專利名稱：一種預(yù)防或治療艾滋病的藥物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種預(yù)防或治療艾滋病的藥物及其制備方法和在制備預(yù)防和治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)在全球廣泛流行，亞洲繼北美、非洲之后已成為全球HIV(Human Immunodeficiency Virus)感染上升最迅速、流行最嚴(yán)重的地區(qū)之一。我國(guó)AIDS也呈加速流行的趨勢(shì)，截止2001年底，全國(guó)31個(gè)省市累計(jì)共報(bào)告HIV感染者30736名，其中AIDS病人1594名，死亡684人。據(jù)專家估計(jì)，全國(guó)實(shí)際感染HIV者已達(dá)85萬(wàn)人。如以目前的增長(zhǎng)速度(30-40％)發(fā)展，到2010年，我國(guó)HIV感染者將超過(guò)1000萬(wàn)人。至今未研制出有確切效果的HIV疫苗，抗HIV藥物仍是防治HIV感染的主要方式。藥物臨床治療取得了前所未有的效果，尤其是高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy，HAART)延長(zhǎng)了HIV感染者壽命，但仍然不能清除體內(nèi)病毒，治愈病人。HIV抗藥株的產(chǎn)生、特殊器官和細(xì)胞(淋巴結(jié)、腦及單核巨噬細(xì)胞等)中HIV的隱匿，藥物的毒副反應(yīng)及半衰期短等問(wèn)題的出現(xiàn)，促使人們尋找更加有效而低毒的藥物。迄今，現(xiàn)有技術(shù)中沒有含有本發(fā)明式I化合物酒花查爾酮(xanthahumol)作為有效成分在治療艾滋病方面的報(bào)道，也沒有該化合物具有抗HIV-1活性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供含有有效量式I化合物及藥用載體和/或賦形劑所制成的藥物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案一種預(yù)防或治療艾滋病的藥物，其中含有預(yù)防或治療艾滋病有效量的式I化合物酒花查爾酮及可藥用載體和/或賦形劑。 本發(fā)明還提供了上述藥物的制備方法，采集植物啤酒花(Humulus lupulus)室溫下用70％乙醇浸泡3-5次，溶劑回收至小體積，分別用石油醚和乙酸乙酯萃取，回收溶劑后，乙酸乙酯部分用適量硅膠拌樣，進(jìn)行硅膠柱層析，用CHCl3-MeOH梯度洗脫，得含h4段，該餾段進(jìn)一步進(jìn)行硅膠柱層析，CHCl3-EtOAc梯度洗脫，得權(quán)利要求1所述的化合物酒花查爾酮，然后再按藥物常規(guī)制備方法配制成所需劑型。
同時(shí)本發(fā)明提供了所述藥物在制備預(yù)防或治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明化合物用作藥物上時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物含有0.1～99％，優(yōu)選為0.5～90％的本發(fā)明化合物，其余為藥物學(xué)上可接受的，對(duì)人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將所述的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)口服和注射(靜注、肌注)兩種形式給藥。
口服可用其固體或液體制劑，如粉劑、片劑、糖衣劑、膠囊、溶液、糖漿、滴丸劑等。
注射可用其固體或液體制劑，如粉針劑、溶液形注射劑等。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用本發(fā)明的式I化合物酒花查爾酮(xanthahumol)及其與藥物載體或賦形劑組成的藥物的生物活性結(jié)果來(lái)說(shuō)明它在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
材料和方法一、試劑和溶液(1)試劑MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)；SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)；DMF(N，N’-Dimethyl formamine)。
(2)溶液RPMI-1640完全培養(yǎng)基，含有10％新生小牛血清(自制)，2m ML-Glutamine，10Mm HEPES free acid，50μM 2-Mercaptoethanol，100.000 IU Penicillin，100μg/ml Streptomycin sulfate.
二、檢測(cè)化合物酒花查爾酮(xanthahumol)溶于DMSO中，4℃保存，貯存液濃度為25mg/ml。
三、細(xì)胞和病毒C8166和HIV-1IIIB/H9均由英國(guó)Medical Resaerch Council，AIDS ReagentProject惠贈(zèng)。按常規(guī)方法制備HIV-1IIIB，滴定并計(jì)算出病毒的TCID50。病毒貯存液分裝后，置-70℃保存。細(xì)胞和病毒均按常規(guī)方法凍存和復(fù)蘇。
四、化合物酒花查爾酮(xanthahumol)對(duì)C8166的細(xì)胞毒性檢測(cè)3×105/ml C8166細(xì)胞懸液100ul與不同濃度的化合物溶液混合，同時(shí)設(shè)置不含化合物的對(duì)照孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)三天，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性。490nmELx800 ELISA Reader測(cè)定OD值。計(jì)算化合物對(duì)細(xì)胞的CC50(50％CytotoxjcConcentration)，即引起50％細(xì)胞死亡的化合物濃度。
五、化合物酒花查爾酮(xanthahumol)對(duì)HIV-1誘導(dǎo)C8166病變的抑制試驗(yàn)將6×105/ml C8166細(xì)胞50ul與100ul不同濃度的化合物溶液混合，加入50μl HIV-I稀釋上清，M.O.I.為0.0089，同時(shí)設(shè)置不含化合物的對(duì)照孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)三天，倒置顯微鏡下(100×)計(jì)數(shù)合胞體(五個(gè)視野)。計(jì)算化合物的EC50(50％Effective Concentration)，即化合物抑制50％合胞體形成的濃度。計(jì)算化合物的TI(Therapeutic Index)，即選擇指數(shù)，其值等于CC50/EC50。
六、化合物酒花查爾酮(xanthahumol)對(duì)HIV-1 p24的抑制將6×105/ml C8166細(xì)胞250ul與500ul不同濃度的化合物溶液混合，加入250μl HIV-1稀釋上清，M.O.I.為0.0089，同時(shí)設(shè)置不含化合物的對(duì)照孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)三天，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中HIV-1 p24的含量。計(jì)算化合物的EC50(50％Effective Concentration)，即化合物使HIV-1 p24表達(dá)減少50％的濃度。計(jì)算化合物的TI(Therapeutic Index)，即選擇指數(shù)，其值等于CC50/EC50。
結(jié)果酒花查爾酮(xanthahumol)的細(xì)胞毒性作用表1列出了酒花查爾酮(xanthahumol)的CC50。本發(fā)明的附圖1顯示了不同濃度的酒花查爾酮(xanthahumol)對(duì)C8166的毒性作用。
表1.酒花查爾酮(xanthahumol)的CC50CC50(μg/ml)第一次 4.32第二次 1.69第三次 19.18第四次 6.20
2、酒花查爾酮(xanthahumol)對(duì)HIV-1誘導(dǎo)C8166合胞體形成的抑制作用表2列出了酒花查爾酮(xanthahumol)HIV-1誘導(dǎo)抑制HIV-1誘導(dǎo)C8166合胞體形成的EC50。本發(fā)明的附圖2顯示了不同濃度的酒花查爾酮(xanthahumol)對(duì)HIV-1誘導(dǎo)C8166合胞體形成的抑制作用。表2.酒花查爾酮(xanthahumol)抑制HIV-1誘導(dǎo)C8166合胞體形成的EC50EC50(μg/ml)第一次 0.69第二次 0.823、酒花查爾酮(xanthahumol)對(duì)HIV-1 p24抗原表達(dá)的抑制作用酒花查爾酮(xanthahumol)對(duì)HIV-1 p24抗原表達(dá)的抑制作用EC50為0.65(μg/ml)。本發(fā)明的附圖3顯示了不同濃度的H-4對(duì)HIV-1 p24抗原表達(dá)的抑制作用。
同樣的，為了進(jìn)一步理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用本發(fā)明的式I化合物酒花查爾酮(xanthahumol)及其與藥物載體或賦形劑組成的藥物的急性毒性結(jié)果來(lái)說(shuō)明它在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
酒花查爾酮(xanthahumol)小鼠腹腔給藥急性毒性試驗(yàn)一.材料1.樣品酒花查爾酮(xanthahumol)，呈黃色粉末狀。二甲基亞砜(DMSO)加少量PEG-400和吐溫-80溶解后加生理鹽水配制為所需濃度備用；2.動(dòng)物健康ICR小鼠，II級(jí)清潔級(jí)，18~22g，雌雄各半，由昆明醫(yī)學(xué)院省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物室提供。合格證號(hào)滇實(shí)動(dòng)證第9806號(hào)。
二.方法健康ICR小鼠16只，分為1000mg/kg和1500mg/kg兩個(gè)劑量組，8只/組，雌雄各半，按0.1ml/10g的給藥體積腹腔注射相應(yīng)劑量的H4，給藥后觀察動(dòng)物的反應(yīng)和死亡情況，觀察時(shí)間為12天。
三.結(jié)果1.1500mg/kg劑量組動(dòng)物在給藥4h后開始死亡，48h死亡達(dá)高峰，72h受試動(dòng)物全部死亡。死亡前動(dòng)物出現(xiàn)呼吸急促、抽搐；2.1000mg/kg劑量組動(dòng)物在給藥后未觀察到明顯的毒性反應(yīng)，至給藥后的第12天亦未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。
四.結(jié)論從本試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)化合物H4在小鼠經(jīng)腹腔給藥的半數(shù)致死劑量(LD50)在1000mg/kg和1500mg/kg之間。


圖1是本發(fā)明化合物酒花查爾酮對(duì)C8166的毒性作用圖；圖2是本發(fā)明化合物酒花查爾酮對(duì)HIV-1誘導(dǎo)的合胞體形成的抑制作用圖；圖3是本發(fā)明化合物酒花查爾酮對(duì)HIV-1 p24的抑制作用作用圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例110kg植物啤酒花(Humulus lupulus)(粒狀)室溫下用70％乙醇浸泡五次，溶劑回收至小體積，分別用石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分回收溶劑后，稱重得539.6g。乙酸乙酯部分用適量硅膠拌樣后，進(jìn)行硅膠柱層(200-300目)，用CHCl3-MeOH梯度洗脫，得含h4段。該餾段進(jìn)一步進(jìn)行硅膠柱層析，CHCl3-EtOAc梯度洗脫，得酒花查爾酮(xanthahumol)4.66g。
該方法分離出的化合物酒花查爾酮(xanthahumol)其化學(xué)名稱為2’，4，4’-三羥基-6’-甲氧基-3’-異戊烯基查爾酮，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 分子量為354.402，分子式為C21H22O5。熔點(diǎn)171-173℃，橙黃色結(jié)晶。易溶于甲醇、丙酮，微溶于水。
酒花查爾酮(xanthahumol)的結(jié)構(gòu)是基于它的質(zhì)譜和核磁共振數(shù)據(jù)并通過(guò)與文獻(xiàn)中已知化合物的光譜進(jìn)行對(duì)照而確定(Sun，S.-S.et al.，Phytochemistry1989，28，1776；Tabata，N.et al.，Phytochemistry 1997，46，683)。
紫外光譜數(shù)據(jù)UVλ(max)(MeOH)(logε)205.5(4.43)，234(sh，4.08)，367(4.50).
紅外光譜數(shù)據(jù)IR vmaxKBr3510-3200(br)，1676.8，1607.5，1579.8，1510.9，1430.1，1402.0，1367.1，1322.2，1264.0，1174.3，1121.2，108206，969.7，913.1，855.9，820.7.
質(zhì)譜數(shù)據(jù)MS m/z354[M+](100)，339，311，299[M-C4H7]+，，234[A1]+，179[A1-C4H7]+，120[B1]+.
有關(guān)核磁共振數(shù)據(jù)見表4。
表4.1HNMR and13C NMR Data for H-4(in DMSO)

實(shí)施例2按實(shí)施例1制得化合物酒花查爾酮(xanthahumol)，按化合物晶體與賦形劑重量比1∶1的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實(shí)施例3按實(shí)施例1制得化合物酒花查爾酮(xanthahumol)，按常規(guī)膠囊制劑方法制成膠囊。
實(shí)施例4按實(shí)施例1制得化合物酒花查爾酮(xanthahumol)，按化合物晶體與賦形劑重量比1∶2的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實(shí)施例5按實(shí)施例1制得化合物酒花查爾酮(xanthahumol)，按化合物晶體與賦形劑重量比1∶3的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實(shí)施例6片劑酒花查爾酮(xanthahumol) 100mg淀粉 100mg玉米漿17％適量硬脂酸鎂 適量實(shí)施例7膠囊劑酒花查爾酮(xanthahumol) 100mg淀粉 100mg硬脂酸鎂 適量制備方法將酒花查爾酮(xanthahumol)與助劑混合，過(guò)篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊。
實(shí)施例8安瓿劑酒花查爾酮(xanthahumol)50mg制備方法將酒花查爾酮(xanthahumol)溶解于2毫升丙二醇中，過(guò)濾所得溶液在無(wú)菌條件下裝入安瓿瓶中。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療艾滋病的藥物，其中含有預(yù)防或治療艾滋病有效量的式I化合物酒花查爾酮及可藥用載體和/或賦形劑。
2.權(quán)利要求1的藥物的制備方法，其特征在于采集植物啤酒花(Humuluslupulus)室溫下用70％乙醇浸泡3-5次，溶劑回收至小體積，分別用石油醚和乙酸乙酯萃取，回收溶劑后，乙酸乙酯部分用適量硅膠拌樣，進(jìn)行硅膠柱層析，用CHCl3-MeOH梯度洗脫，得含h4段，該餾段進(jìn)一步進(jìn)行硅膠柱層析，CHCl3-EtOAc梯度洗脫，得權(quán)利要求1所述的化合物酒花查爾酮，然后再按藥物常規(guī)制備方法配制成所需劑型。
3.權(quán)利要求1所述式I化合物在制備預(yù)防或治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
提供一種藥用有效成分酒花查爾酮(xanthahumol)用于預(yù)防和治療艾滋病。具體地，利用植物啤酒花(Humuluslupulus)為原料，通過(guò)酒精提取和溶劑處理，硅膠柱層析以氯仿/乙酸乙酯混合溶劑洗脫，結(jié)晶得到酒花查爾酮(xanthahumol)純品。實(shí)驗(yàn)證明該化合物具有顯著的體外抗HIV－1活性，可用于制備預(yù)防和治療艾滋病的藥物。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1459281SQ0211377
公開日2003年12月3日 申請(qǐng)日期2002年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月21日
發(fā)明者劉吉開, 鄭永唐, 丁智慧, 王茜, 瞿燕, 董澤軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所, 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所