木聚糖酶在谷物和谷物副產(chǎn)物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請涉及制備飼料產(chǎn)品和/或飼料添加劑組合物，其用于改進(jìn)受試者的表現(xiàn)或 提高消化率（如營養(yǎng)消化率）或提高受試者的飼料轉(zhuǎn)化率。特別的，本發(fā)明涉及在溶解谷 物和谷物副產(chǎn)物中的戊聚糖方面具有預(yù)料不到的優(yōu)良活性的木聚糖酶的用途。本發(fā)明進(jìn)一 步涉及木聚糖酶在例如動物飼料中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 許多植物和植物副產(chǎn)物被用作動物飼料，如大豆、苜蓿、大麥；牛角花；蕓苔屬植 物-例如甘藍(lán)、油菜、蕓苔、瑞典甘藍(lán)和蕪菁；三葉草、玉米（玉蜀黍）、燕麥、粟、高粱、大豆 和小麥。對于這些應(yīng)用，有利的是分解來自植物細(xì)胞壁物質(zhì)的復(fù)合糖。
[0003] 植物細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的半纖維素和纖維素是潛在的能量來源，因為其由C5和C6糖 組成。C6糖可被動物用作能量來源，而寡C5糖可被動物腸道存在的微生物群轉(zhuǎn)化為短鏈脂 肪酸（van den Broek 等，2008Molecular Nutrition & Food Research, 52, 146-63)。因 此，協(xié)助溶解此類C5和C6糖增加了這些植物的能量利用。
[0004] 已經(jīng)教導(dǎo)了酶如木聚糖酶（如內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶（EC 3. 2. 1.8))在分解來 自植物細(xì)胞壁的復(fù)合糖中的應(yīng)用。木聚糖酶是對這一類將線性多糖β-1，4-木聚糖降解為 木寡糖或木糖從而分解植物細(xì)胞壁主要成分之一-半纖維素的酶的命名。
[0005] 例如，Econase? XT是可從ABVista獲得的來自里氏木霉（Trichoderma reesei)的內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶。
[0006] 本領(lǐng)域熟知不同木聚糖酶（來源于不同的微生物或植物）的功能差異很大。
[0007] 谷物和谷物副產(chǎn)物被用于許多工業(yè)之中，例如在動物飼料中。
[0008] 但是，不同植物在半纖維素和纖維素結(jié)構(gòu)上具有變化，其影響了不同酶溶解諸如 糖類的能力。
[0009] 例如，Econase? XT可以溶解小麥中的戊聚糖。如本文所示，這種可商購的木聚 糖酶并不能很好的溶解玉米或玉米副產(chǎn)物中的糖類（如戊聚糖）。
[0010] 相應(yīng)的，存在對制備飼料和/或飼料添加劑組合物的方法的需求，該方法可以使 得來自谷物或谷物副產(chǎn)物的戊聚糖溶解的更多。
【附圖說明】
[0011] 圖1顯示了編碼AclXyn5木聚糖酶的核苷酸序列（SEQ ID No. 1)。小寫字母表示 的核苷酸顯示了內(nèi)含子序列。信號序列以粗體（大寫字母）顯示。
[0012] 圖2顯示了一種編碼本發(fā)明的AclXyn5木聚糖酶的核苷酸序列（SEQ ID No. 2)。 信號序列以粗體（大寫字母）顯示。
[0013] 圖3顯示了一種編碼本發(fā)明的AclXyn5木聚糖酶的核苷酸序列（SEQ ID No. 3)。
[0014] 圖4顯示了本發(fā)明的AclXyn5木聚糖酶的多肽序列（SEQ ID No. 6)。其是前體蛋 白。序列的粗體部分顯示了能在酶成熟之前被剪切的N末端信號肽。
[0015] 圖5顯示了 AclXyn5木聚糖酶的多肽序列（SEQ ID No. 7)。其是酶的一種活性形 式。其在本發(fā)明中可以稱為酶的成熟形式。
[0016] 圖6顯示了 AclXyn5木聚糖酶的多肽序列（SEQ ID No. 8)。其也是酶的一種活性 形式，經(jīng)翻譯后加工而產(chǎn)生。
[0017] 圖7顯示了質(zhì)粒pZZH159的圖譜。
[0018] 圖8顯不了 AclXyn5的pH譜。已發(fā)現(xiàn)AclXyn5的最適pH是約5,并且在ρΗ4· 3和 6. 6之間保留大于最大活性值的70%。
[0019] 圖9顯示了 AclXyn5的溫度譜。已發(fā)現(xiàn)AclXyn5的最適溫度是60°C，并且在49°C 到64°C之間保留大于最大活性值的70%。
[0020] 圖10顯示了用于通過自動化間苯三酚法檢測戊聚糖的自動化分析儀的圖 解：（a)混有HCl的醋酸；(b)氣泡生成器（air bubbling) ; (c)溶于乙醇的間苯三酚； (d)樣品；（e)樣品加速器；（f)流動室出口；（g)蠕動泵；(h)玻璃線圈；（i)恒溫器 (96°C) ;(j)多波長分光光度計（410、510、550 和 620nm) ;(k)廢料；（1)計算機(jī)（Rouau & Surget，1994Carbohydrate Polymers, 24, 123-32)。
[0021] 圖11顯示了來自cDDGS的戊聚糖的溶解，其作為木聚糖劑量的一個函數(shù)。所使用 的木聚糖酶是木聚糖酶（AclXyn5)，與基準(zhǔn)木聚糖酶Econase? XT進(jìn)行比較。圖例的順 序指不了最商木聚糖酶劑量（36mg/kg詞料）的排序。
[0022] 圖12顯示了孵育18h后在添加和不添加 AclXyn5木聚糖酶（36mg/kg飼料）的情 況下，戊聚糖（C-5糖）分別從玉米和cDDGS中的釋放（戊聚糖的溶解）。
[0023] 圖13顯示了單獨和聯(lián)合使用木聚糖酶和蛋白酶處理對來自不溶性玉米DDGS的戊 聚糖和蛋白質(zhì)溶解的作用。根據(jù)在線ANOVA和Holm-Sidak比較，字母a-d具有顯著差異， 整體顯著水平在P = 0. 05。誤差線指示了 S. D。
[0024] 發(fā)明概述
[0025] 本發(fā)明開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)了一種來自棒狀曲霉（Aspergillus clavatusis)的特殊木 聚糖酶，其在溶解谷物和/或谷物副產(chǎn)物中糖（如戊聚糖）方面具有驚人的優(yōu)異表現(xiàn)。
[0026] 特別的，該木聚糖酶出乎預(yù)料的善于分解（溶解）不溶性阿糖基木聚糖 (AXinsol)。驚人的，已發(fā)現(xiàn)該酶有效分解（溶解）來自大范圍底物的AXinsol，底物包括玉 米、小麥、DDGS等，尤其是玉米和基于玉米的底物，特別是小麥（包括基于小麥的）產(chǎn)品和 玉米（包括基于玉米的產(chǎn)品）產(chǎn)品。其與已知的酶明顯不同，已知的酶經(jīng)常在溶解谷物或 基于谷物的底物中的AXinsol表現(xiàn)較差，或不能有效溶解基于小麥或玉米的底物。
[0027] 此外，本發(fā)明的酶不但在分解（溶解MXinsol方面表現(xiàn)優(yōu)異，而且在有效分解 (或降解）溶解的多聚物方面也表現(xiàn)優(yōu)異。
[0028] 不期望被理論所限制，雖然一些傳統(tǒng)的木聚糖酶分解AXinsol，但其導(dǎo)致高分子量 可溶性降解產(chǎn)物的增加，這是不利的。
[0029] 此外，或另外可選的和再次的，不期望被理論所限制，常規(guī)的木聚糖酶分解 AXinsol，但由于它們降解溶解的高分子量產(chǎn)品不夠快，混合物的粘度并不理想。相反地，與 傳統(tǒng)酶相比，使用本發(fā)明的方法和用途，木聚糖酶分解AXinsol，同時也快速降解溶解的高 分子量產(chǎn)物-從而改進(jìn)了受試者的消化率、表現(xiàn)和飼料效率。
[0030] 已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的且如此處所述的酶不僅分解（溶解）不溶性的、來源于大范圍底 物的阿糖基木聚糖（AXinsol)，并且有效分解由此溶解的聚合物，所述底物包括玉米、小麥、 DDGS等，尤其是玉米和基于玉米的底物，特別是小麥（包括基于小麥的）產(chǎn)品和玉米（包括 基于玉米的產(chǎn)品）。
[0031] 因此，本發(fā)明涉及能溶解戊聚糖，尤其是溶解含有木聚糖的原料，例如阿糖基木聚 糖，尤其是不溶性阿糖基木聚糖的酶。特別的，該酶尤其在溶解范圍廣泛的底物的戊聚糖特 別是含有木聚糖的原料方面表現(xiàn)優(yōu)異，如阿糖基木聚糖，尤其是不溶性阿糖基木聚糖，所述 底物包括基于玉米的底物。
[0032] 此外，不同來源的半纖維素的異質(zhì)性/變異是巨大的。雖然大多數(shù)木聚糖的基礎(chǔ) 結(jié)構(gòu)是相似的，即D-木糖殘基的α 3-1，4連接的主鏈，事實上，多樣性是巨大的，這是由于 主鏈大小和主鏈中取代的類型和程度的差異，其都取決于木聚糖的來源。特別的，取代類型 在不同來源之間的變化很大，最常見的取代物是α-4-0-甲基葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、醋酸 和在取代糖中整個被連接的不同酚類物質(zhì)。在兩種木聚糖中的取代方式不僅改變了它們的 物理性質(zhì)例如溶解度、水結(jié)合力、粘度，也改變了其對酶攻擊的敏感性。例如，與產(chǎn)自小麥的 那些相比，來自玉米的木聚糖水解產(chǎn)物在大小、取代程度和數(shù)量上都有所不同。作為植物細(xì) 胞壁結(jié)構(gòu)的這種異質(zhì)性的結(jié)果，逐步形成了大量木聚糖降解系統(tǒng)，其每一種都具有自己的 特點。本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料的開發(fā)了一種木聚糖酶，其在溶解范圍廣泛的植物原料尤 其是谷物和/或谷物副產(chǎn)物的糖類（如戊聚糖）方面表現(xiàn)優(yōu)異。
[0033] 基于這些發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的木聚糖酶可被用于降解含有木聚糖的原料，尤其是 阿糖基木聚糖，特別是AXinsol。此外或另外可選的，根據(jù)本發(fā)明的木聚糖酶可被用于降解 產(chǎn)生于AXinsol的降解的或（天然地）存在于基于谷類的物質(zhì)中的可溶性多聚體（如寡聚 體）。令人吃驚的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的木聚糖酶可被用于降解含有木聚糖的原料，尤 其是阿糖基木聚糖，特別是AXinsol，并且然后可用于降解產(chǎn)生于AXinsol的降解的可溶性 多聚體（如寡聚體）。
[0034] 基于該出乎預(yù)料的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了制備飼料和/或飼料添加劑組合物的方 法，其可使谷物或谷物副產(chǎn)物中的阿糖基木聚糖（如戊聚糖）的溶解增加。
[0035] 例如，這些飼料和/或飼料添加劑組合物可以使得成本-效率提高；改進(jìn)受試者的 表現(xiàn)；增加消化率（如營養(yǎng)消化率）或增加受試者的飼料效率；和/或增加產(chǎn)率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0036] 根據(jù)第一個方面，本發(fā)明涉及制備基于谷物的產(chǎn)品的方法，所述方法包括將一種 含有（組成是或組成基本上是）谷物和/或谷物副產(chǎn)物的植物組合物與一種木聚糖酶相接 觸，該酶含有：如SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示的多肽；或與SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8具有至少85% (更適當(dāng)?shù)?，至?0%或至少95%) 同一性的變體、片段、同源物或其衍生物；或該酶由如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，或可與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3的互補(bǔ)序列在 高嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3具有至 少80% (合適的，至少85%或至少90%或至少95%)同一性的核苷酸序列所編碼。
[0037] 在一個方面，基于谷物的產(chǎn)品可以是基于谷物的飼料產(chǎn)品或其部分。
[0038] 在一個方面，該方法可進(jìn)一步包括加入一種或多種植物原料，例如高纖維植物原 料。例如，該方法可進(jìn)一步包括加入一種或多種額外的飼料原料，例如高纖維飼料原料。
[0039] 常規(guī)用作能量來源（如在動物飼料中）的原料價格持續(xù)上漲導(dǎo)致在這些工業(yè)的初 始底物中使用低成本纖維原料，特別是在動物飼料中使用低成本纖維副產(chǎn)物。
[0040] 但是，纖維的加入可導(dǎo)致一些不利影響。例如在動物飼料中，加入纖維可導(dǎo)致抗?fàn)I 養(yǎng)作用。動物腸內(nèi)存在的未降解多聚體導(dǎo)致產(chǎn)生高粘性內(nèi)含物，結(jié)果阻礙擴(kuò)散并降低了營 養(yǎng)吸收。并且，多聚體具有高水結(jié)合力，妨礙了有效的水分重吸收，該水分保持增加了腸內(nèi) 容物的體積，其導(dǎo)致小腸轉(zhuǎn)運時間減少（Englyst & Kingman(1993) ,Human Nutrition and Dietetics,第 9 版（Garrow J. S.，James W. Ρ· Τ·，eds. )ρ· 53)。
[0041] 在飼料物質(zhì)中，半纖維素和纖維素也形成物理屏障，包裹像淀粉和蛋白質(zhì)一樣的 營養(yǎng)物并因此阻止了動物對這些營養(yǎng)物的吸收。
[0042] 有利地，本發(fā)明制備飼料物質(zhì)或飼料添加劑組合物的方法可分解低成本纖維原料 中的復(fù)合糖類，如谷物DDGS溶解性糖類，例如戊聚糖。相應(yīng)的，可以降低成本同時減輕或降 低與低成本纖維原料相關(guān)的有害作用。進(jìn)一步地，有利地，本發(fā)明的酶對例如來自該低成本 (例如基于玉米的）纖維原料的戊聚糖的溶解可使得動物表現(xiàn)、飼料效率和/或受試者中營 養(yǎng)消化率改善和增加。
[0043] 一個方面，飼料添加劑組合物可與木聚糖酶通過以下方式接觸：將木聚糖酶與飼 料原料組合物混合，將木聚糖酶噴灑在飼料原料混合物表面或?qū)⑹澄镌辖M合物浸漬在含 有木聚糖酶的制劑中。
[0044] -個方面，谷物副產(chǎn)物是谷物谷蛋白粉或谷物谷蛋白飼料或谷物蒸餾干谷粒 (cDDG)或谷物蒸餾干谷?？扇芪铮―DGS)。
[0045] 一個方面，該飼料產(chǎn)品或飼料原料組合物是配合飼料，配合飼料成分、配合飼料預(yù) 混合料、草料、草料成分、或草料的預(yù)混合料。
[0046] -個方面，制備根據(jù)本發(fā)明的飼料產(chǎn)品的方法可包括使飼料原料組合物形成粉 狀飼料（meal)、顆粒飼料（pellete)、堅果狀飼料（nut)、餅狀飼料（cake)或碎屑狀飼料 (crumble)〇
[0047] 本發(fā)明進(jìn)一步提供根據(jù)本發(fā)明方法制備的基于谷物的產(chǎn)品。
[0048] 另一方面，本發(fā)明提供基于谷物的產(chǎn)品，其包括谷物和/或谷物副產(chǎn)物和木聚糖 酶，該酶含有：
[0049] i)如 SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7 或 SEQ ID No. 8 所示的多肽序列，或與 SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8具有至少85%同一性的變體、片段、同源物或其衍生 物；或
[0050] 該木聚糖酶由
[0051] a)如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 或 SEQ ID No. 3 所示的核苷酸序列，或
[0052] b)可與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3的互補(bǔ)序列在高嚴(yán)格條件下 雜交的核苷酸序列，或
[0053] c)與 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 或 SEQ ID No. 3 具有至少 80% 同一性的核苷酸 序列所編碼。
[0054] 本發(fā)明進(jìn)一步提供制備飼料添加劑組合物的方法，其包括：將木聚糖酶與飼料可 接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合，并（可選的）進(jìn)行包裝，該酶含有：如SEQ ID No. 6或 SEQ ID No. 7 或 SEQ ID No. 8 所示的多肽；與 SEQ ID No. 6 或 SEQ ID No. 7 或 SEQ ID No. 8 具有至少85%同一性的變體、片段、同源物或其衍生物；或該酶由如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，或可與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3 的互補(bǔ)序列在高嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3具有至少80%同一性的核苷酸序列所編碼。
[0055] 在另一方面，提供飼料添加劑組合物（或包裝的飼料添加劑組合物），其包括（或 組成是或組成基本上是）木聚糖酶以及飼料可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，該酶含有：如 SEQ ID No. 6 或 SEQ ID No. 7 或 SEQ ID No. 8 所示的多肽；與 SEQ ID No. 6 或 SEQ ID No. 7 或SEQ ID No. 8具有至少85% (合適的，至少90%或至少95%)同一性的變體、片段、同 源物或其衍生物；或該酶由如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3所示的核苷酸序 列，或可與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3的互補(bǔ)序列在高嚴(yán)格條件下雜交的 核苷酸序列，或與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3具有至少80% (合適的，至 少85%或至少90%或至少95% )同一性的核苷酸序列所編碼。
[0056] 在另一方面，本發(fā)明提供含有根據(jù)本發(fā)明的飼料添加劑組合物或木聚糖酶的預(yù)混 合料，該酶含有：如SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示的多肽；與SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8具有至少85% (合適的，至少90%或至少95% )同 一性的變體、片段、同源物或其衍生物；或該酶由如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，或可與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3的互補(bǔ)序列在 高嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3具有至 少80% (合適的，至少85%或至少90%或至少95% )同一'丨生的核苷酸序列所編碼；所述酶 與至少一種礦物質(zhì)和/或至少一種維生素組合。
[0057] 適當(dāng)?shù)?，根?jù)本發(fā)明的飼料添加劑組合物或預(yù)混合料可配制成干粉或顆粒（優(yōu)選 TPT顆粒）。
[0058] -個方面，本發(fā)明提供改進(jìn)受試者表現(xiàn)或增加消化率（如營養(yǎng)消化率）或提高受 試者中飼料效率的方法，其包括施用：
[0059] a.根據(jù)本發(fā)明制備的基于谷物的產(chǎn)品；或
[0060] b.根據(jù)本發(fā)明的飼料添加劑組合物或預(yù)混合料；或
[0061] c.木聚糖酶，其含有：如SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示的多 肽；與SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8具有至少85%同一性的變體、片段、同 源物或其衍生物；或該酶由如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3所示的核苷酸序 列；或可與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3的互補(bǔ)序列在高嚴(yán)格條件下雜交的 核苷酸序列，或與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3具有至少80% (更適合的， 至少85%或至少90%或至少95% )同一'丨生的核苷酸序列所編碼；
[0062] 其中，在b.和c.中，可選的可向受試者進(jìn)一步施加植物組合物，如含有谷物或谷 物副產(chǎn)物的植物組合物。
[0063] 一個方面，本發(fā)明涉及下述物質(zhì)用以改進(jìn)受試者表現(xiàn)或增加消化率（如營養(yǎng)消化 率）或提高受試者中飼料（特別是涉及基于谷物的飼料產(chǎn)品）效率的用途：根據(jù)本發(fā)明的 基于谷物的產(chǎn)品或其部分，或根據(jù)本發(fā)明的飼料添加劑組合物，或根據(jù)本發(fā)明的預(yù)混合料， 或木聚糖酶，該酶含有：如SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示的多肽；與SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8具有至少85% (合適的，至少90 %或至少95% ) 同一性的變體、片段、同源物或其衍生物；或該酶由如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，或可與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3的互補(bǔ)序列在 高嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 1、SEQ ID