專(zhuān)利名稱(chēng)：馬抗嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(sars)血清的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)藥物，特別涉及馬抗SARS血清。
背景技術(shù)：
SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥/急性呼吸窘迫征)是一種急性呼吸道傳染病，主要通過(guò)近距離空氣飛沫和密切接觸傳播，起病急、傳播快，病死率高，目前尚無(wú)有效治療藥物。SARS病人都是既往身體健康、年齡25～70歲的成年病人。也有一部分疑診SARS兒童(≤15歲)病例報(bào)告。潛伏期通常為2～7天，但可以長(zhǎng)達(dá)10天。該病開(kāi)始時(shí)一般先出現(xiàn)發(fā)熱(＞38℃)前驅(qū)癥狀，發(fā)熱通常為高熱，有時(shí)伴有畏寒和寒顫，有時(shí)還伴有其他癥狀包括頭痛、疲乏和肌痛。發(fā)病期間，一些病人有輕度的呼吸系統(tǒng)癥狀。典型病例通常沒(méi)有皮疹和神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)或胃腸道表現(xiàn)，但有一些病人報(bào)告，在出現(xiàn)發(fā)熱前驅(qū)癥狀期間發(fā)生了腹瀉。3～7天后，病人開(kāi)始進(jìn)入下呼吸道受累期，開(kāi)始出現(xiàn)干咳或呼吸困難，可能伴有或發(fā)展為低氧血癥。10％～20％病人的呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)非常嚴(yán)重，需要插管和機(jī)械通氣。在出現(xiàn)發(fā)熱前驅(qū)癥狀期間和整個(gè)病程中，胸部X線檢查可能正常。但是，大量病人在呼吸系統(tǒng)受累期間出現(xiàn)下列特征性表現(xiàn)早期局灶性滲出，發(fā)展為更彌漫的斑片狀間質(zhì)性滲出。
中國(guó)香港的研究人員Peiris等報(bào)告了(Lancet 2003 3619365)50例SARS病人的臨床表現(xiàn)和病毒學(xué)研究結(jié)果。強(qiáng)有力的證據(jù)表明，新冠狀病毒可能是SARS的致病原因。研究者分析了50例SARS病人的病史記錄和微生物學(xué)研究結(jié)果，這50例病人是來(lái)自5個(gè)以上的獨(dú)立的流行病學(xué)聯(lián)系的傳播聚集群。他們通過(guò)胸部X線檢查、鼻咽部抽吸物和血清標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢查來(lái)調(diào)查病原體。對(duì)這些病人的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與其他呼吸道疾病患者的微生物學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，發(fā)熱、寒戰(zhàn)、肌痛和咳嗽是最常見(jiàn)的癥狀。與胸部X線變化相比，呼吸道癥狀和聽(tīng)診結(jié)果不成比例地顯著輕微。年齡較大、淋巴細(xì)胞減少、肝功能異常與嚴(yán)重疾病相關(guān)。2例病人分離出一種屬于冠狀病毒屬的病毒。采用這種病毒的特異性血清學(xué)和PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))試驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果顯示，50例SARS病人中的45例，而對(duì)照組中無(wú)一例，有該病毒感染的證據(jù)。
研究人員采用經(jīng)典的病毒培養(yǎng)法、血清學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代分子基因技術(shù)，描述和確定了香港50例SARS病人的發(fā)病原因。他們報(bào)告的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是分析了來(lái)自對(duì)照病人的標(biāo)本，這一點(diǎn)也是確定因果關(guān)系的一個(gè)重要手段。在40例患有其他呼吸系統(tǒng)疾病的病人中，無(wú)一例病人的呼吸道標(biāo)本含有冠狀病毒的RNA，在來(lái)自獻(xiàn)血者的200份血清標(biāo)本中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)抗這種新冠狀病毒的抗體。
研究者稱(chēng)沒(méi)有恒定地識(shí)別出經(jīng)典的呼吸道的或細(xì)菌性呼吸道病原體。然而，從符合SARS定義的病人標(biāo)本中分離出了一種新的冠狀病毒。在接種了咽拭子標(biāo)本的Vero E6細(xì)胞中以顯微鏡檢查看到了細(xì)胞病理學(xué)特征。培養(yǎng)細(xì)胞的電子顯微鏡檢查揭示了具有冠狀病毒特征的超微結(jié)構(gòu)特征。免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色展示了與I組冠狀病毒多克隆抗體的反應(yīng)性。為了用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR(擴(kuò)增)冠狀病毒聚合酶基因的片段，他們?cè)O(shè)計(jì)并使用了冠狀病毒共有(序列)的引物，以取得一段序列，該序列清楚地識(shí)別了上述分離物是一種獨(dú)特的冠狀病毒，它與以往測(cè)過(guò)序的冠狀病毒只有較遠(yuǎn)的關(guān)系。研究者用特異的診斷用RT-PCR引物，在12例不同地點(diǎn)的病人中識(shí)別出了數(shù)個(gè)相同的核苷酸序列，這一結(jié)果與從一個(gè)點(diǎn)發(fā)源的暴發(fā)一致。以此新的冠狀病毒制備的間接熒光抗體試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法已被用于證實(shí)病毒特異性血清學(xué)反應(yīng)。
2003年4月16日，世界衛(wèi)生組織在日內(nèi)瓦宣布，經(jīng)過(guò)全球科研人員的通力合作，終于正式確認(rèn)冠狀病毒的一個(gè)變種是引起非典型肺炎的病原體。來(lái)自中國(guó)、美國(guó)、中國(guó)香港和新加坡等10個(gè)國(guó)家和地區(qū)的13個(gè)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家在當(dāng)日舉行的會(huì)議上，一致認(rèn)定了變種冠狀病毒的作用。
SARS病毒是一種嶄新的冠狀病毒，而非某種已知冠狀病毒的近期變種。SARS病毒基因組研究表明在不同國(guó)家發(fā)生的SARS病毒沒(méi)有顯著的變異。SARS病毒存活時(shí)間比以往估計(jì)的長(zhǎng)，SARS病毒在病人的糞便和尿中可存活數(shù)天。
冠狀病毒是RNA病毒。冠狀病毒屬Coronavirus是冠狀病毒科Coronaviridae中的一個(gè)屬，其成員包括三個(gè)組。第一組有犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、人冠狀病毒229E、可傳播胃腸炎病毒等；第二組有牛冠狀病毒、人冠狀病毒0C43、小鼠肝炎病毒等；第三組包括傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒和大鼠冠狀病毒。以上病毒中，人冠狀病毒引起人類(lèi)普通感冒。冠狀病毒病毒顆粒多為圓形、橢圓形或輕度多形性，直徑為60-220nm，表面有多個(gè)稀疏的棒狀突起，長(zhǎng)約20nm。電鏡負(fù)染照片示病毒顆粒形似王冠，因而得名。病毒顆粒內(nèi)有由病毒RNA和蛋白質(zhì)組成的核心，外面有脂質(zhì)雙層膜。此病毒對(duì)理化因素的抵抗力不強(qiáng)，56℃10分鐘可消除其感染性；pH3、用乙醚、氯仿或紫外線處理，均可使其滅活。
對(duì)冠狀病毒感染，尚無(wú)特異性抗病毒療法，而且關(guān)于冠狀病毒感染抗病毒治療的文獻(xiàn)報(bào)告也很少。SARS推薦的治療方案為密切觀察病情變化(多數(shù)病人在發(fā)病后14天內(nèi)都可能屬于進(jìn)展期)，預(yù)防和治療繼發(fā)細(xì)菌感染，抗病毒治療，有嚴(yán)重中毒癥狀或達(dá)到重癥病例標(biāo)準(zhǔn)者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，中藥輔助治療。已有報(bào)道稱(chēng)對(duì)重癥病人可使用已康復(fù)非典型肺炎病人的血清進(jìn)行治療。研究者對(duì)21例非典患者不同時(shí)期的血清研究，已將非典保護(hù)性抗體鎖定在IgG抗體上。對(duì)21例非典型患者采集了不同時(shí)期的序列血清，發(fā)現(xiàn)在非典病人發(fā)病一周內(nèi)未產(chǎn)生IgG型抗體，IgG型抗體亦可在10-14天時(shí)檢測(cè)到，但滴度較低，60天時(shí)達(dá)到高峰，90天時(shí)仍維持在高水平。在調(diào)查的21例非典患者中，恢復(fù)期病人100％發(fā)現(xiàn)有IgG型抗體。感染SARS病毒病人如果在首兩星期內(nèi)使用血清，病人的住院時(shí)間和發(fā)燒期會(huì)較短，死亡率會(huì)較低。香港醫(yī)師已經(jīng)用SARS痊愈患者的血清成功治療了一些患者。但在目前的治療中，仍以利巴韋林和類(lèi)固醇等藥物作為抗病毒的首選。因?yàn)檠逍栌煽祻?fù)者捐出，且會(huì)使初痊愈病人感覺(jué)難受，并還得選擇合適的血型配合才行。
病毒是一種抗原，能引起特異性免疫應(yīng)答。病毒抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生多種特異性抗體(IgG、IgM、IgA)?？贵w與病毒結(jié)合后能使病毒失去感染性，抗體對(duì)病毒有中和作用，這種抗體稱(chēng)為中和抗體。病毒感染后細(xì)胞表面抗原變化也能被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，引起特異性免接應(yīng)答。在病毒血癥期間抗體如能充分發(fā)揮作用，則可防止嚴(yán)重臨床癥狀產(chǎn)生。特異性抗體主要作用于游離病毒，亦可作用于受染靶細(xì)胞。IgG抗體對(duì)游離病毒的作用為病毒中和作用，其機(jī)制是抗體與病毒包膜或衣殼結(jié)合后，覆蓋住病毒吸附位點(diǎn)，病毒不能吸附和穿入易感細(xì)胞，喪失感染力，從而阻止病毒對(duì)易感靶細(xì)胞的吸附。血清中最主要的中和抗體是1gG。
免疫預(yù)防是目前人類(lèi)對(duì)付病毒感染最根本的措施。對(duì)付急性病毒感染，球蛋白制劑是最常用的免疫血清。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的有抗狂犬病血清、抗蛇毒血清?？箍袢⊙逵煽袢《久庖唏R的血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑。用于配合狂犬病疫苗對(duì)被瘋動(dòng)物嚴(yán)重咬傷如頭、臉、頸部或多部位咬傷者進(jìn)行預(yù)防注射，被瘋動(dòng)物咬傷后注射愈早愈好，咬后48小時(shí)之內(nèi)注射，可減少發(fā)病率?？股叨狙逵蒙叨久庖唏R匹后由馬血漿精制而成，供治療蛇咬傷者之用，其中蝮蛇抗血清對(duì)竹葉青和烙鐵頭咬傷亦有療效，咬傷后，應(yīng)迅速注射，愈早愈好。此類(lèi)球蛋白制劑還有破傷風(fēng)抗毒素、白喉抗毒素、氣性壞疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗炭疽血清。用于相應(yīng)疾病的治療及預(yù)防。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥，也稱(chēng)急性呼吸窘迫征)的治療和預(yù)防的馬抗嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)血清，它是由組織培養(yǎng)SARS滅活病毒抗原免疫的馬血漿經(jīng)胃酶消化后，用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方案1.制備免疫血漿用組織培養(yǎng)SARS滅活病毒免疫馬匹，經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)免疫、超免疫后，采血，分離血漿
2.精制提純將制得的免疫血漿按3倍稀釋后經(jīng)胃酶消化、加溫變性、超濾等常規(guī)制備工藝，濃縮至蛋白含量為3-15％，效價(jià)含量為40-300IU/ml。
3.分包裝本發(fā)明可有液體及凍干兩種類(lèi)型，規(guī)格為治療用400IU/瓶和預(yù)防用80IU/瓶。凍干制品分裝后應(yīng)立即在-30℃以下進(jìn)行冷凍。干燥時(shí)間可根據(jù)水含量來(lái)決定。干燥完畢后進(jìn)行真空封口。
本發(fā)明馬抗嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)血清的制備方法包括a.用組織培養(yǎng)SARS滅活病毒免疫馬匹，經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)免疫、超免疫后采血，分離血漿；將分離的免疫血漿按照2-4倍稀釋量倒入盛有注射用水的大罐中，慢速攪拌均勻，調(diào)溫至29-31℃，用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.2-3.6之間，加入溶化胃酶，加入0.2％甲苯(ml/ml)，慢速攪拌，消化一小時(shí)；取消化液20ml，測(cè)pH值，快速攪拌，加15％(W/V)硫酸銨；用2mol/L NaOH調(diào)至pH至4.8-5.6，并測(cè)量消化液溫度，用流通蒸汽通過(guò)消化罐夾層加溫至57-59℃并保溫30分鐘；通過(guò)大罐夾層迅速降溫過(guò)濾分離，取清液，棄沉淀；b.上述清液，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，慢速攪拌，每100ml加硫酸銨19-21克，過(guò)濾分離，取沉淀，棄清液；c.將適量注射用水貯于大罐內(nèi)，備用，測(cè)量水溫不得高于30℃，將搗碎的沉淀稱(chēng)量，置大罐內(nèi)稀釋至蛋白含量約2％(g/ml)，慢速攪拌，使沉淀完全溶解，并測(cè)量溫度不得高于30℃，加10％(g/ml)明礬溶液，最終含量為0.8-1.2％(g/ml)，取樣，測(cè)pH值，用2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.7-7.9，慢速攪拌，吸附一小時(shí)，過(guò)濾分離，取清液，棄沉淀；d.將上述清液混合通過(guò)超過(guò)濾裝置，用3萬(wàn)分子量的濾膜，進(jìn)行濃縮，至體積為十分之一時(shí)稀釋5至8倍使硫酸銨含量在0.1％(g/ml)以下；將濃縮液加入注射用水，調(diào)整固體總量不超過(guò)20％(g/ml)；加氯化鈉使最終含量為0.85-0.95％(g/ml)；加入1％硫柳汞液使最終含量為0.01％(g/ml)；調(diào)pH至6.0-7.0；e.澄清除菌過(guò)濾制成抗毒素原液，在冷暗處保存至少1個(gè)月使其穩(wěn)定；原液經(jīng)穩(wěn)定后，以注射用水稀釋?zhuān){(diào)整效價(jià)含量為40-300IU/ml、蛋白質(zhì)濃度3-15％、pH值為6.0-7.0及氯化鈉含量為0.85-0.95％(g/ml)，以液體或凍干劑型包裝。
本發(fā)明涉及馬抗SARS血清免疫血漿的制備馬匹免疫從馬體初次接受免疫原刺激，到產(chǎn)生少量抗毒素即第一次免疫應(yīng)答的出現(xiàn)，需要一定的時(shí)間。這一階段在制造抗血清的工作中被稱(chēng)作“基礎(chǔ)免疫”?；A(chǔ)免疫對(duì)于以后的強(qiáng)化免疫即所謂“超免疫”影響很大。有了第一次免疫應(yīng)答后，再次接觸同一免疫原就會(huì)迅速出現(xiàn)第二次免疫應(yīng)答，抗毒素效價(jià)將會(huì)急劇上升。由第一次應(yīng)答到第二次應(yīng)答之間的有效間隔期，將視馬體狀態(tài)與免疫原的種類(lèi)、性狀及劑量等而異，一般需要1-2個(gè)月以上，也可至半年以上。即使超過(guò)一年，對(duì)首次刺激的記憶也不會(huì)完全消失，對(duì)再次刺激仍會(huì)出現(xiàn)水平相當(dāng)高的第二次應(yīng)答。對(duì)超免疫成功的馬匹予以采血并開(kāi)始再次免疫注射，如此反復(fù)的每-循環(huán)通稱(chēng)“1程”、“2程”……超免疫。
基礎(chǔ)免疫水平、免疫原的強(qiáng)度、注射次數(shù)及注射間隔時(shí)間、前后程間的間隔時(shí)間等都是對(duì)超免疫的成敗、免疫應(yīng)答水平的持久性以及馬體健康狀態(tài)有影響的因素，須根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)與具體條件適當(dāng)調(diào)節(jié)，制訂最佳免疫實(shí)施方案。
在免疫馬匹時(shí)注意到如下幾點(diǎn)(1)免疫原注射采取皮下、肌肉、皮內(nèi)、靜脈、腹腔等途徑。注射部位為頸部?jī)蓚?cè)、脊背兩側(cè)、臀部?jī)蓚?cè)。采用“多點(diǎn)分散、每點(diǎn)少量”的注射方法。
(2)按一般規(guī)律，每注射一次免疫原后，抗血清效價(jià)會(huì)發(fā)生波動(dòng)，波峰逐次升高。達(dá)到最高水平后則可能趨于逐次漸降。掌握波動(dòng)規(guī)律，抓住最好時(shí)機(jī)進(jìn)行注射與采血，對(duì)于抗血清生產(chǎn)很有利。
(3)有的馬匹在長(zhǎng)期免疫、采血的過(guò)程中，抗血清效價(jià)達(dá)到一定水平后不僅不再上升，反而逐漸跌落，對(duì)免疫原的再刺激毫無(wú)應(yīng)答。此現(xiàn)象被稱(chēng)為“免疫麻痹”，可能與免疫原的性質(zhì)及注射劑量、注射的頻率及間隔時(shí)間等有關(guān)；也可能是免疫原中混雜的免疫抑制性物質(zhì)引起的。對(duì)此，應(yīng)給該馬以足夠時(shí)間的休息，以解除抑制作用，然后調(diào)整免疫方案，重新開(kāi)始超免疫。
馬抗SARS血清效價(jià)測(cè)定的動(dòng)物試驗(yàn)用組織培養(yǎng)SARS滅活病毒抗原免疫馬匹制造的馬抗SARS血清，主要成分為中和抗體，分子結(jié)構(gòu)與人的IgG基本相同。經(jīng)胃酶處理。IgG分子在重鏈間的二硫鍵的Fc端側(cè)被切斷。切下的Fc片段無(wú)抗毒活性，不耐熱，經(jīng)繼續(xù)消化與熱變性而被除掉。保留下來(lái)的F(ab)2片段具有抗病毒活性，其作用機(jī)理為中和抗體以多種方式在病毒感染的吸附或穿入期抑制病毒?？芍泻陀坞x的病毒，直接與已吸附在宿主細(xì)胞上的病毒發(fā)生作用，使病毒從宿主細(xì)胞上脫落，亦可直接與宿主細(xì)胞發(fā)生作用從而阻止病毒吸附到宿主細(xì)胞上。
抗血清的效價(jià)測(cè)定分為動(dòng)物法和試管法兩種，本發(fā)明制備的馬抗SARS血清效價(jià)測(cè)定按國(guó)際通用的中和試驗(yàn)法進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。中和試驗(yàn)是指在動(dòng)物體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中檢測(cè)抗原與抗體的相互作用及共作用的程度，主要用于病毒制品的測(cè)定，其方法是把抗原與特異性抗體作用一定時(shí)間后，再給動(dòng)物注射或接種細(xì)胞、雞胚。為作定量試驗(yàn)，可根據(jù)需要稀釋抗原，而不稀釋血清；或者稀釋血清，而不稀釋抗原，以此進(jìn)行中和試驗(yàn)，便可測(cè)知抗體效價(jià)的高低。本發(fā)明采用的方法是取馬抗SARS血清與SARS病毒混合液注射動(dòng)物，并以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)抗血清或其復(fù)制品作對(duì)照，借助動(dòng)物體的反應(yīng)情況來(lái)判定馬抗SARS血清的效價(jià)(即每ml血清所含單位，即Iu)。本發(fā)明所用的動(dòng)物試驗(yàn)方法是以動(dòng)物死亡為反應(yīng)指征，以動(dòng)物小白鼠接種馬抗SARS血清與SARS病毒混合液后，通過(guò)1-24天的觀察，統(tǒng)計(jì)計(jì)算動(dòng)物的死亡生存情況，確定血清的效價(jià)。
抗原及其制備抗原為組織培養(yǎng)SARS滅活病毒。
從非典型肺炎病例標(biāo)本(死亡病例尸解的肺組織標(biāo)本和患者鼻咽拭子標(biāo)本)中采用細(xì)胞培養(yǎng)法分離出病原體，通過(guò)電鏡形態(tài)學(xué)、血清學(xué)和動(dòng)物致病性觀察及RT-PCR擴(kuò)增與部分基因序列分析，對(duì)分離的病原體進(jìn)行鑒定。通過(guò)電鏡在病變細(xì)胞及其培養(yǎng)上清中觀察冠狀病毒樣顆粒。免疫熒光染色檢測(cè)非典型肺炎患者血清，鑒定分離的病毒。分離的病毒接種乳鼠，觀察發(fā)病乳鼠的肺組織標(biāo)本中冠狀病毒樣顆粒。病毒滅活采用福爾馬林(1∶1000-4000)，滅活后采用細(xì)胞培養(yǎng)和乳鼠接種法，觀察細(xì)胞病變及乳鼠發(fā)病情況。
基礎(chǔ)免疫采用二針次或三針次免疫。
佐劑比例抗原∶羊毛脂∶液體石蠟10 ∶1 ∶93 ∶3 ∶23 ∶1 ∶24 ∶2 ∶42 ∶3 ∶5注射劑量及時(shí)間二針次第1天 1ml 第7天 2ml三針次第1天 0.5ml 第7天 1.0ml 第14天 1.5ml超免疫采用五針次免疫抗原組織培養(yǎng)SARS滅活病毒。
佐劑比例抗原∶羊毛脂∶液體石蠟＝10∶1∶9注射劑量及時(shí)間第一程 第1針第1天2-10ml第2針第6-8天 2-20ml
第3針第12-18天 2-20ml第4針第19-24天 4-25ml第5針第26-32天 10-25ml采血 第40、41天各采1次采血量每千克體重16毫升-20毫升休息15天后進(jìn)行下程免疫。
第二程第二程及以后各程采用采用二針次或三針次免疫二針次 第1針第1天 20ml第2針第10天 25ml三針次 第1針第1天 6ml第2針第8天 8ml第3針第15天 12ml采血時(shí)間在末次注射后8-15天休息15天后進(jìn)行下程免疫。
二、精制提純用于精制的血漿應(yīng)符合《中國(guó)生物制品規(guī)程》中附錄《抗毒素生產(chǎn)用馬匹免疫方法》的規(guī)定，不得有嚴(yán)重溶血或嚴(yán)重黃疸，投產(chǎn)前混合血漿的效力檢定應(yīng)合格。
對(duì)血漿的要求制造抗SARS血清的血漿，應(yīng)符合《中國(guó)生物制品規(guī)程》(2000年版)《抗毒素生產(chǎn)用馬匹免疫方法》規(guī)定。
投產(chǎn)精制用的血漿應(yīng)無(wú)染菌、無(wú)溶血、無(wú)黃疸、應(yīng)不混入血球。
裝盛血漿的立瓶，應(yīng)無(wú)裂縫、無(wú)破損、包扎嚴(yán)緊。
血漿效價(jià)抗SARS免疫馬血漿每瓶血漿效價(jià)要求在20IU/ml，低于20IU/ml不能使用。
血漿的準(zhǔn)備每批血漿投產(chǎn)量，按大罐容積，計(jì)算投入血漿量(按照規(guī)程2-4倍稀釋)。
在冷庫(kù)內(nèi)查對(duì)血漿種類(lèi)、瓶號(hào)、馬號(hào)、分漿日期、裝量、效價(jià)，選好后，搬運(yùn)至緩沖間。
收集血漿瓶簽，去除瓶口外包裝，清潔血漿瓶外壁，作好血漿混合記錄。
制造程序消化將注射用水注入大罐內(nèi)，查對(duì)大罐所盛注射用水量，測(cè)量水溫(要求不高于48℃)。揭開(kāi)血漿瓶塞，按照2-4倍稀釋量將血漿倒入大罐中，啟動(dòng)攪拌馬達(dá)，慢速攪拌均勻；取血漿稀釋液50ml，留樣送檢定，并測(cè)pH值，調(diào)溫至29-31℃，用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.2-3.6之間，加入溶化胃酶，加入0.2％甲苯(ml/ml)，慢速攪拌，消化一小時(shí)。
第一次沉淀及加熱處理取上述消化液20ml，測(cè)pH值?？焖贁嚢?，加15％(W/V)硫酸銨。用2mol/L NaOH調(diào)至pH至4.8-5.6，并測(cè)量消化液溫度，用流通蒸汽通過(guò)消化罐夾層加溫至57-59℃并保溫30分鐘；通過(guò)大罐夾層迅速降溫過(guò)濾分離，取清液，棄沉淀。
鹽析上述清液，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH7.2-7.4，慢速攪拌，每100ml加硫酸銨19-21g。過(guò)濾分離，取沉淀，棄清液。
明礬沉淀將適量注射用水貯于大罐內(nèi)，備用。測(cè)量水溫不得高于30℃，將搗碎的沉淀稱(chēng)量，置大罐內(nèi)稀釋至蛋白含量約2％(g/ml)，慢速攪拌，使沉淀完全溶解，并測(cè)量溫度不得高于30℃，加10％(g/ml)明礬溶液，最終含量為0.8-1.2％(g/ml)。取樣，測(cè)pH值，用2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.7-7.9，慢速攪拌，吸附一小時(shí)，過(guò)濾分離，取清液，棄沉淀。
濃縮將上述清液混合通過(guò)超過(guò)濾裝置，用3萬(wàn)分子量的濾膜，進(jìn)行濃縮，至體積為十分之一時(shí)稀釋5至8倍使硫酸銨含量在0.1％(g/ml)以下。
原液處理將上述濃縮液加入注射用水，調(diào)整固體總量不超過(guò)20％(g/ml)；加氯化鈉使最終含量為0.85-0.95％(g/ml)；加入1％硫柳汞液使最終含量為0.01％(g/ml)；調(diào)pH至6.0-7.0。
澄清除菌過(guò)濾按《除菌過(guò)濾崗位標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則》(QB/WIBP JS 30003-2002)進(jìn)行操作。制成的抗毒素原液，須在冷暗處保存至少1個(gè)月作為穩(wěn)定期。
原液檢定無(wú)菌試驗(yàn)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》A項(xiàng)進(jìn)行。
熱原質(zhì)試驗(yàn) 按《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
類(lèi)A型物質(zhì)含量測(cè)定按《抗毒素制造及檢定規(guī)程》附錄6進(jìn)行。
半成品配制與除菌配制將檢定合格的原液，按出品規(guī)格以注射用水準(zhǔn)確稀釋?zhuān){(diào)整效價(jià)、蛋白質(zhì)濃度、pH值及氯化鈉含量。
除菌過(guò)濾按《除菌過(guò)濾崗位標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則》(QB/WIBP JS 30003-2002)進(jìn)行。
理化檢定液狀抗毒素應(yīng)為幾乎無(wú)色或淡黃色的澄明液體，不得含有渣?；虍愇?，長(zhǎng)期貯存后可有微量能搖散的沉淀產(chǎn)生，除血清本身及防腐劑的特有氣味外，不得有其他氣味。
固體總量，液狀抗毒素不得超過(guò)20％(g/ml)，蛋白含量不得超過(guò)17％(g/ml)。
pH值應(yīng)為6.0-7.0。
氯化鈉含量應(yīng)為0.85-0.95％(g/ml)。
硫酸銨含量不超過(guò)0.1％(g/ml)。
液狀抗毒素的防腐劑，硫柳汞不得超過(guò)0.01％(g/ml)。
無(wú)菌試驗(yàn)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》A項(xiàng)進(jìn)行。
熱原質(zhì)試驗(yàn)按《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
異常毒性試驗(yàn)按《生物制品異常毒性試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
類(lèi)A型物質(zhì)含量測(cè)定。按《抗毒素制造及檢定規(guī)程》(附錄6)進(jìn)行。
效價(jià)測(cè)定按《抗SARS血清檢定規(guī)程》進(jìn)行。
三、分包裝按《生物制品分裝規(guī)程》進(jìn)行。本品有液體及凍干兩種類(lèi)型，凍干制品分裝后應(yīng)立即在-30℃以下進(jìn)行冷凍，根據(jù)水含量調(diào)整干燥時(shí)間，干燥完畢后進(jìn)行真空封口，本品規(guī)格為治療用400IU/瓶；預(yù)防用80IU/瓶。
效價(jià)測(cè)定1.試驗(yàn)動(dòng)物體重為10-12g的小鼠。
2.血清中和試驗(yàn)用的血清參考標(biāo)準(zhǔn)品6-10人份SARS患者血清。
3.待檢定血清樣品的稀釋取待檢定的血清樣品，按2倍連續(xù)稀釋的方法用2％小牛血清PBS進(jìn)行稀釋?zhuān)话憧刹捎?∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，1∶25600，1∶51200，1∶102400，但可根據(jù)血清實(shí)際效價(jià)的情況適當(dāng)減低或提高試驗(yàn)時(shí)最低稀釋倍數(shù)，如采用上述8個(gè)稀釋倍數(shù)，則用待檢血清按2.7ml稀釋液加入0.3ml血清作為1∶10，然后再用3.5ml稀釋液加入混勻的1∶10的血清0.5ml為1∶80，再按2.7ml稀釋液加入0.3ml為1∶800。然后均按0.5ml加0.5ml作倍比稀釋。取1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，1∶25600，1∶51200，1∶102400 8個(gè)稀釋倍數(shù)，以上8個(gè)稀釋度分別以0.5ml加入8個(gè)小試管內(nèi)待用。
4.效價(jià)測(cè)定用血清參考標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋方法同待檢定血清樣品的稀釋。
5.中和用病毒懸液組織培養(yǎng)SARS病毒懸液病毒懸液的預(yù)測(cè)取組織培養(yǎng)SARS病毒懸液，加入含2％小牛血清PBS 1.0ml，吹打均勻后再用4.0ml上述稀釋液與病毒液充分混勻，1500r/min沉淀10分鐘，取上清與等量的稀釋液混合則為10-2懸液，然后再作10-3、10-4、10-5、10-6稀釋?zhuān)瑥?0-6至10-2各取0.5ml加入5個(gè)小管內(nèi)，每管再加入2％小牛血清PBS 0.5ml，放置37℃水浴1小時(shí)。用體重10-12g小鼠30只，分成5組，每組6只，用經(jīng)37℃作用的10-6至10-2病毒懸液接種小鼠，每個(gè)稀釋度接種6只小鼠，每只小鼠腦內(nèi)接種0.03ml，觀察14天，每天觀察小鼠發(fā)病死亡情況，接種后4天內(nèi)死亡的小鼠按非特異性死亡計(jì)，以接種5天后的發(fā)病死亡小鼠統(tǒng)計(jì)LD50。要求中和用病毒懸液經(jīng)37℃水浴作用1小時(shí)的病毒量在32LD50-320LD50之間。
按病毒懸液預(yù)測(cè)的100個(gè)LD50的稀釋度作為中和用病毒懸液。
6.中和將上述3項(xiàng)的8個(gè)稀釋度的各裝0.5ml的8支小試管和2.3項(xiàng)的8個(gè)稀釋度的各裝0.5ml的8支小試管，共16支小試管，各加入中和用病毒懸液0.5ml，放置37℃水浴1小時(shí)，作注射小鼠用。
另用相同體重的小鼠測(cè)定中和用病毒懸液的實(shí)際LD50。其方法可將中和用病毒懸液作為原液再稀釋10-1、10-2、10-3等共4個(gè)稀釋度，以上4個(gè)稀釋度各加入0.5ml于小試管內(nèi)，每管再加入2％小牛血清PBS 0.5ml，同樣放置37℃水浴1小時(shí)作為中和病毒對(duì)照。
7.接種小鼠將已中和的待檢血清和血清標(biāo)準(zhǔn)品的不同稀釋度的懸液和病毒對(duì)照接種小鼠，血清按從濃到稀的倍數(shù)接種小鼠，而病毒對(duì)照則按從稀到濃的倍數(shù)接種小鼠。每只小鼠腦內(nèi)接種0.03ml。
8.觀察結(jié)果觀察14天，每天記錄小鼠的發(fā)病死亡情況，接種后4天內(nèi)死亡的小鼠作為非特異性死亡計(jì)。
9.結(jié)果計(jì)算按下列公式計(jì)算待檢血清效價(jià)＝(待檢血清ED50的倒數(shù)/血清標(biāo)準(zhǔn)品ED50的倒數(shù))×血清標(biāo)準(zhǔn)品的單位本發(fā)明藥品的組成、性狀和產(chǎn)成品規(guī)格本品系由組織培養(yǎng)SARS滅活病毒抗原免疫馬的血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法提純制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑。液體制劑為無(wú)色或淡黃色的澄明液體，含硫柳汞防腐劑，久置可析出少量能搖散的沉淀。凍干制劑為白色或乳白色疏松體，按標(biāo)簽規(guī)定量加滅菌注射用水溶解后呈無(wú)色或微黃色的澄明液體。本品規(guī)格為治療用400IU/瓶；預(yù)防用80IU/瓶。，包裝規(guī)格為每箱500瓶。依據(jù)《中國(guó)生物制品規(guī)程》2000年版生產(chǎn)、檢定和控制質(zhì)量。
本發(fā)明具有特異性中和SARS病毒的作用，可用于SARS的治療和預(yù)防，用于受SARS病毒感染病人的治療，還可用于高危人群的預(yù)防。通常采用靜脈注射，也可做肌內(nèi)或皮下注射。預(yù)防劑量1次皮下或肌內(nèi)注射80～200IU，兒童與成人用量相同；經(jīng)5～6日，如感染危險(xiǎn)未消除，應(yīng)重復(fù)注射。治療劑量注射量均按體重計(jì)算，每1kg體重注射20IU(特別嚴(yán)重者可酌情增至40～50IU)，在1～2日內(nèi)分?jǐn)?shù)次注射，以后視病情決定注射劑量與間隔時(shí)間。過(guò)敏試驗(yàn)為陽(yáng)性反應(yīng)者慎用。
使用中出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的處理(1)過(guò)敏休克 可在注射中或注射后數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)突然發(fā)生。者突然表現(xiàn)沉郁或煩躁、臉色蒼白或潮紅、胸悶或氣喘、出冷汗、惡心或腹痛、脈搏細(xì)速、血壓下降，重者神志昏迷或虛脫，如不及時(shí)搶救可以迅速死亡。輕者注射腎上腺素后即可緩解；重者需輸液輸氧，使用升壓藥物維持血壓，并使用抗過(guò)敏藥物及腎上皮質(zhì)激素等進(jìn)行搶救。
(2)血清病 主要癥狀為蕁麻疹、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、局部浮腫，偶有蛋白尿、嘔吐、關(guān)節(jié)痛，注射部位可出現(xiàn)紅斑、瘙癢及水腫。一般系在注射后7～14天發(fā)病，稱(chēng)為延緩型。亦有在注射后2～4天發(fā)病，稱(chēng)為加速型。對(duì)血清病應(yīng)進(jìn)行對(duì)癥療法，可使用鈣劑或抗組織胺藥物，一般數(shù)日至十?dāng)?shù)日即可痊愈。
使用本發(fā)明藥物的注意事項(xiàng)本品有液體及凍干兩種類(lèi)型。制品混濁，有搖不散的沉淀、異物或安瓿有裂紋，標(biāo)簽不清，過(guò)期失效者均不可使用。安瓿打開(kāi)后應(yīng)一次用完。凍干制品應(yīng)加標(biāo)簽規(guī)定量滅菌注射用水，輕搖使完全溶解。每次注射須保存詳細(xì)記錄，包括姓名、性別、年齡、住址、注射次數(shù)、上次注射后的反應(yīng)情況、本次過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果及注射后反應(yīng)情況、所用抗血清的生產(chǎn)單位名稱(chēng)及批號(hào)等。使用抗血清須特別注意防止過(guò)敏反應(yīng)。注射前須詳細(xì)詢問(wèn)既往過(guò)敏史，凡本人及其直系親屬曾有支氣管哮喘、枯草熱、濕疹或血管神經(jīng)性水腫等病史，或?qū)δ撤N物質(zhì)過(guò)敏，或本人過(guò)去曾注射過(guò)馬血清制劑者，均須特別提防過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。注射前必須做過(guò)敏試驗(yàn)。
過(guò)敏試驗(yàn)用氯化鈉注射液將抗血清稀釋10倍(0.1ml抗血清加0.9ml氯化鈉注射液)，在前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射0.05ml，觀察30分鐘。注射部位無(wú)明顯反應(yīng)者，即為陰性，可在嚴(yán)密觀察下直接注射抗血清。如注射局部出現(xiàn)皮丘增大、紅腫、浸潤(rùn)，特別是形似偽足或有癢感者，為陽(yáng)性反應(yīng)，必須用脫敏法進(jìn)行注射。如注射局部反應(yīng)特別嚴(yán)重或除局部反應(yīng)外并伴有全身癥狀，如蕁麻疹、鼻咽刺癢、噴嚏等，為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，則應(yīng)采用脫敏注射，并做好一切準(zhǔn)備，一旦發(fā)生過(guò)敏休克，立即搶救。無(wú)過(guò)敏史或過(guò)敏反應(yīng)陰性者，也并非沒(méi)有發(fā)生過(guò)敏休克的可能。為慎重起見(jiàn)，可先注射小量于皮下進(jìn)行試驗(yàn)，觀察30分鐘，無(wú)異常反應(yīng)，再將全量注射于皮下或肌內(nèi)。
脫敏注射法在一般情況下，可用氯化鈉注射液將抗血清稀釋10倍，分小量數(shù)次作皮下注射，每次注射后觀察20～30分鐘。第1次可注射1ml，觀察無(wú)紫紺、氣喘或顯著呼吸短促、脈搏加速時(shí)，即可注射第2次2ml，如注射量達(dá)到4ml仍無(wú)反應(yīng)，可緩慢地將全量注入。門(mén)診病人注射抗血清后，須觀察至少30分鐘方可離開(kāi)。
本發(fā)明藥物應(yīng)于2～8℃避光干燥處保存和運(yùn)輸。在盒簽(瓶簽)標(biāo)明的失效期前使用。
權(quán)利要求
1.一種用于治療和預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)的馬抗嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)血清，它是由組織培養(yǎng)SARS滅活病毒免疫馬匹獲得免疫血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑。
2.權(quán)利要求1所述馬抗嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)血清的制備方法，包括a.用組織培養(yǎng)SARS滅活病毒免疫馬匹，經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)免疫、超免疫后采血，分離血漿；將分離的免疫血漿按照2-4倍稀釋量倒入盛有注射用水的大罐中，慢速攪拌均勻，調(diào)溫至29-31℃，用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.2-3.6之間，加入溶化胃酶，加入0.2％甲苯(ml/ml)，慢速攪拌，消化一小時(shí)；取消化液20ml，測(cè)pH值，快速攪拌，加15％(W/V)硫酸銨；用2mol/L NaOH調(diào)至pH至4.8-5.6，并測(cè)量消化液溫度，用流通蒸汽通過(guò)消化罐夾層加溫至57-59℃并保溫30分鐘；通過(guò)大罐夾層迅速降溫過(guò)濾分離，取清液，棄沉淀；b.上述清液，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，慢速攪拌，每100ml加硫酸銨19-21克，過(guò)濾分離，取沉淀，棄清液；c.將適量注射用水貯于大罐內(nèi)，備用，測(cè)量水溫不得高于30℃，將搗碎的沉淀稱(chēng)量，置大罐內(nèi)稀釋至蛋白含量約2％(g/ml)，慢速攪拌，使沉淀完全溶解，并測(cè)量溫度不得高于30℃，加10％(g/ml)明礬溶液，最終含量為0.8-1.2％(g/ml)，取樣，測(cè)pH值，用2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.7-7.9，慢速攪拌，吸附一小時(shí)，過(guò)濾分離，取清液，棄沉淀；d.將上述清液混合通過(guò)超過(guò)濾裝置，用3萬(wàn)分子量的濾膜，進(jìn)行濃縮，至體積為十分之一時(shí)稀釋5至8倍使硫酸銨含量在0.1％(g/ml)以下；將濃縮液加入注射用水，調(diào)整固體總量不超過(guò)20％(g/ml)；加氯化鈉使最終含量為0.85-0.95％(g/ml)；加入1％硫柳汞液使最終含量為0.01％(g/ml)；調(diào)pH至6.0-7.0；e.澄清除菌過(guò)濾制成抗毒素原液，在冷暗處保存至少1個(gè)月使其穩(wěn)定；原液經(jīng)穩(wěn)定后，以注射用水稀釋?zhuān){(diào)整效價(jià)含量為40-300IU/ml、蛋白質(zhì)濃度3-15％、pH值為6.0-7.0及氯化鈉含量為0.85-0.95％(g/ml)，以液體或凍干劑型包裝。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療和預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)的馬抗嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥血清，它是由組織培養(yǎng)SARS滅活病毒免疫馬匹獲得免疫血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑，具有特異性中和SARS病毒的作用，用于受SARS病毒感染病人的治療，還可用于高危人群的預(yù)防。通常采用靜脈注射，也可做肌內(nèi)或皮下注射。
文檔編號(hào)C07K14/765GK1449832SQ0312806
公開(kāi)日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2003年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月29日
發(fā)明者魏樹(shù)源, 王鵬, 鄒漢武, 雷詩(shī)良 申請(qǐng)人:武漢生物制品研究所