專利名稱：：采前和采后貯藏化合物再轉(zhuǎn)移的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請(qǐng)涉及采前和采后貯藏化合物再轉(zhuǎn)移的抑制，尤其描述了用重組DNA轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)繁殖植物后對(duì)萌芽的抑制和一種恢復(fù)這些植物萌芽的方法。
背景技術(shù)：
：與農(nóng)業(yè)遺傳工程一樣，傳統(tǒng)育種的主要目的是獲得高產(chǎn)的作物，即通常意味著育種目的是增加作物貯藏器官內(nèi)，例如馬鈴薯的塊莖、甜菜的直根、葉生作物如生菜的葉子中貯藏的量。但是，植物中的一些其它過程如開花和／或萌芽，經(jīng)常對(duì)產(chǎn)量造成影響。在非常低的溫度冷藏(稍高于冰點(diǎn))通常可以抑制萌芽。冷藏不但昂貴，而且會(huì)對(duì)貯藏器官造成破壞性作用，不利于進(jìn)一步加工或?qū)е掠袃r(jià)值的產(chǎn)品如淀粉等物質(zhì)的損失。例如，當(dāng)馬鈴薯的塊莖置于低溫條件時(shí)，它們會(huì)把淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖，此種現(xiàn)象稱為“冷甜化”。變成還原糖是不希望的，因?yàn)楫?dāng)在烤或油炸的過程中會(huì)發(fā)生諸如美拉德反應(yīng)，這會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生不希望的褐變。為了防止冷甜化，馬鈴薯可以貯藏在較高溫度下，但這樣會(huì)引起它萌芽，這是我們不希望發(fā)生的。工業(yè)上采用氯苯胺靈(CIPC)來控制塊莖萌芽。盡管CIPC的使用已經(jīng)很有效，但仍然被認(rèn)為是一種不希望的化學(xué)處理。在世界范圍內(nèi)，人們?cè)絹碓街匾曈蒙锟刂频臋C(jī)制來代替化學(xué)控制試劑，前者非常安全而且更符合環(huán)保的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)考慮用遺傳的方法來抑制萌芽時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮到對(duì)于用作種子的馬鈴薯，萌芽是一個(gè)必須的特性。因此所采用的機(jī)制既能夠使種子馬鈴薯正常生產(chǎn)，又能抑制所培養(yǎng)的用于食用或進(jìn)一步加工用的馬鈴薯的萌芽。發(fā)明概述本發(fā)明包括一種用來抑制采前和采后貯藏化合物再轉(zhuǎn)移的方法。具體地講，本發(fā)明包括一種通過用能夠表達(dá)蛋白質(zhì)的重組DNA轉(zhuǎn)化植物或它的親本，從而抑制植物部分萌芽的方法，其特征在于此蛋白質(zhì)是海藻糖磷酸合酶(TPS)。更具體地講，包含編碼TPS基因的重組DNA來源于細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、植物或人類，優(yōu)選地來自大腸桿菌。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種誘導(dǎo)植物萌芽的方法，即給該植物提供編碼TPS的重組DNA，其側(cè)翼是位點(diǎn)特異性重組酶的目標(biāo)位點(diǎn)，然后用編碼相應(yīng)重組酶的基因轉(zhuǎn)化該植物或與能夠表達(dá)該重組酶的植物雜交，來切除編碼TPS的重組DNA。本發(fā)明的另一實(shí)施方案也包括一種誘導(dǎo)植物萌芽的方法，即給植物提供編碼TPS的重組DNA，隨后或同時(shí)用另一重組DNA轉(zhuǎn)化該植物，后一重組DNA包含編碼能夠在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下中和TPS作用的分子的基因，然后通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)迫使上述中和分子表達(dá)。中和分子的一個(gè)例子是海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)或反義TPS基因的產(chǎn)物。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是通過外源施加中和TPS基因表達(dá)的抑制作用的化合物，來解除采前和采后貯藏化合物轉(zhuǎn)移的抑制。優(yōu)選地，這種抑制的解除可以通過使用赤霉酸來完成。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是用形成創(chuàng)傷(wounding)來恢復(fù)萌芽。本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是通過給植物提供編碼TPS的重組DNA，隨后或同時(shí)在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，用另一重組DNA轉(zhuǎn)化該植物，后一重組DNA包含編碼抑制基因的基因，來誘導(dǎo)植物萌芽。該抑制基因能夠抑制TPS的表達(dá)，并且通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)迫使抑制基因表達(dá)。本發(fā)明也提供了由上述任何一種方法培育的植物，尤其是營(yíng)養(yǎng)繁殖植物，更具體來講是馬鈴薯和洋蔥。另外，編碼TPS的基因可以置于特定啟動(dòng)子的控制下，例如patatin啟動(dòng)子，它特異性的在馬鈴薯植物的塊莖中驅(qū)動(dòng)表達(dá)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是抑制菊苣中菊粉的分解代謝、甜菜中蔗糖的分解代謝和馬鈴薯中淀粉的降解。圖1．用赤霉酸(GA)和不用赤霉酸處理14天(圖1A)和25天后(圖1B)patatin-TPS塊莖的萌芽狀況。發(fā)明詳述只從定義的角度來講，轉(zhuǎn)化植物這一通用概念指的是植物總體或植物群體。這一概念涵蓋寬范圍的植物，而不僅限于某一種特定的植物種。本發(fā)明涉及一種采前和／或采后抑制貯藏化合物再轉(zhuǎn)移的方法。貯藏化合物的再轉(zhuǎn)移是植物利用貯藏化合物所采用的一種方法，這些物質(zhì)通常貯藏在特化的貯藏器官里。一個(gè)如此轉(zhuǎn)移的典型例子是從貯藏器官例如塊莖、鱗莖或種子的萌芽過程。具體講，本發(fā)明提供了抑制萌芽，優(yōu)選為營(yíng)養(yǎng)繁殖植物萌芽的方法，以及再恢復(fù)萌芽被抑制的植物中萌芽能力的方法。此意義上的萌芽是指根尖、蔓、匍匐枝或吸器的形成，特別是從貯藏組織上形成。本發(fā)明的基礎(chǔ)基于以下事實(shí)，人們驚奇的發(fā)現(xiàn)TPS的表達(dá)能抑制萌芽。TPS是在海藻糖合成過程中有活性的一種酶，目前人們還不知道它在萌芽組織中起作用。然而最近人們發(fā)現(xiàn)(WO97／42326)，TPS和TPP酶能夠極大地改變它們所表達(dá)的組織中的碳水化合物代謝和光合能力。而且人們還發(fā)現(xiàn)TPS和TPP的作用是相反的，也就是說，二者同時(shí)表達(dá)時(shí)，在植物的生理和表型上觀察不到任何變化。在該申請(qǐng)中，另外發(fā)現(xiàn)TPS在塊莖中的表達(dá)也可以減小“冷甜化”過程的作用，因?yàn)樵谑斋@時(shí)和貯藏后還原糖的比例都減小了。因此，考慮到本發(fā)明，TPS的表達(dá)可能從兩方面改善了馬鈴薯的貯藏對(duì)于冷藏而言，冷甜化過程的減小作用非常重要，而對(duì)于在更溫和溫度下貯藏而言，預(yù)防萌芽就更為重要。因此，TPS能夠抑制貯藏化合物的再轉(zhuǎn)移。這也可以應(yīng)用到其它作物上，如菊苣，它的菊粉經(jīng)降解為其它的碳水化合物。TPS在菊苣貯藏組織中的表達(dá)抑制了菊粉的分解性降解。同樣，也可以抑制甜菜中蔗糖的降解。這樣，TPS在甜菜塊根中的表達(dá)抑制了貯藏過程中蔗糖的損失。通常，通過在易于萌芽的組織如馬鈴薯塊莖中表達(dá)TPS基因，可以獲得抗萌芽的效果。對(duì)于在馬鈴薯塊莖中的特異表達(dá)，可以使用patatin啟動(dòng)子或其它任何塊莖專一性啟動(dòng)子來促進(jìn)TPS基因的表達(dá)。但是，我們注意到，最重要的是在塊莖灌漿期末和貯藏期階段維持啟動(dòng)子的活性。如果在此階段塊莖專一性啟動(dòng)子活性不好，TPS表達(dá)產(chǎn)物的抑制作用就會(huì)減弱，結(jié)果導(dǎo)致萌芽的延遲而不是徹底地抑制萌芽。TPS基因編碼海藻糖磷酸合酶。已知曉編碼此酶的基因，并且在所有的生物體內(nèi)都可以找到(WO97／42326)。支持本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)使用從大腸桿菌中衍生的基因，但其它編碼TPS的基因如來自酵母或植物的基因也同樣有用。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，使用了中和TPS作用的化合物如海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)。編碼TPP的基因也來自大腸桿菌，但也可以從其它生物體如酵母、植物甚至人類身上提取(WO97／42326)。不僅TPP可以用來恢復(fù)TPS的作用，任何能夠降解海藻糖6-磷酸的酶也可以使用。此種酶的另一個(gè)例子是海藻糖6-磷酸水解酶(TreC)。編碼此種酶的基因可衍生自大腸桿菌(Rimmele．M和Boos．W大腸桿菌的海藻糖6-磷酸水解酶，細(xì)菌學(xué)雜志(J．Bacteriol．)，176，5654-5664，1994)。本發(fā)明最簡(jiǎn)單的形式是用包含編碼TPS的基因和任選地包含標(biāo)記基因的重組DNA盒轉(zhuǎn)化植物，從而抑制轉(zhuǎn)基因植物采前和采后貯藏化合物的再轉(zhuǎn)移。更具體地講，這種方法能夠抑制萌芽。中和TPS的作用可以恢復(fù)萌芽，這可以通過很多方法實(shí)現(xiàn)。以下是實(shí)施例，但抑制TPS作用的方法并不僅限于這些實(shí)施例?；謴?fù)萌芽的第一個(gè)系統(tǒng)是在緊鄰TPS基因處引入一個(gè)編碼TPP的基因，它可以克服由TPS引起的抗萌芽的作用。為了抑制TPP的組成型表達(dá)，構(gòu)想了在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下引入TPP的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括任何能夠應(yīng)答與誘導(dǎo)物接觸從而增加特定基因產(chǎn)生的產(chǎn)物量的啟動(dòng)子。如果缺少誘導(dǎo)物，DNA序列就不會(huì)轉(zhuǎn)錄。一般情況下，特異性地結(jié)合于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子上以激活轉(zhuǎn)錄的因子處于一種無活性的形式，然后通過誘導(dǎo)物直接或間接地轉(zhuǎn)化為有活性的形式。誘導(dǎo)物可以是一種化學(xué)試劑如蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物(糖、醇等)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、除草劑、或酚類化合物，也可是一種直接由溫度、鹽、創(chuàng)傷、毒素造成的或間接地通過病原體作用或疾病(如病毒)引起的生理性逆境?？梢酝ㄟ^給含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的植物細(xì)胞外源施加誘導(dǎo)物，使誘導(dǎo)物與細(xì)胞接觸，例如噴霧、澆水、加熱或類似的方法。熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員都了解誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，有幾個(gè)啟動(dòng)子可以令人信服地用來驅(qū)動(dòng)TPP基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明適于使用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但并不限于以下幾種熱激啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物類固醇受體系統(tǒng)和任何一種化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子有果蠅(Drosophilamelanogaster)的可誘導(dǎo)的70KD熱激啟動(dòng)子(Freeling，M．等人，遺傳學(xué)年鑒(Ann．Rev．Genet．)19，297-323)和乙醇誘導(dǎo)的醇脫氫酶啟動(dòng)子(Nagao，R．T．等人，Miflin，B．J．(編)植物分子和細(xì)胞生物學(xué)牛津縱覽(OxfordSurveyofPlantMolecularandCellBiology)，第3卷，頁(yè)碼384-438，牛津大學(xué)出版社，1986)。由簡(jiǎn)單的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子尤其有用。最后一類的例子是在WO90／08826，WO93／21334，WO93／031294，WO96／37609中描述過的啟動(dòng)子。因此，用誘導(dǎo)物處理可以恢復(fù)抗萌芽作用，這些恢復(fù)萌芽的品系可以用來繁殖種子，如種子馬鈴薯。沒有誘導(dǎo)物，后代的萌芽仍被TPS的表達(dá)所抑制。因此，這也可以用來進(jìn)行種質(zhì)保護(hù)?；謴?fù)原始萌芽表型的另一個(gè)方法是用重組DNA盒供給植物，該DNA盒包含一個(gè)與TPS基因相鄰的反義TPS基因，該反義基因受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制。與以上所述的TPP誘導(dǎo)的實(shí)例一樣，反義TPS也能夠抵消(有義)TPS表達(dá)的作用，因?yàn)殡S著與TPSmRNA的退火，它成功地阻止了TPS的轉(zhuǎn)錄，從而抑制了抗萌芽作用?；謴?fù)原始萌芽表型的第三個(gè)系統(tǒng)是導(dǎo)入編碼抑制基因蛋白質(zhì)的DNA，該抑制基因能夠抑制TPS的表達(dá)，同時(shí)抑制基因的表達(dá)受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制。此抑制作用可以例如通過使用tet-阻遏物系統(tǒng)來完成，其中可被阻遏物識(shí)別的一個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)被引入到一種基因的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)附近，而該種基因的表達(dá)需要抑制。如果tet-阻遏物可得，此阻遏物將結(jié)合到特定的序列上，然后通過空間位阻，抑制RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄。編碼tet-阻遏物的基因可以與應(yīng)受控表達(dá)的基因相鄰，但并不必須如此。當(dāng)編碼阻遏物的基因處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下時(shí)，阻遏物分子的表達(dá)和TPS基因的抑制可通過外源施加誘導(dǎo)物來誘導(dǎo)。然后，TPS就不會(huì)發(fā)生作用，從而正常萌芽。恢復(fù)正常表型的另一個(gè)系統(tǒng)是提供編碼TPS的基因或包含該基因的表達(dá)盒，此基因的側(cè)翼有兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)，此位點(diǎn)可以被相應(yīng)的重組酶識(shí)別。根據(jù)本發(fā)明可以使用許多不同的位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)，包括但不限于噬茵體P1的Cre／lox系統(tǒng)、酵母FLP／FRT系統(tǒng)，噬菌體Mu的Gin重組酶，大腸桿茵的Pin重組酶，pSR1質(zhì)粒的R／RS系統(tǒng)。使用最多的兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)是噬菌體P1Cre／lox和酵母FLP／FRT系統(tǒng)。在這些系統(tǒng)里，重組酶(Cre或FLP)與它各自的位點(diǎn)特異性重組序列(分別為lox或FRT)專一地發(fā)生相互作用，轉(zhuǎn)化或切除間插序列。對(duì)于這兩個(gè)系統(tǒng)中的任何一個(gè)，位點(diǎn)特異性重組酶序列相對(duì)較短(對(duì)于lox為34bp，對(duì)于FRT為34-47bp)。在植物中使用這種位點(diǎn)特異性重組酶在例如US5，527，695中有描述。待切除的DNA的側(cè)翼可為位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的同向重復(fù)，隨后引入重組酶切除DNA(從而恢復(fù)原始表型)。已經(jīng)證明FLP／FRT重組酶系統(tǒng)在植物細(xì)胞中有效。盡管位點(diǎn)特異性重組序列必須連接在要切除或轉(zhuǎn)化的DNA序列的末端，但編碼位點(diǎn)特異性重組酶的基因也可位于其它位置，從而可以通過標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化步驟或通過與已經(jīng)能夠表達(dá)重組酶基因的植物異花傳粉分別轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。但是，上述恢復(fù)萌芽的最后一種方法卻使TPS基因從轉(zhuǎn)基因植物中丟失了。其它消除TPS基因表達(dá)對(duì)貯藏化合物再轉(zhuǎn)移的抑制作用的方法包括，給貯藏器官外源施加能中和TPS基因表達(dá)之作用的化合物。驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)赤霉酸(GA)處理能夠誘導(dǎo)含有TPS基因的馬鈴薯塊莖萌芽。通過在市售的GA溶液里培養(yǎng)整個(gè)塊莖或切塊來實(shí)現(xiàn)。但是，構(gòu)想了處理的方法可能不同，例如用GA溶液噴施塊莖可以產(chǎn)生類似的結(jié)果。根據(jù)噴施方法，溶液中GA的濃度應(yīng)在0．1到10，000ppm范圍內(nèi)。進(jìn)一步認(rèn)為，GA的作用是中和TPS基因之表達(dá)的作用。因此，在貯藏化合物再轉(zhuǎn)移抑制的其它實(shí)施例中，構(gòu)想了用GA處理將能恢復(fù)TPS表達(dá)的抑制作用。同樣我們也驚奇的發(fā)現(xiàn)，僅僅在馬鈴薯的塊莖上形成創(chuàng)傷(切成小塊，每塊至少包含一個(gè)活性分生組織)即足以誘導(dǎo)那些切塊萌芽。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的重組DNA技術(shù)來構(gòu)建。重組基因構(gòu)建體可插入到市售載體內(nèi)，這些載體適于轉(zhuǎn)化植物并在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因產(chǎn)物。通過使用選擇標(biāo)記從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(那些含有插入到宿主細(xì)胞DNA中的重組DNA的細(xì)胞)，選擇標(biāo)記作為導(dǎo)入的重組DNA的一部分，它包括提供抗生素抗性或除草劑抗性的基因。含有重組DNA的細(xì)胞能在抗生素或除草劑存在的濃度下生存，此濃度可殺死未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇標(biāo)記基因的例子包括賦予除草劑Basta抗性的bar基因，賦予卡那霉素抗性的nptⅡ基因和賦予潮霉素抗性的hpt基因，以及賦予氨基氰抗性的cah基因。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，一個(gè)轉(zhuǎn)化的單個(gè)植物細(xì)胞可以產(chǎn)生一株完整的植株?？紤]到本發(fā)明對(duì)不同植物種類的適應(yīng)性不同，需要指出本發(fā)明中某一詳細(xì)的實(shí)施方案僅用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物作為例子來闡述。事實(shí)上，它的適應(yīng)性并不僅限于此種植物。任何植物都可以獲得根據(jù)本發(fā)明的重組DNA序列，但優(yōu)選的那些通常營(yíng)養(yǎng)繁殖的植物種類特別有用。因?yàn)橛行┲参锏幕蜣D(zhuǎn)化難以施行，所以本發(fā)明的一些實(shí)施方案目前仍無法應(yīng)用，但在這類植物中實(shí)施本發(fā)明只是一個(gè)時(shí)間問題，而不是原則問題，因?yàn)檫z傳轉(zhuǎn)化的可行性與本發(fā)明以下的實(shí)施方案不相關(guān)。對(duì)于大多數(shù)植物，包括雙子葉植物和單子葉植物的植物種屬的轉(zhuǎn)化為常規(guī)技術(shù)。原則上，任何轉(zhuǎn)化方法都可以將根據(jù)本發(fā)明的重組DNA導(dǎo)入到適宜的祖細(xì)胞，只要細(xì)胞能夠再生為完整植株。從以下方法中選擇適宜的方法原生質(zhì)體的鈣／聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn)．T．等人，1982，自然(Nature)296，72-74；NegrutiuI．等人，1987年6月，植物分子生物學(xué)(PlantMol．Biol)8，363-373)、原生質(zhì)體的電穿孔方法(ShillitoR．D．等人，1985生物／技術(shù)(Bio／Technol．)3，1099-1102)、植物材料的顯微注射法(CrosswayA．等人，1986，分子基因遺傳學(xué)(Mol．Gen．Genet．)202，179-185)，不同植物材料(DNA或RNA包被的)的微粒轟擊法(KleinT．M．等人，1978，自然，327，70)，(非整合的)病毒或類似物質(zhì)感染法。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，尤其優(yōu)選的是在EPA120516和美國(guó)專利4，940，838所公開的、所謂的雙元載體技術(shù))。番茄的轉(zhuǎn)化可優(yōu)選基本上VanRoekel等人描述的方法進(jìn)行(VanRoekel，J．S．CDamm，BMelchers，L．SHoekema，A．(1993)。影響番茄(Lycopersiconesculentum)轉(zhuǎn)化頻率的因素。植物細(xì)胞報(bào)告(PlantCellReports)，12，644-647)。馬鈴薯的轉(zhuǎn)化可優(yōu)選基本上根據(jù)Hoekema等人描述的方法進(jìn)行(Hoekema，AHuisman，M．JMolendijk，LVandenElzen，P．J．M和Conrnelissen，B．J．C．(1989)。兩個(gè)商品馬鈴薯栽培種抗馬鈴薯病毒X的遺傳工程，生物／技術(shù)，7，273-278)。通常來講，篩選轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞或細(xì)胞群中是否存在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記，這些標(biāo)記由植物表達(dá)基因編碼，與編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸序列一起共轉(zhuǎn)移，隨后轉(zhuǎn)化的材料再生為整個(gè)植株。雖然考慮到對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的抗性，但單子葉植物更容易轉(zhuǎn)化，無菌轉(zhuǎn)基因植物可以從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或胚、或其它植物材料再生。當(dāng)前，單子葉植物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法是胚、外植體或懸浮細(xì)胞的顯微注射轟擊，和直接DNA吸收或電穿孔(Shimamoto，等人，1989，自然，338，274-276)。用顯微注射轟擊法，通過把吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因轉(zhuǎn)入玉米懸浮培養(yǎng)物的胚胎發(fā)生細(xì)胞里，已經(jīng)獲得了轉(zhuǎn)基因玉米，此bar基因編碼膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(一種滅活除草劑phosphinothricin的酶)(Gordon-Kamm，1990，植物細(xì)胞(PlantCell)，2，603-618)。已有報(bào)道遺傳物質(zhì)導(dǎo)入其它單子葉作物如小麥和大麥的糊粉原生質(zhì)體內(nèi)(Lee，1989，植物分子生物學(xué)，13，21-30)。選擇老齡、密集的有突起的胚發(fā)生愈傷組織從胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物再生小麥植株(Vasil，1990，生物／技術(shù)．8，429-434)。結(jié)合這些作物的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，本發(fā)明可以應(yīng)用到單子葉植物。包括有很重要商品價(jià)值的作物如水稻、香蕉和玉米的單子葉植物可通過農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)菌株來進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)移(videWO94／00977；EP0159418B1；GouldJ，MichaelD，HasegawaO，UlianEC，PetersonG，SmithRH，(1991)，植物生理(PlantPhysio1．)．95，426-434)。DNA轉(zhuǎn)移和植株再生后，可評(píng)價(jià)推定轉(zhuǎn)化的植物，可例如使用Southern來分析依本發(fā)明的重組DNA的存在與否、拷貝數(shù)和／或基因組的構(gòu)成。另外，也可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的Northern和／或Western分析技術(shù)，來分析新插入的DNA的表達(dá)水平。任選地初步分析之后，顯示出根據(jù)本發(fā)明的新插入的重組DNA希望拷貝數(shù)和表達(dá)水平的轉(zhuǎn)化植株，可用來檢測(cè)它們的雄性不育或可育性恢復(fù)。另外，選擇植株可用來進(jìn)行另一輪轉(zhuǎn)化，例如，導(dǎo)入其它基因的反義TPS基因、TPS基因或抑制基因。為了獲得能夠組成型表達(dá)多于一個(gè)嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物，可以采用諸多方法，包括A．帶有與選擇標(biāo)記基因物理偶聯(lián)的許多修飾基因的DNA(如雙元質(zhì)粒上的T-DNA)的使用。本方法的優(yōu)點(diǎn)是這些嵌合基因物理上偶聯(lián)，因此作為單一的孟德爾位點(diǎn)遷移。B．各個(gè)能表達(dá)一個(gè)或多個(gè)嵌合基團(tuán)，優(yōu)選地與選擇標(biāo)記基因偶聯(lián)的基因的轉(zhuǎn)基因植物與來自另一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的花粉異花傳粉，后者包含一個(gè)或多個(gè)與另一種選擇標(biāo)記偶聯(lián)的嵌合基因。雜交后獲得的種子可以根據(jù)這兩個(gè)選擇標(biāo)記存在與否來選擇，或根據(jù)嵌合基因本身存在與否來選擇。從選擇的種子獲得的植株可以用來作進(jìn)一步的雜交。原則上講，嵌合基因不在單一位點(diǎn)上，所以基因可能被作為獨(dú)立的位點(diǎn)而分離。C．大量的多重嵌合DNA分子的使用，例如質(zhì)粒，每個(gè)都含有一個(gè)或多個(gè)嵌合基因和選擇標(biāo)記。如果共轉(zhuǎn)化的頻率很高，則基于一個(gè)標(biāo)記來選擇就足夠了。在其它情況下，應(yīng)優(yōu)選考慮用多于一個(gè)標(biāo)記來選擇。D．給已經(jīng)含有第一種、第二種(等等)嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物連續(xù)轉(zhuǎn)化帶有新的嵌合DNA的嵌合基因，嵌合基因任選地包含一個(gè)選擇標(biāo)記基因。同方法B一樣，理論上嵌合基因不在單一位點(diǎn)上，所以嵌合基因可作為獨(dú)立位點(diǎn)而分離。E．上述策略的結(jié)合。本發(fā)明中非常有用的植物是那些能進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖的植物，但它們?cè)谀骋浑A段萌芽是不希望的性質(zhì)。最普通的實(shí)施例是馬鈴薯和洋蔥，但本發(fā)明也可以應(yīng)用到開花的鱗莖、草莓和香蕉上。除了完全抑制萌芽和誘導(dǎo)恢復(fù)機(jī)制之外，還構(gòu)想了抑制作用是可誘導(dǎo)的。這一點(diǎn)對(duì)例如草莓和香蕉非常重要，萌芽是植物繁殖的一個(gè)必需特性，但萌芽可能會(huì)對(duì)其它生長(zhǎng)過程如果實(shí)成熟存在競(jìng)爭(zhēng)。如果TPS基因置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，則可能在作物生長(zhǎng)過程中的任何時(shí)間抑制萌芽，例如在種子發(fā)育或果實(shí)成熟階段。任選地，這樣一種TPS基因表達(dá)的誘導(dǎo)可通過化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來完成，此啟動(dòng)子可以和(外源)施加的化學(xué)物質(zhì)相互作用。另外，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，也應(yīng)該優(yōu)選的使TPS組織的表達(dá)特異于分生組織。對(duì)于分生組織特異的啟動(dòng)子在本領(lǐng)域很容易獲得(例如來自Enjuto等人的HMG2啟動(dòng)子，植物細(xì)胞7，517，1995和來自Kosugi等人的水稻PCNA啟動(dòng)子，植物雜志(PlantJ．)7，877，1995)。除了萌芽，采前和采后貯藏化合物再轉(zhuǎn)移的抑制機(jī)制也可以應(yīng)用于菊苣中以防止菊粉的降解和在甜菜中防止蔗糖的降解。下列實(shí)施例為本發(fā)明進(jìn)一步提供說明，但絕不限制本發(fā)明的使用范圍。DNA分離、操作和擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法以及重組DNA復(fù)制的適宜載體、適宜細(xì)菌菌株、選擇標(biāo)記、培養(yǎng)基等，描述在Sambrook，JFritsch，E．F和Maniatis，T．(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，紐約；DNA克隆卷Ⅰ和卷Ⅱ(D．N．Glover編1985)；和從基因到克隆(E．-L．Winnacker編1987)。DNA操作所有的NDA操作步驟(DNA從大腸桿菌的分離、限制性酶切、連接、轉(zhuǎn)化等)都根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟來操作(Sambrook等人(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版．ColdSpringHarborLaboratoryPress，CSH，紐約)。菌株在所有的實(shí)施例中，大腸桿菌K-12DH5α菌株用于克隆。用于植物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株是EHA105和MOG101(Hood等人，轉(zhuǎn)基因研究(Trans．Research)2，208-218，1993)。pat-TPS轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物的產(chǎn)生在WO97／42326中描述了在塊莖專一性patatin啟動(dòng)子控制下包含大腸桿菌tps基因的pMOG845的構(gòu)建、農(nóng)桿菌的三親交配和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯Solanumtuberosumcv．Kardal的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例1在一部分實(shí)驗(yàn)中，從體外轉(zhuǎn)基因pMOG845(patatin-tps)的馬鈴著植株上產(chǎn)生塊莖材料。用9個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系來設(shè)計(jì)田間試驗(yàn)，每個(gè)株系3塊地，每塊地種5個(gè)塊莖。5月初種植塊莖，采用常規(guī)方法監(jiān)測(cè)萌芽過程。結(jié)果如表1所示。在實(shí)驗(yàn)第二部分，將來自組培植株中的pat-TPS植株(var．Kardal)放在植物培養(yǎng)箱里，500μmol光量子m-2s-1(16小時(shí)光照，20_C；8小時(shí)黑暗(15_C))。3個(gè)月后收獲塊莖，并低溫(4_C)貯藏2個(gè)月。然后移到室溫(RT)下，4周內(nèi)評(píng)估萌芽。表1．<tablesid="table1"num="001"><table>植物株系萌芽田間培養(yǎng)箱Kardal所有塊莖所有塊莖845-17所有塊莖*延遲845-13所有塊莖所有塊莖845-28無無845-4所有塊莖所有塊莖845-11無無845-222／15塊莖無845-2所有塊莖*延遲845-1所有塊莖*延遲845-25所有塊莖所有塊莖</table></tables>*意思是與萌芽延遲的野生型比較，在那塊地里的植株長(zhǎng)得明顯較小。延遲的意思是2個(gè)月的低溫期后轉(zhuǎn)入室溫下2周，觀察不到萌芽。無的意思是4周內(nèi)沒有萌芽。已表明完全沒有萌芽的塊莖具有較高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。在非萌芽株系中觀察到了在WO97／42326中描述過的冷甜化作用的減少，在萌芽延遲的塊莖或正常萌芽的塊莖中觀察到這種作用減少不明顯。實(shí)驗(yàn)2赤霉酸逆轉(zhuǎn)抗萌芽表型從實(shí)施例1中描述的生長(zhǎng)在培養(yǎng)箱條件下的植株中獲得完整的塊莖。轉(zhuǎn)入室溫后大約1周，在含有0．17％(w／v)赤霉酸的溶液中培養(yǎng)24小時(shí)(GA4和GA7；制劑可以從Berele，Zeneca，Ridderkerk，荷蘭購(gòu)實(shí)到)。對(duì)照塊莖沒有培養(yǎng)。繼續(xù)在室溫下貯藏。8天后在用GA處理和沒處理的野生型塊莖中誘導(dǎo)萌芽。14天后，14個(gè)沒有處理的野生型塊莖中有95％萌芽，而轉(zhuǎn)基因株系卻沒有萌芽(圖1A)。相反，GA處理的所有野生型塊莖(5)都萌芽，來自株系845-1、845-17、845-22、845-28的用GA處理過的轉(zhuǎn)基因塊莖分別有80％、50％、100％和17％萌芽。所有未處理的轉(zhuǎn)基因塊莖都沒有萌芽。25天后，可以觀察到株系845-1和845-17的未處理塊莖延遲萌芽(圖1B)。實(shí)驗(yàn)3形成創(chuàng)傷逆轉(zhuǎn)抗萌芽表型來自組織培養(yǎng)植物的Pat-TPS的植株(Var．Kardal)生長(zhǎng)在500μmol光量子m-2s-1(16小時(shí)光照，20_C；8小時(shí)黑暗(15_C)的培養(yǎng)箱內(nèi)。3個(gè)月后收獲塊莖，低溫(4_C)冷藏2個(gè)月。轉(zhuǎn)入室溫(RT)后3天，用小刀將塊莖切成小塊，每塊上至少有一個(gè)有活性的分生組織(芽眼)。來自每個(gè)株系的3-10個(gè)塊莖上的切塊用自來水沖洗15分鐘。隨后大約6-10個(gè)切塊在水中或在1、10或1000ppm的赤霉酸(GA3，SIGMA，Zwijndrecht，荷蘭)溶液中培養(yǎng)10分鐘。來自同一批處理的所有切塊轉(zhuǎn)到一個(gè)放有濕紙的容器里，然后用塑料封口以防干燥。在水或不同的赤霉酸溶液中培養(yǎng)的野生型及tps塊莖切塊在4天內(nèi)可觀察到萌芽，這表明形成創(chuàng)傷自身足以恢復(fù)萌芽。權(quán)利要求1．一種抑制采前和／或采后植物中貯藏化合物再轉(zhuǎn)移的方法，其是通過用能夠表達(dá)蛋白質(zhì)的重組DNA轉(zhuǎn)化植物或來自其親本株的植物，其特征在于蛋白質(zhì)是海藻糖磷酸合酶(TPS)。2．一種抑制植物部分萌芽的方法，其是通過用能夠表達(dá)蛋白質(zhì)的重組DNA轉(zhuǎn)化植物或來自其親本株的植物，其特征在于蛋白質(zhì)是海藻糖磷酸合酶(TPS)。3．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于重組DNA包含的編碼TPS的基因來自細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、植物或人類，優(yōu)選地來自大腸桿菌。4．一種誘導(dǎo)根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法培育的不萌芽的植物萌芽的方法，其特征在于該植物被導(dǎo)入編碼TPS的重組DNA，其側(cè)翼是位點(diǎn)特異性重組酶的目標(biāo)位點(diǎn)，然后通過用編碼相應(yīng)重組酶的基因轉(zhuǎn)化該植物或與包含能表達(dá)該重組酶的重組DNA的植物雜交，來切除編碼TPS的重組DNA。5．一種誘導(dǎo)根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法培育的不萌芽的植物萌芽的方法，其是通過用包含編碼一種化合物的基因的重組DNA來轉(zhuǎn)化該植物，此化合物在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下能中和TPS的作用，并通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)驅(qū)使TPS中和化合物的表達(dá)。6．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于中和化合物是海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)。7．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于中和化合物是反義海藻糖磷酸合酶。8．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于中和化合物是海藻糖磷酸水解酶(TreC)。9．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于中和因子是能夠抑制TPS表達(dá)的抑制基因。10．一種通過用赤霉酸處理植物貯藏器官，解除由海藻糖磷酸合酶表達(dá)引起的植物貯藏化合物采前和／或采后再轉(zhuǎn)移抑制的方法。11．一種通過赤霉酸處理植物來誘導(dǎo)根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法培育的不萌芽植物萌芽的方法。12．一種通過在植物上形成創(chuàng)傷來誘導(dǎo)根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法培育的不萌芽植物萌芽的方法。13．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于貯藏化合物是菊粉，植物是菊苣。14．根據(jù)權(quán)利要求1O的方法，其特征在于貯藏化合物是菊粉，植物是菊苣。15．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于貯藏化合物是蔗糖，植物是甜菜。16．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于貯藏化合物是蔗糖，植物是甜菜。全文摘要本發(fā)明描述了一種通過用編碼海藻糖磷酸合酶的基因轉(zhuǎn)化植物或來自該植物親本株系的植物,來抑制營(yíng)養(yǎng)繁殖植物萌芽的方法,這些植物例如有馬鈴薯、草莓、香蕉和球根植物如洋蔥和鱗莖花卉。同時(shí)也提供了恢復(fù)萌芽的方法。文檔編號(hào)C12N9/10GK1280626SQ98811752公開日2001年1月17日申請(qǐng)日期1998年10月30日優(yōu)先權(quán)日1997年10月30日發(fā)明者O·J·M·古德迪恩,H·迪格拉爾,K－P·克勞斯,C·M·P·范鄧恩申請(qǐng)人:莫根國(guó)際股份有限公司