT突變，并且運(yùn)些突變會(huì)W互相排斥的方式分布。為 了驗(yàn)證運(yùn)些假設(shè)并且解釋關(guān)于TERT啟動(dòng)子突變?cè)诟鞣N不同癌癥類型中的作用的問題，發(fā)明 人確定了TERT啟動(dòng)子突變?cè)诖罅磕[瘤中的普遍性。
[0027] 如下所述的結(jié)果和公布在參考文獻(xiàn)14和15的結(jié)果提供了支持引言里提出的其中 一條假設(shè)和反駁其它假設(shè)的證據(jù)。運(yùn)些假設(shè)中的第一條是TERT突變只在源自正常情況下不 持續(xù)自我更新組織的腫瘤中被觀察到。該假設(shè)得到部分支持:大量的TERT啟動(dòng)子突變?cè)谠?自不持續(xù)自我更新組織的腫瘤中發(fā)生。T邸T-則巾瘤類型僅包括黑素瘤，某些神經(jīng)膠質(zhì)瘤亞 型、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、舌鱗狀細(xì)胞癌、脂肪肉瘤、肝細(xì)胞癌和尿道癌。尿道的正常移行性細(xì)胞 具有非常低的增殖指數(shù)(0.64% ±0.52%)，遠(yuǎn)低于比胃腸道、骨髓或皮膚細(xì)胞的指數(shù)(38)。 正常肝臟細(xì)胞也不經(jīng)常進(jìn)行更新（39)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為具有有限的自我更新能力 (40)。
[00%]其他兩個(gè)觀察結(jié)果也支持該假設(shè)。兒科原發(fā)性