檢測豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒的引物、試劑盒及方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種檢測豬繁殖與呼吸 障礙綜合癥病毒的引物、試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] 豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒（Porcine Reproductive and Respirary Syndrome Virus，PRRSV)感染引起的，以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸衰竭為主要 癥狀的傳染病，臨床癥狀主要表現為母豬流產、早產、死胎、木乃伊胎、仔豬成活率下降和育 成豬呼吸道癥狀等。該病于1987年在美國首次出現，隨后在世界各地迅速蔓延。
[0003] 豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)對養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的影響，特別是北美和歐洲近年 來呈現全球蔓延的趨勢，主要有母豬流產、生長期豬肺炎和仔豬死亡率增加等癥狀，因豬耳 朵呈藍紫狀，因此也被稱為豬藍耳病。在我國新出現一種高致病性藍耳病，除了傳統(tǒng)癥狀外 還可見體溫明顯升高，達41°C以上，皮膚發(fā)紅、部分豬耳朵出血、淤血呈紫紅色等癥狀，在一 個地區(qū)流行數月無明顯好轉，常規(guī)療法無效。
[0004] 在1990年，美國的11個州和加拿大的11個州檢測到這種病毒。接著1990年在德國 的明斯特地區(qū)發(fā)現報道，并且迅速的蔓延到德國的其它地區(qū)，這種病當時在德國被稱為豬 感染晚期流產病（SSS)和地方流行性后期流產病(ESS)。其后在歐洲的其它國家(荷蘭，法 國，比利時，英格蘭和丹麥）相繼出現。1990年晚期在北歐的豬場診斷出超過5000頭患有此 病的豬。盡管這種疾病沒有在意大利、波蘭、瑞士和澳大利亞報道過，但是在意大利和波蘭 的豬群中用抗體檢測出PRRSV。
[0005] 這種疾病對經濟的影響重大，造成了20-30%的豬死胎，每窩仔豬中損失1.5-2.0 只豬。在此疾病爆發(fā)時每頭母豬上的損失達到250-500美元。在衣阿華州的一份報道中，100 英里內的農場中有85,330只死亡，并且造成1060萬美元的損失。在西班牙，當PRRS第二次流 行時有近3000頭豬被屠宰。2006年在中國發(fā)現高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，影響了超過2000 〇〇〇頭豬。這種病毒對所有年齡段的豬都有影響，癥狀主要是高燒（高于41°C)、高致病率 (50-100%)、高死亡率(20-100%)。從2006年到2009年在中國的不同省份分離出了一大批 HP-PRRSV，并且和這種疾病的爆發(fā)相吻合。
[0006] 2015年，有學者報道在中國大陸出現一種新的類NADC30毒株。該類型毒株毒力較 強，造成爆發(fā)母豬流產、死胎以及仔豬呼吸道疾?。ㄋ劳雎士蛇_30%-50%)(Zhou L，Wang Z，Ding Y et al.NADC3〇-like Strain of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，China[J].Emerg Infect Dis.20iroec;21(12):2256-2257·)。另外有學 者通過實驗發(fā)現新出現的NADC30類毒株具有一定毒力，并且應用目前的防控措施較難控制 (Zhao K，Ye C,Chang XB et al. Importation and Recombination Are Responsible for the Latest Emergence of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in China[J].J Virol.20150ct 15；89(20):10712-6.)〇
[0007] 類NADC30毒株的出現給藍耳病的防控提出了新的挑戰(zhàn)。及時、準確的診斷對于疾 病的防控十分的重要，類NADC30毒株屬于新發(fā)流行毒株，目前還未有該類型毒株的PCR診斷 方法。

【發(fā)明內容】

[0008] 基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發(fā)明通過對豬呼吸與繁殖障礙綜合癥 基因組的分析，提供了一種檢測豬呼吸與繁殖障礙綜合癥病毒的引物、試劑盒及方法，該方 法可以對PRRSV經典、變異和新出現的類NADC30毒株進行快捷的鑒別區(qū)分。
[0009] 為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術方案：
[0010] 一種檢測豬呼吸與繁殖障礙綜合癥病毒的引物，所述引物如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示。
[0011] 上述檢測豬呼吸與繁殖障礙綜合癥病毒的引物在制備檢測豬呼吸與繁殖障礙綜 合癥病毒的試劑盒中的應用。
[0012] -種檢測豬呼吸與繁殖障礙綜合癥病毒的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物。
[0013] 在其中一些實施例中，所述試劑盒還包括PrimeScript lstep Enzyme Mix，2 X 1step Buffer，和Rnase Free H2O〇
[0014] -種檢測豬呼吸與繁殖障礙綜合癥病毒的方法，采用上述引物，包括以下步驟：以 待檢測樣品的RNA為模板，進行RT-PCR擴增反應，電泳鑒定;所述RT-PCR擴增反應的反應體 系為： PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μ【 2x1 Step Buffer 12.5pL SE〇 ID NO:l 0.5"L
[0015] SEQ ID 職2 0,5pL 模板 Rinse Tice H〇Q 加至 25ftL.
[0016] 所述PCR擴增反應的反應程序為：50°C30min進行預變性;然后94°C2min，94°C30s， 55°C40s，共進行30次循環(huán);最后72°C延伸lmin，72°C延伸lOmin。
[0017] 與現有技術相比，本發(fā)明具有以下顯著效果：
[0018] 1、本發(fā)明的檢測豬呼吸與繁殖障礙綜合癥病毒的引物具有很高的特異性和靈敏 度，能夠檢測出豬繁殖與呼吸障礙綜合癥的新型病毒類NADC30病毒；
[0019] 2、使用本發(fā)明的檢測豬呼吸與繁殖障礙綜合癥病毒的引物進行PCR擴增，可以通 過擴增片段的大小不同快捷的對PRRSV的經典株、變異株和類NADC30毒株這3類毒株進行鑒 別區(qū)分，省去測序的步驟，節(jié)省了時間和成本，操作簡單、實用。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實施例1中對樣品擴增的電泳圖，其中泳道1為NADC30株，泳道2為經 典株，泳道3為類變異毒株，泳道4為樣品A擴增結果，泳道5為樣品B擴增結果，泳道6為陰性 對照；
[0021]圖2為本發(fā)明試驗例1的特異性檢驗結果，其中泳道1為經典株，泳道2為變異株，泳 道3為類NADC30毒株，4-9分別為豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬 圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒，10為陰性對照；
[0022]圖3為本發(fā)明試驗例2的靈敏度檢驗結果，其中，泳道1、2、3、4、5、6、7代表的RNA濃 度分別為1 · 32yg、0 · 132yg、0 · 0132yg、1 · 32ng、0 · 132ng、0 · 0132ng、1 · 32pg。
【具體實施方式】
[0023] 以下結合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0024] 以下實施例中涉及的實驗材料如