專利名稱：用于預(yù)防激素引起的副作用的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為預(yù)防激素如植物雌激素和甾體雌激素用藥帶來的副作用提供了方法和組合物。
與這種有益的效應(yīng)相反，長期使用雌激素與子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險增高呈現(xiàn)正相關(guān)性。由于孕激素可以防止子宮內(nèi)膜細(xì)胞的過度增殖，通過與孕激素同時給藥可以降低這種風(fēng)險。因此，一種雌激素/孕激素結(jié)合的HRT方案成為具有完整子宮婦女的推薦方案。然而這種聯(lián)合治療形式明顯減少了雌激素對血清脂質(zhì)譜的有益效應(yīng)(Lobo R.1992，孕激素在激素替代療法中的作用；Am.J Obstet.Gynecol，1661997-2004)。此外，一些孕激素還增加乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(Staffa J.A.等1991，孕激素和乳腺癌的流行病學(xué)綜述，57473-491；King R.J.B.1991，關(guān)于雌激素與孕激素在人類乳腺癌發(fā)生中的作用的討論，J.Ster.Biochem.Molec.Bio.398111-8118)。
正如美國專利第5,516,528號中所公開的，已經(jīng)開發(fā)了HRT制劑，其中包括植物雌激素如大豆異黃酮金雀異黃素和大豆黃素。第一次提到這些植物產(chǎn)品保健作用的是流行病學(xué)資料，資料顯示以大豆為飲食原料的亞洲人罹患乳腺、子宮和其他激素依賴性癌癥的發(fā)生率相對較低，表面上看來是由于大豆和大豆產(chǎn)品攝取量高。
盡管大豆異黃酮對體外人腺癌和乳腺癌細(xì)胞系具有抗增殖作用，但功效只在相對高濃度即15摩爾(“M”)濃度時才會出現(xiàn)(Constantinou，A.I.等1998，金雀異黃素可引起培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞的成熟并可防止裸鼠腫瘤生長，Am.J.Clin.Nutr，681426s-1430s；LeBail，J.C.等1998，黃酮類對MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的雌激素和抗增殖活性，Cancer Lett，130209-216)。植物雌激素在所述高濃度下體外對癌細(xì)胞的抗增殖效應(yīng)可能沒有臨床意義，因?yàn)镮C50值至少比大豆型飲食獲得的血藥濃度要高一個數(shù)量級。
植物雌激素濃度變化范圍為約0.1到10微摩爾濃度，代表了基于大豆飲食的亞洲及歐洲健康人群的基本水平。(Adlercreutz，H.等1993，日本男性植物雌激素血清濃度，Lancet 3421209-1210；Goodham等，1996，一種富含金雀異黃素和大豆黃素的大豆蛋白分離物及其對正常人體血清異黃酮濃度、血小板聚集、血脂和血清磷脂的脂肪酸成分的影響，J.Nutr，1252000-2006)。在上述較低濃度情況下，各種植物雌激素，包括金雀異黃素、counestrol、鷹嘴豆素A、芹黃素、luiolin、山奈酚和腸內(nèi)酯，都可對雌激素受體陽性而不對雌激素受體陰性的人乳腺癌細(xì)胞系引起細(xì)胞增殖，因而闡明了這些化合物的雌激素效應(yīng)(Wang，C.和Kurtzer，M.S，1997，植物雌激素濃度對人乳腺癌細(xì)胞DNA合成的決定性影響，Nutr.Cancer 28236-247)。
因此，盡管公開植物雌激素是HRT制劑的有益成分，但發(fā)現(xiàn)在健康人體中正常水平存在的植物雌激素可增加激素依賴性癌癥的發(fā)病風(fēng)險。
已經(jīng)闡明，類胡蘿卜素蝦青素在嚙齒類動物模型中有體內(nèi)抗致癌效應(yīng)(Tanaka，T.等，1995，食用天然存在的葉黃素蝦青素和角黃素對氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌發(fā)生的抑制作用，Carcinogenesis162957-2963；Tanaka，T.等，1995，天然存在的葉黃素、蝦青素和角黃素對大鼠口腔癌的化學(xué)預(yù)防作用，Canc.Res，554059-4064)。
還證實(shí)類胡蘿卜素八氫番茄紅素具抗癌活性。通過引入在正常情況下哺乳動物細(xì)胞中缺乏的編碼八氫番茄紅素合酶的基因，從而闡明了八氫番茄紅素的預(yù)防癌癥的活性。這些細(xì)胞獲得了抗激活的癌基因轉(zhuǎn)染所造成的惡性轉(zhuǎn)化的抗性(Nishino，H，1998，類胡蘿卜素的癌癥預(yù)防作用，Mutat.Res.402159-163)。
β-胡蘿卜素是最早被發(fā)現(xiàn)具抗癌性質(zhì)的類胡蘿卜素(peto等1981，類胡蘿卜素和癌癥著重于人類干預(yù)研究的更新，Nature290201-208)。但是，β-胡蘿卜素對癌癥的作用的流行病學(xué)研究卻出現(xiàn)了矛盾的結(jié)果。盡管一些研究表明β-胡蘿卜素增加了癌癥發(fā)病風(fēng)險(Omenn等，1996，β-胡蘿卜素和維生素A聯(lián)合用藥對肺癌和心血管疾病的作用，N.Engl.J.Med 3341150-1155)，但其他的細(xì)胞培養(yǎng)和動物研究結(jié)果相當(dāng)一致，即β-胡蘿卜素具有抗癌效應(yīng)。
番茄紅素是一種存在于番茄中的類胡蘿卜素，具有強(qiáng)大的抗氧化劑和抗癌活性。研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素的體外抗乳腺癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)是通過干擾IGF-1受體信號通路和細(xì)胞周期過程介導(dǎo)的(Karas等2000，番茄紅素干擾哺乳動物癌癥細(xì)胞細(xì)胞周期過程和胰島素樣生長因子I信號傳導(dǎo)，Nutr.Cancer，36101-11)。IGF-I是一種生長因子，專性引起乳腺組織惡性轉(zhuǎn)化，其血清濃度決定患乳腺癌(LeRoith，D.，Werner，H.，Beitner-Johnson，D.and Roberts，C.T.，Jr.，1995，胰島素樣生長因子受體的分子和細(xì)胞，Endocr.Rev.16143-59；Hankinson S.E.等1998，胰島素樣生長因子I循環(huán)濃度與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險，Lancet3511393-6)和前列腺癌(Chan，J.M.，Stampfer，M.J.Giovannucci，E.，Gann，P.H.，Ma，J，1998，血清胰島素樣生長因子I與前列腺癌風(fēng)險前瞻性研究，Science 279563-66)的風(fēng)險系數(shù)。
美國專利第5,827,900號公開了應(yīng)用番茄紅素體內(nèi)及體外抑制癌生長，包括激素依賴性內(nèi)皮癌和乳腺癌。美國專利5,827,900要求非常高的類胡蘿卜素劑量水平?！?00專利公開了其作為例證的番茄紅素劑量為每天7毫克/公斤體重到20毫克/公斤體重。因此，‘900專利方法對體重70公斤(154 lbs.)的人來說，就要求每天490毫克到1400毫克的劑量。
在膳食增補(bǔ)劑中番茄紅素和大豆異黃酮的組合應(yīng)用，已被美國專利5,904,924公開?！?24專利公開了含有大豆異黃酮(植物雌激素)和番茄紅素的營養(yǎng)性粉末組合物。‘924專利只提到了植物雌激素降低雌激素依賴性癌癥發(fā)病風(fēng)險的能力。‘924專利完全沒有公開飲食性攝取植物雌激素招致健康副作用的風(fēng)險，并且這種風(fēng)險可被同時攝取類胡蘿卜素減小。
美國專利第5,830,887號和第5,807,586號已公開了膳食增補(bǔ)劑中植物雌激素的用途。美國專利5,807,586公開了供婦女用的含有類胡蘿卜素混合物、維生素A和植物雌激素的膳食添加劑組合?！?86專利公開的維生素A和類胡蘿卜素混合物的劑量范圍為約400到約2000微克視黃醇當(dāng)量(“RE”)。1RE等于約6微克β-胡蘿卜素和約12微克α-胡蘿卜素或隱黃素。因此，‘586專利公開的劑量范圍約等于約2.4-12毫克β-胡蘿卜素和約4.8-24毫克α-胡蘿卜素或隱黃素。既然番茄紅素和葉黃素沒有明顯維生素A原活性，這些類胡蘿卜素的RE值就無法計(jì)算。然而，‘586專利公開的劑量水平只以RE單位表示。因此，對那些沒有明顯維生素A原活性的類胡蘿卜素如番茄紅素和葉黃素，‘586專利公開內(nèi)容沒有限制其劑量水平。
本發(fā)明涉及用于預(yù)防攝入以下物質(zhì)可能伴有的副作用的方法和組合物含有激素如雌激素、植物雌激素和孕激素的藥用組合物、食品、營養(yǎng)添加劑或營養(yǎng)劑。所述副作用包括但不限于各種類型癌癥的發(fā)病風(fēng)險增高。先前已公開，服用植物雌激素有利于降低癌癥的發(fā)病風(fēng)險。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物雌激素的攝入可引發(fā)激素依賴性癌癥發(fā)病風(fēng)險的增高。
因此，長久以來人們渴求一種方法和組合物用于預(yù)防以下物質(zhì)的攝入可能導(dǎo)致的副作用，這些物質(zhì)包括含有植物雌激素、甾體雌激素和/或孕激素的食品、藥用組合物、營養(yǎng)添加劑或營養(yǎng)劑。同時，也需要一種組合物用于預(yù)防攝入含有激素如甾體雌激素和孕激素的藥用組合物而導(dǎo)致的副作用，同時不抑制所述激素的有益作用。
所以，本發(fā)明的目的之一就是提供一種方法，用來抑制含有植物雌激素和孕激素的食品添加劑或膳食添加劑的攝入可能導(dǎo)致的副作用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種組合物，用于防止含有植物雌激素和孕激素的食品添加劑或膳食添加劑的攝入可能導(dǎo)致的副作用。
此外，本發(fā)明再一目的是提供一種新型含激素的藥用組合物，其副作用輕微，針對所述激素可能具有的副作用，從而克服先有技術(shù)已知的藥用組合物的缺陷。
本發(fā)明其他的目的會隨說明的展開而明朗。
相應(yīng)地，本發(fā)明方法的目的是預(yù)防激素替代療法中雌激素和/或孕激素給藥帶來的副作用，同時并不抑制所述激素的有益作用。
本發(fā)明的另一目的是提供一種方法來預(yù)防植物雌激素給藥帶來的副作用。本發(fā)明要求保護(hù)的方法的再一目的是預(yù)防植物雌激素給藥帶來的副作用，同時并不抑制所述激素的有益作用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了可用來預(yù)防激素用藥帶來的副作用的組合物。本發(fā)明的組合物可以是適用于人類一日用藥一次的單位劑型。
本發(fā)明的目的之一是提供一種組合物用來預(yù)防植物雌激素給藥帶來的副作用。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種組合物用來預(yù)防甾體激素或孕激素給藥帶來的副作用。
本發(fā)明的另一目的是提供一種組合物用來預(yù)防植物雌激素、甾體激素或孕激素給藥帶來的副作用，同時并不抑制所述激素的有益作用。
圖2番茄紅素抑制金雀異黃素和雌二醇誘導(dǎo)的對激素依賴性惡性細(xì)胞的刺激作用。
圖3番茄紅素對在金雀異黃素和IGF-1存在下培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞的作用。
圖4各種類胡蘿卜素抑制雌二醇和金雀異黃素誘導(dǎo)的ECC-1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。
圖5番茄紅素以劑量依賴形式抑制雌二醇和金雀異黃素誘導(dǎo)的ECC-1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。
圖6番茄紅素和八氫番茄紅素對金雀異黃素誘導(dǎo)的ECC細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用。
本發(fā)明最佳實(shí)施方案詳述以下說明書闡明本發(fā)明最佳實(shí)施方案。下述說明不能解釋為對本發(fā)明的限制，應(yīng)理解為技術(shù)熟練者可對本發(fā)明進(jìn)行許多顯而易見的變更。
整個說明書中使用的“激素”是指來自于高等植物的甾體雌激素、孕激素和非甾體雌激素(植物雌激素)以及化學(xué)修飾衍生物、合成等同物的它們的混合物。
整個說明書中使用的“甾體雌激素”或“雌激素”是指雌二醇、雌酮、雌三醇、合成等同物、化學(xué)修飾衍生物及其混合物。
整個說明書中使用的“孕激素”是指可引起孕酮效應(yīng)的物質(zhì)，例如孕酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、炔諾孕酮、合成等同物、化學(xué)修飾衍生物及其混合物。
整個說明書中使用的“植物雌激素”是指大豆蛋白異黃酮、黃酮以及其葡萄糖苷、馬來?；咸烟擒蘸鸵阴；咸烟擒昭苌铩⒑铣傻韧?、化學(xué)修飾衍生物及其混合物。例證性植物雌激素包括例如大豆黃素、金雀異黃素和黃豆黃素。
整個說明書中使用的“給藥”或“用藥”是指通過各種途徑中的一種或多種途徑包括口服、皮膚、陰道、子宮內(nèi)、肌肉內(nèi)或靜脈注射將藥物導(dǎo)入患者。
可用于本發(fā)明的類胡蘿卜素包括但不限于番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、ζ-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、黃體素、玉米黃素、隱黃素、蝦青素及其混合物。整個說明書中的類胡蘿卜素為天然或合成來源的類胡蘿卜素或來源于遺傳修飾生物體的類胡蘿卜素。
本發(fā)明提供一種方法，用來預(yù)防沒有可檢測到的癌癥的患者使用至少一種激素而可能引起的副作用，本方法包括給上述患者服用至少一種類胡蘿卜素，且用藥劑量可有效預(yù)防所述副反應(yīng)。所述類胡蘿卜素可以以獨(dú)立于所述激素的組合物給藥或以還含有所述激素的組合物給藥。
本發(fā)明方法中可給予單一類胡蘿卜素及給予組合類胡蘿卜素或給予類胡蘿卜素混合物。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，各種番茄紅素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素的組合在預(yù)防激素給藥引起的副作用方面表現(xiàn)出有益的協(xié)同效應(yīng)。相應(yīng)地，類胡蘿卜素混合物番茄紅素和八氫番茄紅素；番茄紅素和六氫番茄紅素；番茄紅素、八氫番茄紅素和六氫番茄紅素都可在本發(fā)明要求保護(hù)的方法中使用。
在消費(fèi)含植物雌激素的產(chǎn)品時，患者血清中植物雌激素的生理濃度可達(dá)0.4到4微摩爾水平。

圖1A說明，培養(yǎng)ECC-1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞時，植物雌激素金雀異黃素或大豆黃素，或存在于大豆提取物的二者的混合物，在這樣的濃度范圍內(nèi)時，可引發(fā)細(xì)胞增殖率的顯著增高(用cpm表示，每分鐘計(jì)數(shù))。因此，植物雌激素濃度達(dá)到這種水平的患者患某些類型癌癥的風(fēng)險增高，尤其是子宮內(nèi)膜和乳腺癌。
圖2通過在有或無番茄紅素存在的兩種情況下，對比培養(yǎng)癌癥細(xì)胞在植物雌激素金雀異黃素和雌二醇濃度逐漸增高下的細(xì)胞增殖率，說明了這個效應(yīng)。很清楚地表明，番茄紅素的存在充分抑制了金雀異黃素引起的細(xì)胞增殖率增高。同樣的效應(yīng)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(圖2，上圖)和乳腺癌細(xì)胞(圖2，下圖)中也可看到。這種抑制效應(yīng)在圖4中得到進(jìn)一步證實(shí)，其中可清楚看出不僅番茄紅素，而且類胡蘿卜素如蝦青素、八氫番茄紅素和β-胡蘿卜素都是植物雌激素金雀異黃素引起的細(xì)胞增殖的有效抑制劑。
當(dāng)消費(fèi)了含有植物雌激素的食品或飲食增補(bǔ)劑后，植物雌激素的生理濃度很快會高于約10微摩爾。這樣的水平超過了0.4到4微摩爾這一人類消費(fèi)植物雌激素后的穩(wěn)定狀態(tài)植物雌激素生理濃度范圍。圖1B說明了這種短暫的高濃度雌激素可誘發(fā)細(xì)胞增殖，并因此增加了癌癥發(fā)病風(fēng)險。圖1B說明培養(yǎng)ECC-1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞時，40微摩爾水平的大豆黃素或金雀異黃素，或存在于大豆提取物的二者的混合物，在培養(yǎng)第一天即可引發(fā)細(xì)胞增殖率的顯著增高。植物雌激素的抑制效應(yīng)從接種的第二天才變得顯著。本發(fā)明方法可有效抑制由消費(fèi)含植物雌激素的產(chǎn)品或組合物后，很快產(chǎn)生的這種高植物雌激素水平引起的副作用。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案，沒有可檢測到的癌癥的患者使用至少一種激素而引起的副作用，可通過與有效預(yù)防所述副作用的劑量的至少一種類胡蘿卜素共同給藥來加以預(yù)防。本發(fā)明方法包括預(yù)防所述副作用卻不抑制所述植物雌激素的有益作用。
類胡蘿卜素給藥劑量從每天約2毫克到約10毫克，優(yōu)選從每天約2毫克到約6毫克，最優(yōu)選每天約2毫克。沒有明顯維生素A原活性的類胡蘿卜素，例如ζ-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、黃體素、玉米黃素、蝦青素和番茄紅素，優(yōu)選給藥劑量為每天約2毫克。
當(dāng)本發(fā)明方法包括給予患者至少一種選自α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、隱黃素的類胡蘿卜素時，所述類胡蘿卜素優(yōu)選用藥劑量為每天約2毫克。
本發(fā)明方法也可用來預(yù)防沒有可檢測到的癌癥的患者使用激素如雌激素和孕激素而可能引起的副作用。所述方法可用于例如激素替代療法，由此激素可與用藥量足以預(yù)防所述激素引起的副作用的至少一種類胡蘿卜素聯(lián)合用藥。所述類胡蘿卜素可以以與所述激素分離的組合物給藥，或以另外含有所述激素的組合物給藥。
本發(fā)明要求保護(hù)的方法對激素替代療法有特殊的幫助作用。僅使用雌激素的激素替代療法，或雌激素替代療法存在子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險。在減少這種風(fēng)險的嘗試中，經(jīng)常使用包括雌激素/孕激素聯(lián)合用藥的激素替代療法。然而，這種用藥形式可減少雌激素的有益效應(yīng)。而且，一些孕激素可使得乳腺癌發(fā)病風(fēng)險增高。本發(fā)明方法可預(yù)防雌激素和孕激素用藥帶來的副作用，同時并不抑制傳統(tǒng)激素替代療法中激素的有益活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法用于預(yù)防IGF-1水平升高引起的累加副作用。IGF-1天然存在于正常健康人的血清中。然而，當(dāng)IGF-1水平升高時，就構(gòu)成了乳腺癌和前列腺癌的顯著風(fēng)險因子。因此，在IGF-1水平提高的個體中，激素用藥引發(fā)的癌癥發(fā)病風(fēng)險就增高了。由IGF-1水平提高和激素消費(fèi)聯(lián)合引起的累加副作用，可由給以用藥量足以預(yù)防所述副作用的至少一種類胡蘿卜素來預(yù)防。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法用于預(yù)防無激素存在情況下IGF-1水平提高引起的副作用。當(dāng)IGF-1水平升高時，即使無激素存在，也會構(gòu)成某些癌癥的顯著風(fēng)險因子。這些由IGF-1水平升高引起的副作用，包括癌癥風(fēng)險升高，都可由給以用藥量足以預(yù)防所述副作用的至少一種類胡蘿卜素來預(yù)防。
本發(fā)明提供了可用于預(yù)防激素用藥引起的副作用的組合物。這些副作用包括例如癌癥發(fā)病風(fēng)險的增高。本發(fā)明組合物是適于人類用藥的單位劑型。本發(fā)明組合物包含生理有效量的至少一種激素和用藥劑量可有效預(yù)防所述副作用的至少一種類胡蘿卜素。本發(fā)明要求保護(hù)的組合物可預(yù)防激素用藥引起的副作用，并且不抑制所述激素的有益活性。
本發(fā)明組合物中可使用單一類胡蘿卜素以及其組合物或混合物。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，各種組合的番茄紅素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素在預(yù)防激素給藥引起的副作用方面表現(xiàn)出有益的協(xié)同效應(yīng)。相應(yīng)地，類胡蘿卜素混合物番茄紅素和八氫番茄紅素；番茄紅素和六氫番茄紅素；番茄紅素、八氫番茄紅素和六氫番茄紅素都可用于本發(fā)明要求保護(hù)的組合物。當(dāng)給予所述混合物時，優(yōu)選番茄紅素和八氫番茄紅素的混合物。
本發(fā)明組合物可有效抑制由消費(fèi)含植物雌激素的產(chǎn)品或組合物后，很快產(chǎn)生的植物雌激素水平升高引起的副作用(見圖1和2)。
給消費(fèi)植物雌激素的患者同時服用至少一種類胡蘿卜素，用藥劑量每天約2毫克，可減少由消費(fèi)植物雌激素引起的癌癥發(fā)病風(fēng)險。本發(fā)明包括適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種雌激素和至少一種類胡蘿卜素，后者的優(yōu)選劑量為約2毫克。最好類胡蘿卜素用量足以使所述類胡蘿卜素有效血清濃度達(dá)到約1.5微摩爾。
當(dāng)本發(fā)明組合物中包括至少一種植物雌激素時，類胡蘿卜素優(yōu)選沒有明顯維生素A原活性。沒有明顯維生素A原活性的類胡蘿卜素包括例如番茄紅素、ζ-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、黃體素、玉米黃素和蝦青素。當(dāng)所述類胡蘿卜素包含多種類胡蘿卜素的混合物時，這些混合物優(yōu)選包含番茄紅素和六氫番茄紅素；更優(yōu)選包含番茄紅素、六氫番茄紅素和八氫番茄紅素；最優(yōu)選包含番茄紅素和八氫番茄紅素。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案是適合人類一日一次給藥的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種激素以及至少一種類胡蘿卜素，所述激素選自甾體雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、孕激素、炔諾孕酮和孕酮，其中所述類胡蘿卜素的用量能夠有效預(yù)防所述激素用藥可能帶來的副作用。這種單位劑型可預(yù)防所述激素引起的副作用，同時不抑制所述激素的有益活性。優(yōu)選類胡蘿卜素劑量為約2到約10毫克，更優(yōu)選類胡蘿卜素劑量為約2到約6毫克，最優(yōu)選約2毫克。最好，類胡蘿卜素用量足以引起所述類胡蘿卜素有效血清濃度達(dá)到約1.5微摩爾濃度。當(dāng)所述類胡蘿卜素包含多種類胡蘿卜素的混合物時，所述混合物優(yōu)選包含番茄紅素、八氫番茄紅素和六氫番茄紅素；更優(yōu)選包含番茄紅素、六氫番茄紅素和八氫番茄紅素。
本發(fā)明要求保護(hù)的包含至少一種甾體雌激素或孕激素的組合物對治療女性絕經(jīng)的激素替代療法有特殊的幫助作用。常規(guī)的激素替代療法用于絕經(jīng)治療時，可引起某些癌癥發(fā)病風(fēng)險增高。本發(fā)明組合物可用于激素替代療法，同時也可預(yù)防甾體雌激素或孕激素用藥引發(fā)的副作用，例如癌癥發(fā)病風(fēng)險增高。本發(fā)明要求保護(hù)的組合物可預(yù)防所述副作用，同時不抑制所述激素的有益活性。
本發(fā)明組合物可用于預(yù)防植物雌激素和共同攝入的生長因子IGF-1水平升高對細(xì)胞增殖產(chǎn)生的累加副作用。IGF-1天然存在于正常健康人的血清中，然而，當(dāng)IGF-1水平升高時，可顯著增加乳腺癌和前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險。圖3A說明了培養(yǎng)激素依賴性MCF-7乳腺癌癌細(xì)胞時，金雀異黃素(用量范圍為約0.4到4微摩爾濃度)和IGF-1(30納摩爾濃度)與只用金雀異黃素加以刺激的對照組相比，可顯著增高細(xì)胞增殖率。增加3到5微摩爾濃度范圍的番茄紅素，可抑制組合存在的IGF-1和金雀異黃素激發(fā)的細(xì)胞增殖。相應(yīng)地，包含至少一種植物雌激素和至少一種類胡蘿卜素的本發(fā)明組合物可給予IGF-1水平增高的患者以預(yù)防IGF-1水平增高所引發(fā)的累加副作用。
本發(fā)明將在以下實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步解釋，這是更進(jìn)一步地描述而不是限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例通用方法類胡蘿卜素的來源和溶液番茄紅素(≥97％)提取于5％番茄油樹脂，如美國專利5,827,900所述。合成番茄紅素購自Sigma Chemical Co.(以色列)，蝦青素和β-胡蘿卜素也購自此公司。八氫番茄紅素提取自番茄提取物，LycoredNatural Products Industries Ltd.，Beer Sheva，以色列。
四氫呋喃(THF)含0.25％丁基化羥甲苯，將其加入純化的類胡蘿卜素中作為抗氧化劑。類胡蘿卜素用2毫摩爾濃度THF溶解，并于-70℃保存。臨用前，解凍貯備液并在氮?dú)庀录尤爰?xì)胞培養(yǎng)基中，然后劇烈攪拌。用Millex-HV濾器(Millipore)過濾，去除沉淀。在經(jīng)2-丙醇和n-己烷∶二氯甲烷提取后，培養(yǎng)基中類胡蘿卜素終濃度用光譜法測定，如美國專利5,827,900所述。
THF的最終濃度0.5％對測得的參數(shù)沒有任何顯著影響。所有過程避光操作。激素、生長因子和其他細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)雌二醇、金雀異黃素和大豆黃素購自Sigma Chemical.(以色列)。含有15％金雀異黃素、15％大豆黃素和1％黃豆黃素的大豆提取物購自Kikkoman，(Chiba-ken，日本)。人重組IGF-1購自GroPep，(Adelaide，澳大利亞)。Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FCS)和不含Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液購自Biological Industries(Beth Haemek，以色列)。細(xì)胞系人子宮內(nèi)膜癌(雌激素依賴型)細(xì)胞系ECC-1開發(fā)自Dr.P.G.Satyaswaroop，賓夕法尼亞州立大學(xué)，賓夕法尼亞州，美國，惠贈自Dr.R.Oregan，西北大學(xué)，芝加哥，依利諾依州，美國。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(雌激素依賴型)和MDA-231(激素非依賴型)得自于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(洛克維爾，馬撒諸塞州，美國)。細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞增殖分析細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng)，含青霉素(100U/毫升)，鏈霉素(0.1毫克/毫升)，制霉菌素(12.5微克/毫升)，胰島素(0.6微克/毫升)和10％FCS。根據(jù)Vignon等(1987，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1461502-8)的程序，連續(xù)在不含酚紅、含有10％然后3％的活性炭吸附過的FCS的培養(yǎng)基中傳代使細(xì)胞去除內(nèi)源性類固醇。細(xì)胞接種于96孔板中(每孔5000個細(xì)胞)，培養(yǎng)基為DMEM，含3％活性炭吸附過的FCS。一天后，培養(yǎng)基更換為只含有溶解的類胡蘿卜素或THF的培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基每天更換以確保類胡蘿卜素的連續(xù)供應(yīng)。
培養(yǎng)后，細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞增殖率通過[3H]標(biāo)記的胸苷摻入細(xì)胞DNA的摻入情況來估算，見美國專利第5,827,900號。細(xì)胞生長情況也可在胰蛋白酶作用后并在Isotone-II(Coulter Electronics，盧頓，英格蘭)中稀釋后，用Coulter計(jì)數(shù)器進(jìn)行直接細(xì)胞計(jì)數(shù)來測量。兩種方法相關(guān)性良好。
實(shí)施例1異黃酮對ECC-1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的刺激作用。
將ECC-1細(xì)胞在濃度遞增的大豆產(chǎn)品兩種主要的異黃酮金雀異黃素和大豆黃素以及大豆提取物一同培養(yǎng)。3天后，細(xì)胞增殖通過[3H]標(biāo)記的胸苷摻入DNA來測定(圖1A)。金雀異黃素、大豆黃素和大豆提取物在0.4和4微摩爾濃度皆可刺激細(xì)胞增殖，這一濃度范圍也可見于大豆補(bǔ)償性個體的血清中。在更高的非生理性濃度(≥10微摩爾濃度)時，經(jīng)過3天培養(yǎng)后金雀異黃素和大豆提取物而不是大豆黃素可抑制細(xì)胞增殖(圖1A)。這些結(jié)果說明，金雀異黃素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長具有雙重效應(yīng)，而大豆黃素只具刺激作用。
此外，ECC-1細(xì)胞只用單一高濃度(40微摩爾)的金雀異黃素、大豆黃素和大豆提取物分別培養(yǎng)，在3天期間內(nèi)每天分析細(xì)胞增殖情況。結(jié)果如圖1B所示，培養(yǎng)一天后高濃度異黃酮也可刺激細(xì)胞增殖，金雀異黃素的抑制效應(yīng)只在培養(yǎng)第二天見到。這些結(jié)果表明，短暫提高的異黃酮水平，特別是金雀異黃素的水平，以及通常細(xì)胞生長抑制相關(guān)水平，實(shí)際上會在大豆補(bǔ)償性個體中起刺激作用。
實(shí)施例2番茄紅素抑制金雀異黃素和雌二醇對激素依賴性惡性細(xì)胞的刺激作用。
考察了雌二醇和金雀異黃素的補(bǔ)充給藥法對激素依賴型細(xì)胞系MCF-7乳腺癌和ECC-1子宮內(nèi)膜癌的增殖的比較效應(yīng)(圖2)。在每種細(xì)胞系中，金雀異黃素對增殖表現(xiàn)出雙重效應(yīng)，低濃度刺激而高濃度抑制(圖2)，如實(shí)施例1所證實(shí)。雌二醇在每個測試濃度(1和10nM)時對細(xì)胞生長只具有刺激作用(圖2)。這些結(jié)果表明金雀異黃素的刺激效應(yīng)可能是因?yàn)槠渚哂写萍に刈饔谩?br> 如上所述，金雀異黃素或雌二醇都可刺激細(xì)胞培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充番茄紅素，培養(yǎng)三天后分析細(xì)胞生長情況。如圖2所示，番茄紅素補(bǔ)充給藥在3到5微摩爾濃度可顯著抑制兩種受試激素依賴性癌細(xì)胞系的基礎(chǔ)生長和雌激素誘導(dǎo)(金雀異黃素或雌二醇)的生長。
實(shí)施例3番茄紅素抑制激素依賴型和激素非依賴型乳腺癌細(xì)胞的IGF-1刺激性生長。
圖3表明，IGF-1(30納摩爾濃度)補(bǔ)充給藥對激素依賴型MCF-7乳腺癌細(xì)胞(A圖)和激素非依賴型MDA-231乳腺癌細(xì)胞(B圖)生長都有顯著刺激作用。在MCF-7細(xì)胞中，由于IGF-1(圖3A)的存在，使得金雀異黃素的刺激效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。MDA-231受IGF-1而不受金雀異黃素刺激。因此，金雀異黃素不僅刺激激素依賴型癌細(xì)胞增殖，同時IGF-1象其他生長因子一樣可對此效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。
如上細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充給藥外，補(bǔ)充番茄紅素3到5微摩爾濃度。如圖3所示，番茄紅素可抑制IGF對激素依賴型和激素非依賴型乳腺癌細(xì)胞系的刺激作用。就MDA-231細(xì)胞來說，細(xì)胞增殖減到低于對照組的水平。
實(shí)施例4各種類胡蘿卜素抑制雌二醇和金雀異黃素誘導(dǎo)的ECC-1細(xì)胞增殖。
ECC-1激素依賴型細(xì)胞系用雌二醇(10納摩爾濃度，圖4)或金雀異黃素(1微摩爾濃度，圖4)刺激，并另外補(bǔ)充各種類胡蘿卜素進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果清楚地表明，所有受試類胡蘿卜素(番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素以及八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的混合物)皆可有效抑制雌二醇和金雀異黃素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。
實(shí)施例5番茄紅素以劑量依賴方式抑制雌二醇和金雀異黃素誘導(dǎo)的ECC-1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。
激素依賴型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系ECC-1用雌二醇(10納摩爾濃度，圖5)或金雀異黃素(1微摩爾濃度，圖5)刺激，并另外補(bǔ)充各種濃度番茄紅素進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果清楚地表明，番茄紅素濃度升高時抑制所用增強(qiáng)，番茄紅素各種測試濃度皆可有效抑制雌二醇和金雀異黃素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。番茄紅素最低測試濃度(0.9微摩爾濃度)在人血清生理濃度范圍內(nèi)。
實(shí)施例6MCF-7乳腺癌細(xì)胞用金雀異黃素(4微摩爾濃度)刺激，并另外補(bǔ)充番茄紅素或八氫番茄紅素或兩者的組合物，在兩種生理濃度下(圖6A)或比生理濃度約大一個數(shù)量級的濃度下(圖6B)進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，高的非生理濃度的各種類胡蘿卜素可有效顯著抑制植物雌激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，兩者組合效果更佳(圖6B)。在低生理濃度情況下，番茄紅素臨界性有效抑制植物雌激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，而八氫番茄紅素?zé)o效。然而，番茄紅素和八氫番茄紅素的組合物在生理濃度下有效顯著抑制植物雌激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。
盡管本發(fā)明所述實(shí)施方案已通過例證方式加以說明，很明顯，可在不背離本發(fā)明宗旨或不超出本權(quán)利要求范圍內(nèi)對本發(fā)明進(jìn)行各種修飾、變動和修改。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防沒有可檢測到的癌癥的患者使用至少一種激素而可能引起的副作用的方法，該方法包括給予所述患者至少一種類胡蘿卜素，其用藥劑量為每天約2-10毫克。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述類胡蘿卜素的使用劑量為每天約2-6毫克。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述類胡蘿卜素的使用劑量為每天約2毫克。
4.一種用于預(yù)防沒有可檢測到的癌癥的患者使用至少一種激素而可能引起的副作用方法，該方法包括給予所述患者至少一種沒有明顯維生素A原活性的類胡蘿卜素，其用藥劑量為每天約2毫克。
5.一種用于預(yù)防沒有可檢測到的癌癥的患者使用至少一種激素而可能引起的副作用的方法，該方法包括給予所述患者至少一種類胡蘿卜素，其用藥劑量為每天約2毫克，其中所述類胡蘿卜素選自α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和隱黃素。
6.權(quán)利要求1、4或5任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素的用量足以使所述類胡蘿卜素的有效血清濃度達(dá)到約1.5微摩爾。
7.權(quán)利要求1、4或5任一項(xiàng)的方法，其中所述激素包括植物雌激素、非甾體雌激素或其混合物。
8.權(quán)利要求1、4或5任一項(xiàng)的方法，其中所述激素包括甾體雌激素、孕激素或其混合物。
9.權(quán)利要求1或4的方法，其中所述類胡蘿卜素為番茄紅素。
10.權(quán)利要求1或4的方法，其中所述類胡蘿卜素選自番茄紅素、ζ-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、黃體素、玉米黃素和蝦青素。
11.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素包括番茄紅素和八氫番茄紅素的混合物。
12.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素包括番茄紅素和六氫番茄紅素的混合物。
13.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素包括番茄紅素、八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的混合物。
14.權(quán)利要求1、4或5任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素以獨(dú)離于所述激素的組合物與所述激素同時給藥。
15.權(quán)利要求1、4或5任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素以進(jìn)一步含有所述激素的組合物與所述激素同時給藥。
16.一種用于預(yù)防沒有可檢測到的癌癥的患者使用至少一種激素而可能引起的副作用的方法，其中所述激素選自雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、炔諾孕酮、孕激素和孕酮，該方法包括給予所述患者至少一種沒有明顯維生素A原活性的類胡蘿卜素，其用藥劑量為每天約2-10毫克，同時不會抑制所述激素的有益作用。
17.一種用于預(yù)防沒有可檢測到的癌癥的患者使用至少一種激素而可能引起的副作用的方法，其中所述激素選自雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、炔諾孕酮、孕激素和孕酮，該方法包括給予所述患者至少一種沒有明顯維生素A原活性的類胡蘿卜素，其用藥劑量為每天約2-6毫克，同時不會抑制所述激素的有益作用。
18.一種用于預(yù)防沒有可檢測到的癌癥的患者使用至少一種激素而可能引起的副作用的方法，其中所述激素選自雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、炔諾孕酮、孕激素和孕酮，該方法包括給予所述患者至少一種沒有明顯維生素A原活性的類胡蘿卜素，其用藥劑量為每天約2毫克，同時不會抑制所述激素的有益作用。
19.一種用于預(yù)防沒有可檢測到的癌癥的患者使用至少一種激素而可能引起的副作用的方法，其中所述激素選自雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、炔諾孕酮、孕激素和孕酮，該方法包括給予所述患者至少一種選自α-胡蘿卜素、隱黃素的類胡蘿卜素，其用藥劑量為每天約2毫克，同時不會抑制所述激素的有益作用。
20.權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素選自番茄紅素、ζ-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、黃體素、玉米黃素和蝦青素。
21.權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素包括番茄紅素和八氫番茄紅素的混合物。
22.權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素包括番茄紅素和六氫番茄紅素的混合物。
23.權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素包括番茄紅素、八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的混合物。
24.權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素以獨(dú)立于所述激素的組合物與所述激素同時給藥。
25.權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的方法，其中所述類胡蘿卜素以進(jìn)一步含有所述激素的組合物與所述激素同時給藥。
26.一種適合人類用藥的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種激素以及至少一種類胡蘿卜素，其中所述激素選自甾體雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、孕激素、炔諾孕酮和孕酮，其中所述類胡蘿卜素的用量能夠有效預(yù)防所述激素用藥可能帶來的副作用。
27.一種適合人類用藥的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種激素以及至少一種類胡蘿卜素，其中所述激素選自甾體雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、孕激素、炔諾孕酮和孕酮，其中所述類胡蘿卜素的用量能夠有效預(yù)防所述激素用藥可能帶來的副作用，同時不會抑制所述激素的有益作用。
28.權(quán)利要求26和27任一項(xiàng)的單位劑型，其中所述類胡蘿卜素的劑量為約2-6毫克。
29.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種激素以及至少一種類胡蘿卜素，其中所述激素選自甾體雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、孕激素、炔諾孕酮和孕酮，其中所述類胡蘿卜素的用量能夠有效預(yù)防所述激素用藥可能帶來的副作用。
30.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種激素以及至少一種類胡蘿卜素，其中所述激素選自甾體雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、孕激素、炔諾孕酮和孕酮，其中所述類胡蘿卜素的用量能夠有效預(yù)防所述激素用藥可能帶來的副作用，同時不會抑制所述激素的有益作用。
31.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種激素以及至少一種類胡蘿卜素，其中所述激素選自甾體雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、孕激素、炔諾孕酮和孕酮，其中所述類胡蘿卜素的用量為約2-10毫克。
32.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種激素以及至少一種類胡蘿卜素，其中所述激素選自甾體雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、孕激素、炔諾孕酮和孕酮，其中所述類胡蘿卜素的用量為約2-6毫克。
33.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種激素以及至少一種類胡蘿卜素，其中所述激素選自甾體雌激素、雌二醇、雌酮、甲羥孕酮、炔諾酮、norethisterone、孕激素、炔諾孕酮和孕酮，其中所述類胡蘿卜素的用量為約2毫克。
34.根據(jù)權(quán)利要求26-33任一項(xiàng)的單位劑型，其中所述類胡蘿卜素選自番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、ζ-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、黃體素、玉米黃素、隱黃素和蝦青素。
35.根據(jù)權(quán)利要求26-33任一項(xiàng)的單位劑型，其中所述類胡蘿卜素包括番茄紅素和六氫番茄紅素的混合物。
36.根據(jù)權(quán)利要求26-33任一項(xiàng)的單位劑型，其中所述類胡蘿卜素包括番茄紅素和八氫番茄紅素的混合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求26-33任一項(xiàng)的單位劑型，其中所述類胡蘿卜素包括番茄紅素、八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的混合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求26、27、32或33任一項(xiàng)的單位劑型，其中所述類胡蘿卜素的用量足以使該類胡蘿卜素的有效血清濃度達(dá)到約1.5微摩爾。
39.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種植物雌激素以及至少一種類胡蘿卜素，所述類胡蘿卜素選自ζ-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、黃體素、玉米黃素和蝦青素，其中所述類胡蘿卜素的用量為約2毫克。
40.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種植物雌激素以及至少一種類胡蘿卜素，所述類胡蘿卜素選自ζ-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、黃體素、玉米黃素和蝦青素，其中所述類胡蘿卜素的用量足以使該類胡蘿卜素的有效血清濃度達(dá)到約1.5微摩爾。
41.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種植物雌激素以及番茄紅素和八氫番茄紅素的混合物，其中所述混合物的用量為約2毫克。
42.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種植物雌激素以及番茄紅素和六氫番茄紅素的混合物，其中所述混合物的用量為約2毫克。
43.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種植物雌激素以及番茄紅素、八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的混合物，其中所述混合物的用量為約2毫克。
44.一種適合人類一日用藥一次的單位劑型，它包含生理有效量的至少一種植物雌激素以及至少一種選自α-胡蘿卜素、隱黃素的類胡蘿卜素，其中所述類胡蘿卜素的用量為約2毫克。
45.權(quán)利要求44的單位劑型，其中所述類胡蘿卜素的用量足以使該類胡蘿卜素的有效血清濃度達(dá)到約1.5微摩爾。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防沒有可檢測到的癌癥的患者使用至少一種激素而可能引起的副作用，包括給所述患者服用至少一種類胡蘿卜素。本發(fā)明方法可用于預(yù)防各種由激素用藥引起的副作用，包括例如用于防止癌癥發(fā)生風(fēng)險增高。本發(fā)明要求保護(hù)的方法可預(yù)防這些副作用，同時并不抑制所述激素的有益作用。本發(fā)明進(jìn)一步提供了可用于預(yù)防激素用藥副作用的組合物。本發(fā)明所述組合物可以為適用于人類每日用藥的單位劑型。
文檔編號A61K31/56GK1434707SQ01810131
公開日2003年8月6日 申請日期2001年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月29日
發(fā)明者J·利維, Y·沙羅尼 申請人:利庫德天然產(chǎn)品工業(yè)有限公司