專利名稱：一種快速制作胰島素抵抗模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速制作胰島素抵抗模型的方法。
背景技術(shù)：
胰島素抵抗(insulin resistance，IR)指體內(nèi)血液循環(huán)中正常濃度的胰島素引起的生物效應(yīng)低于正常的狀態(tài)。II型糖尿病、高血壓病、冠心病、肥胖癥及脂質(zhì)代謝紊亂等疾病常伴有胰島素抵抗。由于IR研究常需要取肝臟、骨胳肌等組織，很不方便，所以制備IR動(dòng)物模型是非常必要的。
現(xiàn)有技術(shù)胰島素抵抗模型的制備中，通常采用戊巴比妥鈉麻醉，但是90％以上的大鼠不產(chǎn)生胰島素抵抗，達(dá)到穩(wěn)定態(tài)的葡萄糖輸注速率在2～2.5ml/h左右，篩選藥物效果不夠顯著。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明即是為了提供一種藥物篩選效果顯著的快速制作胰島素抵抗模型的方法。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種快速制作胰島素抵抗模型的方法，所述的方法是對(duì)體重為300～450g的雄性近交系Wistar大鼠，禁食不禁水4-6h后，用烏拉坦進(jìn)行麻醉，迅速建立胰島素抵抗模型。
所述烏拉坦?jié)舛葹?0～30％，對(duì)Wistar大鼠給藥量為0.5ml/100g。
所述烏拉坦?jié)舛葍?yōu)選為20％。
所述烏拉坦給藥方式為腹腔注射給藥。
所述雄性近交系Wistar大鼠的體重優(yōu)選為300～400g。
具體的，所述的方法是選用300～450g的雄性近交系Wistar大鼠，禁食不禁水4～6h后，按0.5ml/100g給藥量腹腔注射濃度為20％烏拉坦，迅速建立胰島素抵抗模型。
本發(fā)明所述的快速制作胰島素抵抗模型的方法的有益效果主要體現(xiàn)在采用烏拉坦進(jìn)行麻醉，90％以上的大鼠可出現(xiàn)胰島素抵抗，葡萄糖的輸注速率達(dá)到，最低值0.1ml/h，只要有增強(qiáng)胰島素活性的物質(zhì)或胰島素激動(dòng)劑，胰島素抵抗現(xiàn)象就明顯改變，藥物篩選速度快、觀察明顯、方法簡(jiǎn)單。
(四)說明書附1為PPAR激動(dòng)劑對(duì)大鼠胰島素抵抗模型穩(wěn)態(tài)下的GIR影響；圖2為烏拉坦麻醉與戊巴比妥鈉麻醉正糖鉗試驗(yàn)GIR的比較。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1具體方法取300～450g的雄性近交系Wistar大鼠，禁食不禁水4～6h后，腹腔注射20％烏拉坦麻醉(0.5ml/100g)。仰位固定于大鼠固定板上，切開頸部正中皮膚。分離右側(cè)頸外靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，用眼科剪作切口，向近心端插入連接三通旋塞的插管(插管中預(yù)先注入80u/ml肝素生理鹽水溶液)。用眼科鑷夾住靜脈壁和插管，向前行進(jìn)0.5cm，結(jié)扎固定插管。分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，用小動(dòng)脈夾夾住近心端，用眼科剪作切口，往近心端反向插入連接1ml針筒的插管(插管中預(yù)先注入50u/ml肝素生理鹽水溶液)。放開小動(dòng)脈夾，用眼科鑷夾住動(dòng)脈壁和插管，向前行進(jìn)0.5cm，結(jié)扎固定插管。頸靜脈注射50ul/ml肝素0.1ml/100g作預(yù)防抗凝。三通旋塞的一個(gè)進(jìn)口連接胰島素輸注微量泵另一個(gè)進(jìn)口連接20％葡萄糖輸注微量泵，避免管腔中出現(xiàn)氣泡。待插管手術(shù)和輸注裝置安裝完畢后，開始實(shí)驗(yàn)(1)用1ml針筒從右頸動(dòng)脈取血0.5ml，用手術(shù)鉗夾住插管，用OneTouchRUltra血糖儀和試紙測(cè)定基礎(chǔ)血糖約需5ul，放開手術(shù)鉗，將剩余血再注回頸總動(dòng)脈，插管頭上加50ul肝素生理鹽水溶液。
(2)胰島素以速率為0.6ml/h(10μl/min)恒速輸注，胰島素輸注10min后，以(1)同樣方法取右頸動(dòng)脈血測(cè)血糖值，如血糖低于基礎(chǔ)值，則開始輸注20％葡萄糖，每隔5min取血，測(cè)定血糖。根據(jù)血糖值不斷調(diào)整葡萄糖輸注速率，使血糖維持在5mmol/L上下，一般30～60min可達(dá)穩(wěn)態(tài)。達(dá)穩(wěn)態(tài)后，每5min取血測(cè)血糖，記錄穩(wěn)態(tài)下6～8次葡萄糖輸注速率的平均值作為GIR(glucose infusion rate)取穩(wěn)態(tài)下6次血糖的平均值作為穩(wěn)態(tài)下的血糖(BG)。當(dāng)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗時(shí)，血糖持續(xù)升高，要求葡萄糖的流量更低，將20％葡萄糖溶液改為10％葡萄糖溶液。當(dāng)血糖繼續(xù)升高，則再更換為5％葡萄糖溶液。觀察大鼠胰島素抵抗模型穩(wěn)態(tài)下的血糖(BG)和葡萄糖輸注速率(GIR)。
分為以下四組空白對(duì)照組0.5％CMC-Na溶液15ml/kg陽性藥A組羅格列酮15mg/kg
PPAR激動(dòng)劑B組15mg/kgPPAR激動(dòng)劑C組15mg/kg結(jié)果分析由

圖1顯示，試驗(yàn)大鼠以速率為0.6ml/h(10μl/min)恒速輸注胰島素，大鼠穩(wěn)態(tài)血糖值在5mmol/L上下，空白對(duì)照組以1.0ml/h速率始輸注20％葡萄糖，為維持穩(wěn)態(tài)血糖，葡萄糖的輸注速率(GIR)迅速下降，60min后，大鼠機(jī)體組織對(duì)胰島素的敏感性極度低下，葡萄糖輸注速率(GIR)降低至0.1ml/h以下，產(chǎn)生胰島素抵抗，120min后仍未恢復(fù)。而給予陽性藥A、PPAR激動(dòng)劑B、PPAR激動(dòng)劑C組大鼠在穩(wěn)態(tài)血糖下，葡萄糖輸注速率(GIR)繼續(xù)上升，分別達(dá)到1.33m1/h、1.34ml/h，1.1ml/h后開始下降，葡萄糖輸注60min后達(dá)到穩(wěn)定，葡萄糖輸注速率(GIR)最低值分別為0.93ml/h、0.96ml/h、0.87ml/h，90min后葡萄糖輸注速率(GIR)回升至初始值，并有繼續(xù)上升的趨勢(shì)，大鼠機(jī)體組織對(duì)胰島素的敏感性下降不明顯，未產(chǎn)生明顯的胰島素抵抗現(xiàn)象，PPAR激動(dòng)劑B、PPAR激動(dòng)劑C組與空白對(duì)照組比，差異顯著(P＜0.01)，其作用效果，PPAR激動(dòng)劑B與陽性藥A相當(dāng)，PPAR激動(dòng)劑C的療效略低于陽性藥A，但無顯著性差異(P＞0.05)。
實(shí)施例2烏拉坦麻醉與戊巴比妥鈉麻醉正糖鉗試驗(yàn)比較1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種Wistar大鼠80只；級(jí)別清潔級(jí)；性別雄性；重量350～400g2.實(shí)驗(yàn)材料和試劑WZ-50C2型單道微量注射泵；胰島素注射液；肝素鈉注射液；50％葡萄糖注射液；10％葡萄糖注射液；5％葡萄糖注射液；0.9％氯化鈉注射液；OneTouchRUltra血糖儀、試紙；ST-01三通旋塞；PT12(30min)壓力管；插管制作靜脈輸液針剪去針頭部分，放入100℃水中，拉長(zhǎng)至針頭細(xì)、冷卻，制成約0.2mm直徑的插管；小動(dòng)脈夾；靜脈輸液針；手術(shù)線；眼科剪；眼科鑷；一次性1ml注射器；40W手術(shù)燈；大鼠固定板；止血鉗；20ml一次性注射器；5ml一次性注射器；大鼠灌胃針；分析天平等。
3.試驗(yàn)方法3.1手術(shù)方法取350～400g左右的雄性Wistar大鼠20只分為2組20％烏拉坦(0.5ml/100g)麻醉組和3％戊巴比妥鈉(0.15ml/100g)麻醉組，每組10只，禁食不禁水5h后，分別腹腔注射20％烏拉坦(0.5ml/100g)麻醉或3％戊巴比妥鈉(0.15ml/100g)麻醉.仰位固定于大鼠固定板上，切開頸部正中皮膚。
(1)分離右側(cè)頸外靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，用眼科剪作切口，向近心端插入連接三通旋塞的插管(插管中預(yù)先注入80u/ml肝素生理鹽水溶液)。用眼科鑷夾住靜脈壁和插管，向前行進(jìn)0.5cm，結(jié)扎固定插管。
(2)分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，用小動(dòng)脈夾夾住近心端，用眼科剪作切口，往近心端反向插入連接1ml針筒的插管(插管中預(yù)先注入80u/ml肝素生理鹽水溶液)。放開小動(dòng)脈夾，用眼科鑷夾住動(dòng)脈壁和插管，向前行進(jìn)0.5cm，結(jié)扎固定插管。
(3)頸靜脈注射50ul/ml肝素0.1ml/100g作預(yù)防抗凝。
(4)三通旋塞的一個(gè)進(jìn)口連接胰島素輸注微量泵另一個(gè)進(jìn)口連接20％葡萄糖輸注微量泵，避免管腔中出現(xiàn)氣泡。待插管手術(shù)和輸注裝置安裝完畢后，開始實(shí)驗(yàn)。
3.2實(shí)驗(yàn)方法(1)用1ml針筒從右頸動(dòng)脈取血0.5ml，用手術(shù)鉗夾住插管，用OneTouchRUltra血糖儀和試紙測(cè)定基礎(chǔ)血糖約需5ul，放開手術(shù)鉗，將剩余血再注回頸總動(dòng)脈，插管頭上加50ul肝素生理鹽水溶液。
(2)20％烏拉坦麻醉(0.5ml/100g)組以速率為0.6ml/h(10ul/min)恒速輸注40U/ml的胰島素，3％戊巴比妥鈉(0.15ml/100g)麻醉以速率為0.6ml/h(10ul/min)恒速輸注0.2U/ml的胰島素，10min再取血測(cè)血糖，如血糖低于基礎(chǔ)值，則開始輸注20％葡萄糖，每隔10min取血，測(cè)定血糖。根據(jù)所測(cè)血糖值不斷調(diào)整葡萄糖輸注速率，維持在穩(wěn)定血糖5mmol/L上下，一般30～60min可達(dá)穩(wěn)態(tài)。達(dá)穩(wěn)態(tài)后，每5min取血測(cè)血糖，記錄穩(wěn)態(tài)下5～6次葡萄糖輸注速率的平均值作為GIR(glucose infusion rate)取穩(wěn)態(tài)下6次血糖的平均值作為穩(wěn)態(tài)下的血糖(BG)。
4.試驗(yàn)結(jié)果由表1可見，用25％烏拉糖即烏拉坦(0.5ml/100g)麻醉進(jìn)行正糖鉗試驗(yàn)，以胰島素40U/ml的濃度0.6ml/h恒定輸注，試驗(yàn)大鼠已產(chǎn)生抵抗，葡萄糖的輸注極低。
而表2中，用3％戊巴即戊巴比妥鈉(0.15ml/100g)麻醉，0.2U/ml的胰島素以0.6ml/h恒定輸注，試驗(yàn)大鼠未產(chǎn)生抵抗，葡萄糖的輸注仍維持在2.0ml/h左右。
烏拉坦與戊巴比妥鈉麻醉GIR的比較結(jié)果見圖2。
表125％烏拉糖麻醉試驗(yàn)葡萄糖輸注率(GIR)
表23％戊巴比妥鈉麻醉試驗(yàn)的葡萄糖輸注率(GIR)
權(quán)利要求
1.一種快速制作胰島素抵抗模型的方法，其特征在于所述的方法是對(duì)體重為300～450g的雄性近交系Wistar大鼠，禁食不禁水4-6h后，用烏拉坦進(jìn)行麻醉，迅速建立胰島素抵抗模型。
2.如權(quán)利要求1所述的快速制作胰島素抵抗模型的方法，其特征在于所述烏拉坦?jié)舛葹?0～30％，對(duì)Wistar大鼠給藥量為0.5ml/100g。
3.如權(quán)利2所述的快速制作胰島素抵抗模型的方法，其特征在于所述烏拉坦?jié)舛葹?0％。
4.如權(quán)利要求3所述的快速制作胰島素抵抗模型的方法，其特征在于所述烏拉坦給藥方式為腹腔注射給藥。
5.如權(quán)利要求3所述的快速制作胰島素抵抗模型的方法，其特征在于所述雄性近交系Wistar大鼠的體重為300～400g。
6.如權(quán)利要求1所述的快速制作胰島素抵抗模型的方法，其特征在于所述的方法是選用300～450g的雄性近交系Wistar大鼠，禁食不禁水4～6h后，按0.5ml/100g給藥量腹腔注射濃度為20％烏拉坦，迅速建立胰島素抵抗模型。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速制作胰島素抵抗模型的方法，所述的方法是對(duì)體重為300～450g的雄性近交系Wistar大鼠，禁食不禁水4－6h后，用烏拉坦進(jìn)行麻醉，迅速建立胰島素抵抗模型。本發(fā)明采用烏拉坦進(jìn)行麻醉，90％以上的大鼠可出現(xiàn)胰島素抵抗，葡萄糖的輸注速率達(dá)到，最低值0.1ml/h，只要有增強(qiáng)胰島素活性的物質(zhì)或胰島素激動(dòng)劑，胰島素抵抗現(xiàn)象就明顯改變，藥物篩選速度快、觀察明顯、方法簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1907498SQ20051006028
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2005年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月4日
發(fā)明者陳民利, 壽旗揚(yáng), 林琳, 王輝, 周衛(wèi)民, 王德軍, 徐孝平, 應(yīng)華忠, 呂建敏 申請(qǐng)人:浙江中醫(yī)學(xué)院