專利名稱：含異黃酮的槐角提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含異黃酮的槐角(Sohporae Fructus)提取物的制備方法。具體而言，本發(fā)明涉及含高濃度異黃酮的槐角提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
異黃酮也可以稱作植物雌激素，因為它具有類似雌性激素即雌激素的作用。已報道，異黃酮具有各種生理活性，例如，預防骨質(zhì)疏松，抗癌活性尤其是乳腺癌和前列腺癌的抗癌活性，降低膽固醇，抗氧化性等(Toda T.et al.，F(xiàn)ood and Development，31(6)，44-47，1996；Murphy P.A.，F(xiàn)ood Technol.，36，60-64，1982；Adlercreutz.C.H.et al.，J.Nutr.，125(3S)，757-770，1995)。
金雀異黃素(Genistein)，大豆黃素(daidzein)及黃豆黃素(glycitein)是常見的異黃酮，已知它們存在于豆科植物、竹芋粉及其它植物中。因此，已開始對含異黃酮的植物提取物的制備方法進行研究。
主要對以大豆為原料制備含異黃酮的植物提取物的方法進行研究。例如，韓國專利號388511公開了一種制備含異黃酮的大豆提取物的方法，其特征在于，通過步驟采用脂肪醇或脂肪醇與水的混合物提取大豆，濃縮提取物，用脂肪族碳水化合物處理濃縮物并用脂肪醇再次提取該處理物。韓國專利公開號2001-47621公開了一種制備含異黃酮的大豆提取物的方法，其特征在于，通過步驟添加己烷至磨碎的大豆中，通過滲透提取(perfusive extraction)脫除脂質(zhì)組分，添加甲醇水溶液至殘余物中，進一步進行滲透提取，過濾，減壓下濃縮及真空干燥。同樣，韓國專利號348148公開了一種含異黃酮的葛根(PuerariaeRadix)提取物，其通過把葛根浸漬在醇的水溶液中、過濾、冷凍干燥及用酸或堿進行水解來制備。
另一方面，為了制備含高濃度異黃酮的提取物，必需保證新的異黃酮來源或開發(fā)最佳的提取方法。
本發(fā)明目的本發(fā)明人優(yōu)化了采用槐角，Sophora japonica Linne的果實，作為異黃酮來源提取高濃度異黃酮的條件，確定采用同樣的方法可獲得含高濃度異黃酮的槐角提取物，從而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種含高濃度異黃酮的槐角提取物的制備方法。
圖1A是表示采用本發(fā)明方法制備的槐角提取物中異黃酮含量的HPLC色譜圖。
圖1B是用HPLC分析本發(fā)明方法所制備的槐角提取物中異黃酮含量的標準物質(zhì)的色譜圖。
本發(fā)明的詳細說明為了達到本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種含異黃酮的槐角提取物的制備方法。
具體而言，本發(fā)明提供一種含高濃度異黃酮的槐角提取物的制備方法，該法包括以下步驟(a)將水加至槐角中并加熱，進行熱水(hydrothermal)提取槐角；(b)冷卻、過濾提取物，去除沉淀，得到濾液；(c)用淀粉酶或果膠酶處理濾液；(d)對酶處理過的溶液進行離心分離，回收沉淀物，然后將乙醇加至沉淀物中；以及(e)通過離心分離加入乙醇的溶液，回收上清液。
本發(fā)明使用的″槐角″是指Sophora japonica Linne的果實，屬于豌豆科(Leguminosae)落葉樹。優(yōu)選的是Sophora japonica Linne成熟的果實。本發(fā)明優(yōu)選的槐角是具有獨特的顏色與香味、無其它味道及氣味的Sohpora japonicaLinne的成熟果實。還優(yōu)選的是，果實的果皮是黃棕色或棕色，而種子是黑色或黑棕色。
在研究過程中發(fā)現(xiàn)，異黃酮的天然來源，除大豆外，本發(fā)明人確定槐角本身含有約29.58g/kg的高濃度異黃酮，以甙元形式存在(參見實施例1)。據(jù)報道，根據(jù)種類不同大豆一般含約0.5～1.7g/kg的甙元形式的異黃酮(So E.H.etal.，Korean J Breed.，33(1)，35～39，2001)。
因此，本發(fā)明提供一種在下述最佳條件下，采用槐角作為一種新的異黃酮來源，制備含高濃度異黃酮的槐角提取物。
本發(fā)明詳細說明如下。
本發(fā)明制備槐角提取物的方法包括以下步驟步驟1熱水提取將水加至槐角中，然后加熱進行熱水提取。此時，槐角在收獲與洗凈后或另外進行干燥后使用是合適的。干燥槐角的方法包括曬干，陰干，熱空氣干燥，自然干燥等。此外，把槐角或干燥的槐角粉碎至粉末以提高提取效率。把干燥的槐角粉碎至，優(yōu)選10～100篩目的大小，更優(yōu)選20～40篩目的大小。
槐角與熱水提取所用的水的比例并不固定，但通常優(yōu)選為3～20(以重量為基準)，更優(yōu)選5～10(以重量為基準)。
熱水提取的合適溫度范圍為100～130℃，優(yōu)選120～125℃。熱水提取的壓力調(diào)節(jié)至1.0～2.0kgf/cm2，優(yōu)選1.5～1.6kgf/cm2。
提取時間取決于提取溫度，但通常為1～6小時，優(yōu)選1～3小時。此外，如提取中使用震蕩器，則提取的效率更高。
步驟2過濾熱水提取物及除去沉淀物將步驟1中制備的熱水提取物冷卻至足以防止沉淀漂浮，然后過濾去除沉淀。此時，熱水提取物被冷卻至40～60℃，優(yōu)選50～55℃。
采用已知的方法過濾熱水提取物。過濾方法包括，例如離心分離、膜過濾及濾布過濾，而本發(fā)明中濾布是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是把冷卻的熱水提取物用100篩目濾布過濾，然后用200篩目濾布過濾以完全去除不溶的沉淀。
步驟3酶處理通常，植物中含有的異黃酮是糖苷型，即異黃酮化合物與其中的糖結(jié)合。然而，在本發(fā)明中，為了從槐角獲得其中異黃酮不與糖結(jié)合、具有良好生物可吸收性的甙元型異黃酮，采用酶處理步驟2的濾液，以使糖苷型異黃酮水解成甙元型異黃酮。此時可采用的酶為α-淀粉酶、β-淀粉酶或果膠酶。
在酶處理時，將濾液加熱至適于酶反應的溫度。把濾液的溫度調(diào)節(jié)至40～60℃，優(yōu)選52±3℃。用0.01～1％(v/v)，優(yōu)選0.1～0.5％(v/v)的酶，處理加熱的濾液。使酶處理的過濾液振蕩4～24小時，優(yōu)選12～16小時，進行水解。
步驟4離心分離酶處理過的溶液及用乙醇進行提取將上述步驟3的酶處理溶液立即離心以回收沉淀。加乙醇至回收的沉淀中，以提取異黃酮。不同于糖及蛋白質(zhì)，甙元型異黃酮溶于乙醇。因此，用乙醇提取回收的酶處理沉淀，可以得到較純的異黃酮。此時，用水稀釋100％乙醇，得到80～100％乙醇，優(yōu)選90～95％乙醇。然后，將稀釋的乙醇以5～10∶1的比例加至沉淀中。然后，振搖酶處理的溶液30～60分鐘直至沉淀完全溶解，并放置60～120分鐘。
步驟5離心分離添加乙醇的溶液及回收上清液離心分離上述步驟4的添加乙醇的溶液以去除沉淀，然后，回收含高濃度異黃酮的上清液。
把回收的上清液進行濃縮，然后噴霧干燥成粉末。采用間歇式或連續(xù)式濃縮機加熱上清液進行濃縮。把濃縮時蒸發(fā)的乙醇冷卻，然后回收再利用。采用噴霧干燥器噴霧干燥去除乙醇后的濃縮液，使成粉末。
當采用本發(fā)明的上述方法制備槐角提取物時，可以得到含高濃度異黃酮的提取物。
在大豆的甲醇提取物中，提取物中含金雀異黃素的含量為0.1～2.4g/kg，異黃酮為11～12g/kg(韓國專利公開號2001-47621)。在非油大豆粉或成熟大豆的提取物中，提取物中的異黃酮為15～43％(150～430g/kg)(韓國專利號388511)。
反之，當采用本發(fā)明的上述方法制備槐角提取物時，提取物中異黃酮含量為876.6g/kg。
因此，本發(fā)明的方法獲得的槐角提取物中的異黃酮濃度比在最佳條件下用槐角作為異黃酮來源采用常法制備的槐角提取物中的異黃酮濃度高。
實施例通過下列實施例說明本發(fā)明在實際應用中以及目前優(yōu)選的實施方案。
然而，可以理解本領(lǐng)域技術(shù)人員在本申請公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，可以做出在本發(fā)明的精神及范圍內(nèi)的改變及改進。
<實施例1>
按照本發(fā)明方法制備槐角提取物將10g槐角(Jesung Pharmaceutical Co.，Kyungdong Market，Korea)采用干式粉碎機粉碎至30目篩大小。將飲用水加至上述粉碎的槐角中，稀釋10倍(粉碎的材料∶飲用水＝9∶1)，將溶液在1.5kgf/cm2壓力下和121℃下，加熱2個小時。然后，把溶液冷卻至50℃，接著用100目濾布進行過濾，并用200目濾布進行第2次過濾，去除沉淀，得到濾液。將淀粉酶(果膠酶100L，NovoCo.)以0.5％(v/v)的濃度加至上述濾液中，在50℃進行16小時的酶反應。離心分離反應溶液以回收沉淀，并將90％乙醇加至回收的沉淀中，乙醇的添加量為沉淀的5倍。將乙醇混合物振搖30分鐘，直到沉淀完全分散。振搖后，把該溶液放置1小時，然后離心分離以去除沉淀并回收上清液。采用濃縮機，濃縮上清液至體積為原來的十分之一，然后用噴霧干燥機將濃縮液制成粉末，得到0.3g槐角提取物粉末(產(chǎn)率槐角粉碎材料的3％)。
<實施例2>
對本發(fā)明方法所制備的槐角提取物中的異黃酮進行分析利用高效液相色譜法(HPLC)分析實施例1中制備的槐角提取物中含有的異黃酮含量。
取1mg實施例1中制備的槐角提取物粉末，使之完全溶于1ml的100％甲醇中，得到100倍稀釋液。采用注射器過濾器(0.45μm，Waters Korea)過濾該溶液。取10μl濾液作為HPLC分析的樣品。用C18 ODS(150×4.6mm，S-4μm，80A)(YMC Co.，Japan)作為HPLC柱。用混合溶劑作為移動相，該混合溶劑為其中添加1％乙酸，乙腈與水以體積比20∶80進行混合的混合溶劑，30分鐘后，用另外的混合溶劑進行梯度洗脫，該混合溶劑中添加了1％乙酸，乙腈與水以體積比40∶60混合。在室溫下進行分析，流速為0.8ml/min，測量光密度OD280。
用甙元型大豆黃素(Sigma，USA)、黃豆黃素(Sigma，USA)及金雀異黃素(Sigma，USA)作為定量的標準物質(zhì)。
結(jié)果是，實施例1制備的槐角提取物中的異黃酮含量為876.6g/kg(87.6％)(圖1A及1B)。
因此，可以確認通過本發(fā)明的方法制備的槐角提取物中含有的異黃酮濃度非常高。
<實驗例1>
槐角本身異黃酮含量分析對槐角中含有的異黃酮含量進行分析。采用與實施例1同樣的方法，制備槐角的熱水提取物。將5ml的4N HCl與5ml槐角的熱水提取物混合。于100℃水浴中回流冷卻2小時，進行酸水解。在酸水解后，把回收的溶液放入燒瓶內(nèi)，再加入甲醇使總體積達到50ml(稀釋10倍)。然后，取10ml溶液，用甲醇稀釋，使總體積為100ml(稀釋10倍)。調(diào)節(jié)pH至4～8后，通過過濾器過濾溶液。采用與實施例2同樣的方法，用濾液作樣品進行HPLC分析，由此測量槐角中的甙元型異黃酮的含量。
結(jié)果是，槐角本身中的異黃酮含量是29.58g/kg(2.96％)。從該結(jié)果可以確認槐角中含有高濃度的異黃酮。
<實驗例2>
比較各種提取方法所獲得的槐角提取物中的異黃酮濃度為了確定制備含高濃度異黃酮的槐角提取物的適宜提取方法，對各種提取方法所獲得的槐角提取物中的異黃酮含量進行比較。采用己烷與60％乙醇溶劑的提取法、依次采用己烷與水的提取法、僅采用乙醇溶劑的提取法、以及僅采用水的提取法舉例說明各種提取法。
<2-1>采用己烷與60％乙醇的方法制備槐角提取物將100ml己烷加至實施例1中制備的10g粉碎的槐角中，提取2個小時以脫除脂質(zhì)。離心分離提取物以回收沉淀。將100ml的60％乙醇加至沉淀中，接著超聲處理30分鐘。然后，過濾提取液以回收上清液，接著冷凍干燥。結(jié)果，得到槐角提取物2.4g。
<2-2>采用己烷與水的方法制備槐角提取物將100ml己烷加至10g實施例1制備的粉碎的槐角中，進行提取2小時以脫除脂質(zhì)。離心分離提取物以回收沉淀。加入10倍體積的飲用水至提取物中，于100℃加熱6小時進水熱水提取。過濾熱水提取物以回收上清液。冷凍干燥回收的上清液，得到槐角提取物2.8g。
<2-3>采用60％乙醇的方法制備槐角提取物將100ml的60％乙醇加至10g實施例1制備的粉碎的槐角中，進行超聲處理30分鐘。過濾提取物以回收上清液。冷凍干燥回收的上清液，得到槐角提取物2.5g。
<2-4>采用水的方法制備槐角提取物將10g實施例1制備的粉碎的槐角用飲用水稀釋10倍(粉碎的槐角∶飲用水＝9∶1)。于100℃下加熱6小時進行熱水提取。過濾提取物去除沉淀，回收上清液，得到槐角提取物2.6g。
<2-5>分析各提取方法所得到的槐角提取物中的異黃酮含量采用高效液體色譜法(HPLC)分析實驗例<2-1>～<2-4>中制備的槐角提取物中的異黃酮含量。
采用與實驗例1同樣的方法，對上述實驗例制備的各種槐角提取物進行酸水解，并采用與實施例2同樣的方法，用HPLC進行分析。
結(jié)果是，采用己烷與60％乙醇作為提取劑的實驗例<2-1>中，提取物中的異黃酮總含量為2.13％(21.3g/kg)；采用己烷與水的實驗例<2-2>中，異黃酮總含量為2.64％(26.4g/kg)。采用60％乙醇作為提取劑的實驗例<2-3>中，異黃酮總含量為3.42％(34.2g/kg)；在僅用水進行熱水提取的實驗例<2-4>中，異黃酮總含量為3.38％(33.8g/kg)(表1)。因此，采用乙醇的方法制備的<p>
<表4>按照酶處理，槐角提取物中糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)變成甙元型異黃酮的轉(zhuǎn)化率比較
<實驗例5>
利用乙醇提取的槐角提取物中異黃酮的含量比較我們研究了乙醇處理對于采用與實施例1相同的方法，通過熱水提取隨后用酶處理制備的槐角提取物的效果。
為實現(xiàn)該目的，采用與實施例1同樣的方法，對槐角進行熱水提取、酶處理及乙醇提取，回收上清液。然后，把回收的上清液濃縮，用噴霧干燥機制成粉末，得到0.3g粉末狀槐角提取物。
此外，除乙醇提取外，采用與實施例1相同的方法對槐角進行熱水提取及酶處理，回收提取物。然后，將回收的提取物濃縮，用噴霧干燥機制成粉末，得到2.4g粉末狀槐角提取物。
采用與實施例2同樣的方法分析上述制備的各種槐角提取物的異黃酮含量。
結(jié)果證明，用乙醇提取的槐角提取物的異黃酮含量比不用乙醇提取的槐角提取物的異黃酮含量高(表5)。
<表5>乙醇提取的槐角提取物中的異黃酮含量
2003年10月31日提交的韓國專利申請?zhí)?003-77000的全部公開內(nèi)容，包括說明書、權(quán)利要求書、附圖及摘要，其全部內(nèi)容作為參考并入本申請中。
工業(yè)實用性如上所述，生物吸收性良好的含高濃度甙元型異黃酮的槐角提取物，可通過本發(fā)明的方法制備得到。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解上述公開的概念及具體實施方案可容易地作為能實現(xiàn)本發(fā)明同樣目的的基礎(chǔ)用于潤飾或改進得到其他實施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也能夠理解這些等效實施方案并沒有偏離所附權(quán)利要求的精神與范圍。
權(quán)利要求
1.一種含異黃酮的槐角提取物的制備方法，其包括下列步驟(a)將水加至槐角中并加熱，進行熱水提取槐角；(b)通過冷卻與過濾提取物以除去沉淀，得到濾液；(c)用淀粉酶或果膠酶處理濾液；(d)通過離心分離酶處理過的溶液，回收沉淀物，然后將乙醇加至沉淀物中；以及，(e)通過離心分離加入乙醇的溶液，回收上清液。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(a)中的槐角是經(jīng)粉碎后的槐角。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(a)中的熱水提取是在加入相當于槐角重量的3～20倍水后，于100～130℃下提取1-6小時。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(b)中的提取物被冷卻至40～60℃。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(c)是加熱濾液至40～60℃，再向濾液中加入0.01～1％(v/v)的淀粉酶或果膠酶，使反應進行4～24小時。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，加入相當于步驟(d)的沉淀物重量5～10倍的乙醇后，振搖30～60分鐘，然后放置60～120分鐘。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，該法還包括濃縮步驟(e)的上清液的步驟。
8.按照權(quán)利要求7所述的方法，其中，該法還包括通過噴霧干燥濃縮物進行粉化的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備含異黃酮的槐角提取物的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及含高濃度異黃酮的槐角提取物的制備方法，其特征在于，通過步驟對槐角進行熱水提取、酶處理及乙醇提取。采用本發(fā)明的方法可以制備生物可吸收性好的高濃度甙元型異黃酮的槐角提取物。
文檔編號A61K36/489GK1860238SQ200380110595
公開日2006年11月8日 申請日期2003年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日
發(fā)明者權(quán)碩亨, 皇甫植, 金國煥, 李承桓, 尹銀珠, 李承熙 申請人:雷克斯基因生物科技有限公司