專利名稱：嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原冠狀病毒rna干擾制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)的系列RNA干擾制劑，具體涉及利用轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)抑制或干擾SARS冠狀病毒的RNA干擾制劑。
核糖核酸干擾(RNA Interference，以下也簡稱RNAi)，也稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(Post-transcriptional gene silencing，以下簡稱PTGS)，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種生物抵御病毒感染的機(jī)制。在發(fā)生基因沉默的細(xì)胞中大多存在特定長度的小分子RNA(21～25nt)，PTGS導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)RNA的特異性降解，不同生物的PTGS相關(guān)基因及產(chǎn)物具有很高的相似性，基因沉默能夠在細(xì)胞間傳播并能以表型遺傳的方式傳遞給下一代等。是一種抵抗外來核酸(如冠狀病毒和轉(zhuǎn)座子)入侵的共同的防御機(jī)制1-19。
目前，已經(jīng)有一些科學(xué)家將轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)機(jī)制應(yīng)用于抗肝炎病毒、癌癥和艾滋病毒新藥的研究和開發(fā)中。采用的方法是，首先人工合成和病毒核糖核酸具有相應(yīng)序列的大片段雙鏈核糖核酸(dsRNA)或脫氧核糖核酸(dsDNA)，或者小片段雙鏈核糖核酸(smallinterfering RNA，siRNA)或脫氧核糖核酸(small interfering DNA，siDNA)，然后將這些大小片段(20-4000bp)的雙鏈核糖核酸引入靶細(xì)胞。這些dsRNA，dsDNA，siRNA或siDNA會(huì)誘發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，將在靶細(xì)胞內(nèi)合成的病毒核糖核酸分解成碎片，從而達(dá)到預(yù)防和消滅病毒的作用。從事和艾滋病的預(yù)防和治療。
本發(fā)明提供了可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，以抑制或干擾SARS冠狀病毒RNA復(fù)制，以及抑制或干擾SARS冠狀病毒蛋白質(zhì)合成的制劑，這些制劑中含有和SARS冠狀病毒遺傳物質(zhì)相適應(yīng)的RNA或DNA(dsRNA，dsDNA，siRNA或siDNA)及其衍生物。
所述SARS冠狀病毒RNA復(fù)制具體指合成依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)；所述SARS冠狀病毒蛋白質(zhì)包括SARS冠狀病毒包裝蛋白、SARS冠狀病毒刺突糖蛋白、SARS冠狀病毒膜蛋白，以及SARS冠狀病毒其它蛋白。
所述可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制抑制或干擾SARS冠狀病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)合成的RNA或DNA及其衍生物的序列為SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.19～SEQ ID NO.80所示的66個(gè)RNA/DNA序列，以及用SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.80作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA(dsRNA或dsDNA)；所述可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制抑制或干擾SARS冠狀病毒包裝蛋白合成的RNA或DNA及其衍生物的序列為SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.8所示的4個(gè)RNA/DNA序列，以及用SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.86作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA(dsRNA或dsDNA)；所述可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制抑制或干擾SARS冠狀病毒刺突糖蛋白合成的RNA或DNA及其衍生物的序列為SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示的2個(gè)RNA/DNA序列，以及用SEQ ID NO.87～SEQ ID NO.98作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA(dsRNA或dsDNA)；所述可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制抑制或干擾SARS冠狀病毒膜蛋白合成的RNA或DNA及其衍生物的序列為SEQ ID NO.1 1～SEQ ID NO.12所示的2個(gè)RNA/DNA序列，以及用SEQID NO.99～SEQ ID NO.102作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA(dsRNA或dsDNA)；所述可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制抑制或干擾SARS冠狀病毒其它蛋白合成的RNA或DNA及其衍生物的序列為SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18所示的6個(gè)RNA/DNA序列，以及用SEQ ID NO.103～SEQ ID NO.116作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA(dsRNA或dsDNA)；所述制劑可包括以上一種或多種上述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.80所示序列的RNA或DNA，以及用SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.116作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA(dsRNA或dsDNA)。
上述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.80所示序列的RNA或DNA，以及用SEQ ID NO.19～SEQID NO.116作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA(dsRNA或dsDNA)的制備方法的制備方法包括嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原體冠狀病毒收集和處理，嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原體冠狀病毒cDNA的構(gòu)建，長鏈DNA的制備，雙鏈dsRNA的制備，短鏈RNA或DNA的合成。
將本發(fā)明提供的上述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.80所示序列的RNA或DNA，以及用SEQID NO.19～SEQ ID NO.116作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA(dsRNA或dsDNA)的其中一種或多種組合，與藥物可接受的載體及輔劑配合，可制備出預(yù)防和治療SARS的藥物。如將這些RNA或DNA溶解于薩斯耐TM滴眼液輔劑、噴鼻劑輔劑、口腔噴霧劑輔劑，可制成相應(yīng)的藥物制劑。發(fā)明詳述1長鏈DNA的制備1.1 SARS冠狀病毒的培養(yǎng)和RNA分離SARS冠狀病毒取自確診病人的糞便，培養(yǎng)所用細(xì)胞株Vero E6購自ATCC(American TypeCulture Collection)。將細(xì)胞接種于含有10％牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基(2mM L-glutamine，1mMSodium Pyruvate，0.1mM nonessential amino acids，1.Sg/L sodium bicarbonate)，在37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×104/毫升時(shí)，接種SARS冠狀病毒。繼續(xù)培養(yǎng)大約7天，每2天換一次培養(yǎng)液。在接種后第48小時(shí)即可觀察到病毒感染的跡象。
取10毫升被病毒感染的Vero E6細(xì)胞(106cells/mL)離心沉淀細(xì)胞，用1ml培養(yǎng)液洗滌后將細(xì)胞重懸浮于0.2mL，加入1mL TRIZOL Reagent(Life Technology)在15-30℃保溫5-10分鐘，再加入0.2mL氯仿輕柔振搖15秒鐘，然后在15-30℃保溫2-5分鐘，在2-8℃12,000xg離心15分鐘，取上清液并移入一個(gè)新的1.5mL離心管中，加入0.5mL異丙醇在15-30℃保溫5-10分鐘，在2-8℃12,000xg離心5-10分鐘，棄上清液，沉淀用1mL 75％乙醇洗滌，在2-8℃7,500xg離心5分鐘，棄上清液，沉淀干燥10-15分鐘，加入無Rnase的水在55-60℃保溫10-30分鐘，使RNA充分溶解。1.2 cDNA的合成在小試管中加入總RNA 0.1-5μg，oligo(dT)185μg，去離子水(nuclease free)至110μl，70℃水浴保溫5分鐘，冰浴冷卻，以序加5X反應(yīng)試劑40μl，10mM 4 dNTP 20μl(1.0mM終濃度)，RNase抑制劑200u，去離子水(nuclease free)至190μl，在37℃保溫5分鐘，加入400單位的反轉(zhuǎn)錄酶，在37℃保溫60分鐘，70℃保溫10分鐘，冰浴保存，此為初反應(yīng)物。
在滅菌的0.5ml離心管中依次加入45μl初反應(yīng)物；20μl 10×緩沖液，8μl dNTP混合物，114μl蒸餾水，2μl RNA酶H(1.5U/μl)，11μl脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶I(9.0U/μl)，混勻后16℃孵育2.5h。反應(yīng)結(jié)束后加入23μl dNTP混合物和2μl Pfu DNA聚合酶(2.5U/μl)，72℃孵育30min，以補(bǔ)平cDNA末端。反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法，得到cDNA沉淀，再重懸浮于TE緩沖液中，按10μl/管分裝，-20℃保存。1.3 PCR(Polymerase Chain Reaction，多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))制備DNA模板采用熱啟動(dòng)PCR(Hot Start PCR)，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，和即時(shí)PCR(Real Time PCR)等幾種PCR方法。1.4 SARS冠狀病毒核酸引物的設(shè)計(jì)及序列本發(fā)明中所有PCR所使用的引物，都是根據(jù)已經(jīng)公布的SARS冠狀病毒RNA序列(Genbank Accession AY274119.3)設(shè)計(jì)的。下面是SARS冠狀病毒幾種相關(guān)蛋白質(zhì)基因有關(guān)PCR所使用引物的有關(guān)資料。這些基因包括SARS冠狀病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)，SARS冠狀病毒包裝蛋白，SARS冠狀病毒刺突糖蛋白，SARS冠狀病毒膜蛋白，以及SARS冠狀病毒其它蛋白。1.4.1 SARS冠狀病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)正向引物(共31個(gè)，序列號(hào)SEQ ID NO.19～49)名稱 序列基因組排列RdRP001 5’-ctacccaggaaaagccaacca-3’1-21RdRP002 5’-cttaggtgacgagcttggcac-3’681-701RdRP003 5’-attggacctgagcatagtgtt-3’1381-1401RdRP004 5’-agtggttgtctaatcttttgg-3’ 2081-2101RdRP005 5’-tgagcttgatgaacgtgttga-3’ 2781-2801RdRP006 5’-ggagggtcttgtttgctttct-3’ 3481-3501RdRP007 5’-gctaagactgctcttaagaaa-3’ 4201-4221RdRP008 5’-tggacaacactaatctccaca-3’ 4901-4921RdRP009 5’-gtctgcaccacctgctgagta-3’ 5601-5621RdRP010 5’-tgtgaaagtcaacaacccacc-3’ 6301-6321RdRP011 5’-ctaacgttactactatggatt-3’ 7001-7021RdRP012 5’-ggctggtcaaaagacctatga-3’ 7701-7721RdRP013 5’-agactaacttgtgctacaact-3’ 8401-8421RdRP014 5’-gagtagtaacaacttttgatg-3’ 9101-9121RdRP015 5’-tcttgctctatataacaagta-3’ 9801-9821RdRP016 5’-gaaggtaaattctatggtcca-3’ 10501-10521RdRP017 5’-tgtctggttataggcttaagg-3’ 11201-11221RdRP018 5’-tttcgagaagatggtttctct-3’ 11901-11921RdRP019 5’-aataatgaactgagtccagta-3’ 12601-12621RdRP020 5’-gaatgtggaaaggttatggct-3’ 13301-13321RdRP021 5’-tggtacgatttcggtgatttc-3’ 14001-14021RdRP022 5’-ctatcagtgattatgactatt-3’ 14701-14721RdRP023 5’-cggtgatgctacaactgctta-3’ 15401-15421RdRP024 5’-tgggaacctgagttttatgag-3’ 16101-16121RdRP025 5’-acaagttgaatgttggtgatt-3’ 16801-16821RdRP026 5’-cactgtgagtgctttagttta-3’ 17501-17521RdRP027 5’-gttcgtgcgtggattggcttt-3’ 18201-18221RdRP028 5’-ttgtgaagtctgcattgcttg-3’ 18901-18921RdRP029 5’-acctgtttccatcattaataa-3’ 19601-19621RdRP030 5’-aagcgctcacaagattcacca-3’ 20301-20321RdRP031 5’-atgactctaaagaagggtttt-3’ 21001-21021反向引物(共31個(gè)，序列號(hào)SEQ ID NO.50～80)名稱序列 基因組排列RdRp032 5’-cagtgccaagctcgtcaccta-3’ 703-683RdRp033 5’-gcaacactatgctgaggtcca-3’ 1403-1383RdRp034 5’-gcccaaaagattagacaacc-3’2102-2183RdRp035 5’-tgtaacacgttcatcaagct-3’2802-2783RdRp036 5’-ccagaaagcaaacaagaccct-3’ 3503-3483RdRp037 5’-catttcttaagagcagtctta-3 ’ 4223-4203RdRp038 5’-tgtgtggagattatgttgtc-3’4922-4903RdRp039 5’-tatactcagcaggtggtgcag-3’ 5623-5603RdRp040 5’-gaggtgggttgttgactttca-3’ 6323-6303RdRp041 5’-gaaatccatagtagtaacgtt-3’ 7023-7003RdRp042 5’-tctgataggtcttttgaccag-3’ 7723-7703RdRp043 5’-ctagttgtagcacaagttagt-3’ 8423-8403RdRp044 5’-agcatcaaaagttgttactac-3’ 9123-9103RdRp045 5’-tgtacttgttatatagagcaa-3’ 9823-9803RdRp046 5’-aatggaccatagaatttacct-3’ 10523-10503RdRp047 5’-atccttaagcctataaccaga-3’ 11223-11203RdRp048 5’-aaagagaaaccatcttctcga-3’ 11923-11903RdRp049 5’-gctactggactcagttcatta-3’ 12623-12603RdRp050 5’-agagccataacctttccacat-3’ 13323-13303RdRp051 5’-acgaaatcaccgaaatcgtac-3’ 14023-14003RdRp052 5’-ataatagtcataatcactgat-3’ 14723-14703RdRp053 5’-cataagcagttgtagcatcac-3’ 15423-15403RdRp054 5’-ttctaatgtattgtaaataca-3’ 16123-16103RdRp055 5’-gtaatcaccaacattcaactt-3’ 16823-16803RdRp056 5’-cataaactaaagcactcacag-3’ 17523-17503RdRp057 5’-tcaaagccaatccacgcacga-3’ 18223-18203RdRp058 5’-agtaagcaatgcagacttcac-3’ 18923-18903RdRp059 5’-cattcttaatgatggaaacag-3 ’ 19623-19603RdRp060 5’-agtggtgaatcttgtgagcgc-3’ 20323-20303RdRp061 5’-gaaaaacccttctttagagtc-3’21023-21003RdRp062 5’-gcaccggtcaaggtcacttc-3’ 21492-214731.4.2 SARS冠狀病毒包裝蛋白正向引物(共3個(gè)，序列號(hào)SEQ ID NO.81～83)名稱 序列 基因組排列N001 5’-acgaacaaattaaaatgtctg-3’28091-29011N002 5’-acagattgaaccagcttgaga-3’28781-28801N003 5’-agtggagcttctgctgattca-3’29341-29361反向引物(共3個(gè)，序列號(hào)SEQ ID NO.84～86)名稱 序列基因組排列N004 5’-gttgttgttggcgtttaccag-3’28831-28811N005 5’-tgaatcagcagaagctccact-3’29341-29361N006 5’-tttgtcattctcctaagaagc-3’29715-296951.4.3 SARS冠狀病毒刺突糖蛋白正向引物(共6個(gè)，序列號(hào)SEQ ID NO.87～92)名稱序列 基因組排列S001 5’-attatttcttactctcactg-3’ 21491-21511S002 5’-tacagccttttcacctgctca-3’22181-22201S003 5’-ttaattgttattggccattaa-3’22891-22911S004 5’-tacagaagtaatgcctgtttc-3’23591-23601S005 5’-acacacttgttaaacaactta-3’24301-24321S006 5’-aatgaggtcgctaaaaattta-3’24981-25001反向引物(共6個(gè)，序列號(hào)SEQ ID NO.93～98)名稱 序列 基因組排列S007 5’-ctgacgtgccccaaatgtctt-3’22221-22201S008 5’-ccataatcatttaatggccaa-3’22921-22901S009 5’-atattacaatctacggaggtt-3’23641-23621S010 5’-gcacacttgaaattgcaccaa-3’24331-24311S011 5’-catattttcccaattcttgaa-3’25041-25021S012 5’-agagtaaaaaatctcataaac-3’25281-252611.4.4 SARS冠狀病毒膜蛋白正向引物(共2個(gè)，序列號(hào)SEQ ID NO.99～100)名稱 序列基因組排列M001 5’-ttattctgtttggaactttaa-3’26351-26371M002 5’-attgtgaccagaccgctcatg-3’26761-26961反向引物(共2個(gè)，序列號(hào)SEQ ID NO.101～102)名稱序列 基因組排列M003 5’-gatcacagcaccaatgacaag-3’26811-26791M004 5’-atatctctgctattgtaacct-3’28011-270811.4.5 SARS冠狀病毒其它蛋白正向引物(共7個(gè)，序列號(hào)SEQ ID NO.103～109)名稱序列 基因組排列UPA001 5’-gtttatgagattttttactct-3’25261-25281UPA002 5’-ctaccaaattggtggttattc-3’25801-25821UPB001 5’-caaatccaagaacccattact-3’25651-25671E001 5’-tgatgagccgacgacgactac-3’26041-26061UPC001 5’-gttgacttccaggttacaata-3’27071-27091UPD001 5’-aaaattattctcttcctgaca-3’27261-27281UPE001 5’-gtaccttcatgaaggtcacca-3’28031-28051反向引物(共7個(gè)，序列號(hào)SEQ ID NO.110～116)名稱序列 基因組排列UPA003 5’-tagtctttaacacctgagtgc-3’25851-25831UPA004 5’-tttaagctcctcaacggtaat-3’26421-26401UPB002 5’-ggatggctagtgtgactagca-3’26201-26181E002 5’-gtctgccatgataagcaatgt-3’26391-26371UPC002 5’-caagatgtaaatacaatcaat-3’27301-27281UPD002 5’-aggaatagcagaaaggctaaa-3’27681-27661UPE002 5’-ttctgggccagttcctaggta-3’28461-284411.5 PCR產(chǎn)物情況以上述正反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，所得的產(chǎn)品，即經(jīng)PCR合成的DNA的長度，在200--4000個(gè)堿基對(duì)之間。以編碼SARS冠狀病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)的基因?yàn)槔?，如果以RdRP001和RdRP032作為正反向引物，則PCR產(chǎn)品DNA的長度為700個(gè)堿基對(duì)；如果以RdRP001和RdRP033作為正反向引物，則PCR產(chǎn)品DNA的長度為1400個(gè)堿基對(duì)；如果以RdRP001和RdRP034作為正反向引物，則PCR產(chǎn)品DNA的長度為2100個(gè)堿基對(duì)；如果以RdRP005和RdRP040作為正反向引物，則PCR產(chǎn)品DNA的長度為3700個(gè)堿基對(duì)；以此類推。
PCR反應(yīng)混合液(100μl)包括5μl cDNA(5ng/μl)，10μl 10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液，正向引物(25pmol/μl)4μl，反向引物(25pmol/μl)4μl，dNTPs(dTTP，dATP，dGTP，dCTP，各2.5mM)8μl，Tag多聚酶0.5μl(2單位)，加水至100μl。
PCR反應(yīng)條件①94℃變性2分鐘，②94℃1分鐘，③合適的粘和溫度(AnnealingTemperature，每種引物所要求的粘和溫度不一樣，一般在50-60℃)30秒，④72℃2-15分鐘(依每個(gè)PCR反應(yīng)的要求決定)，⑤重復(fù)②-④30-45次(依每個(gè)PCR反應(yīng)的要求決定)，⑥72℃10-30分鐘(依每個(gè)PCR反應(yīng)的要求決定)。
PCR產(chǎn)物DNA提取PCR反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法提取DNA，再重懸浮于TE緩沖液中，按10再重懸浮于TE緩沖液中，按10再重懸浮于TE緩沖液中，按10μl/管分裝，-20℃保存。2雙鏈dsRNA的制備2.1小批量制備小試管中加入下列反應(yīng)液5倍反應(yīng)緩沖液20μl，PCR合成的DNA30μl，NTPs(TTP，ATP，GTP，CTP，各2.5mM)20μl，T7或T3多聚酶40單位(Stratagene產(chǎn)品)，加水至100μl。
上述試劑混合好后，在37℃保溫4小時(shí)或過夜，反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法提取RNA，再重懸浮于薩斯耐輔劑中備用。2.2大批量制備試管中加入下列反應(yīng)液5倍反應(yīng)緩沖液200μl，PCR合成的DNA300μl，NTPs(TTP，ATP，GTP，CTP，各2.5mM)200μl，T7或T3多聚酶400單位(Stratagene產(chǎn)品)，加水至1000μl。上述試劑混合好后，在37℃保溫4小時(shí)或過夜，反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法提取RNA，再重懸浮于薩斯耐輔劑中備用。
合成的雙鏈RNA干擾制劑的種類和數(shù)量如下表所示，共222個(gè)不同長度和序列的雙鏈RNA。

3小片段RNA(siRNA)或DNA(siDNA)的干擾制劑的制備3.1制備方法小片段RNA(siRNA)或DNA(siDNA)利用DNA合成儀進(jìn)行合成。RNA干擾制劑及其衍生物的序列的設(shè)計(jì)取材來自于SARS冠狀病毒RNA(Genbank Accession AY274119.3)。單鏈的RNA或DNA在自然情況下可以形成所謂的“發(fā)夾”型的結(jié)構(gòu)，組成20-24個(gè)堿基對(duì)的結(jié)構(gòu)。而二條具候補(bǔ)性的單鏈在合成以后，可以通過“退火”的方法使他們形成雙鏈(見附圖2)。
合成后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法提取RNA或DNA，再重懸浮于薩斯耐輔劑中備用。3.2本發(fā)明中小片段RNA(siRNA)或DNA(siDNA)及其衍生物的序列為3.2.1抑制或干擾冠狀病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)合成的小片段RNA(序列號(hào)SEQ ID NO.1～4，名稱SARSTOP101-104)3.2.1.1 SARSTOP1015’TCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTTCAAGAGACACAGATTTTAAAGTTCGTTTAGA3’3.2.1.2 SARSTOP1025’TAAACGAACTTTAAAATCTGTTTCAAGGAGAACAGATTTTAAAGTTCGTTTA 3’3.2.1.3 SARSTOP1035’ACAAAGTGCTTAATGAAAAGTTTCAAGGAGAACTTTTCATTAAGAACTTTGT 3’3.2.1.4 SARSTOP1045’TAACTAAATACACAATGGCTGTTCAAGGAGACAGCCATTGTGTATTTAGTTA 3’需要說明的是，在第一部分中所提到的用于合成SARS冠狀病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)的PCR的引物，也可以通過“退火”的方法使他們形成雙鏈，從而組合成可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制抑制或干擾冠狀病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)合成的RNA干擾制劑。它們的組合排列如下表所述。


3.2.2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制抑制或干擾冠狀病毒包裝蛋白合成的小片段RNA干擾制劑及其衍生物(序列號(hào)SEQ ID NO.～8，名稱SARSTOP201-204)3.2.2.1 SARSTOP2015’TAAATAAACGAACAAATTAAATTCAAGGAGATTTAATTTGTTCGTTTATTTA 3’3.2.2.2 SARSTOP2025’TAATGGACCCCAATCAAACCATTCAAGGAGATGGTTTGATTGGGGTCCATTA 3’3.2.2.3 SARSTOP2035’ATTCAACTGACAATAACCAGATTCAAGGAGATCTGGTTATTGTCAGTTGAAT 3’3.2.2.4 SARSTOP2045’ATTACATTTGGTGGACCCACATTCAAGGAGATGTGGGTCCACCAAATGTAAT 3’3.2.3可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制抑制或干擾冠狀病毒刺突糖蛋白合成的小片段RNA干擾制劑及其衍生物(序列號(hào)SEQ ID NO.9～10，名稱SARSTOP01-303)3.2.3.1 SARSTOP3015’CTTGTTAACAACTAAACGAACTTCAAGGAGAGTTCGTTTAGTTGTTAACAAG 3’3.2.3.2 SARSTOP3025’TTATTTTCTTATTATTTCTTATTCAAGGAGATAAGAAATAATAAGAAAATAA 3’3.2.4可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制抑制或干擾冠狀病毒膜蛋白合成的小片段RNA干擾制劑及其衍生物(序列號(hào)SEQ ID NO.11～12，名稱SARSTOP401-402)3.2.4.1 SARSTOP4015’TCTGGTCTAAACGAACTAACTTTCAAGGAGAAGTTAGTTCGTTTAGACCAGA 3’3.2.4.2 SARSTOP4025’TTTTTGTACATAATAAAGCTTTTCAAGGAGAAAGCTTTATTATGTACAAAAA 3’3.2.5可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制抑制或干擾冠狀病毒其它蛋白合成的小片段RNA干擾制劑及其衍生物(序列號(hào)SEQ ID NO.13～18，名稱SARSTOP501-506)3.2.5.1 SARSTOP5015’ACATTACACATAAACGAACTTTTCAAGGAGAAAGTTCGTTTATGTGTAATGT 3’3.2.5.2 SARSTOP5025’ATTTGTTTATGAGATTTTTTATTCAAGGAGATAAAAAATCTCATAAACAAAT 3’3.2.5.3 SARSTOP5035’TTGGAAACTATAAATTAAATATTCAAGGAGATATTTAATTTATAGTTTCCAA 3’3.2.5.4 SARSTOP5045’ATGTTTCATCTTGTTGACTTCTTCAAGGAGAGAAGTCAACAAGATGAAACAT 3’3.2.5.5 SARSTOP5055’TTAGATTATCCATAAAACGAATTCAAGGAGATTCGTTTTATGGATAATCTAA 3’3.2.5.6 SARSTOP5065’ATGAAAATTATTCTCTTCCTGTTCAAGGAGACAGGAAGAGAATAATTTTCAT 3’上述1-5中所述的序列，每個(gè)序列可以單獨(dú)使用，也可以和其它序列組合使用。3.3本發(fā)明中新的抑制或干擾冠狀病毒繁殖的小片段RNA干擾制劑及其衍生物的定義是以1-5中所述的抑制或干擾冠狀病毒繁殖的RNA干擾制劑及其衍生物為基本單元，將這些基本單元經(jīng)排列組合而形成的制劑及其衍生物。4輔劑本發(fā)明所用輔劑可以是任何藥物可接受的載體及輔劑。前述薩斯耐輔劑可從市場(chǎng)上購到，其組成為1)薩斯耐TM滴眼液輔劑0.9％氯化鈉，0.025％乙二胺四乙酸二鈉(Disodium EDTA)，0.00003％聚氨基丙基雙胍(Polyammopropyl Biguanide)，微量氯化鉀；
2)薩斯耐TM噴鼻劑輔劑0.05％Tetrahydrozoline Hydrochloride，(微量)，硼酸鈉(SodiumBorate)微量，氯化鈉微量，鹽酸苯甲烷銨Benzalkonium，Chloride(微量)；3)薩斯耐TM口腔噴霧劑輔劑2％安息香酸鈉(SodiumBenzoate)，0.25％硫酸月桂醇鈉(Sodium Lauryl Sulfate)，0.2％水楊酸鈉(Sodium Salicylate)，人造香精Altificial flacour(微量)，糖精鈉(Saccharin Sodium(微量)，重碳酸鈉(Sodium Bicarbonate(微量)，硼酸鈉(SodiumBorate)微量，山梨醇溶液(Sorbitol Solution微量)。5本發(fā)明中的RNA干擾制劑中輔劑對(duì)嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原冠狀病毒的作用5.1SARS冠狀病毒的培養(yǎng)培養(yǎng)所用細(xì)胞株Vero E6購自ATCC(American Type Culture Collection)。將細(xì)胞接種于含有10％牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基(2mM L-glutamine，1mM Sodium Pyruvate，0.1mM nonessentialamino acids，1.5g/L sodium bicarbonate)，在37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×104/毫升時(shí)，接種SARS冠狀病毒。繼續(xù)培養(yǎng)大約14天，每2天換一次培養(yǎng)液。5.2對(duì)照實(shí)驗(yàn)要檢驗(yàn)幾種薩斯耐的輔劑對(duì)SARS病毒的繁殖是否造成影響。
本實(shí)驗(yàn)涉及到四項(xiàng)不同的對(duì)照實(shí)驗(yàn)①如第一部分中對(duì)病毒的培養(yǎng)，即實(shí)驗(yàn)只涉及病毒和細(xì)胞兩個(gè)部分；②除了細(xì)胞外，不用病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染，而用薩斯耐的輔劑加入培養(yǎng)液中，觀察這些薩斯耐的輔劑對(duì)細(xì)胞生長的影響；③在第②項(xiàng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，即培養(yǎng)基中含有薩斯耐的輔劑的情況下，用病毒感染細(xì)胞，觀察這些薩斯耐的輔劑對(duì)病毒感染率的影響；④觀察這些薩斯耐的輔劑對(duì)已經(jīng)感染了病毒的細(xì)胞生長的影響，即當(dāng)病毒感染了細(xì)胞以后，再在培養(yǎng)液中加入薩斯耐的輔劑，然后觀察這些薩斯耐的輔劑對(duì)細(xì)胞生長和病毒感染率的影響。5.2.1對(duì)照實(shí)驗(yàn)1病毒的培養(yǎng)如上述。在感染后的第2天開始，將感染了病毒的細(xì)胞收集后，用戊二醛或甲醛固定，醋酸雙氧鈾(UranylAcetate)或磷鎢酸(Phoshotungstic Acid)負(fù)染，直接用電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有大量的冠狀病毒顆粒。同時(shí)用PCR檢測(cè)的方法(使用德國Artus-Biotech提供的試劑盒，操作方法見該公司提供的使用說明書)，檢測(cè)到SARS冠狀病毒特異的DNA片段，證明該感染細(xì)胞的病毒是SARS冠狀病毒。下表是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總結(jié)。結(jié)果表明，在接種72小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)的病毒數(shù)達(dá)到最多。 5.2.2對(duì)照實(shí)驗(yàn)2薩斯耐的輔劑對(duì)細(xì)胞生長的影響。
在細(xì)胞成長期間，在培養(yǎng)基中加入薩斯耐的輔劑，觀察薩斯耐的輔劑對(duì)細(xì)胞生長的影響。在培養(yǎng)基中接種Vero E6細(xì)胞后，在第5天于培養(yǎng)基中加入薩斯耐的輔劑。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)薩斯耐的輔劑的體積占培養(yǎng)基體積(V/V)的20％以下時(shí)，對(duì)細(xì)胞生長沒有影響；達(dá)到培養(yǎng)基總體積的40％(V/V)或以上時(shí)，會(huì)減緩細(xì)胞的生長，但并不破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。5.2.3對(duì)照實(shí)驗(yàn)3薩斯耐的輔劑對(duì)病毒感染率的影響。
在接種SARS病毒24小時(shí)前，加入10％(V/V)體積的薩斯耐的輔劑，然后觀察病毒感染率，并和未加薩斯耐的輔劑的培養(yǎng)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，10％體積的薩斯耐的輔劑的存在，對(duì)病毒感染率沒有影響。5.2.4對(duì)照實(shí)驗(yàn)4薩斯耐的輔劑對(duì)已經(jīng)感染了病毒的細(xì)胞生長的影響。
在病毒感染細(xì)胞后，于不同時(shí)間在培養(yǎng)基中加入10％(V/V)的薩斯耐的輔劑，觀察病毒感染率。實(shí)驗(yàn)表明，薩斯耐輔劑對(duì)病毒感染率沒有影響(見下表)。 6 RNA干擾制劑對(duì)嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原冠狀病毒感染細(xì)胞前、后的影響在確定薩斯耐輔劑中的其他成分對(duì)冠狀病毒感染細(xì)胞沒有影響的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步測(cè)定的不同組合的RNA或DNA的制劑對(duì)冠狀病毒感染細(xì)胞的影響。
實(shí)驗(yàn)分為二個(gè)獨(dú)立的部分
第一部分的實(shí)驗(yàn)是，在接種病毒之前24小時(shí)，于培養(yǎng)液中加入溶解于薩斯耐輔劑中的RNA或DNA的制劑，然后觀察RNA干擾制劑對(duì)嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原冠狀病毒感染細(xì)胞的影響。
第二部分的實(shí)驗(yàn)是，在接種病毒之后24小時(shí)，于培養(yǎng)液中加入溶解于薩斯耐輔劑中的RNA或DNA的制劑，然后觀察RNA干擾制劑對(duì)嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原冠狀病毒感染細(xì)胞的影響。每一部分的實(shí)驗(yàn)又分為三個(gè)部分①同一制劑在不同濃度下的作用；②不同制劑的組合在相同濃度下的作用；③不同制劑的組合在不同濃度下的作用。6.1 RNA或DNA制劑對(duì)SARS冠狀病毒感染細(xì)胞的影響(感染前)Vero E6細(xì)胞培養(yǎng)如前述。細(xì)胞接種于含有10％牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基(2mM L-glutamine，1mM Sodium Pyruvate，0.1mM nonessential amino acids，1.5g/L sodium bicarbonate)，在37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×104/毫升時(shí)，加入用薩斯耐輔劑配置的RNA或DNA制劑(培養(yǎng)液中RNA或DNA制劑的加入量分別為100ng，200ng，400ng，800ng，1.2μg)，對(duì)照加入薩斯耐輔劑，24小時(shí)后接種SARS冠狀病毒。
病毒培養(yǎng)如前述。取感染細(xì)胞的培養(yǎng)液，離心200rpm，10min，取上清液200ul，以50倍做系列稀釋，各相當(dāng)于滴度為5、25、125、625、3125和15625 TCID/ml(Tissue CultureInfective Dose)加入24孔培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)液至1ml，再加入1×104/ml Vero E6細(xì)胞懸液0.5ml(含有RNA或DNA制劑)，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞病變(Cytopathic Effect，CPE)。繼續(xù)培養(yǎng)大約7天，每2天換一次培養(yǎng)液。
電鏡觀察如前述。將感染了病毒的細(xì)胞收集后，用2％的戊二醛或甲醛固定，2％醋酸雙氧鈾(Uranyl Acetate)或磷鎢酸(Phoshotungstic Acid)負(fù)染，直接用電子顯微鏡觀察。RT-PCR檢測(cè)如前述(使用德國Artus-Biotech提供的試劑盒，操作方法見該公司提供的使用說明書)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果概述同一制劑在不同濃度下的對(duì)SARS冠狀病毒的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了有些制劑對(duì)病毒滴度沒有影響以外，有相當(dāng)數(shù)量的單一制劑在不同的濃度下有降低病毒滴度的顯著作用。而當(dāng)制劑中的RNA或DNA的長度增加時(shí)，效果比較明顯。電鏡和RT-PCR測(cè)定結(jié)果也證明了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體原因尚不清楚。不同制劑的組合物在相同濃度下的對(duì)SARS冠狀病毒的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同制劑的組合物在相同濃度下的對(duì)SARS冠狀病毒滴度的影響，比使用相同濃度的單一制劑要強(qiáng)烈和持久。不同制劑的組合物在不同濃度下的對(duì)SARS冠狀病毒的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同制劑的組合物在不同濃度下的對(duì)SARS冠狀病毒滴度的影響，比使用相同濃度的單一制劑要強(qiáng)烈和持久。6.2 RNA或DNA制劑對(duì)感染了SARS冠狀病毒細(xì)胞的影響(感染后)Vero E6細(xì)胞培養(yǎng)如前述。
病毒培養(yǎng)如前述。取感染細(xì)胞的培養(yǎng)液，離心200rpm，10min，取上清液200ul，以50倍做系列稀釋，各相當(dāng)于滴度為5、25、125、625、3125和15625 TCID/ml(Tissue CultureInfective Dose)加入24孔培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)液至1ml，再加入1×104/ml Vero E6細(xì)胞懸液0.5ml(含有RNA或DNA制劑)，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，24小時(shí)后加入用20μl薩斯耐輔劑配置的RNA或DNA制劑，對(duì)照加入20μl薩斯耐輔劑。定期觀察細(xì)胞病變(Cytopathic Effect，CPE)。繼續(xù)培養(yǎng)大約7天，每2天換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中RNA或DNA制劑的加入量分別為100ng，200ng，400ng，800ng，1.2μg。
電鏡觀察如前述。將感染了病毒的細(xì)胞收集后，用2％的戊二醛或甲醛固定，2％醋酸雙氧鈾(Uranyl Acetate)或磷鎢酸(Phoshotungstic Acid)負(fù)染，直接用電子顯微鏡觀察。
RT-PCR檢測(cè)如前述(使用德國Artus-Biotech提供的試劑盒，操作方法見該公司提供的使用說明書)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果概述實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)細(xì)胞感染了SARS病毒后，RNA或DNA干擾制劑仍然會(huì)對(duì)病毒的復(fù)制和病毒蛋白的合成產(chǎn)生明顯的抑制作用。同一制劑在不同濃度下的對(duì)已經(jīng)感染了SARS冠狀病毒細(xì)胞的作用基本上和第一部分的結(jié)果類似。除了有些制劑對(duì)病毒滴度沒有影響以外，有相當(dāng)數(shù)量的單一制劑在不同的濃度下有降低病毒滴度的顯著作用。而當(dāng)制劑中的RNA或DNA的長度增加時(shí)，效果比較明顯。電鏡和RT-PCR測(cè)定結(jié)果也證明了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體原因尚不清楚。不同制劑制劑的組合在相同濃度下的對(duì)已經(jīng)感染了SARS冠狀病毒細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同制劑的組合物在相同濃度下的對(duì)SARS冠狀病毒滴度的影響，比使用相同濃度的單一制劑要強(qiáng)烈和持久。不同制劑制劑的組合在不同濃度下的對(duì)已經(jīng)感染了SARS冠狀病毒細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同制劑的組合物在不同濃度下的對(duì)SARS冠狀病毒滴度的影響，比使用相同濃度的單一制劑要強(qiáng)烈和持久。
本發(fā)明提供的嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原體冠狀病毒病RNA干擾制劑，在嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原體冠狀病毒的診斷，嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥的預(yù)防和治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
呼吸道、消化道、生殖和泌尿系統(tǒng)的粘膜是多種病毒侵入人體的第一道關(guān)口，如果將該制劑制成藥物施用于人體的粘膜，就有可能從根本上切斷嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原體冠狀病毒襲擊人體途徑，從而達(dá)到預(yù)防的效果。優(yōu)點(diǎn)或效果本發(fā)明提供的干擾和抑制嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病源體冠狀病毒RNA復(fù)制，以及冠狀病毒蛋白質(zhì)合成的RNA干擾制劑，能夠用于SARS的診斷、預(yù)防、治療，效果明顯，開發(fā)周期短。具有以下四個(gè)特點(diǎn)1.具有特異性抗SARS冠狀病毒感染作用；2.運(yùn)用近年來分子生物學(xué)發(fā)展的新型技術(shù)—RNA干擾作用(RNAi)；3.治療方法簡單，無明顯毒副作用；4.適合于正常及高危人群預(yù)防，潛伏期病人的抗病毒治療。
表明可實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS病原體冠狀病毒RNA復(fù)制的抑制，或者實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS病原體冠狀病毒有關(guān)蛋白質(zhì)合成的抑制，或者同時(shí)抑制病毒的上述兩種功能，從而有希望達(dá)到預(yù)防、治療和緩解SARS病情的作用。
圖2是SEQ ID NO.1的幾種存在形式。
表明單鏈的RNA或DNA在自然情況下可以形成所謂的“發(fā)夾”型的結(jié)構(gòu)，組成20-24個(gè)堿基對(duì)的結(jié)構(gòu)。而二條具互補(bǔ)性的單鏈在合成以后，可以通過“退火”的方法使他們形成雙鏈。
實(shí)施例1SARS冠狀病毒的培養(yǎng)和RNA分離培養(yǎng)所用細(xì)胞株Vero E6購自ATCC(American Type Culture Collection)。將細(xì)胞接種于含有10％牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基(2mM L-glutamine，lmM Sodium Pyruvate，0.1mM nonessentialamino acids，1.5g/L sodiumbicarbonate)，在37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×104/毫升時(shí)，接種SARS冠狀病毒。繼續(xù)培養(yǎng)大約14天，每2天換一次培養(yǎng)液。定期觀察細(xì)胞病變(Cytopathic Effect，CPE)。
電鏡觀察如前述。將感染了病毒的細(xì)胞收集后，用2％的甲醛固定，2％醋酸雙氧鈾(UranylAcetate)負(fù)染，直接用電子顯微鏡觀察。RT-PCR檢測(cè)如前述(使用德國Artus-Biotech提供的試劑盒，操作方法見該公司提供的使用說明書)。結(jié)果都呈陽性反應(yīng)。
取10毫升被病毒感染的Vero E6細(xì)胞(106cells/mL)離心沉淀細(xì)胞，用1ml培養(yǎng)液洗滌后將細(xì)胞重懸浮于0.2mL，加入1mL TRIZOL Reagent(Life Technology)在15-30℃保溫5-10分鐘，再加入0.2mL氯仿輕柔振搖15秒鐘，然后在15-30℃保溫2-5分鐘，在2-8℃12,000xg離心15分鐘，取上清液并移入一個(gè)新的1.5mL離心管中，加入0.5mL異丙醇在15-30℃保溫5-10分鐘，在2-8℃12,000xg離心5-10分鐘，棄上清液，沉淀用1mL 75％乙醇洗滌，在2-8℃7,500xg離心5分鐘，棄上清液，沉淀干燥10-15分鐘，加入無Rnase的水在55-60℃保溫10-30分鐘，使RNA充分溶解。cDNA的合成在小試管中加入總RNA 0.1-5μg，oligo(dT)185μg，去離子水(nuclease free)至110μl，70℃水浴保溫5分鐘，冰浴冷卻，以序加5X反應(yīng)試劑40μl，10mM4dNTP20μl(1.0mM終濃度)，RNase抑制劑200u，去離子水(nuclease free)至190μl，在37℃保溫5分鐘，加入400單位的反轉(zhuǎn)錄酶，在37℃保溫60分鐘，70℃保溫10分鐘，冰浴保存，此為初反應(yīng)物。
在滅菌的0.5ml離心管中依次加入45μl初反應(yīng)物；20μl 10×緩沖液，8μl dNTP混合物，114μl蒸餾水，2μl RNA酶H(1.5U/μl)，11μl脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶I(9.0U/μl)，混勻后16℃孵育2.5h。反應(yīng)結(jié)束后加入23μl dNTP混合物和2μl Pfu DNA聚合酶(2.5U/μl)，72℃孵育30min，以補(bǔ)平cDNA末端。反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法，得到cDNA沉淀，再重懸浮于TE緩沖液中，按10μl/管分裝，-20℃保存。
用正向引物RdRP001和反向引物RdRp032制備DNA模板采用熱啟動(dòng)PCR(Hot StartPCR)。正向引物RdRP001的序列為5’-ctacccaggaaaagccaacca-3’，而反向引物RdRp032的序列為5’-cagtgccaagctcgtcaccta-3’。PCR反應(yīng)混合液(100μl)包括5μl cDNA(5ng/μl)，10μl10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液，正向引物(25pmol/μl)4μ1，反向引物(25pmol/μl)4μl，dNTPs(dTTP，dATP，dGTP，dCTP，各2.5mM)8μl，Tag多聚酶0.5μl(2單位)，加水至100μl。PCR反應(yīng)條件①94℃變性2分鐘，②94℃1分鐘，③55℃30秒，④72℃2分鐘，⑤重復(fù)②-④35次，⑥72℃10分鐘。DNA提取PCR反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法提取DNA，再重懸浮于TE緩沖液中，按10再重懸浮于TE緩沖液中，按10再重懸浮于TE緩沖液中，按10μl/管分裝，-20℃保存。所得DNA用常規(guī)電泳方法檢測(cè)，并用DNA測(cè)序的方法證明該段700個(gè)堿基對(duì)的DNA是屬于我們所感興趣的DNA片段。雙鏈dsRNA的制備小試管中加入下列反應(yīng)液5倍反應(yīng)緩沖液20μl，PCR合成的DNA30μl，NTPs(TTP，ATP，GTP，CTP，各2.5mM)20μl，T7多聚酶40單位(Stratagene產(chǎn)品)，加水至100μl。上述試劑混合好后，在37℃保溫4小時(shí)或過夜，反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法提取RNA，再重懸浮于薩斯耐滴眼液輔劑中備用。該RNA制劑在不同濃度下的對(duì)SARS冠狀病毒的作用Vero E6細(xì)胞培養(yǎng)如前述。細(xì)胞接種于含有10％牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基(2mM L-glutamine，1mM Sodium Pyrnvate，0.1mM nonessential amino acids，1.5g/L sodium bicarbonate)，在37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×104/毫升時(shí)，加入用薩斯耐滴眼液輔劑配置的RNA制劑(培養(yǎng)液中RNA或DNA制劑的加入量分別為100ng，200ng，400ng，800ng，1.2μg)，對(duì)照加入薩斯耐滴眼液輔劑，24小時(shí)后接種SARS冠狀病毒。病毒培養(yǎng)如前述。取感染細(xì)胞的培養(yǎng)液，離心200rpm，10min，取上清液200ul，以50倍做系列稀釋，各相當(dāng)于滴度為5、25、125、625、3125和15625 TCID/ml(Tissue Culture InfectiveDose)加入24孔培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)液至1ml，再加入1×104/ml Vero E6細(xì)胞懸液0.5ml(含有RNA制劑)，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞病變(Cytopathic Effect，CPE)。繼續(xù)培養(yǎng)大約14天，每2天換一次培養(yǎng)液。電鏡觀察如前述。將感染了病毒的細(xì)胞收集后，用2％的甲醛固定，2％醋酸雙氧鈾(UranylAcetate)負(fù)染，直接用電子顯微鏡觀察。RT-PCR檢測(cè)如前述(使用德國Artus-Biotech提供的試劑盒，操作方法見該公司提供的使用說明書)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表(病毒滴度平均值)所示，制劑在不同的濃度下有降低病毒滴度的顯著作用，病毒滴度在第5日開始下降，9日時(shí)病毒分離為陰性，對(duì)照組病毒分離一直為陽性。電鏡和RT-PCR測(cè)定結(jié)果也證明了這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)施例2短鏈DNA的合成用ABI3900型DNA合成儀(Applied Biosystems Inc.產(chǎn)品)合成互補(bǔ)的兩條短鏈DNA，或合成一條DNA，但其前后序列中含有互補(bǔ)的序列(如附

圖1所示)。合成的DNA短鏈如下表所示


互補(bǔ)短鏈DNA的制備將合成的2條互補(bǔ)DNA短鏈溶解于薩斯耐噴鼻液輔劑中，混合后在攝氏90度保溫5分鐘，退火至室溫，即形成互補(bǔ)短鏈DNA。前后序列中含有互補(bǔ)序列的短鏈DNA也同樣處理。短鏈DNA的組合將合成的互補(bǔ)短鏈DNA或含有互補(bǔ)序列的短鏈DNA按4個(gè)一組組合成6組(如下表所述)。每個(gè)短鏈DNA在培養(yǎng)基中的量為200ng，總量為800ng。

Vero E6細(xì)胞培養(yǎng)如前述。病毒培養(yǎng)如前述。取感染細(xì)胞的培養(yǎng)液，離心200rpm，10min，取上清液200ul，以50倍做系列稀釋，各相當(dāng)于滴度為5、25、125、625、3125和15625 TCID/ml(Tissue Culture InfectiveDose)加入24孔培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)液至1ml，再加入1×104/ml Vero E6細(xì)胞懸液0.5ml(含有RNA或DNA制劑)，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，24小時(shí)后加入用20μl薩斯耐滴鼻液輔劑配置的短鏈DNA組合制劑，對(duì)照加入20μl薩斯耐輔劑。定期觀察細(xì)胞病變(CytopathicEffect，CPE)。繼續(xù)培養(yǎng)12天，每2天換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中DNA制劑量為800ng。電鏡觀察如前述。將感染了病毒的細(xì)胞收集后，用2％的戊二醛固定，2％磷鎢酸(Phoshotungstic Acid)負(fù)染，直接用電子顯微鏡觀察。RT-PCR檢測(cè)如前述(使用德國Artus-Biotech提供的試劑盒，操作方法見該公司提供的使用說明書)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表(病毒滴度平均值)所示，制劑在相同的濃度下有降低病毒滴度的作用，病毒滴度在第6日開始下降，10日時(shí)病毒分離為陰性，對(duì)照組病毒分離一直為陽性。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，不同組合的制劑對(duì)病毒滴度的影響也是有差異的。 實(shí)施例3SARS冠狀病毒的培養(yǎng)和RNA分離培養(yǎng)所用細(xì)胞株Vero E6接種于含有10％牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基(2mM L-glutamine，1mMSodium Pyruvate，0.1mM nonessential amino acids，1.5g/L sodium bicarbonate)，在37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×104/毫升時(shí)，接種SARS冠狀病毒。繼續(xù)培養(yǎng)大約14天，每2天換一次培養(yǎng)液。定期觀察細(xì)胞病變(Cytopathic Effect，CPE)。
電鏡觀察如前述。將感染了病毒的細(xì)胞收集后，用2％的甲醛固定，2％醋酸雙氧鈾(UranylAcetate)負(fù)染，直接用電子顯微鏡觀察。RT-PCR檢測(cè)如前述(使用德國Artus-Biotech提供的試劑盒，操作方法見該公司提供的使用說明書)。結(jié)果都呈陽性反應(yīng)。
取10毫升被病毒感染的Vero E6細(xì)胞(106cells/mL)離心沉淀細(xì)胞，用1ml培養(yǎng)液洗滌后將細(xì)胞重懸浮于0.2mL，加入1mL TRIZOL Reagent(Life Technology)在15-30℃保溫5-10分鐘，再加入0.2mL氯仿輕柔振搖15秒鐘，然后在15-30℃保溫2-5分鐘，在2-8℃12,000xg離心15分鐘，取上清液并移入一個(gè)新的1.5mL離心管中，加入0.5mL異丙醇在15-30℃保溫5-10分鐘，在2-8℃12,000xg離心5-10分鐘，棄上清液，沉淀用1mL 75％乙醇洗滌，在2-8℃7,500xg離心5分鐘，棄上清液，沉淀干燥10-15分鐘，加入無Rnase的水在55-60℃保溫10-30分鐘，使RNA充分溶解。cDNA的合成在小試管中加入總RNA 0.1-5μg，oligo(dT)185μg，去離子水(nuclease free)至110μl，70℃水浴保溫5分鐘，冰浴冷卻，以序加5X反應(yīng)試劑40μl，10mM 4 dNTP 20μl(1.0mM終濃度)，RNase抑制劑200u，去離子水(nuclease free)至190μl，在37℃保溫5分鐘，加入400單位的反轉(zhuǎn)錄酶，在37℃保溫60分鐘，70℃保溫10分鐘，冰浴保存，此為初反應(yīng)物。
在滅菌的0.5ml離心管中依次加入45μl初反應(yīng)物；20μl 10×緩沖液，8μl dNTP混合物，114μl蒸餾水，2μlRNA酶H(1.5U/μl)，11μl脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶I(9.0U/μl)，混勻后16℃孵育2.5h。反應(yīng)結(jié)束后加入23μl dNTP混合物和2μl Pfu DNA聚合酶(2.5U/μl)，72℃孵育30min，以補(bǔ)平cDNA末端。反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法，得到cDNA沉淀，再重懸浮于TE緩沖液中，按10μl/管分裝，-20℃保存。制備DNA模板采用熱啟動(dòng)PCR(Hot Start PCR)。共制備5個(gè)不同的DNA模板，所使用的正向引物和反向引物的組合為RdRP006和RdRp036，S001和S008，M001和M003，E001和E002，UPA001和UPA004(它們的序列如上所述)。PCR反應(yīng)混合液(100μl)包括5μl cDNA(5ng/μl)，10μl 10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液，正向引物(25pmol/μl)4μ1，反向引物(25pmol/μl)4μl，dNTPs(dTTP，dATP，dGTP，dCTP，各2.5mM)8μl，Tag多聚酶0.5μl(2單位)，加水至100μl。PCR反應(yīng)條件①94℃變性2分鐘，②94℃1分鐘，③50℃30秒，④72℃5分鐘，⑤重復(fù)②-④40次，⑥72℃10分鐘。DNA提取PCR反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法提取DNA，再重懸浮于TE緩沖液中，按10再重懸浮于TE緩沖液中，按10再重懸浮于TE緩沖液中，按10μl/管分裝，-20℃保存。所得DNA用常規(guī)電泳方法檢測(cè)，并用DNA測(cè)序的方法證實(shí)這些DNA的確是屬于我們所感興趣的DNA片段。雙鏈dsRNA的制備小試管中加入下列反應(yīng)液5倍反應(yīng)緩沖液20μl，PCR合成的DNA30μl，NTPs(TTP，ATP，GTP，CTP，各2.5mM)20μl，T7多聚酶40單位(Stratagene產(chǎn)品)，加水至100μl。上述試劑混合好后，在37℃保溫4小時(shí)或過夜，反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法提取RNA，再重懸浮于薩斯耐噴口液輔劑中，然后將這5種雙鏈dsRNA按同等比例混合備用。雙鏈dsRNA制劑混合液在不同濃度下的對(duì)SARS冠狀病毒的作用
Vero E6細(xì)胞培養(yǎng)如前述。細(xì)胞接種于含有10％牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基(2mM L-glutamine，1mM Sodium Pyruvate，0.1mM nonessential amino acids，1.5g/L sodium bicarbonate)，在37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×104/毫升時(shí)，加入用薩斯耐噴口液輔劑配置的雙鏈dsRNA制劑混合液(培養(yǎng)液中制劑的加入量分別為100ng，200ng，400ng，800ng，1.2μg)，對(duì)照加入薩斯耐噴口液輔劑，24小時(shí)后接種SARS冠狀病毒。病毒培養(yǎng)如前述。取感染細(xì)胞的培養(yǎng)液，離心200rpm，10min，取上清液200ul，以50倍做系列稀釋，各相當(dāng)于滴度為5、25、125、625、3125和15625 TCID/ml(Tissue Culture InfectiveDose)加入24孔培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)液至1ml，再加入1×104/ml Vero E6細(xì)胞懸液0.5ml(含有RNA制劑)，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞病變(Cytopathic Effect，CPE)。繼續(xù)培養(yǎng)大約14天，每2天換一次培養(yǎng)液。電鏡觀察如前述。將感染了病毒的細(xì)胞收集后，用2％的甲醛固定，2％醋酸雙氧鈾(Uranyl Acetate)負(fù)染，直接用電子顯微鏡觀察。RT-PCR檢測(cè)如前述(使用德國Artus-Biotech提供的試劑盒，操作方法見該公司提供的使用說明書)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表(病毒滴度平均值)所示，雙鏈dsRNA制劑混合液在不同的濃度下有降低病毒滴度的顯著作用，病毒滴度在第4日開始下降，10日時(shí)病毒分離為陰性，對(duì)照組病毒分離一直為陽性。電鏡和RT-PCR測(cè)定結(jié)果也證明了這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 實(shí)施例4短鏈DNA的合成用ABI3900型DNA合成儀(Applied Biosystems Inc.產(chǎn)品)合成互補(bǔ)的兩條短鏈DNA，或合成一條DNA，但其前后序列中含有互補(bǔ)的序列(如附圖1所示)。合成的DNA短鏈為SARSTOP101，SARSTOP202，RdRP029和RdRp059。將合成的2條互補(bǔ)DNA短鏈溶解于薩斯耐噴鼻液輔劑中，混合后在攝氏90度保溫5分鐘，退火至室溫，即形成互補(bǔ)短鏈DNA。前后序列中含有互補(bǔ)序列的短鏈DNA也同樣處理。制備DNA模板采用熱啟動(dòng)PCR(Hot Start PCR)。共制備2個(gè)不同的DNA模板，所使用的正向引物和反向引物的組合為UPC001和UPD002，N001和N004(它們的序列如上所述)。PCR反應(yīng)混合液(100μl)包括5μl cDNA(5ng/μl)，10μl 10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液，正向引物(25pmol/μl)4μl，反向引物(25pmol/μl)4μl，dNTPs(dNTP，dATP，dGTP，dCTP，各2.5mM)8μl，Tag多聚酶0.5μl(2單位)，加水至100μl。PCR反應(yīng)條件①94℃變性2分鐘，②94℃1分鐘，③53℃30秒，④72℃5分鐘，⑤重復(fù)②-④36次，⑥72℃10分鐘。DNA提取PCR反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法提取DNA，再重懸浮于TE緩沖液中，按10再重懸浮于TE緩沖液中，按10再重懸浮于TE緩沖液中，按10μl/管分裝，-20℃保存。所得DNA用常規(guī)電泳方法檢測(cè)，并用DNA測(cè)序的方法證實(shí)這些DNA的確是屬于我們所感興趣的DNA片段。雙鏈dsRNA的制備小試管中加入下列反應(yīng)液5倍反應(yīng)緩沖液20μl，PCR合成的DNA30μl，NTPs(TTP，ATP，GTP，CTP，各2.5mM)20μl，T7多聚酶40單位(Stratagene產(chǎn)品)，加水至100μl。上述試劑混合好后，在37℃保溫4小時(shí)或過夜，反應(yīng)結(jié)束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法提取RNA，再重懸浮于薩斯耐噴鼻液輔劑中。然后將這2種雙鏈dsRNA和上述3種合成的DNA短鏈(SARSTOP101，SARSTOP202，RdRP029和RdRp059)按同等比例混合備用。制劑混合液在不同濃度下的對(duì)SARS冠狀病毒的作用Vero E6細(xì)胞培養(yǎng)如前述。細(xì)胞接種于含有10％牛血清的Eagle’s培養(yǎng)基(2mM L-glutamine，1mM Sodium Pyruvate，0.1mM nonessential amino acids，1.5g/L sodium bicarbonate)，在37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×104/毫升時(shí)，加入用薩斯耐噴鼻液輔劑配置的制劑混合液(培養(yǎng)液中制劑的加入量分別為100ng，200ng，400ng，800ng，1.2μg)，對(duì)照加入薩斯耐噴鼻液輔劑，24小時(shí)后接種SARS冠狀病毒。病毒培養(yǎng)如前述。取感染細(xì)胞的培養(yǎng)液，離心200rpm，10min，取上清液200ul，以50倍做系列稀釋，各相當(dāng)于滴度為5、25、125、625、3125和15625 TCID/ml(Tissue Culture Infective Dose)加入24孔培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)液至1ml，再加入1×104/ml Vero E6細(xì)胞懸液0.5ml(含有RNA制劑)，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞病變(Cytopathic Effect，CPE)。繼續(xù)培養(yǎng)大約14天，每2天換一次培養(yǎng)液。電鏡觀察如前述。將感染了病毒的細(xì)胞收集后，用2％的甲醛固定，2％醋酸雙氧鈾(Uranyl Acetate)負(fù)染，直接用電子顯微鏡觀察。RT-PCR檢測(cè)如前述(使用德國Artus-Biotech提供的試劑盒，操作方法見該公司提供的使用說明書)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該制劑混合液在不同的濃度下有降低病毒滴度的顯著作用。以400ng濃度的制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果為例，如下表(病毒滴度平均值)所示，病毒滴度在第3日開始下降，10日時(shí)病毒分離為陰性，對(duì)照組病毒分離一直為陽性。 結(jié)論A.本發(fā)明中利用RNA干擾的原理設(shè)計(jì)和制備的RNA干擾制劑，包括dsDNA，dsRNA，siDNA和siRNA經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明可分別，或者同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS病原體冠狀病毒RNA復(fù)制，及冠狀病毒有關(guān)蛋白質(zhì)合成進(jìn)行抑制的兩種功能。B.本發(fā)明中所用于配制RNA干擾制劑的輔劑成分，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明對(duì)SARS病原體冠狀病毒RNA復(fù)制，及冠狀病毒有關(guān)蛋白質(zhì)合成沒有抑制的作用。C.本發(fā)明提供的嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原體冠狀病毒病RNA干擾制劑，在嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原體冠狀病毒的診斷，嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥的預(yù)防和治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
序列表<110>天津環(huán)球中加生物科技有限公司<120>嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原冠狀病毒RNA干擾制劑<160>116<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>57<212>RNA<213>人工序列<400>1tctaaacgaa ctttaaaatc tgtgttcaag agacacagat tttaaagttc gtttaga 57<210>2<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>2taaacgaact ttaaaatctg tttcaaggag aacagatttt aaagttcgtt ta 52<210>3<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>3acaaagtgct taatgaaaag tttcaaggag aacttttcat taagaacttt gt 52<210>4<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>4taactaaata cacaatggct gttcaaggag acagccattg tgtatttagt ta 52<210>5<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>5taaataaacg aacaaattaa attcaaggag atttaatttg ttcgtttatt ta 52<210>6<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>6taatggaccc caatcaaacc attcaaggag atggtttgat tggggtccat ta 52<210>7<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>7attcaactga caataaccag attcaaggag atctggttat tgtcagttga at 52<210>8<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>8attacatttg gtggacccac attcaaggag atgtgggtcc accaaatgta at 52<210>9<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>9cttgttaaca actaaacgaa cttcaaggag agttcgttta gttgttaaca ag 52<210>10<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>10ttattttctt attatttctt attcaaggag ataagaaata ataagaaaat aa 52<210>11<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>11tctggtctaa acgaactaac tttcaaggag aagttagttc gtttagacca ga 52<210>12<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>12tttttgtaca taataaagct tttcaaggag aaagctttat tatgtacaaa aa 52<210>13<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>13acattacaca taaacgaact tttcaaggag aaagttcgtt tatgtgtaat gt 52<210>14<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>14atttgtttat gagatttttt attcaaggag ataaaaaatc tcataaacaa at 52<210>15<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>15ttggaaacta taaattaaat attcaaggag atatttaatt tatagtttcc aa 52<210>16<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>16atgtttcatc ttgttgactt cttcaaggag agaagtcaac aagatgaaac at 52<210>17<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>17ttagattatc cataaaacga attcaaggag attcgtttta tggataatct aa 52<210>18<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>18atgaaaatta ttctcttcct gttcaaggag acaggaagag aataattttc at 52<210>19<211>21<212>RNA<213>冠狀病毒(SARS)<400>19ctacccagga aaagccaacc 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1.SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.80所示序列的RNA或DNA。
2.長鏈DNA和RNA，其特征是用SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.116作為引物，經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成。
3.權(quán)利要求1或2所述的DNA和RNA的制備方法，包括如下操作嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原體冠狀病毒的收集和處理；嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原體冠狀病毒cDNA的構(gòu)建；長鏈DNA的制備；雙鏈dsRNA的制備；短鏈RNA或DNA的合成。
4.權(quán)利要求3所述的DNA和RNA的制備方法，其中在長鏈DNA的制備中采用PCR方法制備DNA模板，所述PCR方法中所使用的引物為SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.116所示序列。
5.用權(quán)利要求1或2所述的DNA和RNA制備嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原冠狀病毒RNA干擾藥物制劑的用途。
6.權(quán)利要求5所述的用途，其中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.80所示的66個(gè)RNA/DNA序列，以及用SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.80作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA，用于制備抑制或干擾冠狀病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)合成的藥物制劑；SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示的4個(gè)RNA/DNA序列，以及用SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.86作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA，用于制備抑制或干擾冠狀病毒包裝蛋白合成的藥物制劑；SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示的2個(gè)RNA/DNA序列，以及用SEQ ID NO.87～SEQ ID NO.98作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA，用于制備抑制或干擾冠狀病毒刺突糖蛋白合成的藥物制劑；SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示的2個(gè)RNA/DNA序列，以及用SEQ ID NO.99～SEQ IDNO.102作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA，用于制備抑制或干擾冠狀病毒膜蛋白合成的藥物制劑；SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18所示的6個(gè)RNA/DNA序列，以及用SEQ ID NO.103～SEQ IDNO.116作為引物經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA，用于制備抑制或干擾冠狀病毒其它蛋白合成的藥物制劑。
7.權(quán)利要求5所述的用途，其中所述制劑中可包括一種或多種所述的RNA或DNA。
全文摘要
本發(fā)明運(yùn)用核糖核酸干擾(RNAi)的分子生物學(xué)原理，研制了系列嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病原冠狀病毒RNA干擾制劑。所述制劑中含有多組與冠狀病毒基因物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的長鏈RNA或DNA(dsRNA or dsDNA)，及小片段RNA或DNA(siRNA or siDNA)。所述RNA或DNA包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.80(siRNA or siDNA)，以及包括由SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.116經(jīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA體外合成的方法所合成的長鏈DNA和RNA(dsRNA or dsDNA)。本發(fā)明的制劑能夠用于SARS的診斷、治療，效果明顯，開發(fā)周期短，并適合于正常及高危人群預(yù)防。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1458281SQ0313762
公開日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日
發(fā)明者仵小南, 吳和 申請(qǐng)人:天津環(huán)球中加生物科技有限公司