專利名稱：用于人體細胞高效表達外源基因的人源性啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于人體細胞高效表達外源基因的人源性啟動子。具體地，本發(fā)明的啟動子來自人類熱休克蛋白基因hsp90β，在本文中所述的啟動子稱為B6.1。
20世紀后半葉以來，人類的疾病譜已發(fā)生了很大的變化。隨著分子生物學研究的進展和基因工程技術(shù)的擴展和成熟，不斷揭示疾病的本質(zhì)，發(fā)現(xiàn)新的單基因病以及多種嚴重危害人類健康的疾病如腫瘤、動脈硬化、高血壓、哮喘等都具有多基因參與的遺傳性質(zhì)改變或基因突變。因此，使用基因工程產(chǎn)品或直接進行基因治療已成為治療人類疾病的必要手段。目前，可有效表達基因工程產(chǎn)品的大腸桿菌、酵母及昆蟲多角病毒表達系統(tǒng)往往不能完成多種人類蛋白的轉(zhuǎn)譯后加工，因此，很難獲得高生物活性產(chǎn)品。而在哺乳動物細胞內(nèi)，由于缺乏相應(yīng)高效表達的強啟動子，外源基因在體內(nèi)的表達量通常很少，有效生物活性也很低。目前用于人類細胞體外高效表達的巨細胞病毒、腺病毒、SV40等啟動子，以及常用于將外源基因?qū)肴嘶蚪M內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等載體等都具有可能引起意外的遺傳性狀改變、產(chǎn)生比野生型病毒更加危險的新病毒、或潛在的致癌危險性等缺點。因此，構(gòu)建一種非病毒性的、安全、高效的人類基因強啟動子或載體，必將為拓寬基因治療的安全度和使用范圍奠定基礎(chǔ)。
以往的研究已知熱休克蛋白是一類高度保守的應(yīng)激蛋白，存在于幾乎所有生物體內(nèi)，根據(jù)其分子量大小和同源性可分為以下幾大類HSP104,HSP90,HSP70,HSP60/GroEL，小分子HSP(包括HSP23,26,27等)和泛素等。熱休克蛋白可在不同的應(yīng)激如熱、重金屬離子、病毒感染、缺氧等情況下誘導表達，有些HSP如HSP90也可在正常生理代謝條件下表達。熱休克蛋白對在正常生理代謝及應(yīng)激條件下對細胞的保護等生理過程起著重要作用。在細胞內(nèi)，HSP參與蛋白質(zhì)的折疊，亞基的組裝，胞內(nèi)運輸及蛋白質(zhì)降解等過程來調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和功能，同時又不參與靶蛋白的組成。因此，熱休克蛋白又被稱為“分子伴侶”(Molecular Chaperone)。
研究發(fā)現(xiàn)HSP90基因是HSP家族中為數(shù)不多的含有內(nèi)含子的成員，它有α和β兩個拷貝(Hickey,E等Mol.Cell Biol.(1989)9:2615-2626；Rebbe，NF等，J.Biol.Chem.(1989)264，15006-15011)該基因不僅受熱誘導表達而且呈高組成性表達(Shen YF,J.Cell.Physiol.(1996)Suppl.4，36-41)。本發(fā)明人在研究人類淋巴細胞hsp90基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制時發(fā)現(xiàn)，含有hsp90β基因5’上游區(qū)、第一外顯子和第一內(nèi)含子(-1039/+1531bp)的‘全長’(2.57kb)調(diào)控片段具有使報告基因高水平表達的組成性和熱誘導表達活性(Shen YF等，F(xiàn)EBS Lett.(1997)443:92-98)，其組成性表達活性高于國際上已商品化的某些病毒啟動子，如在淋巴細胞中hsp90β的調(diào)控片段比巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子活性高1倍，比猴肉瘤病毒SV40早期啟動子高5.8倍，僅稍低于雞肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子活性。最近發(fā)現(xiàn)在商品化的體外真核基因高效可控表達的細菌tet-on載體體系中，在其最佳誘導條件下，基因表達效率也僅為受hsp90β調(diào)控片段介導的基因的表達水平的3.9倍。因此，人hsp90β基因調(diào)控片段有可能用作體內(nèi)高效表達目的基因的新型非病毒性啟動子。而且，經(jīng)體外升溫處理后，hsp90β基因啟動子的活性可再升高2-2.5倍。顯示它有可能使目的基因出現(xiàn)溫度控制下的超高效表達并應(yīng)用于臨床。此外，升溫處理能使細胞內(nèi)源性HSP90及其它分子伴侶如HSP70，HSP60等都誘導表達，從而有利于外源基因表達產(chǎn)物的正確折疊和轉(zhuǎn)運，以保證產(chǎn)物具有較高的生物活性。
鑒于上述2.57kb基因調(diào)控片段中還可能存在負調(diào)控元件影響目的基因的表達水平，因此，本發(fā)明人從人類hsp90β基因調(diào)控片段出發(fā)，進行高組成性表達的優(yōu)化重組，終于獲得了一段具有更高活性的組成性表達啟動子片段，由此完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于人體細胞高效表達外源基因的啟動子，該啟動子是人源的，克服了現(xiàn)有技術(shù)中病毒性啟動子的缺點。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于人體細胞高效表達外源基因的非病毒性啟動子，命名為B6.1，其長度為1738bp，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，在SEQ ID NO:1中，+1為轉(zhuǎn)錄起始位點，下劃線分別代表CAAT盒(-87/-84)及TATA盒(-27/-24)的所在位置。
本發(fā)明的啟動子B6.1的長度為1738 bp，其核苷酸序列見SEQ IDNO:1，其保留了hsp90β基因從5′上游一1039bp至第一內(nèi)含子+531bp片段及第一內(nèi)含子3′端+1373/+1531bp。該啟動子除含有CAAT盒(-87/-84bp)、SP1結(jié)合位點(-51bp)、核心啟動子TATA盒(-27bp)、轉(zhuǎn)錄起始位點(+1bp)外，還含有本發(fā)明人首先發(fā)現(xiàn)的對hsp90β基因的高組成性及熱誘導轉(zhuǎn)錄起關(guān)鍵作用的第一內(nèi)含子3′端的富含A/T區(qū)(+1373/+1531bp)，及其中的數(shù)個轉(zhuǎn)錄起始子元件。
正如在下述實施例中所詳細描述的，為獲得本發(fā)明的啟動子B6.1，本發(fā)明人構(gòu)建了數(shù)十個含有hsp90β基因不同調(diào)控序列的氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(Chloramphenicol Acetyltransferase，CAT)或熒光素酶(Luciferase，Luc)報告基因質(zhì)粒，并多次分別轉(zhuǎn)染Jurkat真核細胞系，通過檢測轉(zhuǎn)染了受不同調(diào)控序列介導的報告基因質(zhì)粒的細胞，在熱休克前后細胞裂解液中相應(yīng)的酶活性，進一步確定了hsp90β基因中調(diào)控組成性和熱誘導轉(zhuǎn)錄的正、負調(diào)控元件及其序列。然后根據(jù)所得結(jié)果，將hsp90β基因的調(diào)控元件進行了多次過渡性重組，先后構(gòu)建了受不同優(yōu)化重組調(diào)控片段介導的報告基因質(zhì)粒16個。經(jīng)過檢測報告基因的相對酶活性，篩選出一個組成性表達最高的重組質(zhì)粒pB6.1。pB6.1的組成性表達是含有上述hsp90β基因2.57kb基因調(diào)控片段的質(zhì)粒的1.82倍，不僅比CMV及SV40啟動子強，而且超過RSV啟動子的活性(見實施例2)。
因此，與現(xiàn)有技術(shù)的啟動子相比，由于本發(fā)明的啟動子是人源性的，所以具有安全的優(yōu)點。另外，本發(fā)明的啟動子能介導外源基因在人類細胞中高水平表達，其強度超過所檢測過的病毒啟動子。
本發(fā)明的啟動子可用于基因治療中，即通過exvivo基因轉(zhuǎn)移法，將患者的血液取出，在體外將含有本發(fā)明的強啟動子及受其調(diào)控的目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，再輸送回體內(nèi)?；蛘咭部赏ㄟ^肌肉注射或呼吸道吸入等途徑輸入體內(nèi)達到全身或局部治療的目的。
以下將參照附圖和實施例更詳細地描述本發(fā)明。其中

圖1為hsp90β基因‘全長’調(diào)控片段的示意圖。
圖2為質(zhì)粒pHSP90β1的構(gòu)建流程圖。
圖3為質(zhì)粒pHSP90β2的構(gòu)建流程圖。
圖4為質(zhì)粒pHSP90β3的構(gòu)建流程圖。
圖5為質(zhì)粒pHSP90β3.1的構(gòu)建流程圖。
圖6為質(zhì)粒pHSP90βBg的構(gòu)建流程圖。
圖7為質(zhì)粒pHSP90β6.1的構(gòu)建流程圖。
圖8示出B6.1啟動子與其它15種以B3.1為基礎(chǔ)的重組啟動子活性比較。
圖9為B6.1啟動子與hsp90β基因2.57kb調(diào)控片段及四種病毒啟動子的活性比較示意圖。
實施例1含有啟動子B6.1的報告基因質(zhì)粒pHSP90β6.1的構(gòu)建1．含有hsp90β基因5’上游片段(-1102/+67bp)的質(zhì)粒pHSP90β1的構(gòu)建1.1 hsp90β基因5’上游片段(-1102/+67bp)的擴增根據(jù)文獻發(fā)表的人hsp90β基因的序列(圖1)，設(shè)計并合成了能擴增含有hsp90β基因核心啟動子、上游啟動元件、cAMP應(yīng)答元件、一個非典型熱休克元件(HSE，-648/-734)及部分第一外顯子片段的一對引物P1和P2，所述引物序列如下
P1:5’GC-1102GAGCTCCGGCTGCCCTGCAC-10833’(下劃線為SacⅠ位點)P2:5’GCGAATTC+46GCAACGTAGGCTTGCTTTCCGA+673’(下劃線為EcoRⅠ位點)應(yīng)用此對引物，從人外周血白細胞λGEM-11基因組文庫(Promega公司)的DNA中經(jīng)PCR擴增出與預(yù)期一致的1.1kb的DNA片段。1.2 hsp90β基因5’上游片段(-1102/+67bp)的克隆回收所獲得的1.1kb PCR擴增片段，依次用T4 DNA聚合酶處理使片段兩端平末端化，EcoRⅠ酶切，T4多聚核苷酸激酶處理使5′端磷酸化，最后與經(jīng)EcoRⅠ及HindⅡ雙酶切的pGEM-4Z載體(Promega公司)連接。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1blue菌株，挑取陽性克隆，制備質(zhì)粒。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶譜分析、Southem印跡雜交及測序鑒定，證實人hsp90β基因-1102/+67bp片段已被定向克隆，該重組質(zhì)粒被命名為pHSP90β1。該質(zhì)粒的整個構(gòu)建過程如圖2所示。2．含有hsp90β基因第一外顯子及第一內(nèi)含子片段(-2/+1531bp)的質(zhì)粒pHSP90β2的構(gòu)建根據(jù)發(fā)表的人hsp90β基因的序列，設(shè)計合成了第二對引物P3和P4，其序列如下P3:5’-2GTAGCTCTCTCGAGTCACT+173’(下劃線為XhoⅠ位點)P4:5’+1530AAAATAAAAATCTCATTAAT+15113’(下劃線為VspⅠ位點)利用該對引物，以人外周血淋巴細胞基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增出1530bp片段，從瓊脂糖凝膠中回收該擴增片段，與過渡載體pCRⅡ(Invitrogen公司)連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1blue菌株，挑取陽性克隆，制備質(zhì)粒。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶譜分析及測序鑒定，證實hsp90β基因第一外顯子及第一內(nèi)含子片段(-2/+1531bp)已被克隆到過渡載體中。將所得質(zhì)粒用PstⅠ完全酶切及XhoⅠ部分酶切，回收插入片段并克隆到pBS-KS質(zhì)粒(Strategene公司)中，構(gòu)建成質(zhì)粒pHSP90β2(圖3)。3．質(zhì)粒pHSP90β3的構(gòu)建先用EcoRⅠ及PstⅠ酶切質(zhì)粒pHSP90β1，將含有hsp90β基因5’上游片段(-1039/+67bp)插入pBS-KS，然后，用XhoⅠ完全酶切該過渡質(zhì)粒，回收含有hsp90β基因-1039/+7bp的大片段，經(jīng)牛小腸堿性磷酸酶處理后，與經(jīng)XhoⅠ部分酶切pHSP90β2后回收的、含hsp90β基因+7/+1531bp的片段進行重組，構(gòu)建成質(zhì)粒pHSP90β3(圖4)。該質(zhì)粒含有hsp90β基因-1039/+1531bp片段。4．氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)報告基因質(zhì)粒pHSP90β3.1及pHSP90βBg的構(gòu)建依次用PstⅠ完全酶切及XhoⅠ部分酶切質(zhì)粒pHSP90β3，回收含hsp90β基因-1039/+1531bp的片段，插入CAT報告基因質(zhì)粒pBLCAT3(北京醫(yī)科大學賈泓褆教授贈給)的相應(yīng)多克隆位點之間，構(gòu)建成質(zhì)粒pHSP90β3.1(圖5)。然后，用BglⅡ酶切質(zhì)粒pHSP90β3.1，回收大片段，經(jīng)T4 DNA連接酶自連，構(gòu)建成質(zhì)粒pHSP90βBg。與pHSP90β3.1相比，pHSP90βBg的CAT基因上游調(diào)控序列中刪除了hsp90β基因第一內(nèi)含子中+110/+1372bp片段，因此，將pHSP90β3.1質(zhì)粒中+1373/+1531bp片段插入片段的序列號改為+109/+268bp(圖6)。5．質(zhì)粒pHSP90β6.1的構(gòu)建首先用MluⅠ酶切質(zhì)粒pHSP90β3.1中hsp90β基因+531bp位點，經(jīng)Klenow酶補平后，再用PstⅠ酶切-1039bp位點，回收小片段(即hsp90β基因-1039/+531bp片段)。另用BglⅡ酶切質(zhì)粒pHSP90βBg，經(jīng)Klenow酶補平后，再用PstⅠ酶切-1039bp位點，回收大片段(其中含有+109/+268bp片段，相當于hsp90β基因中的+1373/+1531bp)。然后，將回收的兩個片段連接，構(gòu)建成質(zhì)粒pHSP90β6.1。與質(zhì)粒pHSP90β3.1相比，pHSP90β6.1刪除了hsp90β基因第一內(nèi)含子中840bp(+532/+1372bp)片段，該質(zhì)粒中插入片段長度為1738bp(圖7)。pHSP90β6.1中的hsp90β基因調(diào)控片段被命名為啟動子B6.1，其序列見SEQ ID NO:1所示。實施例2 B6.1啟動子活性的測定及其與其它病毒啟動子活性比較A．方法B6.1啟動子活性的測定1．質(zhì)粒轉(zhuǎn)染[Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kinston,RE.,et al.,Current protocol in molecular biology,New York,Greene PublishingAssociated and Wiley-Interscience,1987.]取氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)報告基因質(zhì)粒pB6.1及pHSP90β3.1或其它以hsp90β基因2.57kb調(diào)控片段(B3.1)為基礎(chǔ)的優(yōu)化重組質(zhì)粒各9μg,分別加入含有500μg DEAE-Dextran(Pharmacia公司)的STBS緩沖液(25mMTris-HCl pH7.3,137mM NaCl,6mM Na2HPO4,0.7mM CaCl2,0.5mMMgCl2)的Jurkat細胞(2×107)懸浮液中,并加入1μgβ-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,β-Ga1)報告基因質(zhì)粒pSV-β-gal(Promega公司)作為轉(zhuǎn)染效率內(nèi)參照，在37℃培養(yǎng)90分鐘后，滴加DMSO至終濃度10％，2分鐘后用STBS洗細胞3次，再將細胞分組轉(zhuǎn)入12孔培養(yǎng)板，在37℃培養(yǎng)66小時后收集細胞。
2．氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶活性的測定[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd edNewYork,Cold Spring Harbor Laboratory,1989.]轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)PBS洗2次后，懸浮于細胞裂解液(250mM Tris-HCl pH7.8)中，在液氮及37℃水浴中反復(fù)凍融3-4次，然后，在4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，收集上清液。在30μl上清液中加入20μl 100mM Tris-HCl pH7.8溶液后，在65℃加熱15分鐘，再依次加入200μl反應(yīng)液(100mMTris-HCl pH7.8，125mM氯霉素，0.1μCi3H標記的乙酰輔酶A(Amersham公司))及5ml閃爍液，在37℃反應(yīng)12-14小時后，用Liquid Lumex儀測定各樣品的cpm值。然后，再用相應(yīng)樣品中的半乳糖苷酶活性進行校正。
3．β-半乳糖苷酶活性的測定向6μl細胞裂解上清液中加入40μlLumiGal反應(yīng)液(Clontech公司)，在室溫反應(yīng)1小時后，用Monolight 2010熒光儀測定各上清液中的熒光強度。幾種病毒啟動子活性的測定1．質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性的測定分別將以雞肉瘤病毒(RSV)長末端重復(fù)序列(LTR)、巨細胞病毒(CMV)啟動子及hsp90β基因“全長”片段(1039/+1531bp)為啟動子的三種熒光素酶(Luc)報告基因質(zhì)粒(均由本組構(gòu)建)以及受猴肉瘤病毒SV40早期啟動子和增強子調(diào)控的Luc質(zhì)粒pGL2(Promega公司)用DEAE-Dextran方法(見上述方法)或Lipofectamine方法(Gibco-BRL公司)轉(zhuǎn)染Jurkat細胞，在37℃培養(yǎng)48小時后，收集細胞，向各組細胞中加入100μl裂解液(Promega公司)，在室溫放置15-20分鐘后，在4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，收集上清。取20μl上清液，用Luciferase Reaction System(Promega公司)及Monolight2010熒光儀測定各上清液中的熒光強度。再用相應(yīng)樣品的蛋白濃度進行校正。2．蛋白濃度的測定基本按照Bradford的Coomassie Brillent BlueG-250顯色法[Bradford,M.M.,Concentration of ProteinCoomassieBlue Solution.Anal Biochem,1976,72248.]測定細胞裂解液的總蛋白濃度。結(jié)果一、B6.1的啟動子活性比較分別轉(zhuǎn)染帶有B6.1的CAT報告基因質(zhì)粒pHSP90β6.1及含有“全長”2.57kb的pHSP90β3.1的人淋巴細胞中相對CAT活性，以pHSP90β3.1的啟動子的活性為100時，在pHSP90β6.1質(zhì)粒中，B6.1驅(qū)動下的CAT活性為183.8+42.3，即高于“全長”片段1.8倍以上，是同期構(gòu)建和檢測的15種重組質(zhì)粒中活性最高的(圖8)。二、B3.1與病毒啟動子活性的比較將含有hsp90β基因“全長”片段(B3.1)的熒光素酶報告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性與分別受3種商品化的病毒啟動子介導的熒光素酶活性進行比較。以hsp90β基因“全長”片段的啟動子活性為100，發(fā)現(xiàn)CMV啟動子活性為hsp90β的48.3％，SV40早期啟動子為其l7.1％，只有RSV啟動子活性高于hsp90β基因“全長”片段的1.60倍。
綜合比較上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)B6.1啟動子活性高于所有檢測過的病毒啟動子(圖9)。
序列表SEQ IDNO:1的信息序列特征(A)長度1738bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲學線性序列描述SEQ ID NO:1-1044 CTGCAGGAGC GAAGTGGGCG GAAAAAAAGC GAACCAGCTT GAGAAAGGGC-994 TTGACGTGCC TGCGTAGGGA GGGCGCATGT CCCCGTGCTC CGTGTACGTG-944 GCGGCCGCAG GGGCTAGAGG GGGGTCCCCC CCGCAGGTAC TCCACTCTCA-894 GTCTGCAAAA GTGTACGCCC GCAGAGCCGC CCCAGGTGCC TGGGTGTTGT-844 GTGATTGACG CGGGGAAGGA GGGGTCAGCC GATCCCTCCC CAACCCTCCA-794 TCCCATCCCT GAGGATTGGG CTGGTACCCG CGTCTCTCGG ACAGGTCAGA-744 GCGGGTCGCC GGGTGGGGTC GCTGCAAAAA CCCTGCCCCG GCCGCAGCCG-694 AGAGGCGGAC GTCGCGGGGA GGGGGCGGGA CCGCCGAGAC AGGCCTGGAA-644 ACTGCTGGAA ATGCCGCAGT GCCGCCGCCG CCCCTTCCGC CGCATGTCGG-594 CAAAGAGTCC CCGCCAGCCC CGGCCGGCGC CCTCCCCCTA CGCTGAGCTG-544 CCCCTCAGCG CGAACCCTCC GCCCTTTCCT CTACTCTTGC GAGAGTCGGG-494 ATCTGGGGCT ACCCAAGGTT GGGTCCCGAA TGCCAGTCCC TCTGTCGGGA-444 CGCGAGATGT GTAGGGCAGA TGCTAGGAAG AAGATTGGGT CTGGGAGCGG-394 TGGTCCGCGT GGTTAGCTGC CTCCGCTCTT TTTCGGTGTC CCCCCCAGTC-344 CCGCCCTTGG GTGTGGGGAC GCCTGCCCCA CAAGTGTTTA GGGAGGTCAG-294 TGGGTTCCTC GCCCGTAGAG ACTCCGTTTA TGCCAAATGA GCACTCCTCA-244 TCCCCGCTCT TGATGGAGTC ATGTCCTAGA CGTGAAACTA TGGGGCTGTG-194 ATCACAAGCA AATGTGTGGG CGGATCCGTT GCTTGGGTTC TTCCCCGCCC-144 CCTCCTTTTT TCGGACCATG ACGTCAAGGT GGGCTGGTGG CGGCAGGTGC-94 GGGGTTGACA ATCATACTCC TTTAAGGCGG AGGGATCTAC AGGAGGGCGG+1-44 CTGTACTGTG CTTCGCCTTA TATAGGGCGA CTTGGGGCAC GCAGTAGCTC+7TCTCGAGTCA CTCCGGCGCA GTGTTGGGAC TGTCTGGGTA TCGGAAAGCA+57 AGCCTACGTT GCTCACTATT ACGTATAATC CTTTTCTTTT CAAGGTAAGG+107 CTGAGATCTC CGCTAGCCTT CTTTCCCTTT AGTGCTGTAT TCGTGTTGTT+157 TTTGTTTTTT TCTGTCCTTT AGGGAGCCTT AGTCTAGATG TCGGGGTGGC+207 TTGTGGATAA CGCTCTGGAT TTTTATAGGG TGAGGGTAGT GGTGGGTGAG+257 GTTTTTTGAG TCCTCCTCGG TTTTCTCTAG TGTGTTTGGG GGGTGGGGCT+307 TTCTCTCGGC GCCTGCTGGC CGTAGCGAGG TGGGCTGTGG GGTTGGGGCA+357 GTGGGCGGCT GGCAGCTGCA CGTGGTGGCC GCGCGGCCCG GGACGCTGCC+407 ATTTTTGCCC CTCCACTTCC GGACGCGGCT ACGGGGCGTC GGAGGGGGAC+457 CGCAGGGTGG CGGGGGTGCC CGCTGGGGTG ACTCAGCACG GCCTTGTGGG+507 ACTGGCTTTG TCACCTCTCT TATCGGACGC GGATCTTTAA GAGAATGCAT+557 TTTTAGTCTT GGGAAGGGAT AGTACTCCGG TTAAACCAGT CTGAACTCAC+607 TGTCTAAGGT CCTAACAAAT GATATGACCT TTAGGATTTT TAAACATGGG+657 GCCTTAGTGT TCTTTTGTAA TTAATGAGAT TTTTATTTT
權(quán)利要求
1.一種啟動子，其來自人熱休克蛋白基因hsp90β，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于人體細胞高效表達外源基因的人源啟動子。具體地,本發(fā)明的啟動子來自人類熱休克蛋白基因hsp90β。
文檔編號C12N15/12GK1299871SQ9912593
公開日2001年6月20日 申請日期1999年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月10日
發(fā)明者沈珝琲, 劉巨洪, 王曉哲, 程小款 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所