專利名稱：組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組合物。
具體地講，本發(fā)明涉及含有其含量能提供不大于200μg/天劑量的化合物地藥物組合物。該化合物是含有環(huán)系和氨基磺酸根的環(huán)狀化合物。本發(fā)明還涉及該組合物在治療中的用途。
背景技術(shù)：
雌激素在激素避孕法、在絕經(jīng)后激素替代療法(HRT)中起主要作用，并用于治療婦科疾病(例如，乳腺癌)和男科疾病(如前列腺癌)。對(duì)于HRT和避孕，雌激素主要與促孕素一起使用，促孕素如左炔諾孕酮、去氧孕烯、炔諾酮、醋酸環(huán)丙孕酮、氯地孕酮、地諾孕素。
當(dāng)用于避孕時(shí)，需要用雌激素安全地抑制卵泡成熟和排卵，但是另一方面它們代替了雌二醇的內(nèi)源性卵巢分泌，而雌二醇很大程度上受到抑制。此替代對(duì)于維持人工月經(jīng)周期及其它生殖功能是重要的，其不能僅僅通過(guò)使用促孕素達(dá)到任何令人滿意的程度。
此外，內(nèi)源性和外源性雌激素在女性機(jī)體中履行重要的中樞神經(jīng)和代謝功能正常的雌激素水平對(duì)婦女的康樂(lè)起決定性作用。它們?cè)诖讼到y(tǒng)中的存在通過(guò)多種機(jī)理抵抗心血官疾病的發(fā)生在血液中產(chǎn)生有利的脂蛋白，抑制脂類在血管壁沉積，通過(guò)正面影響血管張力來(lái)降低血壓，降低重要血管扇面中灌注阻力，減弱對(duì)血管肌肉的收縮刺激。內(nèi)膜，當(dāng)受雌激素影響時(shí)，釋放對(duì)抗血栓形成的因子。雌激素對(duì)于保護(hù)婦女骨結(jié)構(gòu)也是不可或缺的。它們的缺乏會(huì)導(dǎo)致骨的破壞(骨質(zhì)疏松)。雌激素的這些近期發(fā)現(xiàn)的“中樞神經(jīng)”和“代謝”作用是HRTd的一個(gè)主要方面。可以認(rèn)為雌激素在男性機(jī)體中具有類似的功能，而它們的撤除導(dǎo)致與婦女中所見(jiàn)相類似的紊亂。這兩種性別之間的一個(gè)不同之處是，較女性而言，在男性中激素產(chǎn)生的停止缺乏規(guī)律性且發(fā)生得較晚。
然而，盡管雌激素療法具有全面的正面作用，它們也存在尚未解決的問(wèn)題，這些問(wèn)題限制了雌激素的治療用途或帶來(lái)了副作用。
已知雌激素表現(xiàn)出了藥動(dòng)學(xué)方面的不足。當(dāng)口服時(shí)，天然雌激素(雌二醇、雌酮、硫酸雌酮、雌二醇的酯、雌三醇)僅僅提供了程度非常低的生物利用度。此程度在人與人之間變化非常大，致使不能給出一般的推薦劑量。此物質(zhì)從血液中快速清除是另一個(gè)問(wèn)題。在HRT中雌激素的替代常常必須依個(gè)體調(diào)整。
合成的雌激素也是一樣。最重要的合成修飾雌激素甾類是乙炔基雌二醇(EE)。此雌激素是口服激素避孕藥中的主要成分。除EE外，在一些情況下使用美雌醇；其是前藥，在生物體中其代謝為EE。當(dāng)給人口服時(shí)，EE比上述雌激素具有更好的生物利用度，但是在個(gè)體之間其口服生物利用度變化很大。一些作者已指出此事實(shí)，并還指出已證實(shí)在此物質(zhì)口服后其血液濃度非常不規(guī)律(Goldzieher，J.W.1989，Goldzieher，J.W.1990，Humpel，M.1987，Kuhnz，1993)。
此外，已知的雌激素表現(xiàn)出藥效學(xué)方面的不足。由腸腔吸收后，口服給藥的活性組分通過(guò)肝臟進(jìn)入機(jī)體。
事實(shí)是雌激素制劑特別重要，因?yàn)楦闻K是雌激素的靶器官；雌激素的口服吸收導(dǎo)致在肝臟中的強(qiáng)雌激素作用。在人肝臟中由雌激素控制的分泌活性包括合成轉(zhuǎn)移蛋CBG、SHBG、TBG、血管緊張肽原、對(duì)于凝血生理很重要的一些因子以及脂蛋白。如果天然雌激素被引入雌性機(jī)體并同時(shí)避免通過(guò)肝臟(例如通過(guò)透皮使用)，則上述肝臟功能本質(zhì)上保持不變。當(dāng)口服給藥時(shí)，等量的天然雌激素(見(jiàn)上述定義)，產(chǎn)生了肝臟參數(shù)的清晰反應(yīng)SHBG、CBG、血管緊張肽原、HDL(高密度脂蛋白)升高。當(dāng)替代天然雌激素，使用馬雌激素制劑(所謂的軛合雌激素)時(shí)，雌激素的這些肝臟作用明顯較強(qiáng)(Campbell，S.等，1981)。乙炔基雌二醇和DES具有更強(qiáng)的肝臟雌激素活性。
當(dāng)涉及抗促性腺激素性質(zhì)時(shí)，在肝臟中EE較口服給藥的天然雌激素的雌激素活性高約4至18倍(Campbell，S.等，1981)。
當(dāng)使用已知天然和合成雌激素時(shí)，這些缺點(diǎn)在臨床上是非常顯著的。
給前列腺癌男性患者使用高劑量的雌激素后，已知可能發(fā)生的并發(fā)癥是致命的血栓栓塞。在肝臟中EE產(chǎn)生副作用的可能性(通過(guò)某種減弱的形式)決定了口服激素避孕方法的策略。一方面考慮到所需避孕效果和維持月經(jīng)過(guò)程，另一方面需要考慮相當(dāng)大的產(chǎn)生副作用的可能性，控制血液中EE水平可能就像走鋼絲。很大可能是大量的婦女不能口服避孕藥，這是因?yàn)榻?jīng)血異常和與雌激素相關(guān)的副作用超出了耐受閾值。
有證據(jù)表明雌激素是主要的促細(xì)胞分裂劑，其參與促進(jìn)內(nèi)分泌依賴性組織如乳腺和子宮內(nèi)膜中腫瘤的生長(zhǎng)。
雖然血漿雌激素濃度在乳腺癌女性患者或非乳腺癌女性中類似，但是乳腺癌雌酮和雌二醇水平顯著高于正常乳腺組織或血液中的水平。人們認(rèn)為雌激素的就地合成是腫瘤中雌激素水平高的重要原因，因此雌激素生物合成的抑制劑，特別是特異性抑制劑對(duì)治療內(nèi)分泌依賴性腫瘤具有潛在價(jià)值。
過(guò)去二十多年中，人們對(duì)芳香酶途徑的抑制劑的開(kāi)發(fā)極為關(guān)注，該途徑將雄激素前體雄二酮轉(zhuǎn)變?yōu)榇仆?。然而，現(xiàn)在有證據(jù)表明硫酸雌酮(E1-STS)途徑，即將硫酸雌酮水解為雌酮(E1S至E1)，與芳香酶途徑相反，在乳腺癌中是雌激素的主要來(lái)源。這一理論得到了下面事實(shí)的支持用芳香酶抑制劑，如氨魯米特和4-羥基雄二酮治療的絕經(jīng)后女性乳腺癌患者中，血漿雌激素濃度得到適度降低，以及在接受這些芳香酶抑制劑治療的患者中血漿E1S濃度保持較高水平這一事實(shí)。與非共軛雌激素(半衰期20分鐘)比較，在血液中E1S的長(zhǎng)半衰期(10-12小時(shí))，以及在肝臟中高水平的甾類硫酸酯酶活性，也支持這一理論。
PCT/GB92/01587說(shuō)明了新的甾類硫酸酯酶抑制劑及含有這些抑制劑的藥物組合物用于治療雌酮依賴性腫瘤特別是乳腺癌。這些甾類硫酸酯酶抑制劑是氨基磺酸酯，如N，N-二甲基雌酮-3-氨基磺酸酯，優(yōu)選雌酮-3-氨基磺酸酯(也稱為“EMATE”)。其它氨基磺酸酯公開(kāi)于WO96/05216和WO96/05217。這些氨基磺酸酯包括雌二醇-3-氨基磺酸酯(本文中稱為J995)。
EMATE(雌酮-3-O-氨基磺酸酯)-具有如下結(jié)構(gòu)
已知EMATE是有效的E1-STS抑制劑，因?yàn)樵谕暾鸐CF-7細(xì)胞中在濃度為0.1M時(shí)其對(duì)E1-STS活性表現(xiàn)出大于99％的抑制。EMATE也以時(shí)間依賴的方式和濃度依賴的方式抑制E1-STS酶，這表明它起到了活性位點(diǎn)直接滅活的作用。雖然EMATE原來(lái)為抑制E1-STS而設(shè)計(jì)，但是它抑制脫氫表雄甾酮硫酸酯酶(DHA-STS)，據(jù)信它在雌激素甾類雄甾烯二醇生物合成的調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵的作用。另外，現(xiàn)在有證據(jù)表明雄甾烯二醇作為乳腺腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)劑可能更重要。EMATE在體內(nèi)也有活性，當(dāng)其口服或皮下給藥時(shí)，幾乎完全抑制了大鼠肝臟E1-STS(99％)和DHA-STS(99％)活性。此外，已表明EMATE在大鼠中具有提高記憶的作用。在小鼠中的研究已表明在DHA-STS活性和部分免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)之間存在聯(lián)系。人們認(rèn)為這也可能在人類中發(fā)生。EMATE中氨基磺酸酯的橋氧原子對(duì)抑制活性很重要。因此，當(dāng)雌酮-3-N-氨基磺酸酯和雌酮-3-S-氨基磺酸酯中的3-O-原子被其它雜原子替代時(shí)，這些類似物便成為較弱的非時(shí)間依賴性滅活劑。
雖然EMATE中可能已經(jīng)獲得了對(duì)E1-STS的抑制的最佳效果，但是在硫酸酯酶抑制期間可能釋放雌酮，EMATE及其雌二醇同類物可能具有雌激素活性。
Ahmed等(Biochem Biophys Res Commun1999 Jan27；254(3)811-5)報(bào)告了STS的甾類和非甾類抑制劑的構(gòu)效關(guān)系的研究。
因此，本發(fā)明的目的是提供適于口服避孕、激素替代療法、抑制E1-STS以及其它治療用途的新的組合物。發(fā)明概述
本發(fā)明基于令人驚奇的發(fā)現(xiàn)提供環(huán)狀化合物的組合物，其中該環(huán)狀化合物包括環(huán)系和氨基磺酸根基團(tuán)(“氨基磺酸酯化合物”)，其含量提供不大于200μg/天的劑量，該組合物可以用于口服避孕、激素替代療法和/或抑制E1-STS。在本發(fā)明組合物提供的劑量，所轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物在所需的治療作用和治療不需要的副作用之間表現(xiàn)出了更為有利的關(guān)系。
氨基磺酸酯化合物含有至少一個(gè)環(huán)組分。該環(huán)組分含有至少4個(gè)環(huán)原子。一般來(lái)說(shuō)，這4個(gè)原子應(yīng)為碳原子。因此，一般來(lái)說(shuō)，該環(huán)組分應(yīng)是烴基。該環(huán)狀化合物也包括氨基磺酸根基團(tuán)作為環(huán)系上的其它取代基(一個(gè)或多個(gè))。該氨基磺酸根基團(tuán)是該環(huán)組分的取代基。發(fā)明詳述
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，其中含有
(i)式(I)的化合物
式I
其中X是環(huán)中具有至少4個(gè)碳原子的烴基環(huán)；K是烴基；Rs是氨基磺酸根基團(tuán)；
(ii)其任選地與藥用載體、稀釋劑、賦形劑或輔劑混合，其中該化合物的含量能提供不大于200μg/天的劑量。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種含有一種化合物的藥物組合物，其中該化合物的存在量使 該化合物或其代謝物為接受治療的對(duì)象的血漿提供不大于200μg/天的量。
除非另行說(shuō)明，上述最大劑量及本說(shuō)明書中所指的所有劑量指70kg體重對(duì)象的劑量。對(duì)于體重超過(guò)70kg的對(duì)象，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地修改所列舉的劑量。
通過(guò)用要給患者使用的劑量除以數(shù)天內(nèi)的預(yù)期給藥時(shí)間來(lái)計(jì)算每天的劑量。預(yù)期的給藥時(shí)間一般是直到下次給藥的時(shí)期，在此時(shí)間內(nèi)該劑量必須具有作用或者在該時(shí)間內(nèi)該劑量必須起作用。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于醫(yī)藥的本發(fā)明的組合物。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的組合物在制備用于口服避孕的藥物中的用途。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的組合物在制備用于激素替代治療的藥物中的用途。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的組合物在制備用于與STS有關(guān)病癥或疾病治療的藥物中的用途。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的組合物在制備用于與不利的STS水平有關(guān)的病癥和疾病治療的藥物中的用途。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了治療患者的方法，包括給所述患者使用用量不大于200μg/天的本發(fā)明化合物。
為了便于參考，現(xiàn)在在適當(dāng)?shù)男?biāo)題下對(duì)本發(fā)明的這些及其它方面進(jìn)行探討。但是，在每個(gè)部分中的說(shuō)法不必限制于各特定的部分。優(yōu)選方面
優(yōu)選，該化合物以能提供10至200μg/天的劑量的量存在于該組合物中。
優(yōu)選，該化合物以能提供50至200μg/天的劑量的量存在于該組合物中。
優(yōu)選，該化合物以能提供20至50μg/天的劑量的量存在于該組合物中。
在另一方面，該化合物以能提供不大于和少于100μg/天的劑量的量存在于該組合物中。
該組合物可以進(jìn)行配制，以便每天、每周和每月的給藥會(huì)提供所需的日劑量。例如，本發(fā)明可以提供一種組合物，其中含有該氨基磺酸酯化合物的量不大于200μg/劑量(每日劑量)，不大于1.4mg/劑量(每周劑量)和不大于5mg/劑量(每月劑量)。應(yīng)領(lǐng)會(huì)該組合物還可以配制為給藥頻率多于和少于每天一次、每周一次和每月一次的形式。
優(yōu)選，X與K聯(lián)合模擬甾類結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選，K環(huán)狀基團(tuán)。
優(yōu)選，X是6員環(huán)。
優(yōu)選，環(huán)X具有6個(gè)環(huán)碳原子。
優(yōu)選，式I化合物具有式II的結(jié)構(gòu)，其中各Rs、X和K具有上述定義。
式II
優(yōu)選基團(tuán)K和環(huán)X一起含有，包括所有的取代基，最多約50個(gè)碳原子，更常見(jiàn)不超過(guò)約30至40個(gè)碳原子。
優(yōu)選，X與K聯(lián)合為甾類環(huán)結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選，基團(tuán)K和環(huán)X是甾類環(huán)結(jié)構(gòu)或其被取代的衍生物。
優(yōu)選，Rs基團(tuán)在環(huán)X的3位。
優(yōu)選，Rs是氨基磺酸根基團(tuán)。
優(yōu)選該化合物是式III
式III其中X、K和Rs定義如上；且其中Rh1是任選地存在的鹵素基團(tuán)；Rh2是任選地存在的鹵素基團(tuán)；Rh1和Rh2至少存在一個(gè)。
優(yōu)選，該Rh1在X環(huán)的2位。
優(yōu)選，此Rh2在環(huán)X的4位。
對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選這些化合物沒(méi)有和有最低的雌激素作用。
對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選這些化合物具有雌激素作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于治療乳腺癌。一些優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明的關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)包括改善了本發(fā)明組合物的藥動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。
本發(fā)明的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)是給藥時(shí)這些氨基磺酸酯化合物具有較低的肝臟代謝。據(jù)信本發(fā)明的化合物如EMATE和J995，對(duì)紅細(xì)胞具有較高的親合性，高達(dá)99％的化合物在血液中是這樣結(jié)合的。在此包合結(jié)構(gòu)中，該化合物的肝臟通過(guò)避免了提取、代謝和肝臟首過(guò)作用。因此，轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基磺酸酯化合物具有高度的生物利用度。
本發(fā)明的另一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)是這些氨基磺酸酯化合物在個(gè)體間的血漿濃度方面表現(xiàn)出低差異。血液中雌激素水平的個(gè)體差異的降低特別允許對(duì)子宮切除和非子宮切除的對(duì)象提供單一的產(chǎn)品，而不需要開(kāi)發(fā)個(gè)別的產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一個(gè)關(guān)鍵的優(yōu)點(diǎn)是這些氨基磺酸酯化合物從患者中清除的速度慢。本發(fā)明的組合物提供了雌酮(E1)和雌二醇(E2)的穩(wěn)定的血漿水平。
本發(fā)明的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)是在給藥時(shí)這些氨基磺酸酯化合物具有低的激素作用。因此，降低了深部靜脈血栓形成的危險(xiǎn)性。
本發(fā)明的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)是在給藥時(shí)提供了骨保護(hù)，而該劑量低于子宮內(nèi)膜增生/刺激閾值。如上所述，雌激素對(duì)于保護(hù)婦女的骨結(jié)構(gòu)是不可或缺的。它們的缺乏會(huì)導(dǎo)致骨的破壞(骨質(zhì)疏松)。但是，在典型的HRT中，雌酮以產(chǎn)生有利作用同時(shí)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生的劑量給藥。本發(fā)明的組合物為骨保護(hù)提供了一種激素替代療法，該療法對(duì)子宮內(nèi)膜沒(méi)有刺激。
因此，在本發(fā)明的另一方面中，其提供了如本文所定義的化合物，優(yōu)選本文中所定義的組合物在制備對(duì)子宮內(nèi)膜沒(méi)有刺激作用的骨保護(hù)激素替代療法的藥物中的用途。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是該組合物可以在不加入孕激素的條件下進(jìn)行配制。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是該組合物可以在不加入促孕素的條件下進(jìn)行配制。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這些化合物中的一些不能代謝為顯示或誘發(fā)激素活性的化合物。
本發(fā)明的一些化合物在它們可以具有口服活性方面也是有利的。
本發(fā)明的一些化合物可以用于治療癌癥，如乳腺癌，以及(或者)非惡性病癥，如自身免疫性疾病的預(yù)防，特別是當(dāng)從年輕時(shí)起就需要的藥物。
因此，據(jù)信本發(fā)明的一些化合物除治療內(nèi)分泌依賴性癌癥以外還具有治療應(yīng)用，如治療自身免疫性疾病。激素替代療法
可以配制本發(fā)明的組合物以提供激素替代療法。該組合物配制成含有該氨基磺酸酯化合物，根據(jù)醫(yī)囑的給藥頻率，該化合物的含量能提供氨基磺酸酯化合物的所需日劑量。
在該組合物的一個(gè)方面，其配制為可每天給藥的形式。此組合物可以與孕激素混合配制。
在本發(fā)明的所有方面中，包括每天口服給藥，以比使用透皮貼劑——HRT的一種典型給藥途經(jīng)更方便的方式進(jìn)行激素替代療法。每天
當(dāng)每天給藥方案提供，例如，100μg/天的給藥時(shí)，特別觀察到下列關(guān)鍵的優(yōu)點(diǎn)
·個(gè)體間對(duì)象血液的雌激素水平差異降低
·E1和E2的血漿濃度穩(wěn)定
當(dāng)每天給藥方案提供20至50μg/天的給藥時(shí)，特別觀察到以下優(yōu)點(diǎn)
·沒(méi)有觀察到子宮出血
·對(duì)乳腺?zèng)]有影響每周給藥
在該組合物的一方面，將其配制為允許每周給藥的形式?？梢蕴峁?.5至2mg/周，例如1mg/周的每周劑量。
較本發(fā)明組合物的貼劑和每天給藥而言，每周劑量具有更方便的益處。每月給藥
還設(shè)計(jì)了本發(fā)明組合物的每月HRT，其中提供了化合物的2至4mg，和高達(dá)5mg/給藥的單一的每月劑量。
此外，含有本發(fā)明化合物的藥物組合物可以用來(lái)治療子宮內(nèi)膜異位和用于治療雌激素依賴性腫瘤。在此方面，本發(fā)明的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的這些氨基磺酸酯化合物可以作為甾類硫酸酯酶抑制劑。甾類硫酸酯酶
甾類硫酸酯酶，有時(shí)稱為甾基(steryl)硫酸酯酶或簡(jiǎn)稱“STS”，其水解一些硫酸化的甾類化合物，如雌酮硫酸酯、脫氫表雄雌酮硫酸酯和膽固醇硫酸酯。已指定STS的酶編號(hào)為EC3.1.6.2。
STS已被克隆和表達(dá)。例如，見(jiàn)Stein等(J.Biol.Chem.26413865-13872(1989))和Yen等(Cell 49443-454(1987))。
STS是一種牽連一些疾病的酶。
例如，人們已發(fā)現(xiàn)STS的完全缺乏導(dǎo)致鱗癬。按照一些科研人員的說(shuō)法，STS缺乏在日本相當(dāng)普遍。正是這些科研人員(Sakura等，JInherit Metab Dis 1997 Nov；20(6)807-10)還報(bào)告過(guò)敏性疾病如支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎或特應(yīng)性皮炎，可能與甾類硫酸酯酶缺乏有關(guān)。
除了由STS活性的完全缺乏導(dǎo)致的疾病外，STS活性升高也可以帶來(lái)疾病。例如，并如上所述，存在有力的證據(jù)支持STS在乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用。
STS還牽涉其它疾病。例如，Le Roy等(Behav Genet 1999年3月；29(2)131-6)已確定在甾類硫酸酯酶濃度和小鼠攻擊性行為發(fā)作之間可能存在遺傳關(guān)系。這些作者推斷甾類的硫酸酯化可能是復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，包括在誘變攻擊中涉及的基因，的主要原動(dòng)力。STS抑制
據(jù)信與STS活性有關(guān)的一些疾病是由于無(wú)活性的硫酸化雌酮向有活性的非硫酸化雌酮的轉(zhuǎn)變。在與STS活性有關(guān)的疾病中，需要抑制STS活性。
此處，術(shù)語(yǔ)“抑制”包括降低和/或消除和/或掩蓋和/或防止STS的有害作用。STS抑制劑
按照本發(fā)明，本發(fā)明的化合物能作為STS抑制劑。
此處，術(shù)語(yǔ)“抑制劑”在本文中針對(duì)本發(fā)明的化合物指可以抑制STS活性的化合物，如降低和/或消除和/或掩蓋和/或防止STS的有害作用。STS抑制劑可以作為拮抗劑。
化合物抑制雌酮硫酸酯酶活性的能力可以用完整MCF-7乳腺癌細(xì)胞或胎盤微粒體檢測(cè)。此外，可以使用動(dòng)物模型。適宜檢測(cè)方案的細(xì)節(jié)在以下部分中給出。注意可以使用其它檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定STS活性和對(duì)STS的抑制。例如，還可以參考WO A-99/50453的內(nèi)容。
優(yōu)選，對(duì)于一些應(yīng)用，該化合物進(jìn)一步的特征是如果氨基磺酸根基團(tuán)被硫酸根基團(tuán)取代以形成硫酸酯衍生物，則該硫酸酯衍生物會(huì)被具有甾類硫酸酯酶(E.C.3.1.6.2)活性的酶水解，即當(dāng)與甾類硫酸酯酶EC3.1.6.2在pH7.4和37℃下孵育時(shí)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果該化合物的氨基磺酸根基團(tuán)被硫酸根基團(tuán)代替以形成硫酸酯化合物，則當(dāng)甾類硫酸酯酶EC3.1.6.2在pH7.4和37℃下孵育時(shí)，此硫酸酯化合物會(huì)被具有甾類硫酸酯酶(E.C.3.1.6.2)活性的酶水解，并會(huì)使得Km值小于200毫摩爾，優(yōu)選小于150毫摩爾，優(yōu)選小于100毫摩爾，優(yōu)選小于75毫摩爾，優(yōu)選小于50毫摩爾。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物不被具有甾類硫酸酯酶(E.C.3.1.6.2)活性的酶水解。
對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選本發(fā)明的化合物對(duì)所需的靶(如STS)具有至少約100倍的選擇性，對(duì)所需的靶優(yōu)選有至少約150倍的選擇性，對(duì)所需的靶優(yōu)選有至少約200倍的選擇性，對(duì)所需的靶優(yōu)選有至少約250倍的選擇性，對(duì)所需的靶優(yōu)選有至少約300倍的選擇性，對(duì)所需的靶優(yōu)選有至少約350倍的選擇性。
應(yīng)注意本發(fā)明的化合物除了或者代替其抑制STS活性外可能具有其它有利的性質(zhì)?；鶊F(tuán)K
基團(tuán)K不需要是環(huán)狀結(jié)構(gòu)。為此，基團(tuán)K可以是線性結(jié)構(gòu)，當(dāng)在體內(nèi)時(shí)其具有可以符合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的能力。
在優(yōu)選的方面中，基團(tuán)K是環(huán)狀的，以便形成環(huán)基團(tuán)K。
環(huán)基團(tuán)K不需要稠合到環(huán)X上。鑒于此，它們可以被適宜的間隔基(其可以是烴基)分隔。
在優(yōu)選的方面中，環(huán)基團(tuán)K稠合在環(huán)X上。
基團(tuán)K可以是多環(huán)基團(tuán)，其不需要是稠合的多環(huán)。
因此，在優(yōu)選的方面中，基團(tuán)K和環(huán)X構(gòu)成了多環(huán)化合物。如上所述，此處術(shù)語(yǔ)“多環(huán)”包括稠合的和非稠合的環(huán)結(jié)構(gòu)，包括其聯(lián)合形式。
至少一個(gè)環(huán)基團(tuán)K和X可以是雜環(huán)基團(tuán)(雜環(huán))或非雜環(huán)基團(tuán)。
至少一個(gè)環(huán)基團(tuán)K和X可以是飽和環(huán)結(jié)構(gòu)或不飽和的環(huán)結(jié)構(gòu)(如芳基)。
優(yōu)選，至少一個(gè)環(huán)基團(tuán)是芳環(huán)。
如果環(huán)基團(tuán)是多環(huán)，該化合物環(huán)成員中的一些或全部可以稠合在一起或者通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適宜的間隔基連接。
該多環(huán)化合物可以含有一些稠合的環(huán)。在此方面，稠合的環(huán)可以包括不同大小的環(huán)的任何結(jié)合，如3個(gè)六員環(huán)(6，6，6)，1個(gè)六員環(huán)、1個(gè)七員環(huán)和1個(gè)六員環(huán)(6，7，6)，1個(gè)六員環(huán)和2個(gè)八員環(huán)(6，8，8)等。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，其涉及其中多環(huán)化合物不是(6，6，7)環(huán)的化合物。在另一方面，本發(fā)明涉及其中多環(huán)化合物只含有非7員的環(huán)的化合物。
優(yōu)選此多環(huán)化合物含有，包括所有的取代基，不超過(guò)約50個(gè)碳原子，更常見(jiàn)不超過(guò)約30個(gè)至40個(gè)碳原子。
該多環(huán)化合物可以含有至少兩個(gè)環(huán)成員，或者至少三個(gè)環(huán)成員，或者至少四環(huán)成員。
優(yōu)選，該多環(huán)化合物含有四個(gè)環(huán)成員。
優(yōu)選的多環(huán)化合物具有甾環(huán)成員，或其生物電子等排物。烴基
術(shù)語(yǔ)“烴基”在本文中指含有至少C和H并可以任選地含有一個(gè)或多個(gè)其它適宜的取代基的基團(tuán)。這樣的取代基的實(shí)例可以包括鹵素、烷氧基、硝基、烷基、環(huán)基團(tuán)等。除取代基是環(huán)基團(tuán)的可能外，取代基聯(lián)合起來(lái)可以形成環(huán)基團(tuán)。如果該烴基含有一個(gè)以上的碳原子，則這些碳原子不需要彼此連接。例如，至少兩個(gè)碳原子可以通過(guò)適宜的元素或基團(tuán)連接。因此，此烴基可以含有雜原子。適宜的雜原子對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的并包括，例如，硫、氮和氧原子。烴基的非限制性實(shí)例是?；?。
典型的烴基是碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)。此處，術(shù)語(yǔ)“烴”指烷基、鏈烯基、鏈炔基中的任何一種，這些基團(tuán)可以是直鏈、支鏈或環(huán)，或者是芳基。術(shù)語(yǔ)烴還包括其中被任選地取代的上述那些基團(tuán)。如果該烴是其上具有取代基(一個(gè)或多個(gè))的支鏈結(jié)構(gòu)，則取代可以在烴主鏈或側(cè)鏈上；或者取代可以在主鏈和側(cè)鏈上。氨基磺酸根基團(tuán)
在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)X具有氨基磺酸根基團(tuán)作為取代基。術(shù)語(yǔ)“氨基磺酸根”在本文中包括氨基磺酸的酯，或者氨基磺酸的N-取代的衍生物的酯，或其鹽。
如果Rs是氨基磺酸根基團(tuán)，則本發(fā)明的化合物稱為氨基磺酸根化合物。
一般來(lái)說(shuō)，該氨基磺酸根基團(tuán)具有下式
(R1)(R2)N-S(O)(O)-O-其中優(yōu)選R1和R2獨(dú)立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基和芳基，或其聯(lián)合，或一起表示亞烷基，其中所有或各烷基或環(huán)烷基或鏈烯基或芳基任選地含有一個(gè)或多個(gè)雜原子或基團(tuán)。
當(dāng)被取代時(shí)，本發(fā)明的N-取代的化合物可以含有一個(gè)或兩個(gè)N-烷基、N-鏈烯基、N-環(huán)烷基或N-芳基取代基，優(yōu)選含有或各含有最多10個(gè)碳原子。當(dāng)R1和/或R2是烷基時(shí)，優(yōu)選其中R1和R2各自獨(dú)立地選自含有1至6個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，即甲基、乙基、丙基等。R1和R2可以都是甲基。當(dāng)R1和/或R2是芳基時(shí)，一般是苯基或甲苯基(PhCH3；o)。當(dāng)R1和R2表示環(huán)烷基時(shí)，一般是環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。當(dāng)R1和R2結(jié)合到一起時(shí)，一般表示含4至6個(gè)碳原子的亞烷基，其中任選地被一個(gè)或多個(gè)雜原子或基團(tuán)間隔，例如，提供5員雜環(huán)，如4-嗎啉基、1-吡咯烷基或1-哌啶基。
在作為其中取代基的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基和芳基范圍內(nèi)，取代基包括一個(gè)或多個(gè)不干擾所討論化合物的硫酸酯酶抑制活性的基團(tuán)。非干擾性取代基的實(shí)例包括羥基、氨基、鹵素、烷氧基、烷基和芳基。
在一些實(shí)施方案中，該氨基磺酸根基團(tuán)可以通過(guò)與基團(tuán)X中或上的一個(gè)或多個(gè)原子稠合(或相聯(lián)系)形成環(huán)結(jié)構(gòu)。
在一些實(shí)施方案中，可以存在一個(gè)以上氨基磺酸根基團(tuán)。例如，可以存在兩個(gè)氨基磺酸根(即雙氨基磺酸根化合物)。如果這些化合物是在甾核上，優(yōu)選弟二個(gè)(或其余中的至少一個(gè))氨基磺酸根基團(tuán)位于該甾核的17位。這些基團(tuán)沒(méi)有必要相同。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1和R2的至少一個(gè)是H。
在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1和R2各是H。模擬
在一個(gè)方面中，X和K可以是甾環(huán)結(jié)構(gòu)的模擬物。
術(shù)語(yǔ)“模擬”在本文中指具有類似或不同的結(jié)構(gòu)，但是具有相似的功能。換言之，基團(tuán)K和環(huán)X一起可以是甾環(huán)或其活性部分的生物電子等排物。
在優(yōu)選的方面中，基團(tuán)K和環(huán)X一起可以是雌酮環(huán)或其部分的生物電子等排物。甾環(huán)結(jié)構(gòu)
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，X和K構(gòu)成甾環(huán)結(jié)構(gòu)，就是說(shuō)一個(gè)環(huán)戊并菲骨架，或其生物電子等排物。
本領(lǐng)域的人們熟知，典型的雜環(huán)結(jié)構(gòu)具有如下通式
在上述結(jié)構(gòu)式中，以常規(guī)方式對(duì)環(huán)進(jìn)行了標(biāo)注。
生物電子等排物的實(shí)例是，當(dāng)A、B、C和D環(huán)的任何一個(gè)或多個(gè)環(huán)是雜環(huán)是和/或當(dāng)A、B、C和D環(huán)的任何一個(gè)或多個(gè)環(huán)已被取代時(shí)和/或當(dāng)A、B、C和D環(huán)的任何一個(gè)或多個(gè)環(huán)已被修飾時(shí)；但是其中不存在氨基磺酸根基團(tuán)的生物電子等排物具有甾類性質(zhì)。
就此而言，優(yōu)選的多環(huán)結(jié)構(gòu)可以表示為
其中各環(huán)A′、B′、C′和D′獨(dú)立地表示雜環(huán)和非雜環(huán)，其中各環(huán)可以獨(dú)立地被取代和不取代，可以是飽和的和不飽和的。
例如，環(huán)A′、B′、C′和D′的任何一個(gè)和多個(gè)可以獨(dú)立地被適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)取代，如烷基、芳基、羥基、鹵素基團(tuán)、烴基、氧烴基等。
D′的一個(gè)實(shí)例是具有至少一個(gè)取代基的5或6員非雜環(huán)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，環(huán)D′被乙炔基取代。
如果環(huán)A′、B′、C′和D′的任何一個(gè)是雜環(huán)，則優(yōu)選該雜環(huán)含有碳原子和至少一個(gè)氮原子和/或至少一個(gè)氧原子的聯(lián)合形式。在該環(huán)中可以存在其它雜環(huán)原子。
本發(fā)明化合物的適宜的、優(yōu)選的甾核環(huán)A′-D′的實(shí)例，包括脫氫表雄雌酮和雌激素的環(huán)A-D。優(yōu)選的雌激素包括天然雌激素如雌酮、雌二醇、雌三醇、表雌三醇；及共軛的雌激素(馬萘雌酮衍生物)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，優(yōu)選本發(fā)明的化合物是天然雌激素的前藥，優(yōu)選的天然雌激素選自雌酮、雌二醇、雌三醇和表雌三醇。
本發(fā)明化合物優(yōu)選的甾核環(huán)A′-D′包括下列化合物的環(huán)A-D雌酮和被取代的雌酮，即
雌酮
4-OH-雌酮
6α-OH-雌酮
7α-OH-雌酮
16α-OH-雌酮
16β-OH-雌酮
17-脫氧雌酮
雌酮雌二醇和被取代的雌二醇。即
4-OH-17β-雌二醇
6α-OH-17β-雌二醇
7α-OH-17β-雌二醇
4-OH-17α-雌二醇
6α-OH-17α-雌二醇
7α-OH-17α-雌二醇
16α-OH-17α-雌二醇
16α-OH-17β-雌二醇
16β-OH-17α-雌二醇
16β-OH-17β-雌二醇
17α-雌二醇
17β-雌二醇
17α-乙炔基-17β-雌二醇
17β-乙炔基-17a-雌二醇
17-脫氧雌二醇雌三醇和被取代的雌三醇，即
雌三醇
4-OH-雌三醇
6α-OH-雌三醇
7α-OH-雌三醇
17-脫氧雌三醇脫氫表雄酮和被取代的脫氫表雄酮，即
脫氫表雄酮
6α-OH-脫氫表雄酮
7α-OH-脫氫表雄酮
16α-OH-脫氫表雄酮
16β-OH-脫氫表雄酮
在一般性術(shù)語(yǔ)中，環(huán)系A(chǔ)′B′C′D′可以含有多種非干擾性取代基。具體地講，環(huán)系A(chǔ)′B′C′D′可以含有一個(gè)或多個(gè)羥基；烷基，特別是低級(jí)(C1-C6)烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基及其它戊基異構(gòu)體以及正己基及其它己基異構(gòu)體；烷氧基，特別是低級(jí)(C1-C6)烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基等；炔基，如乙炔基；或鹵素，如氟取代基。
在高度優(yōu)選的方面，甾環(huán)結(jié)構(gòu)與本發(fā)明優(yōu)選的取代基結(jié)合，于是本發(fā)明的化合物選自下式的化合物
17α乙炔基17β雌二醇-3-氨基磺酸酯17β雌二醇-3-氨基磺酸酯
17α雌二醇-3-氨基磺酸酯 雌酮-3-氨基磺酸酯(EMATE)
雌三醇-3-氨基磺酸酯非甾類結(jié)構(gòu)
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可以不含或者不基于甾核。鑒于此，多環(huán)化合物可以含有或基于非甾環(huán)系如二乙基己烯雌酚、己烯雌酚、香豆素、類黃酮、風(fēng)車子抑制素(combrestatin)及其它環(huán)系。用于或用作本發(fā)明組合物的其它適宜的非甾類化合物見(jiàn)US-A-5567831。其它取代基
本發(fā)明的化合物可以具有Rh1、Rh2和Rs以外的取代基。例如，這些其它取代基可以是一個(gè)或多個(gè)如下基團(tuán)一個(gè)或多個(gè)氨基磺酸根基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)磷酸根基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸根基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)磺酸根基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)氨磺?；鶊F(tuán)，一個(gè)或多個(gè)鹵素基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)O基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)氨基基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)含硫的基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)烴基如氧烴基。氧烴基
術(shù)語(yǔ)“氧烴基”基團(tuán)在本文中指至少含有C、H和O并任選地含有一個(gè)或多個(gè)其它適宜的取代基的基團(tuán)。這樣的取代基的實(shí)例可以包括鹵素、烷氧基、硝基、烷基、環(huán)基團(tuán)等。
除了取代基可以是環(huán)基團(tuán)外，取代基的組合可以形成環(huán)基團(tuán)。如果此氧烴基基團(tuán)含有一個(gè)以上的C，則這些碳原子不必彼此連接。例如，至少兩個(gè)碳原子可以通過(guò)適宜的元素或基團(tuán)連接。因此，此氧烴基基團(tuán)可以含有雜原子。適宜的雜原子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，并包括，例如，硫和氮原子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，此氧烴基基團(tuán)是氧碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)。
此處，術(shù)語(yǔ)“氧碳?xì)浠衔铩敝竿檠趸?、鏈烯基氧基、鏈炔基氧基中的任何一種，其中該基團(tuán)可以是直鏈、支鏈或環(huán)，或者是芳氧基。術(shù)語(yǔ)氧碳?xì)浠衔镞€包括任選地被取代的上述那些基團(tuán)。如果此氧烴基是其上具有取代基(一個(gè)或多個(gè))的支鏈結(jié)構(gòu)，則取代可以在該烴骨架上或在該側(cè)鏈上；或者取代可以在烴骨架和側(cè)鏈上。
一般來(lái)說(shuō)，此氧烴基基團(tuán)是式C1-6O(如C1-3O)。
用癌細(xì)胞測(cè)定STS活性的試驗(yàn)
(方案1)抑制MCF-7細(xì)胞中的甾類硫酸酯酶活性
甾類硫酸酯活性在體外用完整的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞檢測(cè)。此激素依賴性細(xì)胞系被廣泛用于控制人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的研究。它具有顯著的甾類硫酸酯活性(Maclndoe等，Endocrinology，123，1281-1287(1988)；Purohit & Reed，Int.J.Cancer，50，901-905(1992))并由U.S.A.的美國(guó)模式培養(yǎng)物包藏所(ATCC)和U.K.(如皇家癌癥研究基金會(huì))提供。
細(xì)胞維持在極限必需培養(yǎng)基(MEM)(Flow Laboratories，Irvine，Scotland)中，其中含有20mM HEPES、5％胎牛血清、2mM谷酰胺、非必需氨基酸和0.075％碳酸氫鈉。用上述培養(yǎng)基用大約1×105細(xì)胞/燒瓶接種多達(dá)30個(gè)平行測(cè)定25平方厘米組織培養(yǎng)瓶。
細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合并每3天更換一次培養(yǎng)基。
完整的單層MCF-7細(xì)胞在25平方厘米組織培養(yǎng)燒瓶中，一式三份，用Earle′s平衡鹽溶液(EBSS，得自ICN Flow，High Wycombe，U.K.)洗滌并在37℃下與5pmol(7×105dpm)[6，7-3H]雌酮-3-硫酸酯(特異活性60Ci/mmol，得自New England Nuclear，Boston，Mass.，U.S.A.)在無(wú)血清MEM(2.5ml)中和雌酮-3-氨基磺酸酯(11個(gè)濃度0；1fM；0.01pM；0.1pM；1pM；0.01nM；0.1nM；1nM；0.01mM；0.1mM；1mM)一起孵育3-4小時(shí)。孵育后，將各燒瓶冷卻并將培養(yǎng)基(1ml)用移液管加入到獨(dú)立的試管中，試管中加有[14C]雌酮(7×103dpm)(特異活性97Ci/mmol，得自Amersham International RadiochemicalCentre，Amersham，U.K.)。將此混合物與甲苯(5ml)徹底搖動(dòng)30秒。試驗(yàn)顯示通過(guò)此處理＞90％[14C]雌酮和＜0.1％[3H]雌酮-3-硫酸酯從液相中除去。移出部分(2ml)有機(jī)相、蒸發(fā)并通過(guò)閃爍光譜檢測(cè)殘余物中3H和14C的含量。由3H的計(jì)數(shù)計(jì)算雌酮-3-硫酸酯水解的量(校正所用培養(yǎng)基體積和有機(jī)相，并校正加入的[14C]雌酮的回收率)和底物的特異性活性。每批試驗(yàn)包括培養(yǎng)由硫酸酯酶陽(yáng)性人胎盤制備的微粒體(陽(yáng)性對(duì)照)和沒(méi)有細(xì)胞的燒瓶(評(píng)估可見(jiàn)的底物的非酶水解)。用Zaponin處理該細(xì)胞單層后用Coulter計(jì)數(shù)器測(cè)定每燒瓶的細(xì)胞核數(shù)目。每批中選一個(gè)燒瓶用胎盤蘭排除法(Phillips，H.J.(1973)，組織培養(yǎng)和應(yīng)用[Kruse，D.F.& Patterson，M.K.編輯]；pp.406-408；Academic Press，New York)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞膜情況和活力。
甾類硫酸酯活性的結(jié)果以106細(xì)胞在培養(yǎng)期間(20小時(shí))形成的產(chǎn)物(雌酮+雌二醇)的平均值±1S.D.表示，并以表明統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)值表示，以相對(duì)于不含雌酮-3-氨基磺酸酯培養(yǎng)物的降低(抑制)百分率表示。用不成對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
用胎盤微粒體測(cè)定STS活性的實(shí)驗(yàn)
(方案2)抑制胎盤微粒體中的甾類硫酸酯酶活性
將得自正常足月妊娠的硫酸酯酶陽(yáng)性人胎盤用剪刀徹底切碎并用冷磷酸鹽緩沖液(pH7.4，50mM)洗滌一次，然后再懸浮于冷磷酸鹽緩沖液(5ml/g組織)中。在冰中用間隔2分鐘冷卻期的3個(gè)10秒暴發(fā)集落，用Ultra-Turrax勻漿器徹底勻漿化。通過(guò)以2000g離心(4℃)30分鐘除去細(xì)胞核和細(xì)胞碎片，并漿部分(2ml)上清夜保存在20℃。上清夜的蛋白濃度通過(guò)Bradford方法(Anal.Biochem.，72，248-254(1976))檢測(cè)。
用蛋白濃度為100mg/ml，底物濃度為20mM[6，7-3H]雌酮-3-硫酸酯(特異活性60Ci/mmol，得自New England Nuclear，Boston，Mass.，U.S.A.)的培養(yǎng)物(1ml)進(jìn)行，并在37℃下孵育20分鐘。如果需要，用8種濃度的化合物0(即對(duì)照)；0.05mM；0.1mM；0.2mM；0.4mM；0.6mM；0.8mM；1.0mM。孵育后，將各樣品冷卻并用移液管將培養(yǎng)基(1ml)加入到獨(dú)立的試管中，試管中加有[14C]雌酮(7×103dpm)(特異活性97Ci/mmol，得自Amersham InternationalRadiochemical Centre，Amersham，U.K.)。用甲苯(5ml)將此混合物徹底搖動(dòng)30秒。實(shí)驗(yàn)顯示出通過(guò)此處理＞90％[14C]雌酮和＜0.1％[3H]雌酮-3-硫酸酯從水相中除去。將部分(2ml)有機(jī)相移出，蒸發(fā)并通過(guò)閃爍光譜測(cè)定殘余物的3H和14Cd含量。由獲得的3H計(jì)數(shù)計(jì)算雌酮-3硫酸酯水解的量(校正所用培養(yǎng)基和有機(jī)相的體積，并校正加入的[14C]雌酮的回收率)及底物的特異活性。
檢測(cè)STS活性的動(dòng)物模型
(方案3)體內(nèi)對(duì)雌酮硫酸酯活性的抑制
本發(fā)明的化合物可以用動(dòng)物模型進(jìn)行研究，特別是在卵巢切除的大鼠中。在此模型中，雌激素性化合物刺激子宮的生長(zhǎng)。
給大鼠口服該化合物(0.1mg/Kg/天，5天)，另外一組動(dòng)物只接受載體(丙二醇)。研究結(jié)束時(shí)，采集肝組織樣本，并用3H雌酮硫酸酯作為底物檢測(cè)雌酮硫酸酯酶的活性，如上所述(見(jiàn)PCT/GB95/02638)。
測(cè)定雌激素活性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?br> (方案4)體內(nèi)雌激素活性的缺乏
本發(fā)明的化合物可以用動(dòng)物模型進(jìn)行研究，特別是在卵巢切除的大鼠中。在此模型中，雌激素性化合物刺激子宮的生長(zhǎng)
給大鼠口服該化合物(0.1mg/Kg/天，5天)，另外一組動(dòng)物只接受載體(丙二醇)。研究結(jié)束時(shí)，采集子宮并稱重，結(jié)果以子宮重量/全部體重×100表示。
對(duì)子宮生長(zhǎng)沒(méi)有顯著作用的化合物不是雌激素性化合物。
測(cè)定STS活性的生物工程實(shí)驗(yàn)
(方案5)
化合物抑制雌酮硫酸酯活性的能力也可以用氨基酸序列和核苷酸序列編碼STS，或其活性片斷、衍生物、同源物或變體檢測(cè)，例如，高流通量篩選。
任何一個(gè)或或多個(gè)適當(dāng)?shù)陌?，如氨基酸序列?或核苷酸序列，可以在多種藥物篩選技術(shù)的任何一種中用來(lái)鑒定能調(diào)節(jié)STS的試劑。在此試驗(yàn)中使用的靶可以游離地存在于溶液中、固定在固體載體上、攜帶在細(xì)胞表面上或者位于細(xì)胞內(nèi)。可以檢測(cè)靶活性的消失或在靶和被測(cè)試劑之間結(jié)合復(fù)合物的形成。
本發(fā)明的此實(shí)驗(yàn)可以是篩選實(shí)驗(yàn)，其中檢測(cè)一些試劑。一方面，本發(fā)明的檢測(cè)方法是高流通量篩選。
藥物篩選技術(shù)可以基于Geysen的歐洲專利申請(qǐng)84/03564(1984年9月13日公開(kāi))的方法。概括的說(shuō)，在固體底物如塑料針或其它一些表面上合成大量不同的小的肽被測(cè)化合物。此肽被測(cè)化合物與適宜的靶或其片斷反應(yīng)并洗滌。然后，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的適當(dāng)修改的方法檢測(cè)結(jié)合體。純化的靶也可以直接包被在用于藥物篩選技術(shù)中的板上?；蛘?，可以用非中和抗體來(lái)捕獲肽并將其固定在固體載體上。本發(fā)明還會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選實(shí)驗(yàn)，其中能特異性結(jié)合靶的中和抗體與被測(cè)化合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合該靶。
為對(duì)一些物質(zhì)具有結(jié)合親合性的試劑的高流通量篩選(HTS)提供了另一種篩選技術(shù)，且該技術(shù)基于WO84/03564詳述的方法。
預(yù)計(jì)本發(fā)明的檢測(cè)方法在被測(cè)化合物的小規(guī)模和大規(guī)模篩選中以及在定量實(shí)驗(yàn)中都是適宜的。
在優(yōu)選的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及鑒定選擇性調(diào)節(jié)STS的試劑的方法，該試劑具有式(Ia)。報(bào)道分子
在本發(fā)明的檢測(cè)方法(以及篩選)中可以使用多種報(bào)道分子，其中優(yōu)選提供適于檢測(cè)的信號(hào)(例如通過(guò)光譜法)的報(bào)道分子。例如，報(bào)道基因可以編碼催化改變光吸收性的反應(yīng)的酶。
其它方案包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)、發(fā)射免疫測(cè)定(RIA)和熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。還可以使用雙位點(diǎn)、單克隆免疫檢測(cè)，其中使用對(duì)兩個(gè)非干擾性表位具有反應(yīng)性的單克隆抗體。例如，這些及其它實(shí)驗(yàn)描述于Hampton R等(1990，Serological Methods，ALaboratory Manual，APS Press，St Paul MN)和Maddox DE等(1983，J Exp Med 158121 1)。
報(bào)道分子的實(shí)例包括但不限于β-半乳糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、綠熒光蛋白、熒蟲素酶、氯霉素、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、β-葡萄糖醛酸酶、外切葡聚糖酶和葡糖淀粉酶?；蛘撸梢詫?biāo)記的或熒光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸摻入初期的轉(zhuǎn)錄物中，當(dāng)與低聚核苷酸探針結(jié)合時(shí)再對(duì)其進(jìn)行鑒定。
再如，一些公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)提供了商業(yè)試劑盒以及檢測(cè)過(guò)程的方案。適宜的報(bào)道分子或標(biāo)記物包括放射性核素、酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)熒光物質(zhì)或產(chǎn)色試劑，以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。教導(dǎo)此類標(biāo)記物的用法的專利包括US-A-3817837；US-A-3850752；US-A-3939350；US-A-3996345；US-A-4277437；US-A-4275149和US-A-4366241。宿主細(xì)胞
術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”在本發(fā)明中包括可以包含在本發(fā)明試劑的靶中的任何細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用作為或其表達(dá)為本發(fā)明的靶的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
優(yōu)選所述多核苷酸攜帶在載體上進(jìn)行多核苷酸的復(fù)制和表達(dá)，它們是靶或者表達(dá)該靶。選擇這些細(xì)胞以與所述載體相容并可以是原核生物(如細(xì)菌)、真菌、酵母和植物細(xì)胞。
革蘭氏陰性細(xì)菌E.coli在異種基因表達(dá)中被廣泛地用作宿主。但是，大量的異種蛋白易于蓄積在細(xì)胞內(nèi)。有時(shí)，隨后從大量蛋白質(zhì)中純化所需的蛋白質(zhì)可能會(huì)很困難。
與E.coli相比，得自桿菌屬的細(xì)菌作為異種宿主是非常合適的，這是由于它們能將蛋白質(zhì)分泌道培養(yǎng)基中。適于作宿主的其它細(xì)菌為鏈霉菌屬和假單胞菌屬的細(xì)菌。
根據(jù)編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的性質(zhì)，和/或進(jìn)一步處理表達(dá)的蛋白質(zhì)的適宜性，真核生物宿主如酵母或其它真菌可能是優(yōu)選的。一般來(lái)說(shuō)，酵母細(xì)胞比真菌細(xì)胞更優(yōu)選，這是因?yàn)樗鼈兏子谔幚?。但是，一些蛋白質(zhì)從酵母細(xì)胞中分泌得很差，且有時(shí)不能適當(dāng)?shù)丶庸?如在酵母中的過(guò)度糖基化)。在這些實(shí)例中，應(yīng)選擇不同的真菌宿主有機(jī)體。
本發(fā)明范圍內(nèi)適宜表達(dá)宿主的實(shí)例為真菌如曲霉種(如描述于EP-A-0184438和EP-A0284603的)和木霉種；細(xì)菌如桿菌種(如描述于EP-A-0134048和EP-A-0253455的)，鏈霉菌種和假單胞菌種；及酵母如克魯維氏酵母種(如描述于EP-A-0096430和EP-A-0301670的)以及酵母種。例如，典型的表達(dá)宿主可以選自黑曲霉、黑色曲霉var.tubigenis、黑色曲霉var.awamori、棘孢曲霉、構(gòu)巢曲霉、米曲霉、發(fā)菌霉屬reesei、枯草芽孢桿菌，地衣型芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、乳克魯維氏酵母和釀酒酵母。
適宜的宿主細(xì)胞，如酵母、真菌和植物宿主細(xì)胞的使用，可以提供翻譯后變型(如肉豆蔻?；⑻腔?、截短、投石(lapidation)和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酰基化)，可能需要它們賦予本發(fā)明重組表達(dá)產(chǎn)物最佳的生物活性。有機(jī)體
術(shù)語(yǔ)“有機(jī)體”在本發(fā)明中包括任何有機(jī)體，其可以包括本發(fā)明的靶和/或由其獲得的產(chǎn)物。有機(jī)體的實(shí)例可以包括真菌、酵母或植物。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因有機(jī)體”在本發(fā)明中包括任何有機(jī)體，其包括本發(fā)明的靶和/或獲得的產(chǎn)物。宿主細(xì)胞/宿主有機(jī)體的轉(zhuǎn)化
如早期所指出的，宿主有機(jī)體可以是原核或真核有機(jī)體。
適宜的原核宿主的實(shí)例包括E.coli和枯草桿菌。有關(guān)原核宿主轉(zhuǎn)化的教導(dǎo)在本領(lǐng)域中已充分記述，例如，見(jiàn)Sambrook等(MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press)和Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc。
如果使用原核宿主，則在轉(zhuǎn)化之前可能需要對(duì)核苷酸序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎棧绯?nèi)含子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因有機(jī)體可以是酵母。鑒此，酵母也已被廣泛用作異種基因表達(dá)中的載體。釀酒酵母種在工業(yè)上具有悠久的歷史，包括其用于異種基因表達(dá)。Goodey等(1987，YeastBiotechnology，D R Berry等編，pp 401-429，Allen and Unwin，London)和King等(1989，Molecular and Cell Biology of Yeasts，E F Walton and G T Yarronton編，pp107-133，Blackie，Glasgow)已對(duì)在釀酒酵母中的異種基因表達(dá)進(jìn)行了綜述。
釀酒酵母能很好地適于異種基因表達(dá)，這存在若干原因。第一，其對(duì)于人來(lái)說(shuō)是非病原性的，且其不能產(chǎn)生某些內(nèi)毒素。第二，歷經(jīng)出于不同目的的幾個(gè)世紀(jì)的商業(yè)開(kāi)發(fā)后，其安全使用的歷史悠久。這使其更廣泛地被公眾接受。第三，對(duì)該有機(jī)體的多方面的商業(yè)應(yīng)用和研究，使人們對(duì)其遺傳學(xué)和生理學(xué)以及對(duì)釀酒酵母的大規(guī)模發(fā)酵特性有了更充分的了解。
有關(guān)釀酒酵母中異種基因表達(dá)和基因產(chǎn)物分泌的原則的綜述，見(jiàn)EHinchcliffe E Kenny(1993，“Yeast as a vehicle for theexpression of heterologous genes”，Yeasts，Vol 5，Anthony HRose and J Stuart Harrison編，第二版，Academic Press Ltd.)。
一些類型的酵母載體能夠購(gòu)得，包括綜合載體，為了維持其需要與宿主基因組及自主復(fù)制質(zhì)粒載體重組。
為了制備轉(zhuǎn)基因釀酒酵母，通過(guò)將核苷酸序列插入到酵母中設(shè)計(jì)用于表達(dá)的構(gòu)件中來(lái)制備表達(dá)構(gòu)件。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了若干用于異種表達(dá)的構(gòu)件。這些構(gòu)件中含在酵母中有活性的、與核苷酸序列稠合的啟動(dòng)子，通常使用得自酵母的啟動(dòng)子，如GAL1啟動(dòng)子。通常使用得自酵母的信號(hào)序列，如編碼SUC2信號(hào)肽的序列。在酵母中有活性的終止子終止表達(dá)系統(tǒng)。
為了酵母的轉(zhuǎn)化，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了若干轉(zhuǎn)化方案。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母可以按照Hinnen等(1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the USA75，1929)；Beggs，JD(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，JBacteriology 153，163-168)的教導(dǎo)制備。
用多種選擇標(biāo)記物選擇轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化的這些標(biāo)記物為一些營(yíng)養(yǎng)缺陷的標(biāo)記物如LEU2、HIS4和TRP1，以及抗生素抗藥顯性的標(biāo)記物如氨基苷類抗生素標(biāo)記物，例如G418。
另一種宿主有機(jī)體是植物。構(gòu)建經(jīng)基因修飾的植物的基本原則是在植物基因組中插入遺傳信息，以便獲得插入遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定維持性。已有若干技術(shù)用來(lái)插入遺傳信息，兩個(gè)主要原理是直接引入遺傳信息以及通過(guò)使用載體系統(tǒng)引入遺傳信息。對(duì)常規(guī)技術(shù)的綜述可參見(jiàn)Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April1994 17-27)的論文。有關(guān)植物轉(zhuǎn)化的其它一些教導(dǎo)可以參見(jiàn)EP-A-0449375。
因此，本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化帶有作為靶和表達(dá)靶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞的方法。用該核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在適于表達(dá)編碼蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)。重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以表現(xiàn)在該細(xì)胞表面。如果需要，且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，含編碼序列的表達(dá)載體可以用通過(guò)特定的原核或真核細(xì)胞膜直接分泌的信號(hào)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。其它重組構(gòu)件可以將此編碼序列結(jié)合到編碼多肽功能域的核苷酸序列上，該功能域會(huì)有利于可溶性蛋白質(zhì)的純化(Kroll DJ等(1993)DNA CellBiol 12441-53)。變種/同源物/衍生物
除了本文中提及的特異性氨基酸序列和核苷酸序列外，本發(fā)明還包括其變種、同源物和衍生物的應(yīng)用。此處，術(shù)語(yǔ)“同源性”可以視為“相同”。
在本文中，同源系列包括至少75、85或90％相同的序列，優(yōu)選至少95或98％相同的序列。雖然同源性也可以視為相似(即具有相似的化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，在本發(fā)明的文本中，優(yōu)選以序列的一致性來(lái)表示同源性。
通過(guò)肉眼，通常借助于容易得到的序列比較程序來(lái)進(jìn)行同源性比較。這些商購(gòu)的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同源性百分率。
同源性％可以用相鄰的序列即來(lái)計(jì)算，所謂相鄰的序列即一個(gè)序列與另一個(gè)序列平行排列，且一個(gè)序列中的每個(gè)氨基酸與另一個(gè)序列中的相應(yīng)的氨基酸直接對(duì)比，一次一個(gè)殘基。這稱為“無(wú)縫”排列。一般來(lái)說(shuō)，這樣的無(wú)縫排列只在相對(duì)來(lái)說(shuō)小數(shù)目的殘基上進(jìn)行。
雖然這是非常簡(jiǎn)單且一致的方法，但是其無(wú)法顧及，例如，序列中另外相同的對(duì)，一個(gè)插入或缺失會(huì)引起隨后的氨基酸殘基超出此排列，因此，當(dāng)進(jìn)行總體排列時(shí)可能導(dǎo)致同源性％的大幅度降低。因此，多數(shù)序列比較方法的涉及是為了產(chǎn)生最佳的排列，其中考慮到了可能的插入和缺失，不會(huì)不適當(dāng)?shù)赜绊懣傮w同源性評(píng)分。通過(guò)在序列排列中插入“縫隙”以試圖將局部同源性最大化，可以達(dá)到此目的。
但是，這些更復(fù)雜的方法給在此排列中發(fā)生的各縫隙分配了“縫隙罰分”，致使對(duì)于相同氨基酸的相同數(shù)目，具有盡可能少的縫隙的序列排列(在兩個(gè)對(duì)比序列之間反應(yīng)了較高的相關(guān)性)將比具有很多縫隙的獲得更高的評(píng)分。一般使用“類源縫隙成本”，即對(duì)于存在縫隙賦予相對(duì)高的成本，而對(duì)于該縫隙中的各序列殘基賦予較小的罰分。這是最常用的縫隙評(píng)分系統(tǒng)。高的縫隙罰分當(dāng)然產(chǎn)生具有較少縫隙的最佳排列。大多數(shù)排列程序允許修改縫隙罰分。但是，當(dāng)用這樣的軟件進(jìn)行序列比較時(shí)，優(yōu)選使用缺省值。例如，當(dāng)使用GCG Wisconsin Bestfit軟件包(見(jiàn)下文)，對(duì)于氨基酸序列缺省縫隙罰分是每個(gè)縫隙為-12，而每個(gè)擴(kuò)展為-4。
因此，最大同源性％的計(jì)算首先需要產(chǎn)生最佳排列，考慮縫隙罰分。進(jìn)行此排列的計(jì)算機(jī)程序?yàn)镚CG Wisconsin Bestfit軟件包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)?？梢赃M(jìn)行序列比較的其它軟件包括但不限于BLAST軟件包(見(jiàn)Ausubel等，1999，出處同上，弟18章)、FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和比較工具GENEWORKS軟件套裝。BLAST和FASTA都提供了單機(jī)和聯(lián)網(wǎng)檢索(見(jiàn)Ausubel等，1999，出處同上，第7-58頁(yè)至7-60頁(yè))。但是，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。
其它可利用的參考資料見(jiàn)FEMS Microbiol Lett，1999年5月15日；174(2)247-50(及在FEMS Microbiol Lett，1999年8月1日；177(1)187-8刊發(fā)的勘誤表)。
雖然就一致性檢測(cè)最終的同源性％，但是此排列方法本身一般不基于全部和絕無(wú)成對(duì)比較。相反，一般使用順序相似性評(píng)分模型，給基于化學(xué)相似性或展開(kāi)距離給每個(gè)成對(duì)比較打分。常用的這樣的模型的實(shí)例為BLOSUM62模型--BLAST程序套裝的缺省模型。GCGWisconsin程序一般使用公共缺省值或通用符號(hào)比較表(如果給出)，詳見(jiàn)使用手冊(cè)。優(yōu)選使用GCG軟件包的公共缺省值，或者在使用其它軟件時(shí)，用缺省模型，如BLOSUM62。
一旦軟件給出了最佳排列，就可能計(jì)算同源性％，優(yōu)選序列一致性％。該軟件一般將此作為序列比較的一部分內(nèi)容并產(chǎn)生數(shù)字化結(jié)果。
序列還可以具有氨基酸殘基的缺失、插入或替換，這樣產(chǎn)生沉默變化并產(chǎn)生功能等同物質(zhì)。審慎的氨基酸替換可以基于這些殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性，只要該物質(zhì)的次級(jí)活性得以保持。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸，包括天門冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；及具有相似親水性值的無(wú)電荷極性端基的氨基酸，包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如，可以按照下表進(jìn)行保守的替代。在第二欄相同組中的氨基酸，和優(yōu)選在第三欄同一行中的氨基酸可以彼此替代。表達(dá)載體
用作靶或用于表達(dá)靶的核苷酸序列可以摻入重組可復(fù)制載體。該載體可以用來(lái)復(fù)制和表達(dá)相容性宿主細(xì)胞中和/或來(lái)自該宿主細(xì)胞的該核苷酸序列?？梢杂每刂菩蛄衼?lái)控制表達(dá)，該控制序列包括啟動(dòng)子/增強(qiáng)子以及其它表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)?？梢允褂迷藛?dòng)子和在原核細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子?？梢允褂媒M織特異性或刺激特異性啟動(dòng)子。也可以使用嵌合啟動(dòng)子，其中包括來(lái)自上述兩個(gè)或多個(gè)不同啟動(dòng)子的序列要素。
通過(guò)核苷酸序列的表達(dá)由宿主重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，根據(jù)所用的序列和/或載體，可以分泌或可以含于細(xì)胞內(nèi)?？梢杂眯盘?hào)序列設(shè)計(jì)編碼序列，其通過(guò)特定的原核或真核細(xì)胞膜直接分泌編碼序列的物質(zhì)。融合蛋白
靶氨基酸序列可以以融合蛋白的形式產(chǎn)生，例如，為了有助于提取和純化。融合蛋白對(duì)的實(shí)例包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄活性功能域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白對(duì)和相關(guān)蛋白序列之間還可以適當(dāng)?shù)匕ǖ鞍姿饬呀馕稽c(diǎn)，以允許融合蛋白序列的除去。優(yōu)選此融合蛋白不會(huì)妨礙該靶的活性。
該融合蛋白可以包括與本發(fā)明物質(zhì)稠合的抗原或抗原決定簇。在此實(shí)施方案中，融合蛋白可以是非天然產(chǎn)生的融合蛋白，其中含有可以作為輔劑以提供對(duì)免疫系統(tǒng)一般性刺激的物質(zhì)。該抗原或抗原決定簇可以與該物質(zhì)的氨基或羧基末端連接。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該氨基酸序列可以與異種序列連接以編碼融合蛋白。例如，為了由肽文庫(kù)中篩選能影響物質(zhì)活性的試劑，編碼表達(dá)了商購(gòu)抗體可識(shí)別的異種抗原表位的嵌合物質(zhì)可能是有利的。治療
本發(fā)明的化合物可以用作治療劑，即用于治療中。
術(shù)語(yǔ)“治療”包括治愈、減輕及預(yù)防作用。
治療可以針對(duì)人或動(dòng)物，優(yōu)選雌性，更優(yōu)選女性。藥物組合物
本發(fā)明提供了藥物組合物，其中含有本發(fā)明的化合物和任選地存在的藥用載體、稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。
藥物組合物可以在人用藥和獸用藥中給人和動(dòng)物使用，并一般含有任何的一種或多種藥用稀釋劑、載體或賦形劑。治療用可接受的載體或稀釋劑是制藥領(lǐng)域熟知的，并描述于，例如，Remington ′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編，1985)。依預(yù)計(jì)的給藥途經(jīng)和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐可以選擇藥用載體、賦形劑或稀釋劑。作為載體、賦形劑或稀釋劑，或除此以外，這些藥物組合物可以含有任何適宜的一種或多種粘合劑、一種或多種潤(rùn)滑劑、一種或多種助懸劑、一種或多種包衣劑、一種或多種溶劑。
在該藥物組合物中還可以含有防腐劑、穩(wěn)定劑、顏料、以及甚至較味劑。防腐劑的實(shí)例包括苯甲酸鈉、山梨酸以及對(duì)羥基苯甲酸酯。還可以使用抗養(yǎng)劑和助懸劑。
根據(jù)不同的給藥系統(tǒng)，對(duì)組合物/制劑可能存在不同的要求。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以配制為用微型泵給藥或者通過(guò)粘膜途經(jīng)給藥的形式，例如，鼻內(nèi)噴霧劑或吸入性氣霧劑或者可攝入的溶液，或者是非腸道給藥的形式，其中該組合物配制為注射形式，通過(guò)如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下途經(jīng)給藥?；蛘?，該制劑設(shè)計(jì)為可以通過(guò)這兩種途經(jīng)給藥的形式。
當(dāng)該制劑通過(guò)胃腸粘膜進(jìn)行粘膜給藥時(shí)，在經(jīng)過(guò)胃腸道過(guò)程中其應(yīng)能夠保持穩(wěn)定；例如，其應(yīng)抗蛋白水解降解、在酸性pH條件下穩(wěn)定并抗膽汁的去污降解作用。
如果適當(dāng)，這些藥物組合物可以通過(guò)吸入給藥、以栓劑或陰道栓的形式給藥、在子宮系統(tǒng)內(nèi)給藥、以洗劑，溶液，霜，軟膏或撲粉的形式局部給藥、通過(guò)使用透皮貼劑給藥、以含有賦形劑如淀粉或乳糖的片劑形式口服給藥、或者以膠囊或膠丸的形式單獨(dú)或與賦形劑混合給藥、或以含有較味劑或著色劑的酏劑，溶液或混懸劑的形式給藥，或者它們可以非腸道注射，例如，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下注射。對(duì)于非腸道給藥，這些藥物組合物最好以滅菌含水溶液的形式使用，其中可以含有其它物質(zhì)，例如，使該溶液與血液等滲需要的足夠的鹽或單糖。對(duì)于頰部或舌下給藥，這些組合物可以以片劑或錠劑的形式給藥，它們可以以常規(guī)方式配制。聯(lián)合藥物
本發(fā)明的化合物可以與一種或多種其它活性試劑聯(lián)合使用，例如，一種或多種其它藥物活性試劑。
例如，本發(fā)明的化合物可以與其它STS抑制劑和/或其它抑制劑如芳香酶抑制劑(例如，4-羥基雄甾烯二酮(4-OHA))和/或甾類，如天然產(chǎn)生的甾類脫氫表雄酮硫酸酯(DHEAS)和孕烯醇酮硫酸酯(PS)和/或其它結(jié)構(gòu)類似的有機(jī)化合物聯(lián)合給藥。
本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)使用或與孕激素聯(lián)合使用。優(yōu)選本發(fā)明的化合物在不存在孕激素的條件下使用。因此，在優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的組合物基本上不含孕激素。
此外，或供選擇的，本發(fā)明的化合物可以與生物反應(yīng)修飾劑聯(lián)合使用。
術(shù)語(yǔ)生物反應(yīng)修飾劑(“BRM”)包括細(xì)胞因子，免疫調(diào)節(jié)劑，生長(zhǎng)因子，血細(xì)胞生成調(diào)節(jié)劑，集落刺激因子，趨化、溶血和溶解血栓因子，細(xì)胞表面受體，配體，白細(xì)胞粘附分子，單克隆抗體，預(yù)防性和治療性疫苗，激素，細(xì)胞外基質(zhì)組分，纖連蛋白等。對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選，該生物反應(yīng)修飾劑是細(xì)胞因子。細(xì)胞因子的實(shí)例包括白介素(IL)，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-19；腫瘤壞死因子(TNF)，如TNF-α；α、β和γ干擾素；TGF-β。對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選該細(xì)胞因子是腫瘤壞死因子(TNF)。對(duì)于一些應(yīng)用，TNF可以是任何類型的TNF，如TNF-α、TNF-β，包括其衍生物或混合物。更優(yōu)選該細(xì)胞因子是TNF-α。在本領(lǐng)域可以發(fā)現(xiàn)有關(guān)TNF的教導(dǎo)，如WO-A-98/08870和WO-A-98/13348。給藥
一般來(lái)說(shuō)，醫(yī)生會(huì)確定最適于個(gè)體患者的實(shí)際劑量，且該劑量會(huì)隨特定患者的年齡、體重和反應(yīng)而變化。下面的劑量是平均情況的實(shí)例。當(dāng)然，可以存在應(yīng)接受較高和較低劑量范圍的個(gè)例。
本發(fā)明的組合物可以通過(guò)直接注射給藥。該組合物可以配制為非腸道、內(nèi)膜、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)和透皮給藥的形式。
對(duì)于任何特定的患者來(lái)說(shuō)特異性劑量水平和給藥頻率是可以變化的，并可根據(jù)多種因素變化，其中包括所用特定化合物的活性、代謝穩(wěn)定性以及此化合物作用時(shí)間的長(zhǎng)度、年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、給藥的方式和時(shí)間、排泄速度、藥物聯(lián)合、特定病癥的嚴(yán)重性以及該對(duì)象接受的療法。
除了上述典型的給藥方式外，術(shù)語(yǔ)“給藥”還包括通過(guò)技術(shù)如脂類介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑、陽(yáng)離子表面兩親物(CFAs)及其聯(lián)合形式進(jìn)行給藥。此類轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的途經(jīng)包括但不限于粘膜、鼻內(nèi)、口服、非腸道、胃腸道、局部和舌下途經(jīng)。
術(shù)語(yǔ)“給藥”包括但不限于通過(guò)粘膜途經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物，例如，以鼻內(nèi)噴霧劑和吸入氣霧劑或者可攝入的溶液的形式；非腸道途經(jīng)，其中給藥通過(guò)注射形式，例如，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下途經(jīng)。
因此，為了藥物給藥，本發(fā)明的STS抑制劑可以用常規(guī)藥物配制技術(shù)以任何適宜的方式與藥用載體、輔劑、賦形劑、稀釋劑等一起配制，并通常用于非腸道給藥?？梢砸詥蝿┝糠绞?、均分劑量方式和/或多劑量發(fā)生在持續(xù)的若干天內(nèi)給藥。為了口服給藥，它們可以配制為片劑、膠囊、溶液劑和混懸劑?；蛘?，這些化合物在適宜的非腸道給藥載體中配制并提供單日劑量等級(jí)以便非腸道給藥。但是，有效的日劑量應(yīng)隨患者的體重而變化，此變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識(shí)并可以由醫(yī)生判斷。細(xì)胞周期
本發(fā)明該化合物可以用于治療細(xì)胞周期紊亂的方法中。
正如在“Molecular Cell Biology”，第三版，Lodish等，第177-181頁(yè)討論的那樣，不同的真核細(xì)胞可以以差別很大的速度生長(zhǎng)和分裂。例如，酵母細(xì)胞可以每120分鐘分裂一次，而在海膽和昆蟲的胚細(xì)胞中受精卵的第一次分裂只需要1530分鐘，這是因?yàn)橐粋€(gè)大的原始細(xì)胞被再分裂。但是，大多數(shù)生長(zhǎng)植物和動(dòng)物細(xì)胞需要10-20小時(shí)使數(shù)量加倍，而一些以更慢的速度復(fù)制。成人中的很多細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞和紋狀肌細(xì)胞根本不分裂；另外，如促進(jìn)傷口愈合過(guò)程中成纖維細(xì)胞按照需要生長(zhǎng)，否則就處于靜止?fàn)顟B(tài)。
再者，每個(gè)分裂的真核細(xì)胞必須準(zhǔn)備將相等的遺傳物質(zhì)賦予兩個(gè)子代細(xì)胞。真核細(xì)胞中的DNA合成不是發(fā)生于整個(gè)細(xì)胞分裂周期中，而是在細(xì)胞分裂前限于其一部分中。
已在都能夠生長(zhǎng)和分裂的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)物中，徹底分析了真核細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞分裂之間的聯(lián)系。與細(xì)菌相反，人們發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞在DNA合成中只花費(fèi)了其時(shí)間的一部分，而在細(xì)胞分裂(有絲分裂氣)數(shù)小時(shí)前，其已完成。因此，DNA合成后與細(xì)胞分裂前產(chǎn)生了時(shí)間間期；在分裂后與DNA合成的下個(gè)循環(huán)前發(fā)現(xiàn)了其它間期。該分析得到了以下結(jié)論真核細(xì)胞周期由M(有絲分裂)期、G1期(第一個(gè)間期)、S(DNA合成)期、G2期(第二個(gè)間期)，并回到M。有絲分裂之間的期(G1、S和G2)總稱為分裂間期。
組織中很多不分裂的細(xì)胞(例如，所有的靜止成纖維細(xì)胞)在有絲分裂后并恰在DNA合成前終止了該周期；據(jù)稱這樣的“靜止”細(xì)胞已從細(xì)胞周期中退出并處于G0狀態(tài)。
當(dāng)它們處于細(xì)胞周期的三個(gè)分裂間期階段時(shí)，通過(guò)用熒光激活細(xì)胞分選儀檢測(cè)其相對(duì)的DNA含量，鑒定細(xì)胞是可能的處于G1(在DNA合成前)的細(xì)胞具有確定量x的DNA；在S期(DNA復(fù)制)，其含量為x至2x；而當(dāng)處于G2期(或M)，期具有2x的DNA。
動(dòng)物細(xì)胞中有絲分裂和胞質(zhì)分裂的階段如下
(a)分裂間期。分裂間期的G2階段立即處于有絲分裂開(kāi)始之前。染色體DNA已經(jīng)復(fù)制，并在S期與蛋白質(zhì)結(jié)合，但是還不可能看到染色體的明顯結(jié)構(gòu)。此分子只是核亞結(jié)構(gòu)，其在光學(xué)顯微鏡下是可見(jiàn)的。在DNA復(fù)制前在二倍體細(xì)胞中，每種類型存在兩種形態(tài)的染色體，而該是＝細(xì)胞被稱為2n。在G2中，DNA復(fù)制后，此細(xì)胞是4n。每個(gè)染色體DNA存在4個(gè)拷貝。由于姐妹染色體還沒(méi)有彼此分離，它們被稱為姐妹染色單體。
(b)前期的早期。中心粒，各具有新形成的子中心粒，開(kāi)始向細(xì)胞相反的極移動(dòng)；可以看到染色體象長(zhǎng)絲。核膜開(kāi)始解聚為小泡。
(c)前期的中和晚期。完成了染色體的縮合；各可見(jiàn)的染色體結(jié)構(gòu)由在其著絲點(diǎn)結(jié)合在一起的兩個(gè)染色單體組成。各染色單體含有兩個(gè)新復(fù)制的子DNA分子之一。微管紡錘體開(kāi)始從與中心粒相鄰的區(qū)域向外輻射，中心粒移動(dòng)接近它們的兩極。一些紡錘絲從一個(gè)極到達(dá)另一個(gè)極；大多數(shù)趨向染色單體并到達(dá)著絲點(diǎn)。
(d)中期。染色體移向細(xì)胞的赤道，它們?cè)诔嗟烂媾帕谐尚?。姐妹染色單體還沒(méi)有分離。
(e)后期。兩個(gè)姐妹染色單體分離為獨(dú)立的染色體。各含有一個(gè)著絲點(diǎn)，其通過(guò)紡錘絲與一個(gè)極相連，向該極移動(dòng)。因此，各染色體的一個(gè)拷貝獻(xiàn)給每個(gè)子細(xì)胞。同時(shí)，該細(xì)胞伸延，正如極與極紡錘體所為。當(dāng)分裂溝開(kāi)始形成時(shí)，胞質(zhì)分裂便開(kāi)始了。
(f)末期。在子核周圍形成新的膜；染色體展開(kāi)并變得不太明顯，核再次變得可見(jiàn)，且在各子核周圍形成核膜。胞質(zhì)分裂接近完成，隨著微管及其它紡錘絲的解聚紡錘體消失。在整個(gè)有絲分裂中，每個(gè)極上的子中心粒生長(zhǎng)到其全長(zhǎng)。在末期，完成各原始中心粒的復(fù)制，而而在下個(gè)分裂間期中會(huì)產(chǎn)生新的子中心粒。
(g)分裂間期。胞質(zhì)分裂完成時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的G1期并再進(jìn)行下個(gè)周期。
應(yīng)領(lǐng)會(huì)細(xì)胞周期是極其重要的細(xì)胞過(guò)程。正常細(xì)胞周期的偏差可導(dǎo)致一些疾病。升高和/或無(wú)限制的細(xì)胞周期可能導(dǎo)致癌癥。降低的細(xì)胞周期會(huì)導(dǎo)致變應(yīng)性病癥。本發(fā)明化合物的使用可以為治療這些疾病和病癥提供一種方法。
因此，本發(fā)明的化合物可以適用于治療細(xì)胞周期紊亂，如癌癥，包括激素依賴性和激素非依賴性癌癥。
此外，本發(fā)明化合物適用于治療癌癥如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、肉瘤、前列腺癌、胰腺癌等，以及其它的實(shí)體瘤。
對(duì)于一些應(yīng)用，細(xì)胞周期受到抑制和/或阻止和/或停滯，優(yōu)選其中細(xì)胞循環(huán)受到阻止和/或停滯。在另一方面，細(xì)胞周期可以在G2/M期中受到抑制和/或停滯。在一個(gè)方面中，細(xì)胞周期可以不可逆逆地被阻止和/或抑制和/或停滯。優(yōu)選其中細(xì)胞周期不可逆地被阻止和/或停滯。
術(shù)語(yǔ)“不可逆地阻止和/或抑制和/或停滯”指在本發(fā)明化合物應(yīng)用后，在撤除該化合物時(shí)，該化合物的作用，即細(xì)胞周期的阻止和/或抑制和/或停滯，仍是可以觀察到的。更具體地講，術(shù)語(yǔ)“不可逆地受到阻止和/或抑制和/或停滯”，指當(dāng)按照本文中給出的細(xì)胞周期檢測(cè)方案進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，接受被測(cè)化合物處理的細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞在方案I的階段2顯示出了較差的生長(zhǎng)。此方案的細(xì)節(jié)在下文中給出。
因此，本發(fā)明提供了化合物，它們通過(guò)阻止和/或抑制和/或停滯細(xì)胞周期，引起體內(nèi)雌激素受體陽(yáng)性(ER+)和ER陰性(ER-)的乳腺癌細(xì)胞的抑制，和/或在完整動(dòng)物(即，非卵巢切除的動(dòng)物)中引起亞硝基-甲基脲(NMU)誘發(fā)的乳腺腫瘤的消退，和/或阻止和/和抑制和/或停滯癌癥細(xì)胞中的細(xì)胞周期；和/或通過(guò)阻止和/或抑制和/或停滯細(xì)胞周期在體內(nèi)起作用和/或作為細(xì)胞周期激動(dòng)劑。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)(方案6)方法階段1
將MCF-7乳腺癌細(xì)胞以105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到多孔培養(yǎng)板中。當(dāng)將其作如下處理時(shí)，讓細(xì)胞吸附并生長(zhǎng)直到約30％融合
對(duì)照組不處理
被測(cè)化合物(COI)20μM
在含COI的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長(zhǎng)6天，每3天更換培養(yǎng)基/COI。在該過(guò)程結(jié)束時(shí)，用Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。階段2
用COI處理細(xì)胞6天后，以104個(gè)細(xì)胞/孔的密度再接種細(xì)胞。不再進(jìn)行處理。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基的存在下讓細(xì)胞再生長(zhǎng)6天。該過(guò)程結(jié)束時(shí)，再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。癌癥
如上所述，本發(fā)明化合物可以用于治療細(xì)胞周期紊亂。一種特別的細(xì)胞周期紊亂是癌癥。
在大多數(shù)西方國(guó)家，癌癥一直是主要的死亡原因。至今，研發(fā)的癌癥療法包括阻斷激素的作用或合成，以抑制激素依賴性腫瘤的生長(zhǎng)。但是，為了治療非激素依賴性腫瘤，常采用攻擊性更強(qiáng)的化療。
因此，對(duì)激素依賴性和/或非激素依賴性腫瘤進(jìn)行治療又沒(méi)有與化療有關(guān)的一些和全部副作用的抗癌藥物的研發(fā)，將會(huì)代表主要的治療進(jìn)展。
已知雌激素在其合成后，進(jìn)行一些羥基化和軛合反應(yīng)。直到最近，人們才想到這些反應(yīng)是代謝過(guò)程的一部分，該過(guò)程最終賦予雌激素水溶性并促進(jìn)它們從體內(nèi)清除?，F(xiàn)在，人們清楚地認(rèn)識(shí)到一些羥基代謝物(如2-羥基和16α-羥基)及軛合物(如雌酮硫酸酯，E1S)在測(cè)定雌激素的一些體內(nèi)復(fù)雜作用中是重要的。
研究人員已對(duì)2-和16-羥基化雌激素的形成與改變?nèi)橄侔┪ｋU(xiǎn)性的病癥之間的關(guān)系進(jìn)行了研究?，F(xiàn)已清楚增加2-羥化酶活性的因素與癌癥危險(xiǎn)性的降低有關(guān)，而升高的16α-羥基化作用會(huì)提高乳腺癌的危險(xiǎn)性。雌激素代謝物的生物作用中的其它利益受到不斷增加證據(jù)的鼓舞，即2-甲氧基雌二醇是具有抗有絲分裂性質(zhì)的內(nèi)源性代謝物。2-甲氧基雌酮-3-O-氨基磺酸酯(2-MeOE2)通過(guò)兒茶酚雌激素甲基轉(zhuǎn)移酶由2-羥基雌二醇(2-OHE2)形成，該酶廣泛分布在體內(nèi)。
研究人員已揭示了體內(nèi)2-MeOE2抑制腫瘤的生長(zhǎng)，這些腫瘤由皮下注射的Meth A肉瘤、B16黑素瘤或MDA-MB-435雌激素受體陰性的(ER-)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生。它還抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，以及體外血管生成。這暗示2-MeOE2體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力可能是由于其抑制腫瘤誘發(fā)的血管生成的能力，而不是對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的直接抑制。
2-MeOE2發(fā)揮其有力的抗有絲分裂和抗血管生成作用的機(jī)理還正在研究。顯然，其以高濃度可以抑制微管的聚合，并作為秋水仙堿結(jié)合微管蛋白的弱抑制劑。但是，最近發(fā)現(xiàn)以阻斷有絲分裂的濃度，細(xì)胞中的微管蛋白細(xì)絲解聚，但是具有與紫杉醇處理后觀察的相同的形態(tài)。因此，象一種用于乳腺癌和卵巢癌治療的藥物紫杉醇一樣，2-MeOE2通過(guò)穩(wěn)定微管的動(dòng)力學(xué)起作用。
雖然將2-MeOE2確定為治療癌癥的新方法代表了重要的進(jìn)步，但是口服雌激素的生物利用度差。此外，它們?cè)谄渫ㄟ^(guò)肝臟期間進(jìn)行深度代謝。作為開(kāi)發(fā)用于乳腺癌治療的甾類硫酸酯抑制劑研究過(guò)程的一部分，雌酮-3-O-氨基磺酸酯(EMATE)被確定為有效的直接針對(duì)活性位點(diǎn)的抑制劑。出人意料的是，證明EMATE具有強(qiáng)雌激素性質(zhì)，其在大鼠中的口服親子宮活性是雌二醇的100倍。認(rèn)為其升高的動(dòng)情性能來(lái)自紅細(xì)胞(rbc)對(duì)其的吸收，該吸收在其通過(guò)肝臟期間能防止滅活，且其作為貯庫(kù)在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)釋放藥物。合成并檢測(cè)了一些A環(huán)修飾的類似物，包括2-甲氧基雌酮-3-O-氨基磺酸酯。雖然該化合物作為甾類硫酸酯酶抑制劑與EMATE具有等價(jià)活性，但是其完全沒(méi)有動(dòng)情能力。
我們相信本發(fā)明的化合物為治療癌癥，并特別是乳腺癌的治療提供了手段。
此外或者二者擇一地，本發(fā)明的化合物可以用于阻斷癌癥的生長(zhǎng)，包括白血病和實(shí)體瘤，如乳腺、子宮內(nèi)膜、前列腺、卵巢和胰腺的腫瘤。治療相關(guān)性雌激素
我們相信本發(fā)明的一些化合物可以用于控制體內(nèi)特別是女性體內(nèi)的雌激素水平。因此，一些這樣的化合物可以用于提供控制生育的手段，如口服避孕片劑、丸劑、溶液劑和錠劑?；蛘?，該化合物可以是埋植劑和貼劑的形式。
因此，本發(fā)明的化合物可以用于治療與雌激素有關(guān)的病癥，特別是治療與雌激素缺乏有關(guān)的激素病癥。
此外，或供選擇的，本發(fā)明的化合物可以用于治療除與雌激素有關(guān)的激素病癥。因此，本發(fā)明的化合物還能影響激素活性并還能影響免疫反應(yīng)。神經(jīng)變應(yīng)性疾病
我們相信一些本發(fā)明的化合物可以用于治療神經(jīng)變應(yīng)性疾病及相似病癥。
例如，據(jù)信STS抑制劑可以用于提高以下疾病患者的記憶功能例如，健忘癥、頭部損傷、早老性癡呆、癲癇性癡呆、外傷后癡呆、老年性癡呆、血管性癡呆和中風(fēng)后癡呆或者其它需要提高記憶力的個(gè)體。TH1
我們相信本發(fā)明的一些化合物可以用于TH1交織。
例如，據(jù)信在巨噬細(xì)胞或其它存在抗原的細(xì)胞內(nèi)STS抑制劑的存在，可能導(dǎo)致致敏T細(xì)胞增長(zhǎng)TH1(高IL-2、IFNγ，低IL-4)反應(yīng)的能力降低。其它甾類如糖皮質(zhì)激素的正常調(diào)節(jié)劑的影響將因此占主導(dǎo)地位。炎癥
我們相信本發(fā)明的一些化合物可以用于治療炎癥，如與下列任何一種或多種情況有關(guān)的病癥自身免疫性，包括例如，類風(fēng)濕先關(guān)節(jié)炎、I型和II型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、甲狀腺炎、結(jié)節(jié)性脈管炎、潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎，皮膚疾病如牛皮癬和接觸性皮炎；移植物抗宿主病；濕疹；哮喘和移植后器官排斥反應(yīng)。
例如，據(jù)信STS抑制劑可以防止DHEA和相關(guān)甾類對(duì)免疫和/或炎性反應(yīng)的正常生理作用。
本發(fā)明的化合物可以用于制備顯示內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素樣作用的藥物。其它治療
還應(yīng)理解本發(fā)明的化合物/組合物可以具有其它重要的醫(yī)藥用途。
例如，本發(fā)明的化合物或組合物可以用于治療WO-A-99/52890所列出的疾病，即
此外，或供選擇的，本發(fā)明的化合物或組合物可以用于治療WO-A-98/05635中所列出的疾病。為了便于參考，現(xiàn)提供其中列出的部分疾病癌癥，炎癥或炎性疾病、皮膚病、發(fā)燒、心血管病、溶血病、凝血病和急相反應(yīng)、惡病質(zhì)、厭食、急性感染、HIV感染、休克、移植物抗宿主反應(yīng)、自身免疫性疾病、再灌注損傷、腦膜炎、偏頭痛和阿司匹林依賴性抗血栓形成；腫瘤生長(zhǎng)、侵入和擴(kuò)散，血管生成，腫瘤轉(zhuǎn)移，惡性腫瘤，腹水和惡性胸膜滲漏；腦局部缺血，局部缺血性心臟病，骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕先關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松，哮喘，多發(fā)性硬化，神經(jīng)變應(yīng)性疾病，早老性癡呆，動(dòng)脈硬化，中風(fēng)，結(jié)節(jié)性脈管炎，節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎；牙周炎，齒齦炎；牛皮癬，特應(yīng)性皮炎，慢性潰瘍，表皮松解大皰；角膜潰瘍，視網(wǎng)膜病和外科傷口愈合；鼻炎，變應(yīng)性結(jié)膜炎，濕疹，過(guò)敏反應(yīng)；再狹窄，充血性心力衰竭，子宮內(nèi)膜異位，動(dòng)脈粥樣硬化或內(nèi)硬化(endosclerosis)。
此外，或供選擇的，本發(fā)明的化合物或組合物可以用于治療WO-A-98/07859所列出的疾病。為了便于參考，現(xiàn)提供其中所列出的一部分細(xì)胞因子和細(xì)胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(如，用于治療免疫缺陷，包括人類免疫缺陷病毒感染；調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)；治療癌癥和很多自身免疫性疾病，并用來(lái)防止移植物排斥反應(yīng)或誘發(fā)腫瘤免疫性)；調(diào)節(jié)造血，如治療骨髓或淋巴樣疾?。淮龠M(jìn)骨、軟骨、腱和神經(jīng)組織的生長(zhǎng)，如用于愈合傷口，治療燒傷、潰瘍和牙周病以及神經(jīng)變應(yīng)性疾病；抑制和活化卵泡刺激激素(調(diào)節(jié)生育力)；趨化性/化學(xué)促活活性(如用于調(diào)動(dòng)特異細(xì)胞類型到損傷活感染的部位)；止血和溶栓活性(如用于治血友病和中風(fēng))；抗炎活性(用于治療如膿毒性休克和節(jié)段性回腸炎)；在人或獸醫(yī)藥中作為抗菌劑；調(diào)節(jié)劑如代謝或行為調(diào)節(jié)劑；作為止痛劑；治療特異性缺陷疾病；治療牛皮癬。
此外，或供選擇的，本發(fā)明的組合物可以用于治療WO-A-98/09985中所列疾病。為了便于參考，現(xiàn)提供其中所列出的一部分巨噬細(xì)胞抑制和/或T細(xì)胞抑制活性，并因此具有抗炎活性；抗免疫活性，即對(duì)細(xì)胞和/或體液免疫反應(yīng)的抑制活性，包括與炎癥無(wú)關(guān)的反應(yīng)；抑制巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞粘附細(xì)胞外基質(zhì)組分和纖連蛋白的能力，以及上調(diào)fas受體在T細(xì)胞中的表達(dá)；抑制不需要的免疫反應(yīng)和炎癥，包括關(guān)節(jié)炎，包括類風(fēng)濕先關(guān)節(jié)炎，與過(guò)敏性有關(guān)的炎癥，過(guò)敏反應(yīng)，哮喘，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，膠原性疾病及其它自身免疫性疾病，與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的炎癥、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、再灌注損傷、心動(dòng)停止、心肌梗塞、脈管炎、呼吸窘迫綜合癥或其它心肺疾病，與消化性潰瘍有關(guān)的炎癥、潰瘍性結(jié)腸炎及其它胃腸道疾病、肝纖維化、肝壞死或其它肝病、甲狀腺炎或其它腺體疾病、腎小球性腎炎或其它腎和泌尿系統(tǒng)疾病、耳炎或其它耳鼻喉科疾病、皮炎或其它皮膚病、牙周病或其它牙科疾病、睪丸炎或附睪炎、不育癥、睪丸外傷或其它免疫相關(guān)性睪丸病、胎盤機(jī)能障礙、胎盤機(jī)能不全、習(xí)慣性流產(chǎn)、驚厥、驚厥前期和其它免疫和/或與炎癥有關(guān)的婦科疾病、后色素層炎、中色素層炎、前眼色素層炎、結(jié)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、色素層視網(wǎng)膜炎、眼神經(jīng)炎、眼內(nèi)炎癥如視網(wǎng)膜炎或囊性斑水腫、交感神經(jīng)眼炎、鞏膜炎、視網(wǎng)膜炎性色素沉著、變應(yīng)性蛋白乳酪酥樣疾病(degenerative fondus disease)的免疫和炎癥部分、眼外傷的炎癥部分、感染引起的眼炎、增殖性玻璃體-視網(wǎng)膜病、急性局部缺血性視神經(jīng)病、疤痕形成過(guò)度如在青光眼濾光手術(shù)后、對(duì)眼移植的免疫和/或炎癥反應(yīng)以及其它免疫和炎癥相關(guān)性眼病、與自身免疫性疾病有關(guān)的炎癥、或者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或在任何其它器官中存在的且會(huì)得益于免疫和/或炎癥反應(yīng)抑制的病癥或疾病、帕金森氏病、治療帕金森氏病產(chǎn)生的并發(fā)癥和/或副作用、AIDS有關(guān)的癡呆綜合征、HIV相關(guān)性腦病、德維克氏病、舞蹈病、早老性癡呆及其它變應(yīng)性疾病、CNS的病癥或紊亂、中風(fēng)的炎癥反應(yīng)部分、脊髓灰質(zhì)炎后綜合征、神經(jīng)病的免疫和炎癥部分、脊髓炎、腦炎、亞急性硬化盤腦炎、腦脊髓炎、急性神經(jīng)病、亞急性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病、格巴二氏綜合征、Sydenham舞蹈病、重癥肌無(wú)力、假腦瘤(pseudo-tumour cerebri)、Down氏綜合征、Huntington氏舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索、CNS壓迫或CNS外傷的炎癥部分或者CNS感染、肌萎縮和營(yíng)養(yǎng)不良的炎癥部分、及免疫和炎性相關(guān)性疾病、腦和外周神經(jīng)系統(tǒng)的病癥或紊亂、外傷后炎癥、膿毒性休克、傳染病、手術(shù)的炎癥并發(fā)癥或不良反應(yīng)、骨髓移植或其它移植并發(fā)癥和/或不良反應(yīng)、基因療法的炎性和/或免疫性并發(fā)癥和不良反應(yīng)，如由于受病毒載體感染、或者與AIDS有關(guān)的炎癥；抑制體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，治療或減輕單核細(xì)胞或白細(xì)胞增殖性疾病如白血病，通過(guò)降低單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的量來(lái)預(yù)防和/或治療天然和人造細(xì)胞、組織和器官移植情況中的移植排斥反應(yīng)，如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起搏器、天然或人造皮膚組織?；衔镏苽?br> 本發(fā)明的化合物可以通過(guò)適當(dāng)?shù)拇寂c氯化物反應(yīng)制備。例如，本發(fā)明的氨基磺酸酯化合物可以通過(guò)適當(dāng)?shù)拇寂c式R1R2NSO2Cl的適宜的氨基磺酰基氯反應(yīng)制備。
進(jìn)行該反應(yīng)的典型條件如下。
在0℃下，將氫化鈉和氨基磺?；燃尤氲綌嚢璧?、該醇的無(wú)水二甲基甲酰胺溶液中。接著，讓該反應(yīng)升到室溫下，再繼續(xù)攪拌24小時(shí)。將該反應(yīng)混合物倒入到冷的碳酸氫鈉飽和溶液中，并用二氯甲烷萃取水相。將合并的有機(jī)萃取物用無(wú)水硫酸鎂干燥。過(guò)濾，接著真空蒸發(fā)溶劑，并與甲苯共蒸發(fā)，得到粗品殘余物，將其通過(guò)快速色譜進(jìn)一步純化。
優(yōu)選，在與氨基磺?；确磻?yīng)前，將該醇適當(dāng)?shù)匮苌?。如果需要，該醇中的官能基可以以已知方式進(jìn)行保護(hù)，并在該反應(yīng)結(jié)束時(shí)除去一個(gè)或多個(gè)保護(hù)基。
優(yōu)選，這些氨基磺酸酯化合物按照Page等的教導(dǎo)(1990Tetrahedron46；2059-2068)來(lái)制備?；蛘?，這些氨基磺酸酯化合物可以按照WO96/05216或WO96/05217來(lái)制備。概要
總之，本發(fā)明提供了適于口服避孕、激素替代療法、抑制E1-STS及其它治療應(yīng)用的新的組合物。實(shí)施例
現(xiàn)僅參照附圖通過(guò)實(shí)施例描述本發(fā)明，其中
附

圖1表示流程附圖2表示曲線附圖3表示曲線附圖4表示曲線附圖5表示曲線附圖6表示曲線附圖7表示曲線附圖8表示曲線附圖9表示曲線附圖10表示曲線附圖11表示曲線圖；制備本發(fā)明的下列化合物(一種或多種)制備雌酮-3-氨基磺酸酯
在0℃下，將氫化鈉(60％分散液；2eq)和氨基磺酰基氯(2eq)加入到攪拌的、雌酮(1eq)的無(wú)水二甲基甲酰胺溶液中。接著，讓該反應(yīng)升到室溫下，再繼續(xù)攪拌24小時(shí)。
將該反應(yīng)混合物倒入到冷的碳酸氫鈉飽和溶液中，并用二氯甲烷萃取水相。將合并的有機(jī)萃取物用無(wú)水硫酸鎂干燥。過(guò)濾，接著真空蒸發(fā)溶劑，并與甲苯共蒸發(fā)，得到粗品殘余物，將其通過(guò)快速色譜進(jìn)一步純化。
分析顯示如下數(shù)據(jù)δ1H(270MHz；CD3OD)0.91(s，3H，C18-Me)，1.40-2.55(m系列，13H)，2.90-2.92(m，2H)，7.04(brd，2H，J＝10.44Hz)，7.33(brd，1H，J＝8.42Hz)。δ13C(67.8MHz；CD3OD)14.53(q，C18-Me)，22.80(t)，27.24(t)，27.73(t)，30.68(t)，33.05(t)，37.01(t)，39.76(d)，45.73(s，C18)，51.86(d)，120.76(d)，123.54(d)，127.89(d)，139.83(s)，150.27(s)，223.87(s，C＝O)。m/z(％)349(9)(m+)，270(100)，213(26)，185(43)，172(31)，159(21)，146(36)，91(33)，69(37)，57(73)，43(56)，29(24)。
微量分析
C H N
理論值61.87％ 6.63％ 4.01％
實(shí)測(cè)值61.90％ 6.58％ 3.95％用雌二醇氨基磺酸酯(J995)進(jìn)行研究技術(shù)
研究雌二醇氨基磺酸酯(J995)的體外和體內(nèi)激素性質(zhì)。體外研究包括評(píng)價(jià)其與雌激素受體的特異性結(jié)合，其中使用大鼠和小鼠及MCF-7腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)制劑。用幾種動(dòng)物進(jìn)行體外研究，包括完整和卵巢切除的大鼠和cynomolgus猴。這些物種用來(lái)研究該化合物非腸道給藥和口服時(shí)的詳細(xì)藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)。
給絕經(jīng)后婦女口服該化合物，在人類中進(jìn)行研究。評(píng)價(jià)單劑量和多劑量給藥的若干劑量。用非腸道給藥用在油性載體中的溶液進(jìn)行體外研究。用結(jié)晶J995在含水載體中的懸浮液進(jìn)行口服治療。用無(wú)定型藥物與常規(guī)組分的混合物配制的蓋侖制劑以膠囊或片劑的形式進(jìn)行臨床研究。
體外研究表明J995本身對(duì)雌激素受體沒(méi)有親合性。放射性標(biāo)記的J995對(duì)小鼠、大鼠和人的雌激素受體沒(méi)有特異性結(jié)合。大大過(guò)量的J995不能特異性地置換結(jié)合的放射性標(biāo)記的雌二醇。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)都強(qiáng)烈地證明J995在由無(wú)激素活性分子轉(zhuǎn)變?yōu)橛屑に鼗钚苑肿雍蟛虐l(fā)揮雌激素作用。前藥J995，或其主要代謝物雌酮氨基磺酸酯(EMATE)，分別水解為氨基磺酸和天然的雌激素雌二醇及雌酮(附圖1)。
由于在紅細(xì)胞中優(yōu)先運(yùn)輸，該前藥和J995具有特殊的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。J995不象常規(guī)雌激素那樣在血液的血漿部分中循環(huán)，98-99％的J995在紅細(xì)胞內(nèi)循環(huán)。這種紅細(xì)胞運(yùn)輸致使肝臟激素作用和在肝臟首過(guò)中的提取大大降低，而紅細(xì)胞作為貯庫(kù)使J995從其中長(zhǎng)時(shí)間釋放。就口服雌激素治療而言J995的優(yōu)越性
·改變血液濃度的個(gè)體差異(附圖2和3)
雌激素治療的頭號(hào)標(biāo)準(zhǔn)物是乙炔基雌二醇。此化合物不能帶來(lái)恰當(dāng)規(guī)定的血液濃度(附圖4)。這種個(gè)體差異的不利之處是為了達(dá)到可以接受的成功治療率在大多數(shù)個(gè)體中需要使用比實(shí)際需求更高的劑量。
·雌激素劑量的降低及活性代謝物的負(fù)荷可能促進(jìn)了一些激素依賴性腫瘤的生長(zhǎng)
用所謂的共軛雌激素、雌二醇、雌三醇戊酸酯和雌酮硫酸酯進(jìn)行的常規(guī)口服雌激素替代療法，導(dǎo)致循環(huán)中雌酮硫酸酯的大量蓄積。一些該代謝物水解帶來(lái)雌酮和雌二醇的治療性血液濃度。但是，雌酮硫酸酯的缺點(diǎn)是在乳腺癌組織中其特別積極地被硫酸酯酶水解，這會(huì)產(chǎn)生可能促進(jìn)生長(zhǎng)的雌激素。J995，聯(lián)系其劑量而言，在相同的劑量下比雌二醇戊酸酯帶來(lái)更高并持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的雌二醇水平(附圖6、7)。較雌二醇戊酸酯治療，下游產(chǎn)生的代謝物雌酮硫酸酯至少降低了10倍(附圖5)。
·肝臟雌激素作用的降低
為了應(yīng)付肝臟的大量激素?fù)p失，對(duì)于常規(guī)口服雌激素治療來(lái)說(shuō)，高劑量的雌激素是必需的。這種高劑量的缺點(diǎn)是對(duì)雌激素調(diào)節(jié)肝功能方面不利的作用。其中包括對(duì)止血系統(tǒng)和相關(guān)血栓栓塞疾病的作用因素，在循環(huán)中血管緊張肽原升高，及其帶來(lái)的對(duì)腎上腺、腎和血管功能的作用，膽汁分泌和脂代謝的變化。J995作用的肝臟繞過(guò)機(jī)理和本發(fā)明的超低劑量策略，避免了絕經(jīng)后雌激素治療的副作用?？诜o藥的J995幾乎100％到達(dá)紅細(xì)胞貯庫(kù)。多于50％的此前藥在循環(huán)中以雌酮和雌二醇的形式出現(xiàn)(附圖11)。與常規(guī)口服雌激素治療相比，這樣為每單位時(shí)間使用更低的劑量提供了可能。
·獲得恒定的血液濃度
常規(guī)每天口服雌激素治療中，每天之間的雌激素血液濃度不斷波動(dòng)(附圖5，6，7)，而J995帶來(lái)了非常恒定、長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的血液濃度(附圖5，6，7，8，9，10)。附圖9顯示了幾乎恒定的雌酮硫酸酯水平，這反映出以每天100μg非常低的劑量用J995治療14天后在144小時(shí)的沖洗階段中上游產(chǎn)生的雌二醇和雌酮。
·在雌激素缺乏骨骼中雌二醇氨基磺酸酯的作用
已確立的口服雌激素療法不能獲得本文中描述的恒定和很好規(guī)定的血液濃度。J995能恰在導(dǎo)致子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)的閾值下提供精確的骨保護(hù)治療。沒(méi)有子宮內(nèi)膜作用允許，在優(yōu)選的方面中，在不同時(shí)使用孕激素的前提下使用J995?；贘995對(duì)于雌激素替代療法來(lái)說(shuō)用只含雌激素的制劑就可以獲得改善
·不帶有出血的治療
聯(lián)合雌激素/孕激素治療的原理是控制代表子宮內(nèi)膜癌癥惡化危險(xiǎn)的子宮內(nèi)膜增殖。這種保護(hù)基本作用的代價(jià)是巨大的。周期性和持續(xù)性的聯(lián)合治療導(dǎo)致出血，這些可能是中斷雌激素替代治療的最重要的原因。
·對(duì)健康的作用
該治療的另一個(gè)已明確的副面作用是，對(duì)于雌激素對(duì)絕經(jīng)期婦女健康發(fā)揮的正面作用的損害。
·乳腺
孕激素對(duì)乳腺的增生作用帶來(lái)的問(wèn)題類似于孕酮在妊娠中的作用。對(duì)這些作用的憂慮與它們?cè)谌橄侔┌l(fā)展中的潛在作用有關(guān)。
·代謝副作用
孕激素，如孕酮本身，對(duì)很多代謝功能具有重要作用。其中包括胰島素分泌和降低的胰島素抗性，以及對(duì)脂代謝的作用。在雌激素替代治療中相應(yīng)的作用代表了不希望的作用。雌激素替代療法的意義
在絕經(jīng)后，在卵巢雌激素分泌停止后，婦女會(huì)發(fā)生恒定的骨質(zhì)損失。由于婦女的預(yù)期壽命非常高并仍不斷升高這一事實(shí)，必須防止骨損失和所造成的骨骼脆性。至今，這是高齡殘廢和患病以及死亡的最重要的危險(xiǎn)性。
上述說(shuō)明書中所有的出版物和專利引入本文中作為參考。
在不背離本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)的前提下，本發(fā)明的多種改變和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。雖然已結(jié)合特別優(yōu)選的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是應(yīng)理解本發(fā)明所要求保護(hù)的不應(yīng)只限于這樣的特定實(shí)施方案。實(shí)際上，我們要將對(duì)化學(xué)、生物和相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的實(shí)施本發(fā)明的所述方式的各種改進(jìn)形式，包括在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其中含有
(i)式(I)的化合物
式I
其中X是環(huán)中具有至少4個(gè)原子的烴基環(huán)；K是烴基基團(tuán)；Rs是氨基磺酸根；
(ii)任選地與藥用載體、稀釋劑、賦形劑或輔劑混合，其中該化合物以提供不大于200μg/天劑量的量存在。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該化合物以提供10至200μg/天劑量的量存在。
3.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中該化合物以提供50至200μg/天劑量的量存在。
4.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中該化合物以提供20至50μg/天劑量的量存在。
5.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該化合物以不大于200μg/劑量的量存在。
6.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該化合物以不大于1mg/劑量的量存在。
7.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該化合物以不大于4mg/劑量的量存在。
8.上述任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中X與K聯(lián)合模擬甾類結(jié)構(gòu)。
9.上述任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中K是環(huán)狀基團(tuán)。
10.上述任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中X是6員環(huán)。
11.上述任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中環(huán)X具有6個(gè)環(huán)碳原子。
12.上述任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中該化合物是式II的化合物
式II其中各Rs、X和K如權(quán)利要求1所定義。
13.上述任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中X與K聯(lián)合是甾類環(huán)結(jié)構(gòu)。
14.上述任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中基團(tuán)K和環(huán)X是甾類環(huán)結(jié)構(gòu)或其被取代的衍生物。
15.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述Rs基團(tuán)在X環(huán)的3位上。
16.上述任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中Rs是氨基磺酸根基團(tuán)。
17.上述任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中該化合物是式III的化合物
式III其中X、K和Rs如權(quán)利要求1所定義；且其中Rh1是任選的鹵素基團(tuán)；Rh2是任選的鹵素基團(tuán)；Rh1和Rh2的至少一個(gè)是存在的。
18.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中Rh1在環(huán)X的2位上。
19.權(quán)利要求17或18的藥物組合物，其中Rh2在環(huán)X的4位上。
20.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述式I化合物選自如下化合物
17α乙炔基17β雌二醇-3-氨基磺酸酯 17β雌二醇-3-氨基磺酸酯
17α雌二醇-3-氨基磺酸酯雌酮-3-氨基磺酸酯(EMATE)
雌三醇-3-氨基磺酸酯。
21.用于藥物的上述任一權(quán)利要求所述的組合物。
22.權(quán)利要求1至20任一項(xiàng)所述的組合物在制備用于口服避孕的藥物中的用途。
23.權(quán)利要求1至20任一項(xiàng)所述的組合物在制備用于激素替代療法中的藥物中的用途。
24.權(quán)利要求1至20任一項(xiàng)所述的組合物在制備用于沒(méi)有子宮內(nèi)膜刺激的骨保護(hù)激素替代療法的藥物中的用途。
25.權(quán)利要求1至20任一項(xiàng)所述的組合物在制備用于治療與STS有關(guān)的病癥或疾病的藥物中的用途。
26.權(quán)利要求1至20任一項(xiàng)所述的組合物在制備用于治療與有害的STS水平有關(guān)的病癥或疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其中含有(i)式(I)的化合物，其中X是環(huán)中具有至少4個(gè)原子的烴基環(huán)；K是烴基基團(tuán)；Rs是氨基磺酸根；(ii)任選地與藥用載體、稀釋劑、賦形劑或輔劑混合，其中該化合物以提供不大于200μg/天劑量的量存在。
文檔編號(hào)A61K31/565GK1404394SQ0180364
公開(kāi)日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2001年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月14日
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