專利名稱：抗?jié)h坦病毒屬病毒感染的dna疫苗的制作方法
本申請是2000年1月27日提交的美國申請09/941974的部分繼續(xù)申請，其要求1999年1月29日提交的美國臨時申請60/117680的優(yōu)先權。本申請也對更早提交的臨時申請系列享有優(yōu)先權，分別是2002年3月22日提交的60/367128和2002年7月26日提交的60/398985。前言目前，有四種已知的腎綜合征出血熱(HFRS)相關的漢坦病毒屬病毒漢坦病毒(HTNV)，多布拉伐-貝爾格萊德病毒(DOBV)，普馬拉病毒(PUUV)，和漢城病毒(SEOV)。因為通常不同的漢坦病毒屬病毒僅是由一個主要的嚙齒類宿主攜帶，因此，漢坦病毒屬病毒的分布一般就局限在那個宿主的范圍(Schmaljohn和Hjelle1997年的綜述，Emerg.Infect.Dis.3，95-104)。黑線姬鼠(Apodemus agrarius)攜帶的HTNV在亞洲發(fā)現(xiàn)；黃頸鼠(Apodemus flavicollis)攜帶的DOBV和歐鼠(Clethrionomys glareolus)攜帶的PUUV在歐洲發(fā)現(xiàn)。SEOV比其它任何已經(jīng)識別的漢坦病毒屬病毒散布得更廣泛，因為它的宿主，普通的都市大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))可以在全世界范圍發(fā)現(xiàn)。
在美洲，新的世界范圍的漢坦病毒屬病毒都和高致命疾病漢坦病毒肺癥候群(HPS)的爆發(fā)相關。(Schmaljohn和Hjelle1997年的綜述，Emerg.Infect.Dis.3，95-104)。這種疾病的特征是發(fā)熱，血管滲漏，從而導致非心源性肺水腫，接著出現(xiàn)休克。由絕大部分流行于北美和南美的漢坦病毒屬病毒，辛諾柏病毒(SNV)，安地斯病毒(ANDV)所引起的HPS致死病例分別是30-50％。
漢坦病毒屬(布尼亞病毒科)中的病毒都是包膜病毒，所含的基因組由三個單鏈RNA區(qū)段組成，根據(jù)大小分別命名為大(L)，中(M)，小(S)區(qū)段(參考Schmaljohn 1996年的綜述《布尼亞病毒科(TheBunyaviridae)》，R.M.Elliott編輯，紐約，Plenum出版社，63-90頁)。漢坦病毒屬病毒的L區(qū)段編碼依賴RNA的RNA聚合酶，M區(qū)段編碼兩個包膜糖蛋白(G1和G2)，而S區(qū)段編碼核殼蛋白質(zhì)(N)。
從細胞培養(yǎng)物或嚙齒類動物大腦中，開發(fā)了許多滅活的HFRS疫苗，并在亞洲進行了測試(Lee等人，1990，Arch.Virol.，增刊1，35-47；Song等人，1992，Vaccine 10，214-216；Lu等人，1996，J.Med.Virol.49，333-335)。傳統(tǒng)病毒滅活疫苗的缺點包括在病毒的生長和操作中要求適當?shù)姆雷o。為了克服這些缺點，開發(fā)了涉及重組DNA技術的疫苗方法，包括痘苗載體疫苗(Schmaljohn等人，1990，J.Virol.64，3162-3170；Schmaljohn等人，1992，Vaccine 10，10-13；Xu等人，1992，Am.J.Trop.Med.Hyg.47，397-404)，在細菌或昆蟲細胞中表達的蛋白亞基疫苗(Schmaljohn等人，1990，同上，Yoshimatsu等人，1993，Arch.Virol.130，365-376；Lundkvist等人，1996，Virology 216，397-406)，和基于乙肝核心抗原的重組疫苗(Ulrich等人，1998，Vaccine16，272-280)。
用表達HTNV或SEOV的M區(qū)段的重組痘苗接種，能誘導中和抗體的產(chǎn)生，保護嚙齒類動物不受HTNV和SEOV的感染，這表明僅僅對G1-G2的免疫反應就能對動物起保護作用(Schmaljohn等人，1990，同上，Xu等人，1992，同上，Chu等人，1995，J.Virol.69，6417-6423)。相似地，用在昆蟲細胞中表達的G1-G2蛋白接種(桿狀病毒重組系統(tǒng))，能誘導中和抗體的產(chǎn)生，保護倉鼠不受HTNV的感染(Schmaljohn等人，1990，同上)。在痘苗和桿狀病毒系統(tǒng)這兩種情況下，G1-G2接種比單獨用G1或G2接種提供的保護更完全(Schmaljohn等人，1990，同上)。在前述疫苗研究中，中和抗體對G1-G2的應答與保護相關聯(lián)，表明中和抗體在預防漢坦病毒屬病毒感染中發(fā)揮了重要的作用。被動轉(zhuǎn)移特異于G1或G2的中和單克隆抗體(MAbs)能保護倉鼠免受HTNV感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Arikawa等人，1992，J.Gen.Virol.70，615-624)，支持了這樣的觀點，即中和抗體單獨也能發(fā)揮保護作用。
N蛋白在防止?jié)h坦病毒屬病毒感染中也發(fā)揮了重要作用。用在細菌，昆蟲細胞表達的N蛋白接種，或用作為嵌合的乙型肝炎病毒(HBV)核心粒子的N蛋白接種能保護嚙齒類動物免受漢坦病毒屬病毒感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Yoshimatsu等人，1993，同上，Lundkvist等人，1996，同上，Ulrich等人，1998，同上)。用表達S區(qū)段的重組痘苗病毒接種得到的結論比較少。表達HTNV S區(qū)段的構建體并不能保護倉鼠免受HTNV的感染，可能是因為N的表達水平低(Schmaljohn等人，1990) 而表達SEOV S區(qū)段的構建體能保護四種沙鼠中的三種免受SEOV感染(Xu等人，1992，同上)。
相似的，自從20世紀90年代中葉分離第一株HPS相關漢坦病毒屬病毒以來，抵御HPS、基于基因疫苗的基礎研究就一直在進行。有報道認為候選DNA疫苗包括SNV M基因的大約500核苷酸序列，或全長的S基因，是小鼠的免疫原(Bharadwaj等人，1999，Vaccine 17，2836-43)，而且在鹿鼠感染模型中能起到一些保護作用，免受SNV的感染(Bharadwaj等人，2002，J.Gen，Virol.83，1745-1751)。這種保護被推測是細胞介導的，因為沒有令人信服的證據(jù)表明這些構建體能誘導中和，或其他保護性抗體反應。
因此，現(xiàn)在不是很清楚單獨G1，單獨G2，或者糖蛋白的片段是否誘導出中和抗體，并且防止感染。用只含有G1或G2的重組桿狀病毒感染的細胞裂解產(chǎn)物以及只表達G1或G2的重組痘苗病毒接種，都不能誘導中和抗體，并且在倉鼠感染模型中不能表示出完全的保護作用(Schmaljohn等人，1990)。盡管這些痘苗疫苗表示出了一些潛能，但重組的痘苗病毒疫苗和基于痘苗的疫苗表示出了一些不足，包括散布感染的能力，尤其是在無免疫應答的個體中，因為該疫苗由活病毒組成。同樣，用這些病毒接種會導致病灶(痘疤)，這種病灶中含有感染的病毒。這些病灶的病毒會無意地向其他部位(如眼睛)或別的個體擴散。此外，痘苗載體疫苗在以前接種過天花疫苗的人中具有很弱的免疫原性(McClain等人，2000，J.Med.Virol.60，77-85)?；诙幻绲囊呙绲钠渌秉c包括由于淋巴結腫脹而導致的不適以及在接種部位留下疤痕。
發(fā)明概述在本報告中，我們介紹了一種新的重組DNA疫苗方法，它涉及用表達單個漢坦病毒屬病毒基因組區(qū)段cDNA的裸露DNA接種。裸露DNA接種涉及到將帶有目的基因的質(zhì)粒DNA構建體轉(zhuǎn)移到受接種者的組織中(參考Robinson和Torres，1997，Semin.Immunol.9，271-283；和Gregoriadis，1998，Pharm，Res.15，661-670)。
這種疫苗方法比亞單位疫苗有優(yōu)點，亞單位疫苗不能誘導對防止已經(jīng)出現(xiàn)的感染或疾病所必需的細胞毒性反應。DNA疫苗接種模仿從頭合成抗原，并且用活的疫苗獲得I型MHC限制的抗原呈遞，而沒有病原菌感染的危險。此外，這種DNA疫苗方法允許疫苗進入粘膜組織，粘膜組織能幫助抵抗病毒導入，因為病毒的進入可能通過粘膜組織。
在我們的申請中，目的基因就是漢坦病毒屬病毒基因組區(qū)段，它被哺乳動物或病毒啟動子控制(例如巨細胞病毒立即早期啟動子)，這些啟動子有助于裸露DNA基因產(chǎn)物在受接種者細胞中的表達。這種胞內(nèi)表達能誘導體液和細胞介導的免疫反應(Robinson和Torres，1997，同上，以及Gregoriadis，1998，同上)。DNA轉(zhuǎn)移的方法包括接種針接種，口腔或肺部給藥，以及通過粒子轟擊法接種(即基因槍)。用這些方法中的每一種進行DNA疫苗接種都能誘導出針對許多不同的病原菌，包括眾多病毒的保護性免疫反應(Robinson和Torres，1997，同上，以及Gregoriadis，1998，同上)。然而，迄今為止，還沒有證明DNA疫苗能誘導抗?jié)h坦病毒屬病毒的免疫反應，以及防止?jié)h坦病毒屬病毒感染。
在本報告中，我們證明了用裸露的SEOV M或S基因組區(qū)段接種能誘導嚙齒類動物SEOV特異的抗體反應。更重要的是，我們還證明了用SEOV M區(qū)段接種能誘導中和抗體，并保護倉鼠免受SEOV感染。
也是在本申請中，我們報道了HTNV M DNA疫苗的開發(fā)。這種疫苗表達HTNV的G1和G2蛋白，誘導倉鼠產(chǎn)生中和抗體，防止倉鼠感染HTNV，SEOV和DOBV。此外，我們還證明了SEOV M，和HTNV M DNA疫苗在非人的靈長類動物中能誘導高效價的中和抗體反應。
此外，我們介紹了第一個基于ANDV M基因的DNA疫苗的開發(fā)和檢測，這種疫苗能誘導中和，或者其他保護性抗體反應。這是意料之外的結果，因為該疫苗在倉鼠中既沒有免疫原性，也不是保護性的，而在獼猴中是免疫原性和保護性的。此外，對另外兩種HPS相關的漢坦病毒屬病毒辛諾柏病毒和黑渠港病毒的交叉保護作用是明顯的。
本申請也介紹了一種漢他/安地斯病毒雙M基因的漢坦病毒屬病毒DNA疫苗，含有HTNV和ANDV的M基因。這種疫苗在非人的靈長類動物中表示出免疫原性和保護作用。這是第一個設計用來防止所有漢坦病毒屬病毒的DNA疫苗，包括HPRS相關和HPS相關的，這些病毒能引起嚴重的疾病。檢測這種漢他/安地斯病毒雙M基因漢坦病毒屬病毒DNA疫苗，pWRG/HA-M在獼猴中的免疫原性。這種疫苗能誘導抗體反應，該反應能中和漢坦病毒和安地斯病毒(參看表8)。在單一的倉鼠實驗中，我們發(fā)現(xiàn)這種質(zhì)粒和安地斯病毒質(zhì)粒相似，因為它在倉鼠中不能誘導抗體反應。然而，它在猴子中能誘導中和抗體的事實表明它在人體中能誘導中和抗體。
此外，本申請也介紹了一種漢坦病毒屬病毒免疫球蛋白組合物，這種組合物有預防或治療作用，與漢坦病毒屬病毒接觸后，能防止?jié)h坦病毒屬病毒感染，和/或能治療漢坦病毒屬病毒疾病。目前，沒有特異的藥物或免疫治療手段來治療HPS或HFRS疾病，或施用給可能暴露在漢坦病毒屬病毒中或患漢坦病毒屬病毒疾病的人。本發(fā)明的漢坦病毒屬病毒免疫球蛋白組合物由多克隆抗血清組成，這種血清來自接種了DNA疫苗的動物/人群，DNA疫苗包括一種能表達安地斯病毒和/或漢坦病毒M基因的質(zhì)粒。這種多克隆血清含有中和抗體，能預防安地斯病毒和/或漢坦病毒。不像常規(guī)的多克隆免疫血清產(chǎn)品，用在本發(fā)明的方法(產(chǎn)生靈長類動物抗體的受接種者的DNA疫苗接種)并不涉及活病毒，而且不要求識別從漢坦病毒屬病毒疾病中幸存下來的患者。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種漢坦病毒屬病毒DNA疫苗，這種疫苗含有漢坦病毒屬病毒基因組區(qū)段。更具體地說，本發(fā)明涉及一種SEOV漢坦病毒屬病毒DNA疫苗，這種疫苗含有如SEQ ID NO1所示的SEOV M基因組區(qū)段或如SEQ ID NO2所示的SEOV S區(qū)段。本發(fā)明也涉及HTNV漢坦病毒屬病毒DNA疫苗，這種疫苗包括HTNVM基因組區(qū)段，如Genebank登錄號M14627的2-3565這一段延伸序列所示。本發(fā)明還進一步涉及到ANDV DNA疫苗，它包括ANDV M基因組區(qū)段，如Genebank登錄號AF291703的2-3671這一段延伸序列所示。本發(fā)明也涉及到HTNV/ANDV疫苗，這種疫苗含有SEQ IDNO3的HTNV M基因組區(qū)段和SEQ ID NO4的ANDV M基因組區(qū)段。上面介紹的漢坦病毒屬病毒DNA片段可以單獨作為DNA疫苗的一部分呈遞給供試者，或者和其他漢坦病毒屬病毒DNA片段一起呈遞給供試者，而不管它們是組合在相同還是不同的構建體上。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種能在供試者中誘導免疫反應防止?jié)h坦病毒屬病毒的方法，該方法包括給供試者施用一種含有漢坦病毒屬病毒基因組區(qū)段的DNA片段。更具體地說，本發(fā)明涉及通過提供SEOV M或S基因組區(qū)段來誘導免疫反應防止SEOV病毒的方法，通過提供HTNV M基因組區(qū)段來誘導免疫反應防止HTNV病毒的方法，通過提供ANDV M基因組區(qū)段來誘導免疫反應防止ANDV病毒的方法。交叉保護防止別的漢坦病毒屬病毒如漢坦病毒和多布拉伐病毒或辛諾柏病毒和黑渠港病毒也是本發(fā)明的一個目的。
提供一種DNA疫苗也是本發(fā)明的一個目的，該疫苗是漢坦病毒M基因DNA疫苗與安地斯病毒M基因DNA疫苗的結合，通過給供試者提供這種DNA疫苗，使每個M基因在供試者中表達，從而誘導抗HFRS和HFS漢坦病毒屬病毒的免疫反應，并能防止所有能引起嚴重疾病的漢坦病毒屬病毒。漢坦病毒M基因或安地斯病毒M基因可以單獨給藥，即通過單獨的載體給藥，或者如本發(fā)明的一個方面所介紹的那樣可以結合在同一個載體上。此外，為了制造一種多價的疫苗，可以將別的漢坦病毒屬病毒，如普馬拉病毒的M基因區(qū)段同漢坦病毒DNA疫苗以及安地斯DNA疫苗結合，這種多價病毒能提供額外的保護，防止?jié)h坦病毒屬病毒感染。
在本發(fā)明的一個方面，DNA疫苗的轉(zhuǎn)移方法是在一個小的載體粒子上涂上DNA疫苗，通過粒子轟擊法將涂有DNA疫苗的粒子轉(zhuǎn)移到動物的表皮組織。這個方法適用于將DNA疫苗轉(zhuǎn)移到表皮或粘膜組織，或轉(zhuǎn)移到外周血細胞，而且可以在接種個體中用于誘導體液，細胞介導的，以及是分泌的免疫反應。
本發(fā)明的DNA疫苗本質(zhì)上是安全的，給藥時不痛苦，而且不會給接種的個體帶來不利的副作用。此外，本發(fā)明不要求生長或使用漢坦病毒屬病毒，這會通過空氣懸浮粒子傳輸進行擴散。
本發(fā)明進一步的目的是提供一種靈長類動物多克隆血清組合物，這種組合物含有中和抗體，針對至少一種，優(yōu)選的是兩種或多種漢坦病毒屬如安地斯病毒和/或漢坦病毒的M區(qū)段。
本發(fā)明的另一個目的是提供在功能上和上述抗體等效的抗體。這些功能上等效的抗體和上下文介紹的抗體基本上共享至少一種主要功能特性，包括體外免疫反應活性，預防性給藥或治療用給藥時能防止?jié)h坦病毒屬病毒攻擊，競爭G1和/或G2上同一個結合位點?？贵w可以是諸如IgG，IgM，或IgA中的任何一類或諸如IgG1，IgG2a以及別的本領域已知的亞類中的任何一亞類。此外，可以通過任何方法來制造抗體，如噬菌體展示，或在任何生物或細胞系中制造抗體，包括細菌，昆蟲，哺乳動物或別的能產(chǎn)生具所需特征的抗體，如人源化抗體的細胞類型或細胞系。將來自不同物種的Fab部分和Fc部分結合在一起也能形成抗體。
本發(fā)明的另一個目的是通過施用治療或預防有效量的本發(fā)明血清或抗體混合物給需要這種治療的供試者來治療或預防漢坦病毒屬病毒感染。
本發(fā)明的另一個目的是提供被動疫苗用于治療或預防漢坦病毒屬病毒感染，這種疫苗包括治療或預防有效量的能防止?jié)h坦病毒屬病毒疾病的本發(fā)明抗體以及可藥用的載體或賦型劑。
本發(fā)明的另一個目是提供一種用于診斷漢坦病毒屬病毒感染的方法，即通過使用本發(fā)明的抗體測試樣品中漢坦病毒屬病毒的存在。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的含有本發(fā)明抗體的用于檢測漢坦病毒屬病毒感染的免疫探針和檢測試劑盒。對于免疫探針，抗體直接或間接地連接到合適的報告分子如酶或放射性核素上。檢測試劑盒包括一個容器，容器中容納了一或多種本發(fā)明的抗體，還包括抗體使用說明書，目的是使抗體結合到漢坦病毒屬病毒形成免疫復合物，并檢測免疫復合物的形成，這樣就將免疫復合物的存在與否和漢坦病毒屬病毒的存在與否聯(lián)系起來了。
附圖簡述參考下列說明書，隨附的權利要求書及附圖，可以更好的理解本發(fā)明的特征，方面以及優(yōu)點，這些附圖是

圖1裸露SEOV DNA表達構建體。通過RT-PCR擴增SEOV M或S基因組區(qū)段，并將其克隆到pWRG7077的NotI和BamHI位點(PowderJect Vaccines公司，Madison，Wisconsin，在Schmaljohn等人1997年的文章中介紹了，同上)。pWRG7077的特征和以前介紹的pWRG1602的特征相似(Dimmock，N.J.，1995，Med.Virol.5165)，并且包括一個人巨細胞病毒早期啟動子(CMV IE啟動子)和內(nèi)含子A，牛生長激素轉(zhuǎn)錄終止子，多腺苷酸化信號序列(BGH pA)，以及卡那霉素抗性基因。CMV IE啟動子巨細胞病毒立即早期啟動子和內(nèi)含子A，BGHpA牛生長激素多腺苷酸化信號，KAN卡那霉素抗性基因。
圖2A和2BpWRG/SEO-M(SEQ ID NO3)和pWRG/SEO-S(SEQ IDNO4)的瞬時表達。A)在轉(zhuǎn)染了SEOV M或S構建體的單層COS細胞中進行IFAT。轉(zhuǎn)染了pWRG/7077的單層細胞用作陰性對照。抗SEOV多克隆兔抗血清用作一級抗體。B)用所示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細胞，放射性標記的表達產(chǎn)物用抗SEOV多克隆兔血清進行免疫沉淀。kDa大小的分子標準(MW)表示在左邊，而SEOV G1，G2和N蛋白的位置表示在右邊。
圖3A和3B通過基因槍或接種針肌內(nèi)接種了裸露SEOV DNA的小鼠的抗體反應(ELISA)。用ELISA評估通過基因槍或接種針肌內(nèi)接種了pWRG/SEO-M(圖A)或pWRG-SEO-S(圖B)的抗體反應。接種了陰性對照質(zhì)粒pWRG7707的小鼠通過兩次ELISA進行評估。預放血前的血清，第一次接種(1 vacc)后4周收集的血清，第二次接種(2 vacc)后4周收集的血清，最后一次接種(3 vacc)后3周收集的血清在一次試驗中進行檢測。符號表示的是單個小鼠血清樣品雙重檢測的平均值。
圖4接種了裸露SEOV DNA的小鼠的中和抗體反應。在用基因槍或接種針肌內(nèi)注射(接種針)進行第三次接種后3周收集的小鼠血清樣品進行PRNT。柱形表示的是接種了所示免疫原的單個小鼠血清。加熱滅活血清(56℃，30分鐘)，并且在5％豚鼠補體存在的情況下進行試驗。PRNT50％效價表示成導致噬菌斑減少50％時最高血清稀釋度的倒數(shù)。
圖5接種pWRG/SEO-M能交叉保護防止?jié)h坦病毒感染。根據(jù)下面介紹的方法用pWRG/SEO-M或陰性對照質(zhì)粒(pWRG7707)對分組倉鼠接種，每組倉鼠4-5只。最后一次接種后3周，獲得攻擊前的血清樣品，然后用1000PFU的漢坦病毒攻擊倉鼠。攻擊后28天，獲得攻擊后血清樣品。對攻擊前和攻擊后的血清樣品進行評估，方法是通過抗N ELISA檢測核殼的抗體，以及通過漢坦病毒噬菌斑降低中和測驗(PRNT)檢測漢坦病毒中和抗體。ELISA效價表示的是使得OD值比背景OD值+標準差3大的最低稀釋度倒數(shù)。PRNT50％效價表示的是在血清缺乏的情況下導致噬菌斑數(shù)目減少50％的最低稀釋度倒數(shù)。
圖6用pWRG/SEO-M接種能交叉保護防止多布拉伐病毒感染。根據(jù)介紹的方法，用pWRG/SEO-M或陰性對照質(zhì)粒(pWRG7077)對分組倉鼠進行接種，每組5只倉鼠。最后一次接種后3周，獲得攻擊前的血清樣品，然后用1000PFU的多布拉伐病毒攻擊倉鼠。攻擊后28天，獲得攻擊后血清樣品。對攻擊前和攻擊后的血清樣品進行評估，方法是通過抗N ELISA檢測核殼的抗體，以及通過多布拉伐病毒噬菌斑降低中和測驗(PRNT)檢測多布拉伐病毒的中和抗體。ELISA效價表示的是使得OD值比背景OD值+標準差3大的最低稀釋度倒數(shù)。PRNT50％效價表示的是在血清缺乏的情況下導致噬菌斑數(shù)目減少50％的最低稀釋度倒數(shù)。漢城病毒攻擊前的中和抗體效價(由疫苗誘導)也被檢測。漢城病毒的PRNT80％值表示成空環(huán)。
圖7用pWRG/SEO-M接種不能交叉保護防止普馬拉病毒感染。根據(jù)介紹的方法，用pWRG/SEO-M或陰性對照質(zhì)粒(pWRG7077)對分組倉鼠進行接種，每組5只倉鼠。最后一次接種后3周，獲得攻擊前的血清樣品，然后用1000PFU的普馬拉病毒攻擊倉鼠。攻擊后28天，獲得攻擊后血清樣品。對攻擊前和攻擊后的血清樣品進行評估，方法是通過抗N ELISA檢測核殼的抗體，以及通過普馬拉病毒噬菌斑降低中和測驗(PRNT)檢測普馬拉病毒的中和抗體。ELISA效價表示的是使得OD值比背景OD值+標準差3大的最低稀釋度倒數(shù)。PRNT50％效價表示的是在血清缺乏的情況下導致噬菌斑數(shù)目減少50％的最低稀釋度倒數(shù)。漢城病毒攻擊前的中和抗體效價(由疫苗誘導)也被檢測。漢城病毒的PRNT80％值表示成空環(huán)。
圖8HTNV G1和G2的瞬時表達。用pWRG/HTN-M或陰性對照質(zhì)粒(pWRG7077)轉(zhuǎn)染Cos細胞，并在24小時后，用RIPA制備用于分析的放射性標記的細胞裂解液。用抗HTNV的多克隆小鼠超免疫腹水(HTNV HMAF)，即G1特異的MAb(Mab 6D4)，或G2特異的MAb(Mab-23G10)免疫沉淀表達產(chǎn)物。分子標準(M)在左邊表示成kDa大小，而G1和G2的位置表示在右邊。
圖9A，9B，9C，9D有效表達G1要求上游外源序列。(A)含有SEOV M基因的DNA疫苗質(zhì)粒pWRG/SEO-M的示意圖，表示的是載體NotI位點和SEOV G1起始密碼子之間的核苷酸序列[SEQ IDNO5]。NotI位點后是來自以前的克隆方法的24個外源的核苷酸[SEQID NO6]，這些核苷酸后接的是SEOV M反基因組5’非編碼區(qū)，從位置2開始。漢坦病毒屬病毒M基因被克隆進pWRG7077的NotI-BamHI位點，或NotI-BglII位點。G1/G2，編碼G1和G2糖蛋白的開放閱讀框，CMV IE內(nèi)含子A，巨細胞病毒立即早期啟動子，后面接著內(nèi)含子A序列，KANr卡那霉素抗性基因，BGH polyA牛生長激素多腺苷酸化信號。(B)外源序列的改變能影響SEOV G1的表達。用pWRG/SEO-M(SEO-M)(在這欄中的序列對應SEQ ID NO6)，或有如下變化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細胞去掉外源序列(0)；恢復外源序列(1-24)(在這欄中的序列對應SEQ ID NO6)；反向放置外源序列(24-1)(在這欄中的序列對應SEQ ID NO7)；去掉外源序列的3’部分(1-12)(在這欄中的序列對應SEQ ID NO6的核苷酸1-12)；去掉外源序列的5’部分(13-24)(在這欄中的序列對應SEQ ID NO6的核苷酸13-24)；在外源序列的9，10位用CC取代AG(1-24)(在這欄中的序列對應SEQ ID NO6，這個序列的9，10位用CC取代了AG)。用多克隆兔抗SEOV抗體進行免疫沉淀，抗SEOV抗體含有G1特異的和G2特異的抗體(1)，或G2特異多克隆抗體池(3)。在載體的NotI位點和SEOV M基因非翻譯區(qū)的位置2之間的序列如圖所示。Δ表示外源序列被去掉了。有下劃線的GGATCTGC(SEQ ID NO6的核苷酸1-8)是和G1有效表達相關的最小未改變序列。(C)如果外源基因的1-8位核苷酸，GGATCTGC(SEQ ID NO6的1-8位核苷酸)包括在NotI位點和SEOV M非編碼區(qū)之間，G1就能恢復有效表達。用pWRG/SEO-M(SEO-M)或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細胞，所述質(zhì)粒去掉了外源基因(0)；恢復了外源序列(1-24)(SEQ ID NO6)；或外源序列截短了(1-8)(SEQ ID NO6的1-8位核苷酸)。用多克隆兔抗SEOV抗體進行免疫沉淀，抗SEOV抗體含有G1特異的和G2特異的抗體(1)，G1特異的MAb池(2)，或G2特異的MAb-11E10(3)。(D)去掉外源序列能影響HTNV G1表達。用含HTNV M基因的DNA疫苗質(zhì)粒，pWRG/HTN-M(x)(HTN-M)(在這欄中的序列對應SEQ IDNO6)，或有下列變化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細胞去掉外源序列(0)；恢復外源序列(1-24)(在這欄中的序列對應SEQ ID NO6)。用抗HTNV的小鼠超免疫腹水進行免疫沉淀，超免疫腹水含有G1特異的和G2特異的抗體(1)，G1特異的MAb池(2)，或G2特異的MAb-11E10(3)。分子標準(M)在左邊表示成kDa大小，而G1和G2的位置表示在右邊。
圖10表達G1和G2的質(zhì)粒pWRG/HTNV-M(x)的示意圖。pWRG/HTNV-M(x)采用了hCMV立即早期啟動子和外顯子1和2的5’非編碼區(qū)，在它們之間有一個天然插入的內(nèi)含子A。漢坦病毒M基因5′開放閱讀框(ORF)之前有漢坦病毒M基因的非翻譯區(qū)(UTR)，而后面是漢坦病毒M基因的3’-UTR。我們發(fā)現(xiàn)的外源序列對G1有效表達是必要的，它介于內(nèi)含子A和漢坦病毒5’UTR之間。牛生長激素多腺苷酸化信號(BGH polyA)有助于轉(zhuǎn)錄終止。質(zhì)粒骨架是pUC19，而卡那霉素抗性基因(KanR)提供了抗生素抗性。
圖11用表達HTNV G1和G2的質(zhì)粒DNA接種能防止HTNV感染。這張圖結合了兩個獨立的實驗結果。在第一個實驗中，一組倉鼠(659-666)用pWRG/HTN-M接種，而第二組陰性對照(667-674)用載體質(zhì)粒pWRG7077接種。在第二個實驗中，一組倉鼠(2101-2108)用pWRG/HTN-M(x)接種，而第二組陰性對照(2109-2116)沒有接種。最后接種后3周，收集攻擊前的血清，并用HTNV攻擊倉鼠。攻擊后28天收集攻擊后血清。用抗N ELISA檢測攻擊前和攻擊后血清中N特異的抗體，而用PRNT檢測中和抗體。每個倉鼠攻擊前和攻擊后，終點抗體效價如圖所示。對于每個試驗，攻擊前的同型PRNT80％效價按從最高到最低，從左到右進行分類。
圖1212A，12B，12C，12D和12E交叉保護。倉鼠用圖示質(zhì)粒(含有外源序列的pWRG/SEO-M，pWRG/HTN-M(x)或陰性對照質(zhì)粒)接種，然后用圖示的病毒攻擊。圖A，圖B和圖C中的陰性對照倉鼠用基于pWRG7077的質(zhì)粒接種，而圖D和圖E中的陰性對照倉鼠不接種。用抗N ELISA檢測攻擊前和攻擊后血清樣品中的抗N抗體，并用PRNT檢測中和抗體。同型病毒的PRNT80％效價和異型病毒的PRNT50％也檢測了。攻擊前和攻擊后，每個倉鼠的終點抗體效價如圖所示。攻擊前的同型PRNT80％效價(從最高到最低，從左到右進行分類)表示成帶符號的線。每只倉鼠的識別代碼表示在X軸上。倉鼠943，944，945和948的HTNV PRNT和抗N ELISA數(shù)據(jù)以前發(fā)表了(Kamrud等人，1999，Virology，263，209-219)。
圖13用表達SEOV或HTNV G1和G2的質(zhì)粒DNA接種，在獼猴中能誘導高效價的中和抗體反應。根據(jù)所述方法中所示的路線，用pWRG/SEO-M(x)，pWRG/HTN-M(x)或rVV/HTN-M+S接種獼猴。接種前收集血清樣品(P)，然后在第一次(1)，第二次(2)，和第三次(3)接種后3周收集血清樣品。在最后一次接種后2個月(a)，4個月(b)，和6個月(c)后也收集血清。PRNT效價表示的是中和病毒噬菌斑數(shù)80％或50％血清稀釋度的倒數(shù)，每只猴子的識別代碼表示在各自的圖下面。
圖14猴子中中和抗體反應的持續(xù)時間。由DNA疫苗接種所誘發(fā)的中和抗體反應仍在最后接種后8個月的獼猴中檢測到了。用所示疫苗接種的獼猴在每次接種后3周放血，然后在最后接種后2，4，6和8個月(分別是14，22，30和38周)放血。用PRNT對第一次接種后所示的周(0周)的同源中和抗體反應進行評估。每一條線代表一只猴子。第9周的數(shù)據(jù)在圖13也表示了。
圖15在倉鼠/ANDV致死病模型中評估HFRS DNA疫苗。用pWRG/HTN-M(x)或陰性對照質(zhì)粒pWRG7077接種倉鼠，然后用ANDV攻擊。對于死亡的動物，死亡日期用圓括號表示。從第一次攻擊后幸存下來的動物繼續(xù)用ANDV進行第二次攻擊。用PRNT對攻擊當天(攻擊前)，攻擊后4-6周(攻擊后)，以及第二次攻擊后28-48周(重新攻擊后)收集的血清樣品檢測HTNV和ANDV特異的MAbs。柱子表示PRNT效價。倉鼠識別代碼(ID#)68-91以及501-523表示的是兩個獨立的實驗；N表示沒有做。
圖16質(zhì)粒pWRG/AND-M的示意圖。pWRG/AND-M采用了hCMV立即早期啟動子和外顯子1和2的5′非編碼區(qū)，在它們之間有一個天然插入的內(nèi)含子A。安地斯病毒M基因開放閱讀框(ORF)之前有安地斯病毒M非翻譯區(qū)(UTR)，而后面是安地斯病毒M基因的3’-UTR序列。我們發(fā)現(xiàn)的外源序列對G1有效表達是必要的，它介于內(nèi)含子A和安地斯病毒5’UTR之間。牛生長激素多腺苷酸化信號(BGHpolyA)有助于轉(zhuǎn)錄終止。質(zhì)粒骨架是pUC19，而卡那霉素抗性基因(KanR)提供了抗生素抗性。
圖17A，17B和17CpWRG/AND-M的表達。A)用pWRG/AND-M(+)或空的質(zhì)粒pWRG7077(-)轉(zhuǎn)染COS細胞，然后用阿根廷或美國的HPS康復期血清對來自COS細胞的放射標記的蛋白進行免疫沉淀。B)用pWRG/AND-M，pWRG7077轉(zhuǎn)染COS細胞，或用ANDV轉(zhuǎn)染Vero E6細胞，然后用阿根廷(抗ANDV的人)的HPS康復期血清對來自COS細胞或Vero E6細胞的蛋白進行免疫沉淀。C)用pWRG/AND-M(x)(H)或pWRG/AND(A)轉(zhuǎn)染COS細胞，用指定的HTNV特異的MAbs，HTNV特異的小鼠超免疫腹水(HTN-poly)或阿根廷(AND-poly)的HPS康復期血清對來自COS細胞的蛋白進行免疫沉淀。+表示G1或G2被免疫沉淀了，-表示沒有蛋白被免疫沉淀了，而*表示G1和G2都被免疫沉淀了。分子標準(M)在左邊表示成kDa大小，而G1，G2和N的位置表示在右邊。
圖18A，18B和18C漢坦病毒屬病毒DNA疫苗在非人的靈長類動物中的免疫原性。A)用pWRG/HTN-M(x)，pWRG/AND-M，或陰性對照質(zhì)粒接種獼猴。在第一次接種之前(P)，以及在第一次，第二次，第三次和第四次接種后3周分別收集血清。進行HTNV-，ANDV-，BCCV-，以及SNV特異的PRNT，并確定終點50％和80％的效價。B)對用pWRG/AND-M接種四次之前(放血前)和之后(接種后)收集的猴子CH69的血清，利用轉(zhuǎn)染了pWRG/AND-M的細胞放射標記的裂解物，通過RIPA檢測其中的G1和G2特異的抗體。人HPS-患者康復期血清(抗-ANDV人)被用作抗-ANDV抗體的陽性對照。分子標準(M)在左邊表示成kDa大小，而G1，G2和約70kDa(同一性未知)大小的蛋白的位置表示在右邊。C)每次接種后和第一次接種(0周)后的指定星期時，確定接種了pWRG/HTN-M(x)或pWRG/AND-M的猴子的NAb反應。CH64，CH85和CH69在第0，3，6和12周時接種，而猴子90BD25在第0，3，6和9周接種。HTNV的NAb效價(實線)或ANDV(虛線)通過PRNT進行確定。
圖19pWRG/HA-M質(zhì)粒的示意圖。通過PCR從pWRG/AND-M中擴增一個區(qū)域，并將其插入pWRG/HTN-M(x)的XbaI位點，構建成pWRG/HA-M。擴增的區(qū)域(利用了能創(chuàng)造XbaI位點的引物)包括CMV啟動子，內(nèi)含子A，外顯子2，外源序列，安地斯病毒M5′-UTR，安地斯病毒M ORF，安地斯病毒3’-UTR以及BGH PolyA。對于別的縮寫請參考前面的圖。
詳細介紹在本申請中，介紹了用于個體接種防止?jié)h坦病毒屬病毒的組合物和方法。該方法包括將編碼漢坦病毒屬病毒抗原的DNA轉(zhuǎn)移到個體的細胞中，使得抗原在細胞中表達，從而在個體中誘導免疫反應。
DNA疫苗接種涉及在體施用編碼抗原的多核苷酸，從而在靶細胞中誘導生成正確折疊的抗原。將DNA疫苗導入細胞，將會促使和一種或多種病原菌蛋白相關的結構蛋白決定簇在細胞中表達。加工的結構蛋白將會和正常細胞的主要組織相容性復合物(MHC)抗原共同展示在轉(zhuǎn)染細胞的表面。即便細胞介導的免疫不是防止感染的主要手段，它仍可能對解決已經(jīng)發(fā)生的感染是重要的。此外，轉(zhuǎn)染細胞表達的結構蛋白也可以被抗原呈遞細胞獲得，從而引發(fā)全身性的體液抗體反應。
為了獲得要尋求的免疫反應，能引起接種個體的轉(zhuǎn)染細胞表達一或多個主要的病毒抗原決定簇的DNA疫苗構建體是必需的。這可以通過如下方式來進行確定病毒基因組中編碼病毒糖蛋白或衣殼成分的區(qū)域，并將這種編碼序列和能在受接種者細胞中表達其的啟動子連接起來。此外，病毒基因組本身，或部分基因組也可以使用。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及到能編碼漢坦病毒屬病毒抗原的DNA或cDNA。漢坦病毒屬病毒的意思是指任何能引起腎綜合征出血熱(HFRS)的漢坦病毒屬病毒，如漢坦病毒(HTNV)，多布拉伐-貝爾格萊德病毒(DOBV)，普馬拉病毒(PUUV)和漢城病毒(SEOV)以及能引起漢坦病毒屬病毒肺癥候群(HPS)的漢坦病毒屬病毒，如辛諾柏病毒(SNV)，黑渠港病毒(BCCV)，長沼病毒(BAYV)，紐約病毒(NYV)，安地斯病毒(ANDV)，Laguna Negra病毒(LNV)，以及任何別的已知能在人類中引起疾病的漢坦病毒屬病毒。
更具體一點，編碼兩種包膜糖蛋白(G1和G2)的漢坦病毒屬病毒基因組M區(qū)段(SEQ ID NO1)，以及編碼核殼蛋白的S區(qū)段(SEQIDNO2)從SEOV菌株SR-11(Kitamura，T等人，1983，Jpn.J.Med.Sci.Biol.36，17-25)病毒基因組(Arikawa，J等人，1990，Virology176，114-125)中推導出來。M區(qū)段(如SEQ ID NO1中所示)，Genebank登錄號是M34882，對應于漢城病毒(SR-11)M基因2-3602位核苷酸。S區(qū)段(在SEQ ID NO2)，Genebank登錄號是M34881，對應于漢城病毒(SR-11)M基因2-1699位核苷酸。
漢坦病毒(HTNV)編碼G1/G2的M區(qū)段對應于漢坦病毒(菌株76-118)的2-3565位核苷酸，漢坦病毒M序列已經(jīng)發(fā)表，登錄號是M14627。安地斯病毒編碼G1/G2的M區(qū)段對應于安地斯病毒菌株Chile-9717869的2-3671位核苷酸，這個序列的Genebank登錄號是AF291703。
本發(fā)明也涉及到DNA或多核苷酸序列，它們包括別的漢坦病毒屬病毒的M或S基因區(qū)段，含有保護性的表位或抗原決定簇。這種表位是具有構象的，包括G1和/或G2的序列，因為G1和G2的單克隆抗體表現(xiàn)出能中和病毒，并且在被動保護實驗中能保護嚙齒類動物。此外，N蛋白的氨基端具有高度的免疫原性，而且已經(jīng)有人表示，別的用氨基端區(qū)域接種的方法能起保護作用(Lundvist，1996，同上，Ulrich，1998，同上)。
衍生的序列在物理形態(tài)上并不必衍生自核苷酸序列本身，而是通過任何方式產(chǎn)生，包括例如化學合成或DNA復制，或逆轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄，這些方法都是基于多核苷酸序列衍生區(qū)域的堿基序列提供的信息。此外，用本領域已知的方法對對應于標明序列的區(qū)域結合進行修飾，從而達到使用的意圖。本發(fā)明的序列能用在諸如雜交實驗和聚合酶鏈式反應(PCR)這樣的診斷分析中，用來檢測漢坦病毒屬病毒。
通過RT-PCR來克隆SEOV菌株SR-11的M和S基因組區(qū)段，這種方法已經(jīng)在前面介紹了(Arikawa等人，1990，Virology 176，114-125)。用BglII和BamHI將含有漢城病毒(SR-11)M基因2-3602位核苷酸序列的DNA片段從YMIS/SR11-M中剪切下來(Arikawa，1990，同上)。這個片段被連接到pWRG7077的BamHI位點，得到pWRG/SEO-M(SEQ ID NO3)。pWRG/SEO-M含有額外的核苷酸，它衍生自克隆載體桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體YMIS。
利用EcoRI從pBSK+/SR11-S(Arikawa，1990，同上)中剪切DNA片段，該DNA片段含有漢城病毒(SR-11)S基因2-1699位核苷酸。用Klenow酶將該區(qū)段的限制性酶切位點鈍化，然后連接到用Klenow鈍化的pWRG7077的NotI位點(由Wisconsin，Madison的Powderject公司提供)，獲得pWRG/SEO-S(SEQ ID NO4)。pWRG/SEO-S中含有衍生自克隆載體pBSKS+的額外的核苷酸。
HTNV M DNA疫苗質(zhì)粒，pWRG/HTN-M(x)(SEQ ID NO7)基本上是按下列方法構建的。首先，用BglII將編碼HTNV G1/G2的DNA從pTZ19RHTNMm(Schmaljohn等人，1989，在負鏈病毒的遺傳學和病原性(Genetics and pathogenicity of negative strand virus)，D.Kolokofsky和B.Mahy編輯，58-66頁，Elsevier出版社，Amsterdam)中剪切下來，并和用BamHI剪切的pWRG7077載體連接。這個質(zhì)粒表達G2，但不表達G1。我們發(fā)現(xiàn)，如果介于載體NotI克隆位點和SEOVM非編碼區(qū)(圖9A)之間的一段長24堿基對(bp)的外源DNA序列(SEQ ID NO6)被去掉的話，SEOV M質(zhì)粒pWRG/SEO-M就不能有效地表達G1，于是我們解決了上面的問題。這段外源DNA是在更早的SEOV基因克隆和亞克隆程序中獲得的。去掉了24bp序列的SEOVM構建體不能表達G1，但能表達G2(圖9B)。如果將這段24bp的序列通過基因工程以正向，而不是反向重新連接到構建體體中，G2的表達能恢復(圖9B)。這個結果表明核苷酸序列，而不是核苷酸數(shù)目能影響G1表達。為了繪制能有效表達G1的序列，我們構建了包括1-12位或13-24位核苷酸外源序列的載體。當1-12位核苷酸，而不是13-24位核苷酸出現(xiàn)在質(zhì)粒中時，G1被表達(圖9B)。我們注意到DNA 4-10位核苷酸(TCTGCAG)和內(nèi)含子A的最后7個核苷酸(即剪切受體位點)完全一樣(Stenberg等人，1984，J.Virol.49，190-199)。將推定的剪切受體二核苷酸AG突變成CC，并不能影響G1的表達，表明如果該區(qū)域參與了剪切，則并不依賴于保持內(nèi)含子A剪切位點序列的確切性(圖9B)。我們構建了含有外源DNA 1-8位核苷酸的載體，并且發(fā)現(xiàn)這能有效地恢復G1的表達(圖9C)。因此，我們確定位于介于載體NotI位點和SEOV M基因的5′非編碼區(qū)之間的序列GGATCTGC對于基于pWRG7077的DNA疫苗有效表達G1是必需的。
根據(jù)SEOV M中的發(fā)現(xiàn)，我們推定，DNA疫苗質(zhì)粒中包括外源HTNV M基因上游序列使得我們能解決DNA疫苗質(zhì)粒不能同時表達HTNV G1和G2的問題。我們構建了一個質(zhì)粒，它包括外源HTNV M基因上游序列，而且如果我們這樣做的話，我們獲得了能表達G1和G2的克隆，pWRG/HTN-M(x)(圖9D和圖10)。當去掉外源序列，不能表達G1，而當恢復這段序列時，G1又能有效地表達(圖9D)。這些數(shù)據(jù)證實了外源序列不僅對成功表達SEOV G1是必需的，而且對成功表達HTNV G1也是必需的。這個序列并不影響來自SEOV或HTNV的G2的表達(圖9)。外源序列影響G1表達，但不能影響G2表達的機制現(xiàn)在并不明了。
為了構建基于ANDV M基因的DNA疫苗質(zhì)粒pWRG/AND-M(SEQ ID NO8)，從ANDV感染的Vero E6中分離病毒RNA，進行反轉(zhuǎn)錄。在反轉(zhuǎn)錄反應中，包括根據(jù)已發(fā)表的SNV和PUUV序列分別設計的正向和反向引物。正向引物包括一個NotI限制性位點(下劃線)和M基因非編碼區(qū)上游的24個核苷酸，這24個核苷酸就是我們以前發(fā)現(xiàn)的在pWRG/HTN-M表達G1時很重要的序列，這在上面已有介紹。純化cDNA，并在PCR反應中作為模板。用NotI和BamHI酶切PCR產(chǎn)物，并把酶切產(chǎn)物和用NotI和BamHI酶切的pWRG7077載體連接，得到pWRG/AND-M。ANDV M基因的序列未知，因此，我們對M基因以及載體/插入連接處進行了測序。菌株Chile-9717869的ANDV全長M基因通過RT-PCR克隆到pWRG7077中，得到pWRG/AND-M。我們對整個M基因開放閱讀框進行了測序。我們克隆的M基因的序列和已經(jīng)發(fā)表的，Genebank登錄號為AF291703的ANDV M基因序列幾乎完全一樣，這種情況并不奇怪，因為病毒分離株來自同一種嚙齒類動物(Meisner等人，2002，Virus Res.89，131-143)。在序列中有兩個腺嘌呤取代鳥嘌呤的變化。在位置1504的變化是沉默的，而在位置1840的改變卻導致了蘇氨酸取代597位的丙氨酸。
制備了同時含有漢坦病毒M基因和安地斯病毒M基因的構建體。將漢坦病毒M基因和安地斯病毒M基因克隆到pWRG7077中，得到pWRG/HA-M(SEQ ID NO9，圖19)。每個M基因的側翼是巨細胞病毒啟動子和內(nèi)含子A(CMV內(nèi)含子A)以及牛生長激素多腺苷酸化位點。整個漢坦病毒和安地斯病毒M基因開放閱讀框以及絕大部分5’和3’非編碼序列都包括在這個構建體中。此外，24bp序列位于每個漢坦病毒屬病毒M序列和它們各自CMV內(nèi)含子A序列之間。如上面所討論的那樣，我們發(fā)現(xiàn)，由于一些不明了的原因，這個24bp的序列(或者它的一部分)對于G1糖蛋白的表達是必需的。當pWRG/HA-M被導入哺乳動物細胞時，漢坦病毒和安地斯病毒M基因被表達。表達產(chǎn)物由漢坦病毒G1和G2糖蛋白以及安地斯病毒G1和G2糖蛋白組成。
在本領域可以理解，基因構建體中所用核苷酸序列上的某些變化對由該構建體編碼的蛋白影響很小，或沒影響，原因例如是遺傳密碼具有簡并性。這種變化可能是由于沉默的點突變，也可能是點突變編碼的不同氨基酸并不能顯著改變編碼蛋白的行為。也可以理解，去掉一部分編碼區(qū)域，卻不影響構建體體達到所需效果的能力，即誘導抗?jié)h坦病毒屬病毒的保護性免疫反應。在本領域可以進一步理解，可以采用一些有利的步驟，如修飾氨基酸組成來增加編碼蛋白的抗原性。通過修飾編碼這種蛋白的遺傳序列，可以將這種變化導入氨基酸組成。值得思考的是漢坦病毒屬病毒M和S區(qū)段的所有這些修飾和變異在本發(fā)明的范圍之內(nèi)都是等同的。
編碼所需抗原的DNA可以任何合適的形式導入細胞，這些形式包括線性質(zhì)粒，環(huán)形質(zhì)粒，能復制的質(zhì)粒，附加體，RNA等。把基因包含在質(zhì)粒中是優(yōu)選的。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，質(zhì)粒是表達載體。能表達遺傳物質(zhì)的單個表達載體可以通過標準的重組技術獲得。例如對于一般的克隆方法，請參看Maniatis等人，1985，分子克隆實驗室手冊或DNA克隆，第I和第II卷(D.N.Glover，編輯，1985)。
因此，在另一實施方案中，本發(fā)明涉及重組DNA分子，它包括載體以及上述的DNA序列。載體可以質(zhì)粒的形式存在，如pCRII(Invitrogen)，或pJW4303(Konishi，E.等人，1992，Virology 188714)或任何諸如病毒載體這樣的表達載體，如腺病毒或委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒或別的本領域已知的病毒。在靶細胞中優(yōu)選的是將可操作的啟動子序列連接在DNA序列上。對于哺乳動物系統(tǒng)，已知若干這種啟動子，為了使編碼蛋白表達，啟動子可以連接在編碼序列的5’端，或上游。合適的啟動子是人巨細胞病毒立即早期啟動子。下游轉(zhuǎn)錄終止子，或多腺苷酸化序列，如牛生長激素基因的PolyA附加序列也可以加在蛋白編碼序列的3’端。
用在本發(fā)明方法中的合適構建體是圖1中的pWRG7077(4326bp)(PowderJect Vaccines公司，Madison，WT)。pWRG7077包括人巨細胞病毒(hCMV)立即早期啟動子(IE)以及牛生長激素polyA附加位點。啟動子和polyA附加位點之間是內(nèi)含子A，它在天然情況下和hCMV IE啟動子一起出現(xiàn)，當hCMV IE啟動子出現(xiàn)在表達質(zhì)粒中時，能增強轉(zhuǎn)錄。內(nèi)含子A下游，介于內(nèi)含子A和polyA附加序列之間的是唯一的克隆位點，漢坦病毒屬病毒M或SDNA可克隆到其中。pWRG7077也包括能使細菌宿主細胞對卡那霉素具有抗性的基因。編碼漢坦病毒屬病毒G1和/或G2或核殼蛋白的任何區(qū)段都可以通過本領域已知的方法克隆到pWRG7077的一個克隆位點。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了上述重組DNA構建體的宿主細胞。宿主細胞可以是原核細胞如桿狀細菌或大腸桿菌，或真核細胞如糖酵母或畢赤酵母，或哺乳動物細胞或昆蟲細胞。含有漢坦病毒屬病毒序列的載體在細菌中表達，而表達產(chǎn)物用于診斷或作為疫苗。例如對于通用的克隆方法，請參看Maniatis等人，1985，分子克隆實驗室手冊或DNA克隆，第I和第II卷(D.N.Glover編輯，1985)。DNA序列可以出現(xiàn)在載體中，可操作地連接到高度純化的IgG分子，佐劑，載體，或有助于漢坦病毒屬病毒蛋白或肽純化的試劑上。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞可以作為上述DNA序列的來源。當重組分子是表達系統(tǒng)時，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞可以作為DNA編碼蛋白或肽的來源。DNA使用時可以是線形或環(huán)形的，或線性化的質(zhì)粒，只要漢坦病毒屬病毒序列可操作地連接在啟動子上，而啟動子可以在轉(zhuǎn)染細胞中表達。
在本申請中，我們介紹了DNA疫苗針對漢坦病毒屬病毒引發(fā)保護性免疫。DNA的轉(zhuǎn)移方式可以是通過注射進入受體組織，口服或肺部給藥，或者通過粒子轟擊(即基因槍)接種。任何一種方法都可以轉(zhuǎn)移DNA，只要DNA能被表達而且細胞能制造所需的抗原。本申請例舉了兩種方法，這兩種方法都能在受接種者中成功地誘導保護性免疫反應。
為了通過粒子轟擊轉(zhuǎn)移DNA疫苗，我們選用了在1995年7月27日公開的WO95/19799中介紹的PowdererJect-XRTM基因槍裝置。別的儀器都可以得到，而且本領域的人所熟知。這些儀器利用高速粒子轟擊將包被了DNA的金珠直接轉(zhuǎn)移到表皮細胞，和別的接種同樣DNA的非腸道途徑相比，它用更少量的DNA，能更有效地誘導體液和細胞介導的免疫反應(Eisenbraun，M等人，1993，DNA Cell.Biol.，12791；Fynan，E.F.等人，1993，美國科學院院刊，9011478；Haynes，J.R.等人，1994，AIDS Res.Hum.Retroviruses 10Suppl.2S43；Pertmer，T.M等人，1995，Vaccine 131427)。DNA候選疫苗進行表皮接種對于在免疫活性組織中的基因表達也有好處，免疫活性組織一般在15-30天脫落，而且它是蜱螫傷后病毒繁殖的重要天然聚集點(Bos，J.D.，1997，Clin.Exp.Immuno.107，Suppl.13；Labuda，M等人，1996，Virology219357；Rambukkana，A等人，1995，Lab.Invest.73521；Stingl，G.，1993，Recent Results Cancer Res.12845)。
候選疫苗包括含有M基因組區(qū)段的粒子，M基因組區(qū)段含有G1和/或G2，來自一或多個不同的HFRS相關的病毒，如漢城病毒，漢坦病毒，普馬拉型病毒和多布拉伐病毒，也來自一或多個HPS相關的病毒，如辛諾柏病毒，黑渠港病毒，長沼病毒，紐約病毒，安地斯病毒和Laguna Negra病毒或這些病毒的組合。來自不同病毒的DNA片段可以在不同的粒子上，也可以在同一粒子上，無論哪種都會導致所需的免疫反應。此外，本發(fā)明涉及的疫苗包括一或多個來自不同漢坦病毒屬病毒的DNA。這種疫苗被稱作多價疫苗。設計這種疫苗來防止由于暴露在一或多個漢坦病毒屬病毒中而引起的病變。疫苗也可以和試劑結合，這種試劑能提高疫苗的抗原性，或降低它的副作用。
加速粒子基因轉(zhuǎn)移或粒子轟擊的技術的基礎是將要轉(zhuǎn)移到細胞中的DNA涂在很小的載體粒子上，該粒子比通過這個方法尋求轉(zhuǎn)化的細胞要小。含有所需基因的DNA序列能在一種小的惰性粒子上簡單地干燥。粒子可以由任何惰性材料組成，如惰性金屬(金，銀，鉑，鎢等)或惰性塑料(聚苯乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯纖維等)。優(yōu)選的粒子是由金，鉑或鎢組成。最優(yōu)選的粒子是由金組成。合適的粒子是球形的，直徑是0.5-5微米，優(yōu)選的是1-3微米。
含有所需基因的DNA序列可以制備成適合基因?qū)氲男问?，能簡單地在裸露的金或鎢粒子上干燥。然而，這種形式的DNA分子具有相對短的穩(wěn)定期，而且由于和粒子本身的金屬或氧化底物的化學反應，DNA分子往往降解得十分迅速。因此，如果載體粒子首先用封裝試劑包被，DNA鏈的穩(wěn)定性會顯著改善，而且即便是在幾周的時間內(nèi)，也不會顯著降解。合適的封裝試劑是聚賴氨酸(分子量200000)，它在DNA分子使用前用在載體粒子中。包括亞精胺在內(nèi)的其他封裝試劑，聚合的還是非聚合的，可以作為相似的封裝試劑使用。聚賴氨酸在粒子中的應用方式是用含0.02％聚賴氨酸的溶液沖洗金粒子，然后空氣干燥或加熱干燥，從而將粒子包被。一旦包被了聚賴氨酸的金屬離子被合適地干燥，就可以將DNA鏈負載到粒子中。
DNA負載到粒子中的比率是每毫克金珠0.5-30微克DNA。DNA和金珠的優(yōu)選比率是每毫克金珠0.5-5.0μgDNA。樣品開始用γ射線照射(優(yōu)選的是30kGy)乙烯-四氟乙烯共聚物小管。金粒子在微離心管中稱重，加入大約0.5M亞精氨(游離堿)并混合，然后加入DNA。10％的CaCl2溶液和DNA一起培養(yǎng)大約10分鐘，提供細的鈣沉淀。沉淀物攜帶DNA到金珠上。將微離心管離心，沉淀重懸并用100％乙醇沖洗，終產(chǎn)物重懸在含有0.0025mg/ml PVP的100％乙醇中。然后把帶有DNA的金粒子放在小管中干燥。
加速粒子基因轉(zhuǎn)染的通用方法在授權給Sanford的美國專利No4945050中已有介紹。根據(jù)這種方法改進版本設計的儀器可以通過商業(yè)途徑從Wisconsin，Madison的PowderJect Vaccines公司購買到，這在WO95/19799中介紹了。本申請上下文所引用的所有文件都以其全文被引作本發(fā)明的參考。簡而言之，包被了DNA的粒子沉積在塑料小管的內(nèi)表面，塑料小管被切成合適的長度，形成樣品夾。將樣品夾放在壓縮氣體的通道上(例如氦氣，壓力足以將粒子從彈藥夾中驅(qū)逐出來，如350-400psi)。粒子被氣流帶走，然后朝著靶組織用足夠的力量轉(zhuǎn)移到組織的細胞中。進一步的詳細說明可以從已經(jīng)出版的儀器應用指南上獲得。
包被的載體粒子通過物理方法加速飛向?qū)⒁晦D(zhuǎn)化的細胞，致使載體粒子射入靶細胞的里面。這種技術可以在體外細胞中使用，也可以在體內(nèi)細胞中使用。以前已包被在載體粒子上的DNA以某種頻率在靶細胞中表達。基因表達技術已經(jīng)證明在原核和真核細胞，從細菌和酵母到高等植物和動物中都能發(fā)揮作用。因此，加速粒子的方法提供了一種方便的方法學，它可以將基因轉(zhuǎn)移到范圍更廣的不同類型的組織細胞中，并提供了一種原位或體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因到細胞中的能力，而不會對處理的個體有不利的影響或副作用。因此，加速粒子的方法也是優(yōu)選的，因為它使得DNA疫苗能夠針對特定的組織和某種組織的特定細胞層誘導免疫反應，只要分別改變轉(zhuǎn)移位點和粒子加速的力量。這種技術因此特別適合將抗原蛋白的基因轉(zhuǎn)移到表皮上。
為了在個體中獲得所需的抗原反應，利用一種非入侵的方式將DNA疫苗轉(zhuǎn)移到不同類型的易感組織中。最有利的是，基因疫苗可以導入表皮。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種轉(zhuǎn)移能產(chǎn)生一種全身性的體液免疫反應。
為了從這種技術中獲得額外的效果和保證在接種個體中產(chǎn)生粘膜，體液和細胞免疫反應，將基因轉(zhuǎn)移到粘膜組織表面也是需要的。有許多不同的可用的適合轉(zhuǎn)移的位點，包括表皮，外周血細胞以及不同的口腔，上呼吸道，和生殖粘膜表面上任意數(shù)目的位點，外周血細胞即淋巴細胞，它們可以在體外處理，然后放回體內(nèi)。
通過基因槍進行DNA免疫能使DNA直接轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)，誘發(fā)更高水平的保護性免疫反應，而且比標準接種方法使用的DNA要少大約3個量級。
此外，基因槍轉(zhuǎn)移使得在某個給定的表皮位點能精確地控制抗原產(chǎn)物的水平和形式，因為胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)移能通過系統(tǒng)性地改變轉(zhuǎn)移的粒子數(shù)目和每個粒子中DNA的量來控制。對抗原產(chǎn)物水平和形式的精確控制使得控制產(chǎn)生的免疫反應的屬性成為可能。
本發(fā)明使用的術語“轉(zhuǎn)染”指的是整合了轉(zhuǎn)移的外源DNA疫苗的細胞，而不管使用的轉(zhuǎn)移技術。
本發(fā)明公開的是在DNA疫苗接種后，在誘導細胞，體液，和保護性免疫反應時，優(yōu)選的靶細胞是表皮細胞，而不是更深層皮膚，如真皮的細胞。表皮細胞是優(yōu)選的DNA疫苗的受體，因為這些細胞是身體中最容易進入的細胞，因此，可以非入侵的方式免疫。第二，除了能誘導體液免疫反應，DNA免疫的表皮細胞也能誘導細胞毒性反應，這種反應比表皮下細胞中產(chǎn)生的反應更強烈。向真皮轉(zhuǎn)移也具有侵入少以及轉(zhuǎn)移的細胞最終被身體脫落的優(yōu)點。
盡管通過將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到靶動物中來誘導免疫反應是所需的，但僅僅證明免疫反應并不足以給動物提供保護性好處。重要的是獲得一種保護性的免疫反應，這種反應顯然和臨床的形式有差異。換句話說，一種方法只要在它能降低疾病癥狀的嚴重性時才是有效的。在漢坦病毒屬病毒攻擊免疫種群后，抑制死亡的有效性至少能達到20％的免疫方法是優(yōu)選的。對免疫種群死亡的抑制能達到50％或更大的有效性的免疫接種方法是更優(yōu)選的，而最優(yōu)選70-100％的有效性。本發(fā)明顯示的免疫接種方法對漢坦病毒屬病毒感染的倉鼠模型具有100％的有效性。倉鼠被廣泛地用作實驗室模型，選用來評估針對漢坦病毒屬病毒的保護性免疫反應。相反，由于漢坦病毒屬病毒的攻擊，沒有免疫的動物一律被感染。我們的結果表明用SEOV M基因組區(qū)段接種能防止?jié)h城病毒，漢坦病毒(HTNV)和多布拉伐病毒(DBOV)感染。用HTNV M基因組區(qū)段接種能防止?jié)h坦病毒，漢城病毒和多布拉伐病毒感染。用ANDV M基因組區(qū)段接種能防止ANDV，辛諾柏病毒和黑渠港病毒感染。用ANDV-M/HTNV-M區(qū)段接種能防止SEOV，HTNV，DBOV，ANDV，辛諾柏病毒以及黑渠港病毒等其他漢坦病毒屬病毒的感染。
總之，施用的DNA疫苗數(shù)量是每劑大約1-8μgDNA，而且取決于將要處理的供試者，供試者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生所需免疫反應的能力，以及所需保護的程度。將要施用疫苗的精確數(shù)量取決于從業(yè)者的判斷，而對每個供試者和抗原是特殊的。
誘導免疫反應的疫苗能防止一或多種病毒，可以單劑量施用，或優(yōu)選地以多劑量施用，在多劑量規(guī)程中，疫苗接種開始進程是1-8次單獨劑量，在隨后的時間間隔中使用的是其他劑量，時間間隔是保持或增強免疫反應所必需的，例如，在1-4個月是第2劑，而如果需要的話，若干月后，再施用隨后的劑量。合適免疫規(guī)程的實施例包括(i)0，1和6個月；(ii)0，7天和1個月；(iii)0和1個月；(iv)0和6個月，或別的足以誘導所需免疫反應，按預期那樣提供保護性免疫反應，或減少疾病癥狀，或降低疾病嚴重性的免疫規(guī)程。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于實施本發(fā)明方法的試劑。這種試劑包括含有來自一或多個漢坦病毒屬病毒的M或S或兩個基因片段的DNA片段，以及小的惰性的密集的粒子。DNA片段和密集的粒子在上面已經(jīng)介紹了。
DNA優(yōu)選的是冷凍的或凍干的，而小的惰性的密集的粒子是干粉形式。如果使用了包被溶液，包被溶液的干燥成分可以預混合和提前測量，而且可以放在諸如小瓶或密封的包膜這樣的容器中。
本發(fā)明也提供用來實施本發(fā)明的試劑盒。本試劑盒含有第一個容器，該容器中含有上述冷凍或凍干的DNA。該試劑盒也包括第二個容器，該容器中含有包被溶液或包被溶液中預混合和提前檢測的干燥成分。該試劑盒也包括第三個容器，該容器中包括小的，惰性的，密集的粒子，這些粒子是干粉形式或懸浮在100％的乙醇中。這些容器可以由玻璃，塑料或金屬薄片構成，可以是小瓶，瓶子，袋子，管子，包等。該試劑盒也包括書寫的信息，如實施本發(fā)明的程序，或分析信息，如第一個容器中包含的試劑數(shù)量(例如DNA的摩爾數(shù)或質(zhì)量數(shù))。手寫的信息可以在第一，第二和/或第三個容器中的任一個中，和/或與第一，第二，和第三個容器一起，單獨放在第四個容器中。例如，第四個容器可以是盒子或包，而且包括第一，第二和第三個容器。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及多克隆抗體，它來自接受了上述DNA疫苗的受接種者。術語“抗體”是本領域公知的術語，意思包括能結合已知抗原的分子或分子的活性片段。這些活性片段是通過許多技術從本發(fā)明的抗體中衍生而來的。為了進一步介紹分離抗體活性片段的通用技術，請參看Khaw，B.A等人，J.Nucl.Med.231011-1019(1982)。術語“抗體”也包括雙特異和嵌合抗體。
下面實施例介紹的多克隆抗體的特征是用諸如ELISA，免疫沉淀，或免疫熒光試驗時，能和合適免疫原，即G1和G2結合的抗體。此外，用噬菌斑降低中和試驗(PRNT)檢測抗體必須能中和漢坦病毒屬病毒。任何保留了這些特征的抗體都和本發(fā)明有關。多克隆抗體可以濃縮，照射以及測驗中和安地斯病毒和漢坦病毒等其他目的漢坦病毒屬病毒的能力。具有足夠高中和抗體效價的血清，即高到轉(zhuǎn)移后足以在受體中檢測到反應，可以被匯集。然后將產(chǎn)物凍干用于貯存和復溶。
如實施例中所更詳細介紹的那樣，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用含有諸如漢坦病毒或安地斯病毒這類漢坦病毒屬病毒M區(qū)段的DNA疫苗免疫的受接種者的血清含有能中和漢坦病毒屬病毒的抗體，并能在體外和體內(nèi)展示中和漢坦病毒屬病毒的性質(zhì)。有意義的是，抗體的反應性適用于范圍更廣的不同的漢坦病毒屬病毒，無論是HFRS漢坦病毒屬病毒還是HPS漢坦病毒屬病毒。
鑒于這些結果，本發(fā)明的多克隆抗體適合作為治療用和預防用試劑，這些試劑用來治療或預防易受漢坦病毒屬病毒接觸影響的供試者中漢坦病毒屬病毒感染或疾病。供試者包括諸如小鼠或豚鼠這樣的嚙齒類動物，鳥或禽類，以及包括人在類的哺乳類動物。
總之，這種方法包括給可能在漢坦病毒屬病毒中暴露的供試者或表示出漢坦病毒屬病毒癥狀的供試者施用治療或預防有效量的本發(fā)明多克隆抗體?？贵w的任何活性形式都可以施用。本發(fā)明的抗體可以在任何系統(tǒng)中產(chǎn)生，包括昆蟲細胞，桿狀病毒表達系統(tǒng)，小雞，兔，山羊，母牛，或植物，如番茄，馬鈴薯，香蕉或草莓。在這些系統(tǒng)中生產(chǎn)抗體的方法是本領域普通的技術人員所熟知的。優(yōu)選的是，使用的抗體和受體物種是相容的，致使針對抗體的免疫反應不會在病毒得到控制之前將抗體清除掉，而且供試者中針對抗體誘導的免疫反應不會在供試者中誘導“血清病”。
患有漢坦病毒屬病毒感染的個體的治療可包括施用治療有效量的本發(fā)明抗?jié)h坦病毒屬病毒的抗體?？贵w可以在下面介紹的試劑盒中提供。在給患者提供能結合漢坦病毒屬病毒的抗體，或抗體區(qū)段，或能防止患者受體感染漢坦病毒屬病毒的抗體時，施用試劑的劑量根據(jù)患者的因素如年齡，體重，高度，性別，總的醫(yī)療情況，以前病史等來變化。
總之，給受體提供一劑抗體是所需的，盡管可以施用更低或更高的劑量，但抗體劑量的范圍是1pg/kg-100pg/kg，100pg/kg-500pg/kg，500pg/kg-1ng/kg，1ng/kg-100ng/kg，100ng/kg-500ng/kg，500ng/kg-1μg/kg，1μg/kg-100μg/kg，100μg/kg-500μg/kg，500μg/kg-1mg/kg，1mg/kg-50mg/kg，50mg/kg-100mg/kg，100mg/kg-500mg/kg，500mg/kg-1g/kg，1g/kg-5g/kg，5g/kg-10g/kg(受體的體重)。
把防止?jié)h坦病毒屬病毒感染的抗體提供給受體供試者，數(shù)量足以減輕漢坦病毒屬病毒感染癥狀。如果試劑的劑量，給藥途徑等足以影響這種反應，數(shù)量被說成足以“影響”感染癥狀的減輕。對施用抗體的反應可以通過分析供試者的生命征象來檢測。
如果組合物的施用能被受體患者耐受，則說它是“可藥用的”。如果這種試劑施用的數(shù)量具有生理意義，則說它是以“治療有效量”施用的。如果一種試劑的存在能在受體患者中檢測到生理變化，則說它具有生理意義。
根據(jù)已知的方法，可以將本發(fā)明的化合物配制成藥用組合物，將這些材料，或它們的功能衍生物，和可藥用的載體介質(zhì)結合成混合物。合適的介質(zhì)，以及它們的制劑，包括其他人蛋白，如人血清白蛋白，都在諸如Remington的《藥物科學》(16版)(Osol，A編輯，Mack EastonPa.(1980))這樣的出版物中被介紹了。為了形成藥用可接受的組合物，適合有效地施用，這種組合物將包含有效量的上述化合物，以及合適數(shù)量的載體介質(zhì)。
可以應用別的藥用方法去控制作用的持久。通過使用多聚體來復合或吸收化合物來獲得控釋制劑。為了控制釋放，通過選擇合適的大分子(例如聚酯，聚氨基酸，聚乙烯，吡咯酮，乙烯-醋酸乙烯共聚物，甲基纖維素，羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白)和大分子濃度以及摻入的方法可實施受控的轉(zhuǎn)移。另一種由控釋制劑控制作用持續(xù)時間的可能方法是將本發(fā)明的化合物整合到諸如聚酯，聚氨基酸，水凝膠，聚乳酸或乙烯-醋酸乙烯共聚物這樣的多聚體材料粒子中。此外，也可以不把這些試劑整合到多聚體粒子中，而把這些試劑包埋在通過諸如界面聚合法制備的微膠囊，如羥甲基纖維素或明膠微膠囊以及聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊中，或者膠體藥物釋放系統(tǒng)如脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳劑，納米微粒，以及納米囊或巨大乳劑中也是可能的。這些技術在Remington′s Pharmaceutical Sciences一書中(1980)中公開了。
可以采用任何合適的方法包括腸道外注射(如腹膜內(nèi)的，皮下的或肌肉注射)，蛋內(nèi)(in ovo)注射鳥，口服或局部給藥將抗體(典型的是包含在藥用制劑中)施用在導氣管表面這樣的方法施用本發(fā)明公開的抗體。將抗體局部施用到導氣管表面的實施方法是鼻內(nèi)給藥(例如利用點滴器，藥簽或吸入器，這些儀器都能在鼻內(nèi)放置藥用制劑)。將抗體局部施用到導氣管表面的實施方法也可是吸入給藥，如通過制造一種藥用制劑的可呼吸粒子(包括固體和液體粒子)，該藥用制劑含有以氣溶膠懸浮液形式存在的抗體，然后使得供試者吸入可吸入粒子。藥用制劑呼吸粒子給藥的方法和儀器是眾所周知的，而且任何常規(guī)的技術都可以使用。口腔給藥的方式可以是可消化的液體或固體形式。
治療可以是單劑量規(guī)程，或者優(yōu)選的是多劑量規(guī)程，在多劑量規(guī)程中，初始療程是單獨的1-10劑，在隨后的時間間隔中使用的是其他劑量，時間間隔是保持或增強免疫反應所必需的，例如，在1-4個月是第2劑，而如果需要的話，若干月后，可以施用隨后的劑量。合適的治療方案實施例包括(i)0，1和6個月；(ii)0，7天和1個月；(iii)0和1個月；(iv)0和6個月，或別的足以誘導所需免疫反應，按預期那樣減少疾病癥狀，或降低疾病嚴重性的方案。
本發(fā)明進一步涉及一種在疑似漢坦病毒屬病毒感染樣品中檢測漢坦病毒屬病毒的方法。方法包括，用本發(fā)明能結合漢坦病毒屬病毒抗原的多克隆抗體接觸樣品，讓抗體結合到漢坦病毒屬病毒抗原上形成免疫復合物，檢測形成的免疫復合物，并且使免疫復合物存在與否與樣品中漢坦病毒屬病毒存在與否相聯(lián)系。樣品可以是生物樣品，環(huán)境樣品或食物樣品。
“檢測形成的免疫復合物”這句話的意思包括發(fā)現(xiàn)樣品中漢坦病毒屬病毒抗原存在與否。利用免疫試驗可以檢測漢坦病毒屬病毒抗原存在與否。許多用來檢測和/或定量抗原的免疫試驗都是本領域普通技術人員所熟知的。參看Harlow和Lane，抗體實驗室手冊(冷泉港實驗室，紐約1988，555-612)。這些免疫試驗包括抗體捕捉試驗，抗原捕捉試驗和雙抗體夾心試驗。這些試驗都是本領域普通技術人員通用的方法。在抗體捕捉試驗中，將抗原吸附到固體支持物上，允許標記的抗體結合。沖洗后，通過檢測固體支持物上保留的抗體數(shù)量來定量該實驗。這個實驗的一個變化是競爭性ELISA，在ELISA實驗中，抗原結合在固體支持物上，而兩種含有能結合抗原的抗體溶液，例如漢坦病毒屬病毒受接種者的血清以及本發(fā)明的多克隆抗體，都被允許和抗原競爭性地結合。然后檢測結合的多克隆抗體的量，然后可以確定血清中是否含有抗?jié)h坦病毒屬病毒抗原的抗體。這個競爭性ELISA實驗結果可用來表示接種后，受接種者中已知的保護性表位的免疫性。
在抗原捕捉實驗中，將抗體吸附到固體支持物上，允許標記的抗原結合。通過沖洗去掉未結合的蛋白，通過檢測結合抗原的數(shù)量來定量該實驗。在雙抗體夾心試驗中，一種抗體吸附到固體支持物上，允許抗原結合該第一種抗體。通過檢測可結合抗原的標記第二個抗體的數(shù)量來定量該實驗。
這些免疫試驗典型的依賴于檢測用的標記的抗原，抗體或第二種試劑。這些蛋白可以用放射活性化合物，酶，生物素或熒光染料標記。其中，放射活性標記幾乎可以用在所有類型的實驗中，而且有最多的變化。當放射活性必須避免或需要快速的結果時，酶聯(lián)標記是特別有用的。生物素偶聯(lián)的試劑通常用標記的鏈霉親和素來檢測。鏈霉親和素能緊密和迅速地結合生物素，并且標記上放射性同位素或酶。熒光染料，盡管在使用時要求昂貴的設備，但它提供了非常靈敏的檢測方法。用在這些實驗中的抗體包括單克隆抗體，多克隆抗體，以及親和純化的多克隆抗體。本領域普通技術人員都知道別的合適的標記，它們可根據(jù)本發(fā)明來使用。利用本領域普通技術人員共同知道的標準技術可以將這些標記和抗體或抗體區(qū)段結合在一起。典型的技術在Kennedy，J.H.等人1976年的Clin.Chim.Acta 701-31)和Schurs，A.H.W.M.等人1977年的Clin.Chim Acta 811-40中介紹了。在后文中提到的偶聯(lián)技術是戊二醛方法，高碘酸鹽方法，二馬來酰亞胺方法以及其他，所有這些方法都被引作本申請的參考。
“生物樣品”這句話的意思包括生物材料，如細胞，組織，或生物流體?！碍h(huán)境樣品”意思是指諸如土和水這樣的樣品。食物樣品包括罐裝品，肉等。
本發(fā)明另一方面是檢測生物樣品中漢坦病毒屬病毒的試劑盒。試劑盒包括含有一或多個本發(fā)明多克隆抗體的容器，本發(fā)明多克隆抗體能結合漢坦病毒屬病毒抗原，還包括抗體使用說明書，目的是將抗體結合到漢坦病毒屬病毒抗原上形成免疫復合物，并且檢測免疫復合物的形成，以致將免疫復合物的存在與否和樣品中漢坦病毒屬病毒的存在與否聯(lián)系起來。容器的實施例包括多孔培養(yǎng)板，它使得能同時檢測多個樣品中的漢坦病毒屬病毒。
所有在整個本申請中引用的參考文獻的內(nèi)容(包括文獻參考，發(fā)表的專利，出版的專利申請和在審申請)專門在此引作本申請的參考。
本發(fā)明的其他特征將在下面示范性實施方案的介紹過程中變得更清晰，給出的這些實施方案是為了證明本發(fā)明，而不是有意限制本發(fā)明。
下列材料和方法都在下面實施例中使用了。
材料和方法病毒，細胞和培養(yǎng)基HTNV病毒株76-118(Lee等人，1978，J.Infect.Dis.137，298-308)，ANDV病毒株Chile-9717869(Hooper等人，2001，Virology 289，6-14)，BCCV(Rollin等人，1995，J.Med.Virol.46，35-39)，和SNV病毒株CC107(Schmaljohn等人，1995，Virology 206，963-972)都在Vero E6細胞中繁殖(Vero C1008，ATCC CRL 1586)。在COS細胞(COS-7；ATTC CRL1651)中進行瞬時表達實驗。兩種類型細胞都在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基是含有Earle氏鹽的Eagle氏基礎培養(yǎng)基(EMEM)，其中含有10％的胎牛血清，10mM，pH7.4的HEPES，以及抗生素(青霉素[100U/ml]，鏈霉素[100μg/ml]和硫酸慶大霉素[50μg/ml])(cEMEM)。
HTNV G2特異的單克隆抗體(MAbs)MAb-23G10，MAb-11E10，MAb-3D7，MAb-16E6和MAb-HC02；HTNV G1特異的MAbsMAb-2D5，MAb-6D4，MAb-8B6，MAb-3D5，以及MAb-10F11都在以前介紹了(Arikawa等人，1989，J.Gen.Virol.70，615-24，24)。MAb-HC02和MAbE606由J.McCormick博士提供(亞特蘭大，疾病控制中心，Georgia，Ruo等人，1991，Arch.Virol.119，1-11)。
SEOV M和S裸露DNA質(zhì)粒的構建通過RT-PCR克隆SEOV病毒株SR-11的M和S基因組區(qū)段這種方法已經(jīng)在前面介紹了(Arikawa等人，1990，Virology 176，114-125)。將代表每個基因組區(qū)段的cDNA亞克隆到以前介紹的裸露DNA載體pWRG7077的NotI或BamHI位點(Schmaljohn等人，1997，J.Virol.64，3162-3170)。根據(jù)制造商的說明書，用Qiagen maxiprep DNA純化試劑盒(目錄號12163，Qiagen)純化質(zhì)粒DNA。我們用于接種針肌內(nèi)接種和表皮基因槍接種的DNA并不是通過無內(nèi)毒素(endo-free)qiagen DNA試劑盒制備的，因此，該DNA并不是無內(nèi)毒素的(Qiagen質(zhì)粒試劑盒，每μgDNA產(chǎn)生～9.3內(nèi)毒素單位[QIAGEN質(zhì)粒純化手冊01.971])。為了控制內(nèi)毒素可能的免疫刺激效果，我們用制備候選疫苗相同的方法精確地制備了陰性對照質(zhì)粒DNA。
含漢坦病毒屬病毒M基因的DNA疫苗質(zhì)粒的構建。
用如下方式構建pWRG/SEO-M的修飾版本。
用聚合酶鏈式反應(PCR)從pWRG/SEO-M擴增SEOV M DNA，使用的正向引物是[引物0，5’-GCGCGCGGCCGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAAC(SEQ ID NO10)]和反向引物[反向，5′-GCGCGGATCCCGGGTACCGGGCCCCCCCTCG(SEQ ID NO11)]。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，得到pWRG/SEO-M(0)。
通過PCR從pWRG/SEO-M(0)中擴增SEOV M DNA，使用的正向引物是[引物1-24，5’GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO12)]，或[引物24-1，5’-GGCCGCGGCCGCGAGCACGGCTTAAGGACGTCTAGGAGTAGTAGTCTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO13)]，或[引物1-12，5’-GGCCGCGGCCGCATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO14)]，或[引物13-24，5’-GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO15)]，或[引物1-24*，5’GGCCGCGGCCGCGGATCTGCCCGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO16)]，或[引物1-8，5’GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO17)]以及反向引物BACK。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，分別得到pWRG/SEO-M(1-24)，pWRG/SEO-M(24-1)，pWRG/SEO-M(1-12)，pWRG/SEO-M(13-24)，pWRG/SEO-M(1-24*)，以及pWRG/SEO-M(1-8)。
為了構建pWRG/SEO-M(x)，通過PCR從pWRG/SEO-M中擴增編碼SEOV G1/G2蛋白的DNA，使用引物1-24和反向引物[SEOMX，5′-GCGCGGATCCAGATTGGGAGATAGAAGAGAG(SEQ IDNO18)]。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中。通過去掉pWRG7077 BamHI和BglII位點之間不需要的克隆人造DNA(猿免疫缺陷病毒nef基因大約100個核苷酸)，構建該克隆。去掉該序列對克隆基因的表達沒影響(數(shù)據(jù)沒有表示出來)。
HTNV M DNA疫苗質(zhì)粒pWRG/HTN-M的構建基本按如下方法進行。首先，用BglII將編碼HTNV G1/G2的DNA從pTZ19RHTNMm中剪切下來(Schmaljohn等人，1989，同上)，并連接到用BamHI剪切的pWRG7077載體中。該質(zhì)粒表達G2，但不表達G1(數(shù)據(jù)沒有表示出來)。第二步，該質(zhì)粒含有M基因5’末端的NotI-PshAI區(qū)段被剪切下來，并用PCR擴增的DNA(來自質(zhì)粒pUC18，pUC18中含有全長HTNV M基因，該基因是通過反轉(zhuǎn)錄酶PCR從病毒RNA中克隆來的)取代，PCR使用的引物是1-24(參考上文)和反向引物[M5B，5’-TCAGGACTCCTGTCATGCAATAAGATCTC(SEQ ID NO19)]。反向引物包括HTNV M基因中沉默的核苷酸變化，這種變化創(chuàng)造了一個用于診斷的BglII位點。用NotI和PshAI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-PshAI切割的pWRG7077中，得到pWRG/HTN-M。
利用引物1-24和反向引物[HTNMX，5’-GCGCGGATCCGTTTGTGGTTAGAAAGCTAC(SEQ ID NO20)]從pWRG/HTN-M中擴增HTNV M基因，構建pWRG/HTN-M(x)。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的載體pWRG7077中。這個克隆和pWRG/HTN-M完全一樣。然而，該基因3，非翻譯區(qū)的一部分，以及NotI和BglII之間的載體序列被去掉了。
利用引物0和反向引物HTNMX，從pWRG/HTN-M(x)中PCR擴增HTNV M基因，構建pWRG/HTN-M(0)。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中。
利用引物1-24和反向引物HTNMX，從pWRG/HTN-M(0)中PCR擴增HTNV M基因，構建pWRG/HTN-M(1-24)。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中。
根據(jù)制造商的說明書，用Qiagen maxiprep DNA純化試劑盒純化質(zhì)粒DNA。
為了構建含有ANDV M基因的DNA疫苗質(zhì)粒pWRG/AND-M，根據(jù)標準方法，利用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，Calif)從ANDV感染的Vero E6細胞中分離病毒RNA。利用SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)在50℃將該RNA反轉(zhuǎn)錄50分鐘，然后在70℃培養(yǎng)15分鐘使反轉(zhuǎn)錄酶失活。用RNaseH在37℃消化20分鐘，去掉RNA。分別根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的SNV和PUUV序列設計的正向和反向引物包括在反轉(zhuǎn)錄反應中正向引物[SN-Fj，5’-GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCACGAAGAAGC(SEQ ID NO21)]和反向引物[PUUM-R，5’-GCGCGGATCCTAGTAGTATGCTCCGCAGGAAC(SEQ IDNO22)]。正向引物包括一個NotI限制性位點(下劃線)和M基因非編碼區(qū)上游的24個核苷酸，這24個核苷酸就是我們以前發(fā)現(xiàn)的在pWRG/HTN-M(x)中表達G1時很重要的序列。反向引物包括一個BamHI限制性位點(下劃線)。用PCR純化試劑盒(Qiagen)純化cDNA，并在PCR反應中作為模板。PCR反應包括SN-Fj和PUUM-R引物，以及Platinum Taq高保真DNA聚合酶(Invitrogen)94℃，3分鐘，一個循環(huán)，緊接著是30個循環(huán)，每個循化是94℃30秒，68℃8分鐘。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，得到pWRG/AND-M(1.1)，迄今稱作pWRG/AND-M(SEQID NO8)。根據(jù)制造商的說明書，用Qiagen maxiprep DNA純化試劑盒純化質(zhì)粒DNA。在構建這個質(zhì)粒的時候，ANDV M基因的序列是未知的，因此我們利用引物步移技術和ABI 3100基因分析儀對M基因和載體/插入位點連接處進行了測序。
間接熒光抗體實驗(IFAT)
IFAT是以前介紹的方法的修改(Kamrud等人，1995，Exp.Parasitol.81，394-403)。根據(jù)制造商的說明，利用Fugene6(BoehringerMannheim)，將1μg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染生長在12孔細胞培養(yǎng)板的15mm玻璃蓋玻片上的COS細胞。轉(zhuǎn)染后24小時，用PBS(pH7.4)沖洗蓋玻片一次，用丙酮在室溫下固定10分鐘，然后和抗SEOV的多克隆抗血清(兔)或接種動物的血清反應。在含有3％胎牛血清(FBS)的PBS中稀釋抗體，然后和轉(zhuǎn)染細胞在37℃培養(yǎng)30分鐘。用PBS沖洗蓋玻片三次，并和生物素酰化的猴抗兔抗體在37℃培養(yǎng)30分鐘，緊接著和稀釋在含3％FBS的PBS中的鏈霉親和素交聯(lián)的熒光素(Amersham)，或熒光素標記的山羊抗倉鼠抗體反應(Kirkegaard &Perry實驗室)。伊文氏藍(Fisher)包含在二級抗體溶液中，作為復染劑。用PBS沖洗蓋玻片三次，并且用去離子水沖洗一遍，然后放在玻片上熒光裝片基質(zhì)(DAKO)液滴中。用Zeiss Axioplan熒光顯微鏡觀察細胞。
對于HTNV，倉鼠血清用含有3％FBS的PBS按1∶200稀釋，然后和轉(zhuǎn)染細胞在37℃培養(yǎng)1小時。用PBS沖洗蓋玻片三次，并和熒光素標記的山羊抗倉鼠IgG抗體在37℃培養(yǎng)30分鐘(Kirkegaard &Perry實驗室)。赫斯特染色劑(1μg/ml)包含在二級抗體溶液中，作為復染劑。用PBS沖洗蓋玻片三次，并且用去離子水沖洗一遍，然后放在玻片上熒光裝片基質(zhì)(DAKO)液滴中。用Nikon E600熒光顯微鏡觀察細胞。
免疫沉淀培養(yǎng)在T-25細胞培養(yǎng)瓶中的COS細胞經(jīng)Fugene6(BoehringerMannhein)介導，用5-8μg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。24小時后，表達產(chǎn)物用Promix([35S]-甲硫氨酸和[35S]-半胱氨酸，Amersham)進行放射性標記，然后根據(jù)前面介紹的方法進行免疫沉淀(Schmaljohn等人，1997，Emerg.Infect.Dis.3，95-104)。還原的樣品在200V常壓下，4-12％Bis-Tris SDSPAGE梯度膠上電泳，3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)做電泳緩沖液(NuPage)。
用基因槍接種根據(jù)前面介紹的方法制備基因槍的彈夾(Eisenbraun等人，1993，DNA Cell Biol.12，791-797；Schmaljohn等人，1997，同上)。簡而言之，將～1.5μgDNA沉淀到0.5mg的約2μm直徑的金珠上(Degussa)。DNA包被的金珠被用來包被Tefzel小管的內(nèi)表面(McMaster-Carr)。彈夾的制作方法是將DNA-金-包被的Tefzel小管切成約0.5英寸的小塊，每一塊含有～0.5mg的金，包被著～0.75μg的DNA(根據(jù)洗脫和熒光分析確定的結合在金珠上的沉淀DNA的～50％)。為了接種動物，用大剪刀去掉腹部的毛，根據(jù)以前介紹的方法(Pertmer等人，1995，Vaccine 13，1427-1430)，利用基因槍(Powderject-XR轉(zhuǎn)移裝置，Powderject Vaccine公司)將DNA包被的金珠施用到腹部表皮的不相重疊的部位。BALB/c小鼠(National Cancer Institute(國家癌癥研究所))和遠交的敘利亞倉鼠(Charles River)分別用2或4個彈夾在400p.s.i的氦氣壓下接種。這些研究根據(jù)Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals(實驗室動物管理及使用指南)上介紹的方法進行(國家衛(wèi)生研究院，1996)。這些設施已經(jīng)被American Association for Accreditationof Laboratory Animal Care(美國實驗室動物管理授權協(xié)會)充分授權了。
對于HTNV，制備基因槍彈夾(～0.5μg質(zhì)粒DNA包被0.5mg金珠)，并且如上所述用基因槍接種遠交的金黃色敘利亞倉鼠。倉鼠每隔3周接種3次。獼猴用接種倉鼠同樣的彈夾和基因槍條件接種，然而，猴子每接種一次得給藥8次，而不是4次。
根據(jù)第II期臨床試驗接種人的方法(McClain等人，2000，同上)，獼猴用重組的痘苗病毒rVV/HTN-M+S接種。用26G3/8英寸的針將疫苗(0.5ml PBS中有3.4×107PFU)皮下注射到右側上臂。42天后，猴子左臂接受了完全一樣的加強接種。
對于ANDV，質(zhì)粒DNA沉淀在金珠上(每毫克金珠是3μg DNA)，然后將DNA包被的金珠包被在小管上。制備由包被在0.5mg金珠上的～0.75μg質(zhì)粒DNA的基因槍彈夾，并將其貯存在4℃，使變干，直到使用時。在400p.s.i氦氣壓的情況下在刮剃的腹部表皮的非重疊部位敘利亞倉鼠用Powderject XR1粒子介導的表皮轉(zhuǎn)移裝置(基因槍)(Powerject Vaccines公司，Madison，Wis.)接種，每次接種要給藥四次。獼猴用接種倉鼠同樣的彈夾和基因槍條件接種，然而，猴子每接種一次得給藥8次(4次在腹部，而4次在腹股溝淋巴結)。在不痛苦的基因槍接種過程中，倉鼠和猴子都得麻醉。唯一可見到的效果是在接種部位有輕微的紅斑。
接種針肌內(nèi)接種用28.5號針頭將懸浮在50μl PBS(pH7.4)中的質(zhì)粒DNA(25μg)注射到麻醉了的小鼠腓腸肌中。
ELISA。為了檢測SEOV G1和G2，將SEOV感染的Vero E6細胞裂解液(-Co照射(3000000拉德)失活的病毒)用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋，4℃過夜，然后涂在酶標板(Costar)上。用PBS，3％脫脂奶，0.05％Tween-20(封閉溶液)在37℃封閉酶標板1小時，然后用PBS，0.05％Tween-20(沖洗溶液)沖洗一遍。小鼠或倉鼠血清在封閉溶液中稀釋，加到孔中，然后用前面的方法培養(yǎng)酶標板。用沖洗溶液沖洗酶標板4次，然后和在封閉溶液中稀釋了1000倍的辣根過氧化物酶(HRP)交聯(lián)的山羊抗小鼠抗體(目錄號A-4416，Sigma)或稀釋了2000倍的辣根過氧化物酶標記的山羊抗倉鼠抗體(目錄號14-22-06，Kirkegaard & Perry實驗室)培養(yǎng)1小時。同前面一樣沖洗酶標板，然后和四甲基聯(lián)苯胺底物(TMB，目錄號50-76-04，Kirkegaard & Perry實驗室)在室溫共培養(yǎng)10分鐘。加入終止溶液(目錄號50-85-04，Kirkegaard & Perry實驗室)終止呈色反應，并且確定450nm處的光密度(OD)。檢測SEOV N特異抗體的方法是從以前介紹的技術中改編而來的(Elgh等人，1997，J.Clin.Microbiol.35，1122-1130)。利用pRSET質(zhì)粒(Invitrogen)將SEOV(病毒株SR-11)核殼蛋白的1-117位氨基酸在大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen公司)中表達成組氨酸標簽的融合蛋白，并在Ni-NTA柱(Qiagen)上通過親和層析進行純化。用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋抗原，并將其加入96孔的微升板上(Maxisorp；NUNC)(每個孔中100μl緩沖液，含有0.2μg抗原)，然后在4℃培養(yǎng)過夜。用去離子水沖洗酶標板，并在室溫下和封閉溶液培養(yǎng)30分鐘。用去離子水沖洗酶標板后，將100μl血清(在封閉緩沖液中稀釋，封閉緩沖液含有大腸桿菌抗原提取物
)加入完全相同的孔。酶標板在37℃培養(yǎng)1小時，然后又用以前的方法沖洗。加入HRP二級抗體，用上面介紹的方法，對SEOV G1-G2 ELISA進行呈色檢測。終點效價被確定為最高的稀釋度，這時的OD比陰性對照質(zhì)粒(pWRG7077)接種的動物血清的平均OD加上3個標準差要大。用SEOV N抗原檢測HTNV N特異的抗體，而用PUUV N來檢測ANDV N特異的抗體。
噬菌斑減少中和試驗(PRNT)。中和試驗基本上是按以前介紹的方法進行(Chu等人，1995，J.Virol.69，6417-6423)。血清樣品在cEMEM中稀釋，然后和等量的含有～75PFU SEOV的cEMEM(111μl)結合。這種血清病毒混合物在4℃培養(yǎng)過夜，然后以200μl/孔的量加入6孔酶標板中，酶標板中含有3-7天大的Vero E6單層細胞。在37℃吸收1小時后，在每個孔中加入3ml含10％FBS的覆蓋培養(yǎng)基(Earl氏基礎培養(yǎng)基(EBME)，10mM HEPEs，0.6％瓊脂糖[Sea Kem ME瓊脂糖]，8mM L-谷氨酰胺，抗生素)和1×非必需氨基酸(GIBCOBRL)。酶標板在37℃培養(yǎng)7天，然后通過添加2ml/孔的含5％FBS和5％中性紅溶液(GIBCO BRL)的覆蓋培養(yǎng)基進行染色。酶標板在37℃培養(yǎng)2天后計數(shù)噬菌斑。實驗前將血清樣品加熱滅活(56℃，30分鐘)。在使用補體的實驗中，血清和病毒在存在5％豚鼠補體(目錄號ACL-4051，Accurate Chemical and Scientific Corporation)的情況下培養(yǎng)過夜。HTNV，SEOV，ANDV，以及BCCV PRNT在1周后用中性紅染色，而PUUV，DOBV，以及SNV PRNT在9天后染色。染色后2-3天(37℃)計數(shù)噬菌斑。
用SEOV攻擊。將稀釋在0.2ml滅菌PBS(pH7.4)中的103PFU的SEOV用25號針通過肌內(nèi)(近尾股)注射到倉鼠。103PFU劑量是根據(jù)以前發(fā)表的文章來定的，該文章報道用這樣的劑量和途徑攻擊后，倉鼠會100％感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Chu等人，1995，同上)。攻擊后28天，將倉鼠麻醉，通過心臟穿刺進行抽血。通過IFAT，ELISA和PRNT評估攻擊后血清中抗SEOV抗體的存在與否。攻擊后病毒蛋白，而不是免疫原的抗體效價顯著上升說明倉鼠被SEOV感染了。
對于HTNV和ANDV，通過ELISA評估攻擊前和攻擊后血清中N特異抗體的存在，并且通過PRNT評估中和抗體的存在。檢測攻擊后N特異抗體表明倉鼠被攻擊的病毒感染。
HTNV的攻擊劑量是2000PFU，這時大約1000LD50(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。ANDV的攻擊劑量是2000PFU，這時大約250LD50。在生物安全4級(BSL-4)實驗室做了一些涉及感染了ANDV的倉鼠的實驗。在生物安全3級(BSL-3)實驗室做了涉及感染了HTNV的倉鼠的實驗，這時要戴著3M-RACAL兜帽，穿著TYVEK衣服。利用一種邏輯回歸模型評估疫苗對殘存結果的作用。利用SAS8.2版本(SAS Insitute Inc.SAS OnlineDoc，Version 8，Cary，NC2000)進行分析。
所有的動物研究都是根據(jù)實驗室動物管理與使用指南中介紹的方法進行的(國家衛(wèi)生研究所，Bethesda，MD，1996)。這種設施是由美國實驗室動物管理授權委員會充分授權的。
交叉保護實驗。用pWRG/SEO-M或陰性對照質(zhì)粒(pWRG7707)接種倉鼠，每組倉鼠4-5只。在3周的間隔中，用基因槍給藥(每次給藥約1.5μg DNA)接種了4次。最后一次接種后3周，獲得攻擊前的血清樣品，然后用1000PFU的漢坦病毒，1000PFU的多布拉伐病毒或1000-2000PFU的普馬拉病毒攻擊倉鼠。攻擊后28天，獲得攻擊后血清樣品。對攻擊前和攻擊后的血清樣品進行評估，方法是通過抗NELISA檢測核殼的抗體，通過漢坦病毒，多布拉伐病毒或普馬拉病毒噬菌斑降低中和測驗(PRNT)檢測攻擊病毒依賴的切除的中和抗體。
抗體注射。把人類HPS患者的恢復期的血漿凍干，重懸在水中，在使用前加入CaCl2至0.1M，在37℃培養(yǎng)4小時，然后在4℃過夜，最后在-20℃放置1小時進行重新鈣化。將處理過的血漿解凍，在10000×G下離心20分鐘，收集上清夜。將接種了DNA疫苗的猴血清和人血清(PEL-FREEZ，Biologics，Rogers，Ariz)加熱滅活(56℃，30分鐘)。用帶25號，5/8英寸針頭的1ml注射器將1ml血清或血漿以腹膜內(nèi)(i.p.)給藥的方式注射到倉鼠中。
實施例1漢坦病毒屬病毒基因的瞬時表達表示SEOV病毒株SR-11M(SEQ ID NO1)或S(SEQ ID NO2)基因區(qū)段的cDNA被亞克隆到裸露的DNA表達載體pWRG7077巨細胞病毒立即早期啟動子的下游，分別得到pWRG/SEO-M(SEQ ID NO3)和pWRG/SEO-S(SEQ ID NO4)(圖1)。為了檢測M和S構建體的表達，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS細胞中，并對表達蛋白進行免疫染色或免疫沉淀。在和抗SEOV的多克隆血清一起培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染單層細胞中，出現(xiàn)了染色的細胞，表明pWRG/SEO-M和pWRG/SEO-S都表達了SEOV反應蛋白(圖2A)。放射性標記的表達產(chǎn)物用抗SEOV的多克隆抗血清進行免疫沉淀，并用SDS-PAGE分析(圖2B)。免疫沉淀的蛋白具有G1，G2和N所預計的表觀分子量(80kDa，56kDa，以及48kDa)(Elliot等人，1984，J.Gen.Virol.65，1285-1293；Schmaljohn等人，1986，Virology 155，633-643)。其他表觀分子量是約37kDa和約28kDa的蛋白條帶和N蛋白共沉淀。這些多肽被N蛋白氨基端特異的單克隆抗體免疫沉淀，并且用Western印跡能檢測出來，表明它們是截短形式的N蛋白(數(shù)據(jù)未表示)。
實施例2用pWRG/SEO-M或pWRG/SEO-S免疫接種小鼠。為了確定是M構建體還是S構建體在小鼠中誘導抗體反應，用pWRG/SEO-M，pWRG/SEO-S或陰性對照質(zhì)粒(pWRG7077)對10組6-8周大小的BALB/c小鼠免疫接種，采用了兩種不同的接種方式用基因槍接種表皮或用針注射腓腸肌。對小鼠進行初次接種，然后在4周的間隔中加強2次。每次接種前收集血樣品，并且在最后一次加強后3周，用ELISA篩選SEOV特異的抗體反應。M構建體和S構建體用兩種DNA給藥途徑都能誘導SEOV特異的抗體反應(圖3)。用基因槍接種了SEOV S基因的大多數(shù)小鼠僅在一次接種后表示出特異的抗體，而在隨后的免疫接種后抗體反應增加(圖3B)。為了比較相對抗體反應，對終了血樣品確定終點ELISA效價(表1)。與肌內(nèi)接種任一構建體比較，基因槍接種導致較高的血清轉(zhuǎn)化頻率和幾何平均效價(GMT)。
表1在接種有SEOV裸露的DNA疫苗的小鼠中的ELISA效價
備注小鼠在4周間隔中接種3次。
在最后加強免疫后3周對采集的血清確定效價。
ag.g.表述基因槍；i.m.表示肌內(nèi)接種針接種。
b組中所有動物的幾何平均效價。
為了確定裸露的DNA接種是否引發(fā)中和抗體，本發(fā)明人對最后加強接種后3周采集的血清進行了噬菌斑減少中和測試(PRNT)。所有以基因槍接種有pWRG/SEO-M的小鼠(10/10)所顯示的PRNT50％效價范圍為40-1280(圖4)。而僅有1/10的通過接種針注射接種有pWRG/SEO-M的小鼠顯示出可檢測的中和抗體反應(PRNT50％＝40)。通過基因槍或接種針注射接種有pWRG/SEO-S或pWRG7077的小鼠未發(fā)展中和抗體(圖4)。
實施例3對倉鼠進行接種和攻擊。為了研究裸露的DNA漢坦病毒屬病毒疫苗的保護性作用，用基因槍將pWRG/SEO-M，pWRG/SEO-S或陰性對照質(zhì)粒pWRG7077接種到倉鼠中，每組5只倉鼠(對小鼠進行初次接種，接著在4周的間隔中加強2次)，然后在最后一次加強后6周用SEOV攻擊。對接種前，攻擊當天以及攻擊后4周收集的血清樣品進行IFAT，ELISA和PRNT。由于在成年嚙齒類動物中沒有漢坦病毒屬病毒的疾病模型，我們評估了本發(fā)明的DNA疫苗是否能保護免受感染，而不是預防疾病。
IFAT和ELISA結果表明，接種前，沒有倉鼠對SEOV G1-G2或N蛋白是陽性的(數(shù)據(jù)沒有表示)。接種后(在攻擊當天收集的攻擊前血清)，根據(jù)IFAT結果(表2)，接種了pWRG/SEO-M的5只倉鼠都產(chǎn)生了抗G1-G2抗體，而5只接種了pWRG/SEO-S的倉鼠中有4只產(chǎn)生了抗N的抗體。除了5只接種了pWRG/SEO-M的倉鼠中僅有4只是抗SEOV ELISA的陽性之外，攻擊前ELISA結果檢測到了相似的抗體反應。根據(jù)IFAT和ELISA結果，攻擊前，pWRG7077接種的倉鼠不能產(chǎn)生G1-G2和N蛋白特異抗體。
根據(jù)IFAT結果，攻擊后，以前接種了pWRG/SEO-M的倉鼠血清樣品對抗核殼抗體仍是陰性的，表明動物沒被SEOV感染。相反，接種了pWRG/SEO-S和pWRG7077的倉鼠在攻擊后，血清樣品對G1-G2和N抗體都是陽性的，表明動物用SEOV攻擊時受到了感染。攻擊后的ELISA結果和IFAT結果相似，然而，5只接種了pWRG/SEO-M的倉鼠中有3只攻擊后表示出弱的抗N反應，表明盡管IFAT結果是陰性的，倉鼠還是產(chǎn)生了針對攻擊病毒的抗體。
接種前，沒有倉鼠有SEOV中和抗體效價(數(shù)據(jù)沒有表示)。接種后，所有接種了pWRG/SEO-M的倉鼠產(chǎn)生了中和抗體，PRNT80％效價范圍是160-640(表2)。中和抗體在接種了pWRG/SEO-S和pWRG7077的倉鼠的攻擊前血清中沒有檢測到。SEOV攻擊后，pWRG/SEO-M免疫動物的中和抗體效價仍然基本上和攻擊前一樣(+/-2倍)。相反，pWRG7077和pWRG/SEO-S免疫動物的攻擊后中和抗體效價顯著上升，從小于20到介于1280和大于81920之間。
表2.接種了裸露的DNA疫苗的倉鼠的血清學反應和保護
a三次接種，每次接種都是在4周的間隔中施加4個基因槍彈夾(大約1.5μg/彈夾)。
b在IFAT中，利用轉(zhuǎn)染了pWRG/SEO-S或pWRG/SEO-M的細胞作為靶抗原，按1∶200分別篩選血清中的抗N和抗G1-G2。-表示沒有反應性，+表示有反應性。
cPRNT值是能降低噬菌斑數(shù)50％時血清稀釋度的倒數(shù)。在5％豚鼠補體存在的情況下進行試驗。括弧中的數(shù)字表示在補體缺乏的情況下，加熱血清中的PRNT值。前攻擊前血清樣品，是在攻擊當天收集的；后攻擊后血清樣品，是在攻擊后血清樣品，是在攻擊后4周收集的。
在本研究過程中，我們觀察到如果血清被加熱滅活(56℃，30分鐘)，PRNT效價就會顯著下降。為了測試中和活性是補體增強的可能性，我們在5％豚鼠補體存在下做了PRNT試驗，并且發(fā)現(xiàn)添加補體能使加熱血清的PRNT效價上升4-32倍(表2)。單獨補體對SEOV噬菌斑數(shù)沒有影響(數(shù)據(jù)沒有表示)。
實施例4用pWRG/SEO-M接種能交叉保護防止?jié)h坦病毒感染接種了pWRG/SEO-M的倉鼠在攻擊前檢測不到抗N抗體，而攻擊后的抗N反應也檢測不到或水平非常低(＜＝1∶200)(圖6)。相反，接種了陰性對照質(zhì)粒的倉鼠的抗N抗體顯著增長(相對于背景有約2的指數(shù)倍增長)。PRNT結果表明，在4只接種了pWRG/SEO-M的倉鼠中有3只能檢測到交叉中和抗體。這些倉鼠的PRNT效價攻擊后不會上升。在一只檢測不到(＜1∶20)漢坦病毒中和抗體的倉鼠中，PRNT效價確實上升了，然而，這種增長至少比接種了陰性對照質(zhì)粒的倉鼠中觀察到的至少低32倍。
用漢坦病毒攻擊后，針對漢坦病毒結構蛋白的抗體效價增長較低或不增長(用ELISA和PRNT檢測)，表明用漢城病毒M基因(pWRG/SEO-M)接種能防止?jié)h坦病毒感染。
實施例5用pWRG/SEO-M接種能交叉保護防止多布拉伐病毒感染。
接種了pWRG/SEO-M的倉鼠在攻擊前檢測不到抗N抗體，而攻擊后的抗N反應也檢測不到。相反，除了一只，所有接種了陰性對照質(zhì)粒的倉鼠的抗N抗體顯著增長(攻擊后抗N效價在1∶200-1∶204800之間)。PRNT結果表明，在5只接種了pWRG/SEO-M的倉鼠中全部能誘發(fā)低水平的交叉中和抗體。這些倉鼠的PRNT效價攻擊后不會上升超過1∶80。相反，所有接種了陰性對照質(zhì)粒的倉鼠，除了一只外都表示出高的攻擊后PRNT(1∶5120)，表明倉鼠被多布拉伐病毒所感染?，F(xiàn)在還不清楚為什么#182號動物沒被感染。
用多布拉伐病毒攻擊后，多布拉伐病毒結構蛋白的抗體效價增長小或不增長(根據(jù)ELISA和PRNT檢測結果)，表明用漢城病毒M基因(pWRG/SEO-M)接種具有保護作用，能防止多布拉伐病毒感染。
實施例6用pWRG/SEO-M接種不能交叉保護防止普馬拉病毒感染用pWRG/SEO-M接種的倉鼠在攻擊前檢測不到抗N抗體。攻擊后，除了一只外，所有倉鼠攻擊后的抗N反應都要大于或等于1∶200，表明倉鼠被普馬拉病毒感染。陰性對照質(zhì)粒接種的倉鼠具有相似的攻擊前和攻擊后抗N效價。PRNT結果表明，盡管用pWRG/SEO-M接種能誘導抗?jié)h城病毒的中和抗體(空的環(huán))，但這些抗體并不能交叉中和普馬拉病毒，并且不能防止感染。除了一只接種了陰性對照質(zhì)粒的倉鼠沒被感染外，pWRG/SEO-M接種和陰性對照質(zhì)粒接種的倉鼠的攻擊后普馬拉病毒PRNT效價都是相似的(大于或等于1∶160)?，F(xiàn)在還不清楚為什么#220號動物沒被感染。
用普馬拉病毒攻擊后，多布拉伐病毒結構蛋白的抗體效價增長(根據(jù)ELISA和PRN檢測結果)，表明用漢城病毒M基因(pWRG/SEO-M)接種沒有保護作用，不能防止普馬拉病毒感染。應該注意到倉鼠的最高攻擊前抗?jié)h城病毒PRNT效價是1∶640(#209動物)。動物攻擊前中和抗體效價越高，它就越有可能起交叉保護作用，防止普馬拉病毒感染。
討論我們報道了作為一種防止?jié)h坦病毒屬病毒的接種手段，裸露DNA具有美好的前景。本發(fā)明結果證明了用SEOV M或S基因組區(qū)段的cDNA接種能在BALB/c小鼠和敘利亞倉鼠中誘導抗體反應。用M區(qū)段，而不是S區(qū)段的DNA接種倉鼠，產(chǎn)生中和抗體，能防止SEOV感染。
在我們最初的免疫原性試驗中，在BALB/c小鼠中，無論是pWRG/SEO-M還是pWRG/SEO-S，基因槍接種都會比接種針肌內(nèi)接種導致更高的血清轉(zhuǎn)化率，正如ELISA和PRNT所檢測。這些預備試驗數(shù)據(jù)促使我們將注意力集中到基因槍上，而不是通過肌內(nèi)轉(zhuǎn)移DNA。然而，因為只測試了一次肌內(nèi)注射DNA劑量(每只動物25μg)，通過調(diào)整參數(shù)如注射DNA的量，注射位點，或疫苗接種規(guī)程是有可能增加血清轉(zhuǎn)變率和/或效價的。也有可能針注射接種主要誘導的是針對DNA疫苗的細胞介導的，而不是體液介導的反應，這和通過別的方式所看到的一樣(Feltquate等人，1997，J.Immunol.158，2278-2284，Robinson和Torres，1997，Semin.Immunol，9，271-283；Gregoriadis，1998，Pharm.Res.15，661-670)。
用pWRG/SEO-M通過基因槍接種能保護所有倉鼠免受SEOV感染，正如根據(jù)1)檢測不到，或很少檢測到攻擊后抗N抗體反應和2)在SEOV攻擊后基本不變的PRNT效價所測量的。盡管IFAT結果表明沒有pWRG/SEO-M接種的倉鼠在攻擊后產(chǎn)生了抗N抗體，但更靈敏的抗N ELISA結果表示3只倉鼠有弱的抗N抗體反應。因為這些倉鼠的攻擊后抗N ELISA GMT(GMT＝50)比陰性對照pWRG7077接種的倉鼠(GMT＞3195)要低50多倍，因此可能抗N抗體的反應表示的是針對輸入型SEOV抗原(沒有復制)，或針對有限的感染(例如一輪復制)。PRNT數(shù)據(jù)提供了額外的證據(jù)，即用pWRG/SEO-M，而不是pWRG/SEO-S接種保護倉鼠免受SEOV感染。然而陰性對照pWRG7077接種的倉鼠PRNT效價在攻擊后從＜20增加到10280和81920之間，pWRG/SEO-M接種的倉鼠PRNT效價保持在攻擊前水平的2倍上。此外，pWRG/SEO-M接種的倉鼠的攻擊后PRNT效價(GMT＝368)仍遠低于接種了pWRG7077的倉鼠的攻擊后PRNT效價(GMT＞27024)。接種了pWRG/SEO-S的倉鼠攻擊后感染有SEOV。pWRG/SEO-S接種的倉鼠攻擊后PRNT效價從＜20增加到2560和20480之間。盡管接種了pWRG/SEO-S的倉鼠攻擊后PRNT效價高(GMT＝5885)，但值得注意的是這些效價要比接種陰性對照(pWRG7077)倉鼠攻擊后效價(GMT＞27024)低約5倍。
不管有沒有補體存在，接種了pWRG/SEO-S的小鼠和倉鼠中都不存在中和抗體反應，這和已經(jīng)發(fā)表的數(shù)據(jù)即G1和G2蛋白，但不是N蛋白的單克隆抗體具有中和活性(Dantas等人，1986，Virology 151，379-384；Arikawa等人，1989，J.Gen.Virol.70，615-624；Schmaljohn等人，1990，J.Virol.64，3162-3170；Arikawa等人，1992，Arch.Virol.70，615-624)相一致，而且用表達G1和/或G2蛋白，而不是N蛋白的重組痘苗接種誘導中和反應(Pensiero等人，1988，J.Virol.62，696-702；Schmaljohn等人，1992，Vaccine 10，10-13；Xu等人，1992，Am.J.Trop.Med.Hyg.47，397-404，Chu等人，1995，同上)。
抗N免疫反應不能防止感染出乎意料，因為別人發(fā)現(xiàn)用在昆蟲細胞，細菌細胞中表達的重組N蛋白或以嵌合的HBV核心粒子形式接種能防止感染(Schmaljohn等人，1990，同上；Yoshimatsu等人，1993，Arch.Virol.130，365-376；Lundkvist等人，1996，Virology 216，397-406；Ulrich等人，1998，Vaccine 16，272-280)。此外，用表達SEOV S區(qū)段的重組痘苗病毒接種能部分保護沙鼠免受SEOV感染(Xu等人，1992，同上)。在我們實驗中用S區(qū)段的裸露的DNA接種不能保護倉鼠，這可能和定量，而不是定性缺陷有關。盡管5只接種了pWRG/SEO-S的倉鼠中有4只能產(chǎn)生可用IFAT和ELISA檢測到的抗體反應，但效價相對較低(ELISA效價小于或等于1∶1600)。倉鼠，而不是小鼠中抗N抗體效價低的原因還不明了。這種過錯不能歸結于基因槍彈夾，因為在同一天用同一批樣品接種了倉鼠和小鼠，而小鼠的血清轉(zhuǎn)化率是90％，ELISA GMT超過7000?？贵w效價低反映了用pWRG/SEO-S接種的倉鼠中并不全面的免疫反應，或者，有可能是用基因槍表皮施用S DNA，導致主要是細胞介導的，而不是體液介導的針對N的反應。不過，我們的發(fā)現(xiàn)證明了5只用基因槍接種了裸露的pWRG/SEO-S的倉鼠中有4只能檢測到抗N的免疫反應，而這種反應，不管是體液介導的，還是細胞介導的都不足以防止SEOV感染。pWRG/SEO-S和pWRG7077接種的倉鼠攻擊后PRNT效價有約5倍差異表明pWRG/SEO-S接種可限制SEOV感染。
我們發(fā)現(xiàn)如果血清被加熱滅活(56℃，30分鐘)，小鼠和倉鼠中誘導的SEOV中和活性降低4-32倍。如果豚鼠補體包括在PRNT，那么中和活性中的這種損失可以完全逆轉(zhuǎn)。這些數(shù)據(jù)和下列別人報道的數(shù)據(jù)一致人，小鼠尤其是大鼠血清中的漢坦病毒屬病毒中和活性可以被補體增強(Takenaka等人，1985，Arch.Virol.84，197-206；Asada等人，1989，J.Gen.Virol.70，819-825)。補體在漢坦病毒屬病毒中和中發(fā)揮了重要的作用，這種發(fā)現(xiàn)的意義重大，因為PRNT效價通常被用來評估免疫原性和預測漢坦病毒屬病毒疫苗的效力。去掉或添加補體的條件，如加熱滅活，或添加外源補體(例如作為純化蛋白的級分或新鮮的動物血清)能改變PRNT效價，并且能改變候選疫苗的評估。
實施例7HTNV M DNA疫苗G1和G2的表達將表示HTNV M基因組區(qū)段的cDNA克隆到含巨細胞病毒(CMV)啟動子的表達質(zhì)粒pWRG7077中，獲得pWRG/HTN-M。利用多克隆和單克隆抗體(MAbs)的放射性免疫沉淀實驗(RIPA)表明無論G1還是G2都能在轉(zhuǎn)染了pWRG/HTN-M的細胞中瞬時表達G1和G2蛋白(圖8)。
早期開發(fā)功能性HTNV M DNA疫苗的努力沒有成功(即表達G2，而不是G1)(數(shù)據(jù)沒有發(fā)表)。我們解決了這個問題，我們發(fā)現(xiàn)如果位于載體NotI克隆位點和SEOV M非編碼區(qū)的24bp大小的外源DNA序列(圖9A)被去掉，我們的SEOV M質(zhì)粒(pWRG/SEO-M)就不能有效地表達G1(圖9A)。這段外源DNA是在更早對SEOVM基因進行克隆與亞克隆過程中產(chǎn)生的。去掉了24bp序列的SEOV M構建體不能表達G1，但能表達G2(圖9B)。如果將24bp的序列以正向，而不是反向改造回構建體中，那G1的表達就會恢復(圖9B)。這個結果表明核苷酸序列，而不是核苷酸數(shù)目，能影響G1表達。為了繪制能有效表達G1的序列圖譜，我們構建了不同的載體，包括外源序列的1-12或13-24。當核苷酸1-12，而不是13-24出現(xiàn)在質(zhì)粒中時，G1能被表達(圖9B)。我們注意到4-10位核苷酸的DNA(TCTGCAG)和內(nèi)含子A(即剪切受體位點)(Stenberg等人，1984，同上)的最后7個核苷酸完全一樣。把推導的剪切受體二核苷酸AG突變成CC，并不影響G1的表達，表明如果該區(qū)域參與了剪切，則并不需要保持內(nèi)含子A剪切位點序列的確切性(圖9B)。我們構建了含有外源DNA 1-8位核苷酸的載體，并且發(fā)現(xiàn)這足以恢復G1的表達(圖9C)。因此，我們確定位于介于載體NotI位點和SEOV M基因非編碼區(qū)之間的序列GGATCTGC對基于pWRG7077的DNA疫苗有效表達G1是必需的。
根據(jù)SEOV M中的發(fā)現(xiàn)，我們推導DNA疫苗質(zhì)粒中包括HTNV M基因上游外源序列使得我們能解決DNA疫苗質(zhì)粒不能同時表達HTNVG1和G2的問題。我們構建了一種質(zhì)粒，它包括HTNV M基因上游外源序列，而且如果這樣做的話，就獲得了能表達G1和G2的克隆，pWRG/HTN-M(圖9D)。當去掉外源序列，不能表達G1，而當恢復這段序列時，G1又能有效地表達(圖9D)。這些數(shù)據(jù)證實了外源序列不僅對成功表達SEOV G1也是必需的，而且對成功表達HTNV G1是必需的。這個序列并不影響來自SEOV或HTNV的G2的表達(圖9)。外源序列影響G1表達，但不能影響G2表達的機制現(xiàn)在尚不明了。
實施例8用pWRG/HTN-M接種能誘導中和抗體，并能保護倉鼠免受HTNV感染為了確定HTNV M DNA疫苗質(zhì)粒是否是免疫原性的，我們使用基因槍用pWRG/HTN-M(pWRG/HTN-M或pWRG/HTN-M(x)，參看方法)或陰性對照接種倉鼠。最后一次接種后3周，對倉鼠進行放血，通過溶菌斑減少中和試驗(PRNT)檢測中和抗體。在兩個單獨實驗中，所有接種了pWRG/SEO-M疫苗的倉鼠產(chǎn)生了HTNV中和抗體反應(圖11)。第一次實驗中效價(PRNT80％)范圍是20-1280，幾何平均效價(GMT)＝104，而第二次試驗分別是20-10240，GMT＝493。陰性對照組是血清反應陰性。因此，基因槍接種pWRG/SEO-M在倉鼠中是免疫原性的。
為了確定pWRG/HTN-M的保護性效力，我們使用了以前介紹的感染模型(Hooper等人，1999，同上)。該模型涉及用病毒攻擊接種的倉鼠，而且4周后，利用血清學實驗來檢測感染。具體而言，如果一個攻擊的倉鼠產(chǎn)生了針對漢坦病毒屬病毒N蛋白(它不是疫苗的成分)的抗體，那這種倉鼠就被認為感染了病毒。另一方面，如果受到攻擊的倉鼠不能產(chǎn)生N蛋白特異的抗體反應，那么這種倉鼠就沒感染病毒(即防止了感染)。攻擊后中和抗體反應增長超過4倍也用作感染的標記。
用2000噬菌斑形成單位(ID50大約是2個噬菌斑形成單位[PFU]，數(shù)據(jù)沒有發(fā)表)的HTNV對接種倉鼠進行肌內(nèi)(i.m)攻擊。攻擊后4周，收集血清樣品，通過ELISA檢測N蛋白特異抗體，而通過PRNT檢測中和抗體。攻擊前和攻擊后抗N蛋白效價和PRNT效價表示在(圖11)。所有接種了pWRG/HTN-M的倉鼠能防止感染，這是根據(jù)攻擊后沒有N蛋白特異的抗體反應所定義的。此外，攻擊前和攻擊后PRNT效價差異≤4倍。相反，所有接種了陰性對照質(zhì)粒的倉鼠，無論它們是接種了陰性對照質(zhì)粒pWRG7077，還是沒有接種，都被感染，這是因為它們攻擊后產(chǎn)生了N蛋白特異抗體和中和抗體。因此，基因槍接種pWRG/HTN-M(或pWRG/HTN-M(x))能防止HTNV的生產(chǎn)感染，甚至當攻擊前效價PRNT80％低于20。
實施例9接種了pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M能交叉保護，防止異型漢坦病毒屬病毒的攻擊因為已確定了含有SEOV M和HTNV M基因的DNA疫苗能保護倉鼠免受同型病毒的感染，我們想確定這兩種疫苗中的每一種是否能交叉保護防止HFRS-相關漢坦病毒屬病毒的感染。我們首先測量了HFRS漢坦病毒屬病毒感染倉鼠以及接種了SEOV M或HTNV M疫苗倉鼠血清的交叉中和活性(表3)。我們發(fā)現(xiàn)SEOV感染的倉鼠血清HTNV中和活性水平低，沒有檢測到DOBV或PUUV中和活性。HTNV或DOBV感染倉鼠血清表示了低水平的抗SEOV，DOBV和PUUV的中和抗體。PUUV感染的倉鼠不能中和HTNV或SEOV，而且很少能檢測到DOBV中和活性。接種倉鼠血清比感染倉鼠血清的交叉中和活性要高。用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M接種能誘導抗體反應，這種反應能中和SEOV，HTNV和DOBV，但不是PUUV。
表10
減少％ 38.05減少％67.73 減少％ 63.95起始重量82.02起始重量 79.91 起始重量77.66最終重量79.91最終重量 77.96 最終重量76.90差 2.11g差1.95g 差 0.76g
我們以前證明SEOV M DNA疫苗不僅能保護大多數(shù)倉鼠免受SEOV攻擊，還能受HTNV攻擊(Kamrud等人，1999，Virology 263，209-219)。為了證實這些發(fā)現(xiàn)，而且進一步評價SEOV M疫苗交叉保護防止別的漢坦病毒屬病毒的能力，我們測試了pWRG/SEO-M對HTNV，DOBV，和PUUV的保護性效力。本研究的結果表明接種了pWRG/SEO-M的倉鼠能防止HTNV和DOBV，但不能防止PUUV，這是根據(jù)攻擊后沒有抗N蛋白抗體反應來確定的(圖12)。大于160的同型PRNT80％效價能防止DOBV，小于80的效價能防止DOBV，但高達1280的效價不能防止PUUV(圖12A，12B，12C)。一只接種了疫苗和一只對照倉鼠不能對PUUV攻擊產(chǎn)生反應，可能是因為PUUV攻擊劑量是10ID50，而其他病毒的攻擊劑量是1000ID50(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。
我們測試了pWRG/HTN-M交叉保護防止SEOV或DOBV的能力。結果表明用pWRG/HTN-M接種能誘導抗SEOV和DOBV的交叉保護免疫(圖12D和12E)。小于640的同型PRNT80％效價和倉鼠防止SEOV感染相關，而小于320的效價能防止DOBV。我們沒有測量接種pWRG/HTN-M防止PUUV感染的能力，因為我們發(fā)現(xiàn)SEOV基因疫苗并不能保護(圖12C)，而且因為痘苗載體化的HTNV疫苗不能保護倉鼠免受PUUV感染(Schmaljohn等人，1995，Virology 206，963-972)。總之，這些數(shù)據(jù)表明用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M接種能交叉保護防止四種HFRS相關漢坦病毒屬病毒中的三種SEOV，HTNV和DOBV。
實施例10用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M接種能誘導非人靈長類動物中高效價的中和抗體反應用能表達SEOV M基因(Hooper等人，1999，同上)或HTNV M基因的質(zhì)粒接種的數(shù)據(jù)表明這些疫苗可能在人中有效。作為臨床開發(fā)這些疫苗的進一步，我們測試了它們在非人靈長類動物中誘導抗體反應的能力。用SEOV M基因疫苗接種兩只獼猴，而用HTNV M基因疫苗接種三只獼猴。三只接種了表達不相關基因的pWRG7077的獼猴作為陰性對照，而三只接種了表達HTNV M和S基因的重組痘苗病毒rVV/HTN-M+S的猴子作為陽性對照(Schmaljohn等人，1992，Vaccine 10，10-13)。rVV/HTN-M+S以前表示能誘導HTNV特異的免疫性，包括倉鼠中的中和抗體(Chu等人，1995，J.Virol.69，6417-6423)以及誘導人中的中和抗體(Mcclain等人，2000，J.Med.Virol.60，77-85)?；蛞呙缭?周間隔中給藥3次。rVV/HTN-M+S給藥的劑量和規(guī)程與人II期實驗中使用的一樣(即初次皮下接種，接著在第42天加強)。
第一次接種后3周，3只接種了pWRG/HTN-M(x)中的2只表現(xiàn)出了中和抗體(圖13)。第二次基因槍接種后3周，所有接種了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的猴子都能檢測到中和抗體。第三次接種后3周，所有接種了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的猴子的中和抗體效價驚人地高。陰性對照接種的猴子從不產(chǎn)生中和抗體(數(shù)據(jù)未示出)。接種rVV/HTN-M+S的猴子在一次接種后，不能產(chǎn)生中和抗體反應，但在第42天加強后都產(chǎn)生中和抗體。最后一次接種后3周，接種了pWRG/SEO-M(x)，pWRG/HTN-M(x)或rVV/HTN-M+S的猴子的PRNT80％GMT分別是905，2032和160。這些數(shù)據(jù)第一次表明了表達漢坦病毒屬病毒M基因產(chǎn)物的疫苗在非人靈長類動物中是免疫原性的，并且能誘導相對高水平的中和抗體。
為了評估由基因疫苗和重組痘苗病毒疫苗誘導的免疫性的持續(xù)時間，分別在最后一次接種后2，4和6個月收集接種猴子血清，并且測試它的中和活性。最后一次接種后2個月，接種了基因疫苗的倉鼠血清的中和抗體效價下降了2-4倍(圖14，表9和10)。在接種后4個月，接種了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的猴子的PRNT80％GMT分別等于160和80。接種后6個月，所有接種了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的猴子仍然可檢測到中和抗體，PRNT80％GMT分別等于113和63。接種后8個月，接種了HTNV M基因疫苗的猴子(CH27)之一的PRNT80％效價小于20，然而，仍然可以檢測到中和抗體反應，PRNT50％＝20。相反，接種了陽性對照疫苗rVV/HTN-M+S的猴子在最后一次接種后4個月，中和抗體水平很低或檢測不到。
實施例11用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M疫苗接種非人靈長類動物能誘導交叉中和DOBV的抗體。
我們用PRNT測試了接種猴子血清的交叉中和活性(表4)。所有接種了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的猴子都具有交叉中和DOBV的抗體。接種了rVV/HTN-M+S的猴子也有DOBV交叉中和抗體，雖然效價更低。令人驚奇的是，接種了pWRG/SEO-M(x)的猴子HTNV中和抗體水平很低或檢測不到，而接種了pWRG/HTN-M(x)的猴子SEOV中和抗體水平很低或檢測不到。只有一只猴子(CH32號猴子)，它是用pWRG/SEO-M(x)接種，能檢測到PUUV中和抗體。
表4.接種猴子血清的交叉中和活性
a最后一次接種后3周收集的猴血清。
b用基因槍在3周間隔中給猴子接種所示基因疫苗質(zhì)粒3次。
c用重組痘苗病毒疫苗在42天間隔中2次皮下注射猴子。
d PRNT值是能將所示病毒噬菌斑數(shù)中和80％或50％時血清稀釋度的倒數(shù)。
同型效價用黑體表示。
*，少于20的效價。
討論利用重組痘苗病毒和桿狀病毒系統(tǒng)第一次完成了克隆HTNV V基因的瞬時表達(Pensiero等人，1988，J.Virol.62，696-702；Schmaljohn等人，1989，同上)。G1和G2蛋白都能表達，而且看起來和真的病毒蛋白具有完全相同的生化和抗原活性。利用痘苗病毒/T7RNA聚合酶表達系統(tǒng)，HTNVG1和G2也能在含有HTNV基因的質(zhì)粒中表達，HTNV基因受T7啟動子控制(Kamrud和Schmaljohn，1994，Virus Res.31，109-121)。然而當HTNV M基因被克隆到利用CMV啟動子的質(zhì)粒時，糖蛋白表達中出現(xiàn)了一些問題。在絕大部分情況下，用RIPA檢測發(fā)現(xiàn)G2表達，G1不表達(數(shù)據(jù)沒有表示)。例如，最近用在假病毒研究中的質(zhì)粒pcHTN-M(Ma等人，1999，Virus Res.64，23-34)被認為能表達G1和G2，然而，我們實驗室隨后做的RIPA實驗結果表明，只有G2被正確表達了(數(shù)據(jù)未發(fā)表)?？赡苁荊1被表達了，但加工不正確(例如不正確折疊，從細胞分泌，靶向到細胞核，或?qū)蚪到?，或部分表達(例如被截短)。
我們發(fā)現(xiàn)在SEOV或HTNV M基因上游包括一段短的外源DNA序列，能使DNA疫苗載體pWRG7077表達G1。在pWRG7077中，CMV啟動子后接的是內(nèi)含子A。內(nèi)含子A包括能增加克隆基因表達水平的元件(chapman等人，1991，Nucl.Acids.Res.19，3979-3986)。轉(zhuǎn)錄后，內(nèi)含子A序列從RNA中被剪切掉，而剪切的轉(zhuǎn)錄本從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，在細胞質(zhì)中，它被表達。我們假設，如果內(nèi)含子A剪切異常，那么不知什么原因就會導致G1序列的破壞，于是在G1表達中就會觀察到缺失，而G2表達正常。我們推測，位于內(nèi)含子A和漢坦病毒屬病毒M基因之間的異源序列，可能會抑制這種假設的異常剪切，使G1和G2表達正常。我們注意到外源序列中的7個核苷酸序列和內(nèi)含子A剪切受體位點TCTGCAG完全一樣，這種發(fā)現(xiàn)支持了這個假設(Stenberg等人，1984，同上)。然而，外源序列中推導的拼接受主的突變對G1表達沒有影響(圖9B)。這不能排除這種可能性，即別的剪切事件影響了質(zhì)粒pWRG7077中G1的表達。闡明位于克隆的SEOV和HTNV M基因上游的一段短核苷酸序列，GGATCTG如何能夠影響G1，但不是G2的表達，還有必要進一步的實驗。不管機制如何，這種發(fā)現(xiàn)使得我們能開發(fā)一種抗HTNV的候選DNA疫苗。
以前對SEOV M基因疫苗研究的結果以及本發(fā)明報道的結果證明了HTNV M基因疫苗的免疫原性和保護性效力，強有力的情形是全長M基因可以用在抗別的漢坦病毒屬病毒DNA疫苗中?，F(xiàn)在還不清楚單獨G1，單獨G2，或糖蛋白的片段是否能誘導中和抗體以及防止感染。用只含G1或G2的重組桿狀病毒感染細胞裂解物以及只表達G1或G2的重組痘苗病毒接種不能誘導中和抗體，并且在倉鼠感染模型中，表現(xiàn)出不完全的保護作用(Schmaljohn等人，1990，J.Virol.64，3162-3170)。這些數(shù)據(jù)表明能表達G1和G2的全長M基因?qū)ΡＷo性免疫是必需的。相反，Bharadwai等人報道用含HPS相關漢坦病毒屬病毒，辛諾柏病毒(SNV)M基因短區(qū)段(～166個氨基酸)的基因疫苗質(zhì)粒通過針肌內(nèi)注射小鼠，產(chǎn)生低水平的中和抗體(Bharadwai等人，1999，Vaccine 17，2836-2843)。這個發(fā)現(xiàn)表明，為了誘導中和抗體反應，不必全長的M基因，只要G1或G2的亞基被表達就可以誘導中和抗體。目前，我們正在做一些實驗，設計來測試DNA疫苗誘導中和抗體以及保護倉鼠免受感染的能力，所述DNA疫苗只能表達HTNV G1，或G2或G1和G2的組合(在不同質(zhì)粒中表達)。
現(xiàn)在已知至少有10種漢坦病毒屬病毒能引起HFRS或HPS，因此關于漢坦病毒屬病毒之間的交叉中和與交叉保護的信息對交叉保護疫苗的合理設計是重要的。調(diào)查者評估了用漢坦病毒屬病毒感染的不同物種(包括人)血清交叉中和別的漢坦病毒屬病毒的能力(Chu等人，1995，同上，Niklasson等人，1991，Am.J.Trop.Med.Hyg.45，660-665；Lee等人，1985，J.Clin.Microbiol.22，940-944；Lundkvist等人，1997，J.Med.Virol.53，51-59)。不同的物種，以及一個物種中的不同個體顯示出不同水平的交叉中和抗體。總之，這些試驗的數(shù)據(jù)表明HTNV，SEOV或DOBV感染的個體血清具有共同的交叉中和抗體，雖然血清型中效價有4倍的差異。然而，PUUV感染的個體血清表示出很低水平的SEOV，HTNV或DOBV交叉中和抗體，或沒有抗體。我們從感染病毒或接種了DNA疫苗的倉鼠血清中獲得的數(shù)據(jù)和更早的發(fā)現(xiàn)一致。我們觀察到接種了DNA疫苗的倉鼠中收集的血清的交叉中和抗體比感染的倉鼠要高。這可能反映了接種DNA疫苗后誘發(fā)的抗體和感染誘導的抗體之間性質(zhì)的差異，或者它只是簡單地反映了抗體水平的數(shù)量差異。值得注意的是接種倉鼠中高水平的同型中和抗體并沒必要和交叉中和活性相關(圖12)。
對倉鼠血清池的交叉中和測試表明，如果中和抗體能預知保護性免疫反應的話，那用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M接種可以防止SEOV，HTNV，但不會防止PUUV，并且我們發(fā)現(xiàn)這基本上都是真的。圖12的數(shù)據(jù)表明交叉中和抗體的存在和保護性效果相關聯(lián)，除了一個例外。倉鼠2119表示了交叉中和抗體，但并不受到保護，因為能檢測到抗N蛋白的反應。然而，檢測不到交叉中和抗體沒必要預測缺乏保護。后一種情況的實施例可以在圖12的倉鼠1437，1434，2122和2133中發(fā)現(xiàn)。有可能存在交叉中和抗體，但由于試驗限制檢測不到，或者非中和反應也是保護性的。
在本研究中，我們證明了用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M接種能交叉防止SEOV，HTNV和DOBV。在別的試驗中，漢坦病毒屬病毒疫苗有交叉保護的能力。例如，表達HTNV G1，G2和N(rVV/HTN-M+S)的重組痘苗能交叉防止SEOV感染，但不能防止PUUV感染(Chu等人，1995，J.Virol.69，6417-6423)，而且表達SEOVG1和G2或N的重組痘苗能交叉防止HTNV(Xu等人，1992，Am.J.Trop.Med.Hyg.47，397-404)。本發(fā)明是第一次證明能防止DOBV的報道。
含有漢坦病毒屬病毒M基因的DNA疫苗在獼猴中不僅能誘導陽性反應，而且能誘導相對高水平的中和抗體。當我們將三次接種SEOV和HTNV M基因疫苗的獼猴的血清學數(shù)據(jù)結合時，PRNT80％GMT是1470。這種中和抗體反應幾乎比重組痘苗病毒疫苗誘導的大10倍，重組痘苗病毒疫苗誘導的中和抗體反應PRNT80％GMT＝160，PRNT50％GMT＝320。rVV/HTN-M+S中和抗體反應和以前報道的人的中和抗體反應PRNT80％＝160相似(McClain等人，2000，同上)。施用給人的滅活的漢坦病毒屬病毒疫苗也能按常規(guī)方式誘導效價為～100的中和抗體(Yu等人，1999，在Factors in the Emergence and Control ofRodent-borne Viral Diseases(Hantavirus and Arenal Diseases)(嚙齒類病毒疾病(漢坦病毒屬病毒和腎上腺疾病)出現(xiàn)和控制因子)，J.F.Saluzzo和B.Dodet編輯，157-161頁。Elsevier出版社，巴黎；Zhu等人，1994，Chinese Med.J.107，167-170)。
我們發(fā)現(xiàn)接種猴子的中和抗體水平在最后一次基因槍接種后的數(shù)月中下降。然而，即便是在6個月后，中和抗體仍然可以在接種了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的所有猴子中檢測到。比較而言，接種了rVV/HTN-M+S的猴子在4個月后檢測不到中和抗體(圖14)。
在中國，已開發(fā)了若干抗?jié)h坦病毒屬病毒的滅活病毒疫苗，并已在人體中進行了測試，PRNT實驗被用來評估疫苗的潛能(Zhu等人，1994，同上，Yu等人綜述，1999，同上)。絕大部分從細胞培養(yǎng)物中制備的滅活病毒疫苗在三次劑量后，在90-100％的受接種者中能誘導中和抗體，GMT≤100。血清反應陽性的速率在最后一次加強后6個月降低到～50％，但通過施用加強接種可以得到恢復。盡管在亞洲開發(fā)的漢坦病毒屬病毒疫苗根據(jù)效力而言表示出了很好的前景，但我們還要努力開發(fā)重組的漢坦病毒屬病毒疫苗，這種疫苗要避免已根植于滅活病毒疫苗中的安全擔憂。此外，我們相信利用受接種者細胞內(nèi)必須表達G1和G2(例如DNA疫苗)，而不是外源蛋白(如和佐劑結合的β-丙內(nèi)酯處理的病毒粒子)這樣一個疫苗平臺，可能誘導更猛烈的中和抗體反應。在接種了DNA疫苗的猴子中誘導高水平的中和抗體反應表明高水平的中和抗體可以通過疫苗方法達到。
實施例12pWRG/HTN-M(x)能部分防止致命的ANDV攻擊。我們以前證明了本發(fā)明的基于HTNV M基因的DNA疫苗，pWRG/HTN-M(x)能交叉防止四種導致HFRS的漢坦病毒屬病毒中的三種。為了確定這種疫苗能否防止引起HPS的漢坦病毒屬病毒，我們用pWRG/HTN-M(x)或陰性對照質(zhì)粒在3周的間隔中接種了倉鼠3次，然后在最后一次接種后3周用ANDV攻擊(250LD50，肌內(nèi)注射)。做了兩個獨立的試驗，組合的結果如圖15所示。除了一只倉鼠外，該疫苗能在其余所有倉鼠中誘導HTNV NAb(50％中和幾何平均效價[GMT]＝226；范圍＜20-5120)。除了一個例外(#514，效價＝20)，檢測不到ANDV交叉NAb。攻擊后，24只接種了pWRG/HTN-M(x)的倉鼠中死了15只，而15只接種了陰性對照質(zhì)粒的倉鼠中死了14只。兩組的平均死亡天數(shù)都是13。因此，由pWRG/HTN-M(x)接種對致命ANDV攻擊的防止沒有統(tǒng)計學意義，但有啟發(fā)性(P＝0.0569)。從攻擊中幸存下來的倉鼠用ANDV重新攻擊，保證它們暴露在病毒中。至少一只動物(ID#504)在兩次連續(xù)的攻擊后沒有抗體反應，但明顯能防止致命疾病。
實施例13表達G1和G2的基于ANDV M基因的DNA疫苗。因為我們實驗中pWRG/HTN-M(x)提供的保護水平僅有38％，我們努力構建一種含ANDV M基因的DNA疫苗。ANDV病毒株Chile-9717869的全長M基因通過RT-PCR克隆進pWRG7077中，得到pWRG/AND-M(SEQ IDNO8)。我們將整個M基因開放閱讀框進行了測序。我們克隆的M基因的序列幾乎和已經(jīng)發(fā)表的Genebank登錄號是AF291703的ANDV的M基因序列一樣，這并不令人驚奇，因為不同的病毒分離株是來自同一種嚙齒類動物標本(Meissner等人，2002，Virus Res.89，131-143)。有兩個腺嘌呤變成了鳥嘌呤。在位置1504上的變化是沉默的，而在1840上的變化卻導致在597位氨基酸以丙氨酸取代了蘇氨酸。
通過RIPA來評估轉(zhuǎn)染COS細胞中G1和G2的表達。從康復HPS患者中收集的血清免疫沉淀多肽，該多肽和pWRG/AND-M轉(zhuǎn)染細胞或ANDV感染細胞中的G1和G2的預測大小一樣(圖17A-B)。表達產(chǎn)物的大小和別的漢坦病毒屬病毒G1和G2的大小一樣，G1的范圍是68-76kDa，而G2的范圍是52-58kDa(Schmaljohn和Hooper，2001，在Fields Virology(病毒學領域)，第4版，Lippincott，Williams，和Wilkins，Philadelphia，PA，1581-1602頁)。我們假設在ANDV感染細胞，而不是pWRG/AND-M轉(zhuǎn)染細胞中，～46kDa蛋白是ANDV核殼蛋白。為了證實這個多肽是G1和G2，我們篩選了一系列的HTNV G1和G2特異的MAbs免疫沉淀ANDV糖蛋白的能力，糖蛋白來自轉(zhuǎn)染了pWRG/AND-M或pWRG/HTN-M(x)細胞。我們不能確定和ANDV G1蛋白交叉反應的HTNV G1特異的MAbs，MAb-2D5，MAb-6D4，MAb-8B6(圖17C)，MAb-10F11，或MAb-3D5(數(shù)據(jù)未表示)。HTNV G2特異的MAb-23G10，MAb-16E6和MAb-HCO2不能免疫沉淀ANDVG2，然而，HTNV G2特異的MAb-3D7卻能免疫沉淀pWRG/AND-M轉(zhuǎn)染細胞的ANDV G2蛋白(圖17C)。根據(jù)推斷，我們得出結論遷移在69kDa分子標準之下的蛋白是被HPS患者血清，而不是被G2特異的MAb-3D7免疫沉淀的，該蛋白就是ANDV G1蛋白?！?0kDa蛋白的身份仍然未知。
實施例14pWRG/AND-M基因疫苗在倉鼠中既不能產(chǎn)生免疫原性，也不能起保護作用。為了測試pWRG/AND-M的免疫原性，我們在3周的間隔中用基因槍將24只倉鼠接種了3次，收集血清樣品，通過PRNT測試NAb。檢測不到ANDV特異的NAb(沒有表示數(shù)據(jù))。在同一天接種了pWRG/HTN-M(x)的倉鼠確實產(chǎn)生了效價高達10240的HTNV特異的NAb(沒有表示數(shù)據(jù))。為了確定用pWRG/AND-M接種是否能誘導ANDV G1或G2特異的非中和抗體，我們用轉(zhuǎn)染了pWRG/AND-M的細胞進行了IFAT。從有代表性的接種了pWRG/AND-M的倉鼠血清中檢測不到抗G1或G2的抗體，但在以前感染了ANDV的倉鼠血清的陽性對照樣品中能檢測到抗體(數(shù)據(jù)沒有表示)。我們在第二組7只倉鼠中重復了整個接種試驗，又沒檢測到NAb反應(數(shù)據(jù)沒表示)。因為存在一種可能性，即用pWRG/AND-M接種能誘導非體液的，但仍然是保護性的免疫反應，我們用250 LD50的ANDV在第一次實驗中攻擊了8只倉鼠，而第二次試驗攻擊了7只倉鼠。14只接種了pWRG/AND-M的倉鼠中有12只患了HPS，并死亡。8只未接種的倉鼠中有6只患了HPS，并死亡。接種和未接種組的平均死亡天數(shù)介于12和13之間。從這些否定數(shù)據(jù)中，我們得出結論pWRG/AND-M在敘利亞倉鼠中沒有免疫原性。
實施例15pWRG/AND-M在獼猴中能誘導高效價的NAb反應。為了確定pWRG/AND-M在倉鼠中缺乏免疫原性是否是種屬特異的現(xiàn)象，我們在獼猴中測試了這個質(zhì)粒。在3周的間隔中，用基因槍對編號為ID#CH69的猴子進行4次pWRG/AND-M接種。兩只接種了pWRG/HTN-M(x)的獼猴作為陽性對照，我們以前顯示pWRG/HTN-M(x)在非人靈長類動物中具有免疫原性。在每次接種前收集血清，然后在第四次接種后3周測試HTNV和ANDV NAb的存在(圖18A，C)。接種了pWRG/AND-M的CH69猴子以及接種了pWRG/HTN-M(x)的陽性對照猴子在第二次接種后產(chǎn)生NAb反應，而第四次接種后NAb效價異常地高(圖18A，C)。
我們測試了接種猴子血清和別的HPS相關漢坦病毒屬病毒交叉中和的能力。接種了pWRG/AND-M，但沒有接種pWRG/HTN-M(x)的猴子血清能中和SNV和BCCV(圖18A)。接種了pWRG/AND-M或pWRG/HTN-M(x)的猴子血清不能分別交叉中和HTNV或ANDV。
接種前和接種后(最后一次接種后6周)，收集CH69猴子的血清，并且通過RIPA測試免疫沉淀ANDV糖蛋白的能力。接種后，但不是接種前血清免疫沉淀蛋白和人康復期血清免疫沉淀的蛋白相似一條強烈的G2帶，一條弱的G1帶，以及一條未知身份的～70kDa帶(圖18B)。
為了證實pWRG/AND-M接種在獼猴中是免疫原性的，我們在3周的間隔中對第二只動物接種了四次。這只猴子(ID#90BD25)在第二次接種后能產(chǎn)生5120的PRNT50效價，而在第四次接種后3周能產(chǎn)生10240的效價(圖18C)。因此，pWRG/AND-M在非人靈長類動物中誘導高效價Nab的能力是可重復的。
為了看看接種了HPS或HFRS DNA疫苗的猴子的NAb反應的持續(xù)時間，定期性地收集血清樣品約6個月。接種了pWRG/AND-M的猴子在接種最后一次疫苗后20和25周仍然分別具有320(ID#90BD25猴子)和2560(ID#CH69猴子)的PRNT50效價(圖18C)。兩只接種了pWRG/HTN-M(x)的陽性對照猴子在最后一次接種后25周仍然具有同源的PRNT50效價(640)。
實施例16雙構建體能防止HTNV和ANDV感染。制備含漢坦病毒M基因和安地斯病毒M基因的載體。將漢坦病毒M基因和安地斯病毒M基因克隆到pWRG7077中，獲得pWRG/HA-M(SEQ ID NO9)。每個M基因的側翼是巨細胞病毒啟動子和內(nèi)含子A(CMV內(nèi)含子A)以及牛生長激素多腺苷酸化位點。整個漢坦病毒和安地斯病毒M基因開放閱讀框以及絕大部分5’和3’非編碼序列都包括在這個構建體中。此外，24bp序列位于每個漢坦病毒屬病毒M序列和它們各自CMV內(nèi)含子A序列之間。如上面所討論的那樣，我們發(fā)現(xiàn)，由于一些不明了的原因，這個24bp的序列(或者他的一部分)對于G1糖蛋白的表達是必需的。
當pWRG/HA-M被導入哺乳動物細胞時，漢坦病毒和安地斯病毒M基因被表達。表達產(chǎn)物由漢坦病毒G1和G2糖蛋白以及安地斯病毒G1和G2糖蛋白組成。
測試了漢坦病毒/安地斯病毒雙M基因疫苗pWRG/HA-M在獼猴中的免疫原性。疫苗能誘導中和漢坦病毒和安地斯病毒的抗體反應(參看表8)。在一個單獨的倉鼠實驗中，我們發(fā)現(xiàn)這個質(zhì)粒和安地斯病毒質(zhì)粒相似，因為它在倉鼠中不能誘導抗體反應。然而，它能在猴子中誘導中和抗體的事實說明它能在人中誘導中和抗體。這是第一個被設計來防止所有能引起嚴重疾病的漢坦病毒屬病毒，包括HRPS相關的和HPS相關的病毒的DNA疫苗。
實施例17在攻擊前一天從接種了pWRG/AND-M猴子中被動轉(zhuǎn)移它的血清能延遲或預防倉鼠中的HPS。因為已經(jīng)成功地用HPS基因疫苗接種了獼猴，我們現(xiàn)在感興趣的是確定由這種疫苗所誘導的NAb反應是否能保護倉鼠免受致命ANDV感染。為此，接種了pWRG/AND-M的猴子血清，或接種了陰性對照質(zhì)粒的猴子的血清被注射到了4個一組的倉鼠中。第二天用ANDV(250 LD50，肌內(nèi)注射)攻擊倉鼠，并且每天觀察，持續(xù)4周。所有接受了含ANDV NAb的血清的倉鼠都幸存下來了，而所有接受陰性對照血清的倉鼠在攻擊后10-13天都死亡(表5)。對攻擊當天(0天)以及28天時幸存的倉鼠中收集的血清樣品進行PRNT。注射了ANDV PRNT50效價為20480的保護性猴血清后，倉鼠在攻擊時的PRNT50效價是320-1280。四周后，和ELISA檢測的結果一樣，這些倉鼠檢測不到NAb和核殼特異的抗體。因此，這些倉鼠不僅幸存下來，而且這些數(shù)據(jù)表明它們對來自攻擊的感染具有無菌免疫。
在第二個實驗中，接種了pWRG/AND-M(ANDV PRNT50效價＝640)的猴子的不同血清池被注射到四只倉鼠中。用接種了陰性對照質(zhì)粒的猴子血清注射倉鼠作為陰性對照。用ANDV(250 LD50，肌內(nèi)注射)攻擊倉鼠，并每天觀察，持續(xù)14周。如預料的那樣，注射了陰性對照猴子血清的倉鼠都會產(chǎn)生HPS，并在10-14之間死亡(表5)。然而，在第一個實驗中，所有注射了來自接種pWRG/AND-M猴子的血清的倉鼠都被無菌保護，在第二個實驗中，這些倉鼠中的兩只在第23天死亡，而剩余的兩只在第40天死亡?？傊懊嫣岬降膶嶒灡砻?，在攻擊前一天對接種pWRG/AND-M的猴子的血清進行被動轉(zhuǎn)移能無菌保護倉鼠免受致命的ANDV攻擊，或顯著遲緩疾病的開始和死亡。
表5把接種了pWRG/AND-M的獼猴的血清在攻擊前和攻擊后被動轉(zhuǎn)移到倉鼠
表5續(xù)把接種了pWRG/AND-M的獼猴的血清在攻擊前和攻擊后被動轉(zhuǎn)移到倉鼠
表8a(3)
表6.接種pWRG/HTN-M(x)的NHP血清在非致命感染模型中的被動轉(zhuǎn)移
表6續(xù)接種pWRG/HTN-M(x)的NHP血清在非致命感染模型中的被動轉(zhuǎn)移
a HTN-M表示接種了pWRG/HTN-M(x)的猴子的血清；(-)表示接種了不相關質(zhì)粒的陰性對照猴子血清，無″表示沒有被動轉(zhuǎn)移。
b 攻擊時倉鼠血清中的NAb效價(50％)。
c 2000PFU ANDV(1000 LD50)在0天時通過肌肉注射。
d 中和50％噬菌斑的最高稀釋度的倒數(shù)；ND，未做。
e 終點ELISA效價。
f 攻擊后35天時終了放血。
g 無菌免疫表示沒有檢測到針對核殼的抗體。Y和N分別表示有或沒有無菌免疫。
表7.在攻擊前和攻擊后把智利HPS患者的血漿被動轉(zhuǎn)移到倉鼠
表2-片狀共混用聚合物級分的比例和性能
注釋上表中的分子量是計算得到的。我們發(fā)現(xiàn)，對于低分子量(100000以下)而言樹脂的多分散性大約為3，而對于高達700000的高分子量而言樹脂的多分散性增大至約為3.25的數(shù)值。多分散性在這些數(shù)值周圍的波動大約是+/-0.5。
實施例18將接種了pWRG/AND-M的猴子血清在ANDV攻擊后4-5天被動轉(zhuǎn)移到倉鼠，能完全防止致命的HPS。當接種pWRG/AND-M的猴子血清在攻擊后3，4，5，6或9天時施用給倉鼠時，我們測試了它的保護效力(表5)。攻擊后3，4，5天接受了抗體的16只倉鼠中有15只幸存下來了。然而，如果抗體在攻擊后6天施用，那8只倉鼠中只有3只能幸存下來，而如果抗體是在攻擊后9天施用，那四只倉鼠中只有1只能幸存。除了一只外(ID#909，第3天)，所有暴露后實驗中幸存下來的倉鼠被ANDV感染，這可以通過PRNT和核殼特異的ELISA檢測。不像上文介紹的攻擊前被動轉(zhuǎn)移試驗，在攻擊后被動轉(zhuǎn)移實驗中，我們后來沒有觀察到死亡。因此，用接種了pWRG/AND-M猴子血清進行的免疫預防，最多在用ANDV進行致命攻擊后5天才能保護88-100％的受ANDV攻擊的倉鼠。
實施例19HTN-M DNA接種猴子血清被動轉(zhuǎn)移能保護倉鼠免受HTNV感染。在更早的研究中，我們證明了用pWRG/HTN-M(x)接種的倉鼠能誘導NAbs，并能防止感染；然而，我們從沒測試誘導的抗體本身能否足以起保護作用。為了解決這個問題，不同組的倉鼠或者不注射，或者用來自接種了pWRG/HTN-M(x)四次的猴子血清池注射(PRNT50效價＝20480)，或用來自接種了陰性對照質(zhì)粒的猴子血清池接種。被動轉(zhuǎn)移后一天，倉鼠被放血，并用HTNV攻擊。攻擊后5周，倉鼠被終了放血，并通過PRNT從0天到第35天測試血清中的HTNV NAbs，以及通過ELISA測試核殼特異的抗體(表6)。所有注射了陰性對照血清或無血清的倉鼠顯然被感染了，這可通過高的PRNT和核殼特異的ELISA效價表示出來。相反，注射了來自接種了pWRG/HTN-M(x)的倉鼠血清的8只倉鼠中有6只用ELISA檢測不到抗核殼抗體。倉鼠#495的ELISA效價低，表明感染水平低。盡管倉鼠#498在注射了免疫血清的一組，但在攻擊的時候沒檢測到NAb反應，表明抗體沒有成功地轉(zhuǎn)移，這就解釋了為什么這個動物沒有防止HTNV感染。因此，來自接種了pWRG/HTN-M(x)的非人靈長類動物的血清，在攻擊前一天施用，足以有效地保護倉鼠免受HTNV感染。
實施例20從HPS人類患者中被動轉(zhuǎn)移血漿。由于已經(jīng)證明來自接種了基于ANDV M基因DNA疫苗的猴子血清在暴露前或暴露后施用時，能防止致命ANDV攻擊，我們調(diào)查了Chilean HPS患者康復期血漿(人HPS血漿)在ANDV/倉鼠致命疾病模型的保護能力。人HPS血漿，最初的ANDV NAb PRNT50效價是10240，在第1，3，4或5天的時候注射到不同組的倉鼠中。對照組在第一天注射了正常的人血清。在0天，從倉鼠中收集血清，然后用ANDV攻擊倉鼠(250 LD50，肌內(nèi)注射)。作為毒性對照，三只在第一天注射了人HPS血漿的倉鼠沒有被攻擊。監(jiān)控倉鼠98天，幸存的倉鼠被終了放血，并在第0天和98天，對血清樣品進行PRNT和ELISA(表7)。所有接受了正常人血清的倉鼠在攻擊后10-12天死亡。四只在第一天接受了人HPS血漿的倉鼠中有兩只幸存下來。在第一天組的另外兩只倉鼠產(chǎn)生了HPS，并在攻擊后的第57和68天死亡。在攻擊后的第3，4，或5天接受抗體的12只倉鼠中有7只幸存下來了。在這些組中死亡的倉鼠在攻擊后11-15天也接受了抗體。在毒性對照組中的3只倉鼠都保持健康。
攻擊后血清的血清學結果表明在第1天注射了人HPS血漿，并幸存下來的兩只倉鼠可以防止感染(即他們不會產(chǎn)生抗核殼抗體)(表7)。除了一只外，所有攻擊后接受了人HPS血漿，并幸存下來的倉鼠仍然被感染了，這是因為他們產(chǎn)生了抗核殼抗體。因此，當人HPS血漿在第1，3，4或5天施用時，保護至少一半受到攻擊的倉鼠。在第一天接受血漿的倉鼠或者能防止感染，或者比對照存活時間長4倍。
討論目前，沒有疫苗，有效的抗病毒藥物，或免疫促進劑(immunologics)能防止或治療HPS。這令人不安，因為HPS能折磨在所有年齡組中的以前健康的個體，疾病進程很快，而且致死率在已知的任何急性病毒疾病中是最高的之一。在阿根廷南部和智利，關于人對人傳播AND V相關HPS的報道使得發(fā)展抗這種高致命疾病的對策顯得尤為迫切(Padula等人，1998，Virology 241，323-330；Toro等人，1997，Emerg.Infect.Dis.4，687-694；Wells等人，1997，Emerg.Infect.Dis.3，171-174)。在本申請中，我們報道了一種候選HPS基因疫苗的開發(fā)，該疫苗在非人靈長類動物中能誘導高效價NAb。此外，我們報道了被這種疫苗誘導的抗體能保護倉鼠免受致命HPS的感染，甚至在攻擊后5天施用都可以。
這是第一個研究，在這個研究中，成年實驗動物漢坦病毒屬病毒疾病模型一直被用來評估候選疫苗，藥物或免疫促進劑的保護性效力。以前的研究使用包括小鼠，倉鼠，或田鼠在內(nèi)的漢坦病毒屬病毒感染模型來評估疫苗或免疫促進劑，或利用哺乳的小鼠神經(jīng)性疾病模型來評估藥物(Hooper和Li，2001，在漢坦病毒屬病毒，171-191頁，Springer-Verlag，柏林，德國，Schmaljohn和Hooper，2001，同上)。在本申請中，我們利用了最近介紹的ANDV/倉鼠致命疾病模型(Hooper等人，2001，Virology 289，6-14)。我們證實ANDV在成年的敘利亞倉鼠中能引起致命的HPS，并確定這種攻擊有相對一致的結果。在主動接種或被動轉(zhuǎn)移實驗中，作為陰性對照的35只倉鼠中，ANDV攻擊的倉鼠100％被感染，并且91％患上了致命的HPS(平均死亡天數(shù)＝12，范圍是10-15天)。癥狀(如呼吸困難)開始很快，并且通常在開始后24小時內(nèi)死亡。
在更早的研究中，我們證明了以前用HTNV，SEOV，DOBV，PUUV或SNV感染能保護倉鼠免受致命的ANDV的攻擊(Hooper等人，2001，同上)。從這點出發(fā)，我們推斷利用我們的基于HTNV M基因的DNA疫苗pWRG/HTN-M(x)保護倉鼠免受ANDV攻擊是可能的。我們測試了這種可能性，并且發(fā)現(xiàn)pWRG/HTN-M(x)能保護24只倉鼠中的9只免受致命的ANDV的攻擊。這種保護水平?jīng)]有統(tǒng)計學上的意義(P＝0.0569)，但卻表明該疫苗能誘導一些抗ANDV的免疫反應。很可能pWRG/HTN-M(x)疫苗能提供更高水平的抗少于250 LD50的攻擊劑量的保護，或抗不同攻擊途徑的保護(如氣溶膠或口服途徑)。在pWRG/HTN-M(x)接種的倉鼠(圖14)或HTNV感染的倉鼠血清中基本沒有ANDV交叉中和抗體，HTNV感染的倉鼠在我們更早的工作中被保護了(Hooper等人，2001，同上)。這表明我們在以前感染的倉鼠中觀察到的交叉保護是因為細胞介導的免疫反應靶向核殼和糖蛋白，然而我們在pWRG/HTN-M(x)接種的倉鼠中觀察到的部分交叉保護可能是因為細胞介導的免疫反應僅靶向糖蛋白。在理論上可能是L基因組區(qū)段產(chǎn)物在以前感染的倉鼠中觀察到的保護中發(fā)揮了重要的作用，然而，目前沒有關于病毒聚合酶誘導體液或細胞介導的免疫反應的證據(jù)。用HTNV感染后的交叉保護，而不是用HTNV糖蛋白接種后的交叉保護表明用表達HTNV核殼和唐蛋白的質(zhì)粒接種能模仿HTNV感染和抗ANDV的交叉保護。
在另一個開發(fā)HPS疫苗的方法中，我們構建了一種質(zhì)粒，這種質(zhì)粒被設計來特異性防止引起HPS的病毒感染。該質(zhì)粒pWRG/AND-M含有完全的ANDV M基因開放閱讀框，并且在細胞培養(yǎng)物中表達G1和G2糖蛋白。據(jù)我們所知，BCCV M基因是其他HPS漢坦病毒屬病毒中唯一的已經(jīng)被成功克隆和表達的完全M基因(Ravkov等人，1998，J.Virol.72，2865-2870)。在那個研究中，將BCCV M基因克隆到辛德畢斯病毒復制系統(tǒng)SIN-rep5中，并通過免疫沉淀檢測在BHK21細胞中的表達。
用pWRG/AND-M接種能誘導獼猴中潛在的NAb反應。這是第一個候選的HPS疫苗，它能在任何實驗室動物中明確地誘導NAb反應。不僅猴子中產(chǎn)生的NAb，而且1)僅在兩次接種后就能檢測到NAbs；2)NAbs效價非常高(即效價和在HPS患者康復血清中發(fā)現(xiàn)的一樣高)；3)NAbs至少能和兩種別的HPS相關漢坦病毒屬病毒SNV和BCCV交叉中和；以及4)在最后一次接種后6個月，仍然能檢測到NAbs。SNV的中和表明pWRG/AND-M疫苗將能防止南美和北美主要的HPS漢坦病毒屬病毒，分別是ANDV和SNV。BCCV的中和表明用pWRG/AND-M接種可能防止大范圍的漢坦病毒屬病毒(參看表8)。這些數(shù)據(jù)加上我們HFRS DNA疫苗數(shù)據(jù)表明包括pWRG/HTN-M(x)和pWRG/AND-M的疫苗能令人信服地防止若干已知對人高度致命的主要漢坦病毒屬病毒。
表8.基于漢坦病毒屬病毒M基因的DNA疫苗在非人靈長類動物中的免疫原性在1-4次接種后的反應。
a作了三個獨立的實驗。每次接種猴子接受8g.g的給藥。
b抗同型病毒的PRNT50效價。對于pWRG/HA-M，給出了漢坦病毒(HTN)和安地斯病毒(AND)的效價。
cpWRG/HA-M是一種質(zhì)粒，它含有安地斯病毒和漢坦病毒的M基因。
所有接種了本發(fā)明基于漢坦病毒，漢城病毒，安地斯病毒或漢坦病毒/安地斯病毒M基因的DNA疫苗的猴子都能誘導中和抗體，水平在6個月后仍然能檢測到。接種了pWRG/HTN-M(x)的3只猴子中有2只在最后一次接種后2年仍然能檢測到中和抗體(表9)。免疫持續(xù)時間數(shù)據(jù)在表10中總結了。
表9.基于漢坦病毒屬病毒M基因的DNA疫苗在非人靈長類動物中的免疫原性免疫持續(xù)時間
a作了三個獨立的實驗。每次接種猴子接受了8g.g給藥。
b抗同型病毒的PRNT50效價。
表10.基于漢坦病毒屬病毒M基因的DNA疫苗在非人靈長類動物中的免疫原性免疫持續(xù)時間
a抗同型病毒的PRNT50效價。
我們在研究過程中獲得的令人更困惑的結果之一是pWRG/AND-M在倉鼠中不能誘導可檢測的免疫反應。在兩個獨立的實驗中，三次接種了pWRG/AND-M的倉鼠不能產(chǎn)生通過PRNT或IFAT可檢測到的抗體，而且不能防止致命的ANDV的攻擊。相反，只接種了少至2次pWRG/AND-M的獼猴產(chǎn)生了可檢測的NAb反應。盡管不相似，但可能是DNA疫苗由于技術的原因在倉鼠中沒有免疫原性。在探究為什么pWRG/AND-M在倉鼠中不能產(chǎn)生免疫反應，以及這種現(xiàn)象是否涉及敘利亞倉鼠中高致命的ANDV性質(zhì)的機制之前，我們應該謹慎地評估在一起做的實驗中，倉鼠和非人類靈長類動物中的pWRG/AND-M疫苗，在這些實驗中，兩種動物中都使用了同一批疫苗和接種規(guī)程。在目前的研究中，關鍵點是pWRG/AND-M在非人靈長類動物中是高度免疫原性的。
在以前的研究中，我們證明了表達SEOV或HTNV糖蛋白的基因疫苗能在小鼠，倉鼠和非人靈長類動物中誘導NAb，而且我們證明了接種倉鼠中存在的NAb和防止感染相關聯(lián)(Hooper等人，1999，Virology 255，269-78；Kamrud等人，1999，Virology 263，209-219)。在本申請中，我們第一次證明了由pWRG/HTN-M(x)DNA接種所誘導的體液反應足以防止HTNV感染。具體而言，我們證明了在攻擊前一天接種了pWRG/HTN-M(x)的猴子血清的被動轉(zhuǎn)移給用HTNV攻擊的8只倉鼠中的6只提供了無菌保護。沒有被保護的兩只倉鼠或者保護有限(#495倉鼠)，這可通過攻擊后非常低的抗核殼效價來確定，或沒有接受正確的血清注射(倉鼠#498)，這可通過檢測攻擊當天可檢測的NAb存在與否來確定。相似的被動轉(zhuǎn)移試驗可以用作臨床研究的一部分，評估接種了pWRG/HTN-M(x)的人的血清以及預測疫苗的效力，這是有可能的。
目前，對暴露或潛在暴露在HPS漢坦病毒屬病毒中的個體沒有治療手段。醫(yī)院接納的患者中NAb高效價和有利的臨床治療相關的報道表明NAb可能能改善疾病，因此免疫治療可能對暴露在HPS病毒中的人是一種可行的治療選擇(Bharadwaj等人，2000，J.Infect.Dis.182，43-48)。對于HFRS相關的漢坦病毒屬病毒，感染大鼠免疫血清或小鼠MAbs的被動轉(zhuǎn)移能防止倉鼠感染或防止新生大鼠或哺乳小鼠患神經(jīng)性疾病(Arikawa等人，1989，J.Gen.Virol.70，615-24；Liang等人，1996，Virology 217，262-271；Schmaljohn等人，1997，J.Virol.71，9563-9569，Zhang等人，1989，Arch Virol.105，235-246)。對于HPS漢坦病毒屬病毒，沒有關于保護性免疫被動轉(zhuǎn)移的報道。AND/倉鼠致命疾病模型的發(fā)現(xiàn)使得我們第一次能評估抗體防止和人疾病相似的漢坦病毒屬病毒疾病的能力。利用這個模型，我們證明了接種了pWRG/AND-M的猴子血清，如果在暴露后第4或5天施用被動轉(zhuǎn)移能100％保護受到攻擊的倉鼠免受致命的ANDV的感染。這個發(fā)現(xiàn)表明有可能開發(fā)一種產(chǎn)品(例如包括人的靈長類動物多克隆免疫球蛋白，用pWRG/AND-M和/或pWRG/HTN-M(x)接種，或中和ANDV和/或HTNV的MAbs)，它能用于治療暴露在漢坦病毒屬病毒中的實驗室工作人員，和HFRS或HPS患者親密接觸的家庭成員或其他人，或治療HPS病例的醫(yī)療機構工作人員，尤其在南美，在這里有人對人傳播HPS的證據(jù)(Padula等人，1998，Virology 241，323-330；Toro等人，1997，同上，Wells等人，1997，Emerg.Infect.Dis.3，171-174)。
在暴露后第3天施用時，HPS患者康復血清基本上和猴子血清效果一樣(保護作用是75％對88％)，但是當在暴露后第4或5天施用時，倉鼠只有50％的保護作用了。因為低的樣品數(shù)，這種差異可以是人為現(xiàn)象。此外，有可能是人的NAbs比獼猴的NAbs清除得更快，從而導致在攻擊時低效的NAb效價。我們沒有評估猴子或人漢坦病毒屬病毒特異的NAbs從倉鼠中被清除的動力學。
將接種pWRG/AND-M的猴子血清或HPS患者血漿在攻擊前1天施用被動轉(zhuǎn)移能通過無菌免疫保護倉鼠免受致命的ANDV攻擊，或者延緩疾病開始和降低死亡率2倍至幾乎4倍。在涉及將含有ANDVNAb的血清被動轉(zhuǎn)移的實驗中(表5和表7)，后來死掉的唯一的一批倉鼠是在攻擊前1天注射了血清的倉鼠。這六只倉鼠分別在第23，23，40，40，57和68天死亡，平均死亡天數(shù)是42天。這種死亡時間的延緩是很有意義的，因為注射了陰性對照血清(猴子或人)的12只倉鼠在10-14天全都死亡，平均死亡天數(shù)是12天。我們推測在第1天注射了抗體的倉鼠后來死亡可能是異型猴子或人ANDV特異NAb的清除，以及隨后從“來自外部”(例如從同一個房間不同籠子中的倉鼠散布出來的ANDV)或“來自內(nèi)部”(例如，從用被動轉(zhuǎn)移抗體而產(chǎn)生的中和中逃逸出來并感染細胞的病毒)導入的病毒擴增的結果。我們假設以后死亡沒有在暴露后接受血清的倉鼠中觀察到，因為受攻擊的倉鼠設置了一道針對攻擊病毒的活性免疫反應。這道主動的免疫反應在正常情況下是不足以保護倉鼠免受ANDV感染，然而，在第3-5天施用的被動轉(zhuǎn)移免疫(即來自接種了pWRG/AND-M的猴子血清的NAb)使平衡朝有利于倉鼠方向傾斜，并且使其幸存下來(28只倉鼠中有22只幸存，參看表6和表7)。當倉鼠在被動免疫被清除后重新暴露在ANDV中時，主動的免疫反應將會保持并保護倉鼠。為了支持這個結論，在第3，4，5，6或9天時接受了被動轉(zhuǎn)移抗體的26只幸存?zhèn)}鼠中，除了一只外(倉鼠#902，表5)仍然被感染了，這可以通過攻擊后若干星期檢測到抗核殼和/或NAb反應表現(xiàn)出來。不管后來的死亡是否是因為重新暴露在來自“內(nèi)部”或“外面”的病毒，這些數(shù)據(jù)都表明漢坦病毒屬病毒暴露后的預防性治療方案可能要求重復施用，或者是抗體的被動轉(zhuǎn)移和主動接種免疫。暴露后預防用的被動/主動免疫方法按常規(guī)是用來防止別的病毒疾病，包括甲型肝炎，乙型肝炎和狂犬病(疾病控制中心，Atlanta，Georgia，1991，MMWR40，1-19，MMWR 48，1-21，MMWR 48，1-37)。
絕大部分在第6或9天接受了ANDV特異的NAb的倉鼠都死亡了，表明當疾病發(fā)展后，免疫預防可能沒什么效果。別人報道小的分子藥物利巴偉林(Ribavirin)可能對治療HPS無效，因為對于絕大部分患者，藥物治療都是在臨床癥狀出現(xiàn)后開始的(Chapman等人，1999，Antivir，Ther.4，211-219)。關鍵的致病結合點還沒有確定，在這個結合點中，由感染所引起的損傷不能逆轉(zhuǎn)，而且預防也不可能。將來在安地斯病毒/倉鼠致命疾病模型中以HPS時控為特點的研究，將會對HPS的發(fā)病機理提供見解，并且允許我們闡明暴露前和暴露后預防和治療的策略。
序列表Seq ID NO1 SEOV M基因組區(qū)段tagtagtaga ctccgcaaga aacagcagtt aaagaacaat40aggatcatgt ggagtttgct attactggcc gctttagttg80gccaaggctt tgcattaaaa aatgtatttg acatgagaat 120tcagttgccc cactcagtca actttgggga aacaagtgtg 160tcaggctata cagaatttcc cccactctca ttacaggagg 200cagaacagct agtgccagag agctcatgca acatggacaa 240ccaccagtca ctctcaacaa taaataaatt aaccaaggtc 280atatggcgga aaaaagcaaa tcaggaatca gcaaaccaga 320attcatttga agttgtggaa agtgaagtca gctttaaagg 360gttgtgtatg ttaaagcata gaatggttga agaatcatat 400agaaatagga gatcagtaat ctgttatgat ctagcctgta 440atagtacatt ctgtaaacca actgtttata tgattgttcc 480tatacatgct tgcaacatga tgaaaagctg tttgattggc 520cttggcccct acagaatcca ggttgtctat gaaaggacat 560actgcactac gggtatattg acagaaggaa aatgctttgt 600ccctgacaag gctgttgtca gtgcattgaa aagaggcatg 640tatgctatag caagcataga gacaatctgc ttttttattc 680atcagaaagg gaatacatat aagatagtga ctgccattac 720atcagcaatg ggctccaaat gtaataatac agatactaaa 760gttcaaggat attatatctg tattattggt ggaaactccg 800cccctgtata tgcccctgct ggtgaagact tcagagcaat 840ggaggttttt tctgggatta ttacatcacc acatggagaa 880gaccatgacc tacccggcga agaaatcgca acgtaccaga 920tttcagggca gatagaggca aaaatccctc atacagtgag 960ctccaaaaac ttaaaattga ctgcttttgc aggtattcca 1000tcatactcat caactagtat attggctgct tcagaagatg 1040gtcgtttcat atttagtcct ggtttatttc ctaacctaaa 1080tcagtcagtc tgtgacaaca atgcactccc tttaatctgg 1120aggggcctaa ttgatttaac gggatactat gaggcagtcc 1160acccttgcaa tgtgttctgt gtcttatcag gaccaggtgc 1200ttcatgtgag gccttttcag aaggaggtag gggcaatatt 1240acttctccaa tgtgtctggt gtctaagcaa aatagattta 1280gagcagctga gcagcagatt agctttgtct gccaaagagt 1320tgatatggat attatagtgt actgtaatgg tcagaaaaaa 1360acaatcctaa caaaaacatt agttataggc caatgtattt 1400atactattac aagtctcttt tcactgttac caggggttgc 1440ccattctatt gctattgagt tgtgtgttcc agggtttcat 1480ggctgggcca cagctgcact tttgattaca ttctgcttcg 1520gctgggtatt gattcctgca tgtacattag ctattctttt 1560agtccttaag ttctttgcaa atatccttca tacaagcaat 1600caagagaacc gattcaaagc cattctacgg aaaataaagg 1640aggagtttga aaaaacaaag ggttccatgg tttgtgagat 1680ctgtaagtat gagtgtgaaa cattaaagga attgaaggca 1720cataacctat catgtgttca aggagagtgc ccatattgct 1760ttacccactg tgaaccgaca gaaactgcaa ttcaggcaca 1800ttacaaagtt tgtcaagcca cccaccgatt cagagaagat 1840ttaaaaaaga ctgtaactcc tcaaaatatt gggccaggct 1880gttaccgaac actaaatctt tttaggtata aaagtaggtg 1920
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gacagattgc agcagggaag aacatccggg caggaccggg 280atcctacagg ggtagagcca ggtgatcatc ttaaggaaag 320atcagcacta agctacggga atacactgga cctgaatagt 360cttgacattg atgaacctac aggacagaca gctgattggc 400tgaccataat tgtctatctg acatcattcg tggtcccgat 440catcttgaag gcactgtaca tgttaacaac acgaggtagg 480cagacttcaa aggacaacaa ggggatgagg atcagattca 520aggatgacag ctcatatgag gatgtcaatg gaatcagaaa 560gcccaaacat ctgtatgtgt caatgccaaa cgcccaatcc 600agcatgaagg ctgaagagat aacaccagga agattccgca 640ctgcagtatg tggactatat cctgcacaga taaaggcaag 680gaatatggta agccctgtca tgagtgtagt tgggttcttg 720gcactggcaa aagactggac atcgagaatt gaagaatggc 760tcggtgcacc ctgcaaattc atggcggagt ctcttattgc 800cgggagttta tctgggaatc ctgtgaatcg tgactatatc 840agacagagac aaggtgcact tgcagggatg gagccaaagg 880aatttcaagc cctcaggcaa cattcaaagg atgctggatg 920tacactagtt gaacatattg agtcaccatc atcaatatgg 960gtgtttgctg gggcccctga taggtgtcca ccaacatgct 1000tgtttgtcgg agggatggct gaattaggtg ccttcttttc 1040tatacttcag gatatgagga acacaatcat ggcttcaaaa 1080actgtgggca cagctgatga aaagcttcga aagaaatcat 1120cattctatca atcatacctc agacgcacac aatcaatggg 1160aatacaactg gaccagagga taattgttat gtttatggtt 1200gcctggggaa aggaggcagt ggacaacttt catctcggtg 1240atgacatgga tccagagctt cgtagcctgg ctcagatctt 1280gattgaccag aaagtgaagg aaatctcaaa ccaggaacct 1320atgaaattat aagtacataa atatataatc aatactaact 1360ataggttaag aaatactaat cattagttaa taagaatata 1400gatttattga ataatcatat taaataatta ggtaagttaa 1440ctagtattta gttaagttag ctaattgatt tatatgattg 1480tcacaattaa atgtaatcat aagcacaatc actgccatgt 1520ataatcacgg gtatacgggt ggttttcata tggggaacag 1560ggtgggctta gggccaggtc accttaagtg accttttttt 1600gtatatatgg atgtagattt caattgatcg aatactaatc 1640ctactgtcct cttttctttt cctttctcct tctttactaa 1680caacaacaaa ctacctcaca ccttaatata tactacttta 1720ttaagttgtt aagttgtgtc tttttgggga gtaagggagt 1760ctactacta1769SEQ ID NO3備注＝″亞克隆到DNA載體pWGR7077中SEOV病毒株SR-11的M基因組區(qū)段″gggggggggg ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg40ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag80ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg 120taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca 160cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc 200cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccga 240cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa 280ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc 320aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac 360
catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 400ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat 440cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta 480ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 520atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa 560agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc 600cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc 640gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg 680cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat 720gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt 760ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct 800gttttcccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat 840caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat 880aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta 920acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca 960actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt 1000cgcacctgat tgccccacat tatcgcgagc ccatttatac 1040ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc 1080tcgagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc 1120ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt 1160catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga 1200gattttgaga cacaacgtgg ctttcccccc ccccccggca 1240tgcctgcagg tcgacataaa tcaatattgg ctattggcca 1280ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata 1320ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt 1360attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta 1400gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1440cggtaaatgg cccgcctcgt gaccgcccaa cgacccccgc 1480ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 1520caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 1560acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 1600atgccaagtc cggcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 1640tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1680actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 1720tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg 1760cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1800accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 1840tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg 1880ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1920atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg 1960gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 2000cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg 2040gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc 2080ctatagactc tataggcaca cccctttggc tcttatgcat 2120gctatactgt ttttggcttg gggcctatac acccccgctc 2160cttatgctat aggtgatggt atagcttagc ctataggtgt 2200gggttattga ccattattga ccactcccct attggtgacg 2240atactttcca ttactaatcc ataacatggc tctttgccac 2280aactatctct attggctata tgccaatact ctgtccttca 2320gagactgaca cggactctgt atttttacag gatggggtcc 2360catttattat ttacaaattc acatatacaa caacgccgtc 2400ccccgtgccc gcagttttta ttaaacatag cgtgggatct 2440ccacgcgaat ctcgggtacg tgttccggac atgggctctt 2480ctccggtagc ggcggagctt ccacatccga gccctggtcc 2520
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GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCCTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGACTCTATAGGCACACCCCTTTGGCTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGCCTATACACCCCCGCTTCCTTATGCTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTATCTCTATTGGCTATATGCCAATACTCTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCCCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACAACGCCGTCCCCCGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAGCGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCCACATCCGAGCCCTGGTCCCATGCCTCCAGCGGCTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACAATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCTGCGGAGCTGGGCTCGCACCGCTGACGCAGATGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTATTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACAGAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCAAGCTTGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCACGAAGAAGCAAAAAAATTAAAGAAGTGAGTTTAAAATGGAAGGGTGGTATCTGGTGTTCTTGGAGTCTGCTATACGCTGACACTGGCAATGCCCAAGACCATTTATGAGCTTAAAATGGAATGCCCGCACACTGTGGGTCTCGGTCAAGGTTACATCATTGGCTCAACAGAACTAGGTTTGATCTCAATTGAGGCTGCATCTGATATAAAGCTCGAGAGCTCTTGCAATTTTGATCTTCATACAACATCTATGGCCCAGAAGAGTTTCACCCAAGTTGAATGGAGAAAGAAAACTGACACAACTGATACCACAAATGCTGCGTCCACTACCTTTGAAGCACAAACTAAAACTGTTAACCTTAGAGGGACTTGTATACTGGCACCTGAACTCTATGATACATTGAAGAAAGTAAAAAACACAGTCCTGTGCTATGATCTAACATGTAATCAAACACATTGTCAGCCAACTGTCTATCTGATTGCACCTGTATTGACATGCATGTCAATAAGAAGTTGTATGGCTAGTGTGTTTACAAGCAGGATTCAGGTGATTTATGAAAAGACACATTGTGTAACAGGTCAGCTGATTGAGGGTCAGTGTTTCAACCCAGCACACACATTGACATTATCTCAGCCTGCTCACACTTATGATACTGTCACCCTTCCTATCTCTTGTTTTTTCACACCAAAGAAGTCGGAGCAACTAAAAGTTATAAAAACATTTGAAGGAATTCTGACGAAGACAGGTTGCACGGAGAATGCATTGCAGGGTTATTATGTGTGTTTTTTAGGAAGTCATTCAGAACCTTTAATTGTTCCGAGTTTGGAGGACATACGGTCTGCTGAAGTTGTTAGTAGGATGCTTGTACACCCTAGGGGAGAAGACCATGATGCCATACAGAATTCACAAACTCACTTAAGAATAGTGGGACCTATCACAGCAAAAGTGCCATCAACTAGTTCCACAGATACCCTAAAGGGGACAGCCTTTGCAGGCGTCCCAATGTATAGCTCTTTATCTACACTAGTCAGAAATGCAGACCCAGAATTTGTATTTTCTCCAGGTATAGTACCTGAATCTAATCACAGTACATGTGATAAGAAGACAGTACCTATCACATGGACAGGCTACCTACCAATATCAGGTGAGATGGAAAAAGTGACTGGATGTACAGTTTTTTGTACACTAGCAGGACCTGGTGCTAGTTGTGAGGCCTATTCTGAAAATGGTATATTTAACATCAGTTCTCCAACATGTCTTGTAAACAAAGTCCAAAGATTTCGTGGATFTGAACAGAAAATAAATTTTATCTGTCAGCGGGTAGATCAGGATGTTGTTGTATACTGCAATGGGCAAAAGAAAGTCATATTAACCAAAACTTTGGTTATTGGGCAGTGTATTTATACATTCACAAGCCTATTTTCATTGATGCCTGATGTAGCCCACTCATTGGCTGTAGAATTATGTGTCCCGGGATTACATGGGTGGGCCACTGTCATGCTTCTATCAACATTCTGCTTTGGGTGGGTCTTGATTCCTGCGGTCACATTAATAATATTAAAGTGTCTAAGGGTTTTGACGTTTTCTTGTTCCCATTACACTAATGAGTCAAAATTTAAATTCATCCTGGAAAAAGTTAAAATTGAATACCAAAAGACTATGGGATCAATGGTGTGCGATGTATGTCATCATGAGAGTGAAACAGCAAAAGAACTTGAATCACATAGACAGAGTTGTATCAATGGACAATGTCCTTATTGCATGACAATAACTGAAGCAACTGAAAGTGCCTTGCAAGCCCATTATTCCATTTGTAAATTGGCAGGAAGATTTCAGGAGGCACTGAAAAAGTCACTTAAAAAGCCAGAGGTAAAAAAAGGTTGTTACAGAACACTCGGGGTATTTAGATATAAAAGTAGATGTTATGTGGGTTTGGTATGGTGCCTATTGTTGACATGTGAAATTGTTATTTGGGCCGCAAGTGCAGAGACTCCACTAATGGAGTCAGGCTGGTCAGATACGGCTCATGGTGTTGGTGAGATTCCAATGAAGACAGACCTCGAGCTGGACTTTTCACTGCCTTCTTCATCCTCTTACAGTTATAGGAGAAAGCTCACAAACCCAGCCAATAAAGAAGAGTCTATTCCCTTCCACTTCCAGATGGAAAAACAAGTAATTCATGCTGAAATCCAACCCCTGGGTCATTGGATGGATGCGACATTTAATATTAAGACTGCATTTCATTGTTATGGTGCATGCCAGAAATACTCTTATCCATGGCAGACATCTAAGTGCTTCTTTGAAAAGGACTACCAGTATGAAACAGGCTGGGGCTGTAATCCTGGTGACTGCCCAGGGGTTGGGACTGGATGCACTGCTTGTGGTGTTTATCTCGATAAACTAAAATCTGTTGGGAAGGCCTATAAGATAATTTCTTTAAAATATACCAGAAAGGTTTGTATTCAGTTAGGAACAGAACAAACTTGCAAGCATATTGATGCAAATGATTGTTTAGTGACACCATCTGTGAAAGTTTGCATAGTGGGCACAGTTTCAAAACTTCAACCATCTGATACTCTTTTGTTCTTAGGTCCACTAGAACAAGGGGGAATCATTCTTAAGCAATGGTGCACAACATCATGTGCATTTGGGGACCCTGGTGATATCATGTCCACTCCCAGTGGTATGAGGTGTCCAGAGCACACTGGATCATTTAGGAAAATTTGCGGTTTTGCTACTACACCAGTTTGTGAATATCAAGGAAATACCATTTCTGGATATAAAAGAATGATGGCAACAAAAGATTCATTCCAATCATTTAACTTAACAGAACCTCACATCACAACAAACAAGCTTGAATGGATCGACCCAGATGGGAATACAAGAGACCACGTAAACCTTGTCTTAAATAGAGATGTCTCATTTCTGGATTTAAGTGATAACCCCTGTAAAGTAGACCTACACACACAAGCAATAGAAGGGGCATGGGGTTCTGGTGTAGGGTTTACACTCACATGTACTGTCGGATTAACAGAGTGCCCAAGTTTTATGACATCAATTAAGGCATGTGACCTAGCTATGTGTTATGGATCAACAGTAACAAACCTTGCCAGGGGCTCTAATACAGTGAAAGTAGTTGGTAAAGGAGGCCATTCAGGGTCCTCATTTAAATGCTGTCATGATACAGATTGCTCCTCTGAAGGTTTACTTGCATCAGCCCCTCATCTTGAGAGGGTAACAGGATTCAATCAAATTGATTCAGATAAGGTTTATGATGATGGTGCACCACCTTGCACATTCAAATGCTGGTTCACTAAGTCAGGTGAGTGGCTTCTTGGGATCTTAAACGGGAATTGGATTGTTGTTGTAGTGCTTGTTGTGATACTCATTCTCTCTATCATAATGTTCAGTGTTTTGTGTCCCAGGAGAGGGCACAAGAAAACTGTCTAAGCATTGACCTCAACTCCTACATTAGATCATATACATTTATGCACTTCCTCATATTTAGCTGCACTAAGATATTAATAAACTCTAGTTATTGACTTTATAAGATTATTATGGAACTAACCTCACTTAA
AAAAAACAAATACTTTACTCATATATAACTCCATATTCTCTTACCGAGGATTTTGTTCCTGCGGAGCATACTACTAGGATCTACGTATGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGGGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGACAGCTCGACTCTAGAATTGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCAVGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCSEQ ID NO:10引物0，5’-GCGCGCGGCCGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACSEQ ID NO:11反向引物，5’-GCGCGGATCCCGGGTACCGGGCCCCCCCTCGSEQ ID NO:12引物1-24，5’GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCASEQ ID NO:13引物24-1，5’-GGCCGCGGCCGCGAGCACGGCTTAAGGACGTCTAGGAGTAGTAGTCTCCGCAAGAAACAGCASEQ ID NO:14引物1-125’-GGCCGCGGCCGCATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA
SEQ ID NO15引物13-24，5′GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCASEQ ID NO16引物1-24*，5′GGCCGCGGCCGCGGATCTGCCCGAATTCGGCACGGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCASEQ ID NO17引物1-8，5 ′GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCASEQ ID NO18SEOMX，5′-GCGCGGATCCAGATTGGGAGATAGAAGAGAGSEQ ID NO19M5B，5′-TCAGGACTCCTGTCATGCAATAAGATCTCSEQ ID NO20HTNMX，5′-GCGCGGATCCGTTTGTGGTTAGAAAGCTACSEQ ID NO21SN-Fj，5′-GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCACGAAGAAGCSEQ ID NO22PUUM-R，5′-GCGCGGATCCTAGTAGTATGCTCCGCAGGAAC
權利要求
1.如SEQ ID NO6中所示的核酸。
2.DNA片段，編碼漢坦病毒M基因區(qū)段以及權利要求1所述的序列。
3.DNA片段，編碼漢城病毒M基因區(qū)段以及權利要求1所述的序列。
4.DNA片段，編碼安地斯病毒M基因區(qū)段以及權利要求1所述的序列。
5.一種重組DNA構建體，包括i)載體，ii)至少一種漢坦病毒屬病毒M基因核酸片段，以及iii)權利要求1所述的核酸片段。
6.根據(jù)權利要求5所述的重組DNA構建體，其中所述的構建體是如SEQ ID NO1中所示的pWRG/SEO-M。
7.根據(jù)權利要求5所述的重組DNA構建體，其中所述的構建體是如SEQ ID NO7中所示的pWRG/HTN-M(x)。
8.根據(jù)權利要求5所述的重組DNA構建體，其中所述的構建體是如SEQ ID NO8中所示的pWRG/AND-M(x)。
9.根據(jù)權利要求5所述的重組DNA構建體，其中所述的構建體包括兩種所述的漢坦病毒屬病毒M基因核酸片段。
10.根據(jù)權利要求9所述的重組DNA構建體，其中所述的構建體是如SEQ ID NO9中所示的pWRG/HA-M。
11.一種組合物，包括惰性粒子，以及包被在惰性粒子上形成核酸包被的粒子的核酸，所述核酸包括能在哺乳動物細胞中操作的啟動子和漢坦病毒屬病毒多核苷酸M區(qū)段，該區(qū)段編碼一或多種漢坦病毒屬病毒的G1和G2蛋白。
12.根據(jù)權利要求11所述的組合物，其中所述的漢坦病毒屬病毒選自漢城病毒，多布拉伐病毒，普馬拉病毒，漢坦病毒，辛諾柏病毒，黑渠港病毒，長沼病毒，紐約病毒，安地斯病毒和Laguna Negra病毒。
13.根據(jù)權利要求11所述的組合物，其中所述核酸進一步包括如SEQ ID NO6中所示的序列。
14.根據(jù)權利要求13所述的組合物，其中所述漢坦病毒屬病毒是SEOV。
15.根據(jù)權利要求14所述的組合物，其中所述核酸是如SEQ IDNO1中所示的pWRG/SEO-M。
16.根據(jù)權利要求13所述的組合物，其中所述漢坦病毒屬病毒是HTNV。
17.根據(jù)權利要求16所述的組合物，其中所述核酸是如SEQ IDNO7中所示的pWRG/HTN-M(x)。
18.根據(jù)權利要求13所述的組合物，其中所述漢坦病毒屬病毒是ANDV。
19.根據(jù)權利要求18所述的組合物，其中所述核酸是如SEQ IDNO8中所示的pWRG/AND-M。
20.根據(jù)權利要求11所述的組合物，其中所述核酸包括兩種漢坦病毒屬病毒的M區(qū)段。
21.根據(jù)權利要求20所述的組合物，其中所述兩種漢坦病毒屬病毒是HTNV和ANDV。
22.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中所述核酸是如SEQ IDNO9中所示的pWRG/HA-M。
23.一種在哺乳動物中誘導抗?jié)h坦病毒屬病毒感染的保護性免疫反應的方法，包括在體內(nèi)促進權利要求11所述的組合物進入哺乳動物表皮細胞，以便所述核酸能表達。
24.一種在哺乳動物中誘導抗SEOV，HTNV，DOBV感染的保護性免疫反應的方法，包括在體內(nèi)促進權利要求15所述的組合物進入哺乳動物表皮細胞，以便所述核酸能表達。
25.一種在哺乳動物中誘導抗HTNV，SEOV，以及DOBV感染的保護性免疫反應的方法，包括在體內(nèi)促進權利要求17所述的組合物進入哺乳動物表皮細胞，以便所述核酸能表達。
26.一種在哺乳動物中誘導抗ANDV，SNV，以及BCCV感染的保護性免疫反應的方法，包括在體內(nèi)促進權利要求19所述的組合物進入哺乳動物表皮細胞，以便所述核酸能表達。
27.一種在哺乳動物中誘導抗HTNV，SEOV，DOBV，ANDV，SNV，以及BCCV感染的保護性免疫反應的方法，包括在體內(nèi)促進權利要求22所述的組合物進入哺乳動物表皮細胞，以便所述核酸能表達。
28.一種抗SEOV，DOBV，以及HTNV感染的疫苗，所述疫苗包括權利要求15所述的組合物。
29.一種抗SEOV，DOBV，以及HTNV感染的疫苗，所述疫苗包括權利要求17所述的組合物。
30.一種抗ANDV，SNV，以及BCCV感染的疫苗，所述疫苗包括權利要求19所述的組合物。
31.一種抗SEOV，HTNV，DOBV，ANDV，SNV，以及BCCV感染的疫苗，所述疫苗包括權利要求22所述的組合物。
32.一種防止多于一種HFRS漢坦病毒屬病毒感染的多價疫苗，包括組合物，所述組合物含有惰性粒子，在所述惰性粒子上包被了核酸，所述核酸含有兩種或多種不同漢坦病毒屬病毒的M區(qū)段，每個M區(qū)段編碼來自各自漢坦病毒屬病毒的G1和G2，并且可操作地連接在啟動子上，這些啟動子在哺乳動物細胞中有活性。
33.根據(jù)權利要求32所述的多價疫苗，其中所述漢坦病毒屬病毒選自SEOV，PUUV，HTNV和DOBV。
34.一種防止多于一種HFRS漢坦病毒屬病毒感染的多價疫苗，包括組合物，所述組合物含有兩種或多種惰性粒子，每種惰性粒子上包被了核酸，所述核酸含有HFRS相關漢坦病毒屬病毒的M區(qū)段，所述M區(qū)段編碼G1和G2蛋白，并且可操作地連接在啟動子上，這些啟動子在哺乳動物細胞中有活性，其中所述M區(qū)段選自不同的漢坦病毒屬病毒。
35.根據(jù)權利要求34所述的多價疫苗，其中所述漢坦病毒屬病毒選自HTNV，DOBV，PUUV和SEOV。
36.一種防止多于一種HPS漢坦病毒屬病毒感染的多價疫苗，包括組合物，所述組合物含有惰性粒子，在所述惰性粒子上包被了核酸，所述核酸含有兩種或多種不同HPS相關漢坦病毒屬病毒的M區(qū)段，每個M區(qū)段編碼來自各自漢坦病毒屬病毒的G1和G2，并且可操作地連接在啟動子上，這些啟動子在哺乳動物細胞中有活性。
37.根據(jù)權利要求36所述的多價疫苗，其中所述漢坦病毒屬病毒選自ANDV，SNV，以及BCCV。
38.一種防止多于一種HPS漢坦病毒屬病毒感染的多價疫苗，包括組合物，所述組合物含有兩種或多種惰性粒子，在每種惰性粒子包被了核酸，所述核酸含有HPS相關漢坦病毒屬病毒的M區(qū)段，所述M區(qū)段編碼G1和G2蛋白，并且可操作地連接在啟動子上，這些啟動子在哺乳動物細胞中有活性，其中所述M區(qū)段選自不同漢坦病毒屬病毒。
39.根據(jù)權利要求38所述的多價疫苗，其中所述漢坦病毒屬病毒選自ANDV，SNV，以及BCCV。
40.一種防止多于一種HFRS和HPS漢坦病毒屬病毒感染的多價疫苗，包括組合物，所述組合物含有兩種或多種惰性粒子，在每種惰性粒子上包被了核酸，所述核酸含有漢坦病毒屬病毒的M區(qū)段，所述M區(qū)段編碼G1和G2蛋白，并且可操作地連接在啟動子上，這些啟動子在哺乳動物細胞中有活性，其中所述M區(qū)段選自不同漢坦病毒屬病毒，這些漢坦病毒屬病毒包括至少一種HPS相關漢坦病毒屬病毒和至少一種HFRS相關漢坦病毒屬病毒。
41.根據(jù)權利要求40所述的多價疫苗，其中所述漢坦病毒屬病毒選自ANDV，HTNV，以及SEOV。
42.一種防止多于一種HFRS和HPS漢坦病毒屬病毒感染的多價疫苗，包括組合物，所述組合物含有惰性粒子，所述惰性粒子上包被了兩種或多種核酸，每個核酸含有漢坦病毒屬病毒的M區(qū)段，所述M區(qū)段編碼G1和G2蛋白，并且可操作地連接在啟動子上，這些啟動子在哺乳動物細胞中有活性，其中所述M區(qū)段選自不同漢坦病毒屬病毒，這些漢坦病毒屬病毒包括至少一種HPS相關漢坦病毒屬病毒和至少一種HFRS相關漢坦病毒屬病毒。
43.根據(jù)權利要求42所述的多價疫苗，其中所述漢坦病毒屬病毒選自ANDV，HTNV，以及SEOV。
44.一種組合物，含有一群受接種者的多克隆抗體，受接種者接種了DNA疫苗，該疫苗含有能表達漢坦病毒屬病毒M基因區(qū)段的質(zhì)粒。
45.根據(jù)權利要求44所述的組合物，其中所述的漢坦病毒屬病毒選自漢城病毒，多布拉伐病毒，普馬拉病毒，漢坦病毒，辛諾柏病毒，黑渠港病毒，長沼病毒，紐約病毒，安地斯病毒和Laguna Negra病毒。
46.根據(jù)權利要求44所述的組合物，其中所述疫苗含有pWRG/SEO-M。
47.根據(jù)權利要求44所述的組合物，其中所述疫苗含有pWRG/HTN-M(x)。
48.根據(jù)權利要求44所述的組合物，其中所述疫苗含有pWRG/AND-M。
49.根據(jù)權利要求44所述的組合物，其中所述疫苗含有pWRG/HA-M。
50.根據(jù)權利要求44所述的組合物，其中所述組合物能在供試者體內(nèi)抑制漢坦病毒屬病毒感染。
51.根據(jù)權利要求50所述的組合物，其中所述供試者是哺乳動物。
51.根據(jù)權利要求44所述的組合物，其中當所述組合物在感染漢坦病毒屬病毒后施用給供試者時，能改善漢坦病毒屬病毒感染癥狀。
52.根據(jù)權利要求51所述的組合物，其中所述供試者是哺乳動物。
53.根據(jù)權利要求44所述的組合物，其中所述多克隆抗體在體外能中和漢坦病毒屬病毒。
54.一種改善漢坦病毒屬病毒感染癥狀的治療用組合物，包括權利要求44所述的組合物，以及可藥用的賦形劑。
55.一種抗?jié)h坦病毒屬病毒感染的被動疫苗，包括權利要求44所述的組合物。
56.一種抗?jié)h坦病毒屬病毒的組合物，包括來自接種了DNA疫苗的受接種者的多克隆抗體和可藥用的載體，所述DNA疫苗包括漢坦病毒屬病毒M區(qū)段，所述多克隆抗體的數(shù)量足以抑制漢坦病毒屬病毒感染。
57.一種治療漢坦病毒屬病毒感染的方法，包括給需要這種治療的患者使用有效量的權利要求54所述的組合物。
58.一種檢測漢坦病毒屬病毒感染的方法，包括將疑似感染漢坦病毒屬病毒的供試者樣品和權利要求44所述的抗體接觸，以及通過檢測漢坦病毒屬病毒抗原及其特異抗體之間形成的復合物的存在與否來確定是否存在漢坦病毒屬病毒感染。
59.一種診斷漢坦病毒屬病毒感染的方法，包括下列步驟(i)將疑似感染漢坦病毒屬病毒的個體的樣品和權利要求44所述的組合物接觸，并且(ii)通過檢測漢坦病毒屬病毒抗原及其特異抗體之間形成的復合物的存在與否來確定是否存在漢坦病毒屬病毒感染。
60.一種漢坦病毒屬病毒感染診斷試劑盒，包括權利要求44所述的組合物和助劑，所述助劑適合用于檢測樣品中是否存在漢坦病毒屬病毒抗原。
全文摘要
本申請介紹的是抗HFRS－和HPS－相關漢坦病毒的保護性DNA疫苗。疫苗的構建是將表示中間(M)序列(編碼G1和G2糖蛋白)的cDNA亞克隆到DNA表達載體pWRG7077中。接種有M構建體的動物產(chǎn)生中和抗體反應。被動轉(zhuǎn)移試驗顯示，攻擊后4或5天注射接種動物的血清可以保護動物免受致命疾病的傷害。
文檔編號A61K39/42GK1650013SQ03806701
公開日2005年8月3日 申請日期2003年3月21日 優(yōu)先權日2002年3月22日
發(fā)明者杰伊·W·胡珀, 康尼·S·施馬爾約翰, 馬克斯·卡斯特 申請人:美國傳染性疾病軍醫(yī)研究所