專利名稱：來自肺炎鏈球菌之人類補體c3降解蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)且特別涉及一種肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)之鑒定，該蛋白質(zhì)能夠降解人類補體蛋白質(zhì)C3。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌造成之呼吸道感染每年引起估計約500，000例之肺炎及47，000人死亡。對細(xì)菌性肺炎鏈球菌感染具有高危險性者為二歲以下之嬰兒，免疫系統(tǒng)功能不彰之個人及老年人。在這些族群中，肺炎鏈球菌為細(xì)菌性肺炎及腦膜炎之主要原因。進而，肺炎鏈球菌為所有年齡兒童之耳感染主因。兒童與老人兩者在細(xì)菌侵入繁殖(colonization)，局部或全身感染之后或以純化多糖進行免疫接種后，對于肺炎鏈球菌莢膜多糖之保護性抗體的合成有障礙。肺炎鏈球菌對于HIV感染之成人或兒童而言皆為侵入性細(xì)菌吸呼道疾病之主因，并在這些病人身上引發(fā)出血性感染(Connor等人，Current Topics in AIDS1987；1185-209及Janoff等人，Ann．Intern．Med．1992117(4)314-324)。
對于嚴(yán)重感染顯示最大危險性之個體無法對現(xiàn)有莢膜多糖疫苗產(chǎn)生抗體。結(jié)果，目前有四種結(jié)合(conjugate)疫苗進入臨床試驗之階段。結(jié)合疫苗包括與蛋白質(zhì)載體或佐劑結(jié)合之肺炎鏈球菌莢膜多糖，希望能加強抗體反應(yīng)。然而，在臨床試驗中的結(jié)合疫苗另有其它潛在難題。例如，在美國極為盛行之肺炎鏈球菌血清型與在例如以色列，西歐，南非或斯堪地那維亞等地最常見的血清型不同。因此，在一個局部地域有利的疫苗在另一個地區(qū)可能為不利的。至于修正目前可用莢膜多糖疫苗或發(fā)展蛋白質(zhì)結(jié)合物作為適應(yīng)地域血清型差異之莢膜疫苗之潛在需求，則產(chǎn)生令人卻步之金錢及技術(shù)上復(fù)雜性。因此，對于肺炎鏈球菌感染之預(yù)防及調(diào)制廣泛保護性肺炎鏈球菌疫苗而言，在不同有毒力之血清型中找尋具全世界保守性之免疫產(chǎn)生性表面暴露蛋白質(zhì)是至為重要的。進而，全世界性地出現(xiàn)青霉素及頭芽孢素抗藥性肺炎鏈球菌，使得對于有效疫苗之需求至為迫切(Baquero等人，J．Antimicrob．Chemother．1991；28S；31-8)。
有數(shù)個肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)已被提出與肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合或作為單一免疫原來激發(fā)對抗肺炎鏈球菌之免疫反應(yīng)。已有報導(dǎo)指出與肺炎鏈球菌黏附至呼吸道上皮細(xì)胞相關(guān)之表面蛋白質(zhì)包括PsaA，PspC／CBPll2及IgAl蛋白酶(Sampson等人，Infect．Immun．1994；62319-324，Sheffield等人，Microb．Pathogen．1992；13261-9及Wani等人Infect．Immun．1996；643967-3974)。對抗這些黏附蛋白質(zhì)之抗體可以抑制肺炎鏈球菌黏附至呼吸道上皮細(xì)胞，且因此減抑侵入繁殖。其它如肺溶素(pneumolysin)，自溶素(autolysin)，神經(jīng)胺苷酶或硫璃糖苷酶之細(xì)胞質(zhì)肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)被提出作為疫苗抗原，因為抗體可以潛在性阻止這些蛋白質(zhì)在肺炎鏈球菌感染病人身上之毒性作用。然而，這些蛋白質(zhì)典型上并非位于肺炎鏈球菌的表面，而是當(dāng)細(xì)胞溶解及死亡時自細(xì)菌分泌或釋出(Lee等人，Vaccine 1994；12875-8及Berry等人，Infect．Immun．1994；621101-1108)。雖然使用這些細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)作為免疫原可以緩和肺炎鏈球菌感染之晚期影響，但對抗這些白質(zhì)的抗體既不會促進肺炎鏈球菌死亡亦不會防止最初或后續(xù)之肺炎鏈球菌侵入繁殖。
正在進行肺炎鏈球菌疫苗試驗之原型表面蛋白質(zhì)為肺炎鏈球菌表面蛋白質(zhì)A(PspA)。PspA為約70-140kDa之異源性蛋白質(zhì)。PspA的結(jié)構(gòu)包括在胺基端之α螺旋，接著是富含脯氨酸之序列，且在羧端以一系列之11個膽堿結(jié)合性重復(fù)序列作為結(jié)束。雖然與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的許多信息均為已知，PspA在不同的肺炎鏈球菌血清型之間并無結(jié)構(gòu)保守性，且其功能完全未知(Yother等人，J．Bacteriol．1992；174601-9及Yother，J．Bacteriol．1994；1762976-2985)。研究已經(jīng)證實PspA在動物之免疫產(chǎn)生性(McDaniel等人，Microb．Pathogin．1994；17323-337)。雖然PspA具有免疫產(chǎn)生性，其作為疫苗抗原之能力卻因PspA系異源性、其以四個結(jié)構(gòu)群存在以及其未予定性之功能而使情形變得復(fù)雜。
在無法對型-特異性多糖莢膜產(chǎn)生保護性抗體之病人身上，補體之第三種成份C3及替代補體路徑相關(guān)之蛋白質(zhì)構(gòu)成宿主對抗肺炎鏈球菌感染之第一道防線。因為補體蛋白質(zhì)不能穿透肺炎鏈球菌之堅固細(xì)胞壁，調(diào)理性C3b在肺炎鏈球菌表面之沉積成為清除肺炎鏈球菌之主要媒介作用。肺炎鏈球菌與血漿中C3之間的交互作用已知會在肺炎鏈球菌性菌血癥時發(fā)生，此時C3b(C3之調(diào)理活性片段)之共價結(jié)合激活吞噬細(xì)胞之辨識及吞噬(Johnston等人，J．Exp．Med．1969；1291275-1290，Hasin HE，J．Immunol．1972；10926-31及Hostetter等人，J．Infect．Dis．1984；150653-61)。C3b沉積在肺炎鏈球菌莢膜及細(xì)胞壁上。然此控制肺炎鏈球菌感染之方法全然無效率。激發(fā)肺炎鏈球菌調(diào)理作用之方法能改善此微生物引發(fā)之疾病過程。目前對于限制肺炎鏈球菌感染之方法及治療仍有強烈需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及鑒定及使用肺炎鏈球菌所表達之一群人類補體C3降解性蛋白質(zhì)(蛋白酶)。該等蛋白質(zhì)較佳具有約15kD至約25kD之分子量，該分子量例如系在10％SDS聚丙烯酰胺膠上測定。本發(fā)明包括自肺炎鏈球菌之不同C3-降解性菌株所能分離之許多蛋白質(zhì)。
就一方面而言，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO2具有至少80％序列一致性之分離蛋白質(zhì)。在較佳之具體例中，該蛋白質(zhì)系自肺炎鏈球菌分離，或者該蛋白質(zhì)系一重組蛋白質(zhì)。較佳的是，該分離蛋白質(zhì)降解人類補體蛋白質(zhì)C3。本發(fā)明較佳之蛋白質(zhì)為具有包含SEQ ID NO2之氨基酸序列之分離蛋白質(zhì)，更佳的是該氨基酸序列即SEQ ID NO2。術(shù)語“分離”在本文意指已由其自然環(huán)境移出之一天然發(fā)生物質(zhì)或合成物質(zhì)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在本文中包括一或多個功能性單位，其包括一或多個肽或多肽。
本發(fā)明亦相關(guān)自本發(fā)明C3-降解性蛋白酶所分離之肽或多肽。較佳的是，本發(fā)明提供至少15個連續(xù)氨基酸之肽或多肽，其來自與SEQ ID NO2具有80％序列一致性之分離蛋白質(zhì)，且更佳的是提供SEQ ID NO2中至少15個連續(xù)氨基酸之肽或多肽。在本發(fā)明另一方面，該肽或多肽能夠降解人類補體蛋白質(zhì)C3。
本發(fā)明較佳之具體例包括具有SEQ ID NO2中約第1個至約第58個氨基酸之分離蛋白質(zhì)及具SEQ ID NO1或其互補鏈中約第1至約第174個核苷酸。較佳的是，該分離核酸片段包括SEQ ID NO1或其互補鏈中約第150至約第174個核苷酸。
在另一方面，本發(fā)明涉及降解人類補體蛋白質(zhì)C3之分離蛋白質(zhì)，其中編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQ ID NO1或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交件下雜交。
本發(fā)明亦涉及免疫系統(tǒng)刺激性組合物(較佳為疫苗)，其包括一有效量之免疫系統(tǒng)刺激性肽或多肽，該肽或多肽具有衍生自一種蛋白質(zhì)之至少15個連續(xù)氨基酸，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2有至少80％序列一致性且能降解人類補體蛋白質(zhì)C3。
較佳的是，該蛋白質(zhì)系自肺炎鏈球菌分離。在一具體例中，該免疫系統(tǒng)刺激性組合物或疫苗進而包括至少一種自肺炎鏈球菌所分離之其它免疫系統(tǒng)刺激性肽，多肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進而涉及一種能夠與SEQ ID NO2有至少80％序列一致性且能降解人類補體蛋白質(zhì)C3之蛋白質(zhì)結(jié)合(典型上專一性結(jié)合)之抗體。在一具體例中，該抗體為單株抗體，且在另一具體例中，該抗體為多株抗體。在另一具體例中，該抗體為抗體片段。該抗體或抗體片段可得自小鼠，大鼠，山羊，雞，人，或兔。
在另一具體例中，該抗體能夠結(jié)合至一蛋白質(zhì)之至少一部份，其中編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQ ID NO1或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交件下雜交。
本發(fā)明亦涉及可與SEQ ID NO1或其互補鏈以在高度嚴(yán)格之雜交條件下進行雜交之分離核酸片段(聚核苷酸)。在本文中所指的高度嚴(yán)格之雜交條件包括，例如，以6X SSC，5X Denhardt，0．5％SDS，及100微克／毫升片段化及變性之鮭魚精子DNA在65℃進行雜交一整夜，并一次在2X SSC，0．1％SDS中于室溫下清洗約10分鐘，接著一次于65℃清洗約15分鐘，接著至少有一次在0．2X SSC，0．1％SDS中于室溫下清洗至少3-5分鐘。在一具體例中，該核酸片段系自肺炎鏈球菌分離，且在另一具體例中，該核酸片段編碼一蛋白質(zhì)之至少一部份。在一具體例中，該蛋白質(zhì)降解人類補體蛋白質(zhì)C3。在另一具體例中，該核酸片段編碼一種不會降解人類補體C3之肽或多肽。
在另一具體例中，該核酸片段系在核酸載體中，且該載體為能夠生產(chǎn)至少蛋白質(zhì)的一部份的表達載體。包含該核酸片段的細(xì)胞亦于本發(fā)明中規(guī)劃。在一具體例中，該細(xì)胞為細(xì)菌或真核細(xì)胞。
本發(fā)明進而涉及包括SEQ ID NO1核酸序列或其互補鏈之分離核酸片段。本發(fā)明進而涉及由包括SEQ ID NO1之雙鏈DNA所轉(zhuǎn)錄之RNA片段。
在本發(fā)明另一方面，本發(fā)明涉及一種在哺乳動物(特別是人類)產(chǎn)生對抗肺炎鏈球菌的免疫反應(yīng)的方法，其包括將一組合物施用至動物的步驟以產(chǎn)生對抗該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，該組合物包括治療有效量之一蛋白質(zhì)的至少一部份，其中編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQ ID NO1或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。該免疫反應(yīng)可為B細(xì)胞反應(yīng)，T細(xì)胞反應(yīng)，上皮細(xì)胞反應(yīng)或內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)。在一較佳的具體例中，該組合物為疫苗組合物。較佳的是該蛋白質(zhì)為至少15個氨基酸長度，且亦較佳的是該組合物進而包括至少一種來自肺炎鏈球菌之其它免疫系統(tǒng)刺激性肽，多肽或蛋白質(zhì)。在一具體例中，該蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO2中至少15個氨基酸。
本發(fā)明進而涉及來自肺炎鏈球菌之約15kDa至約25kDa之能夠降解人類補體C3之分離蛋白質(zhì)，并涉及一種抑制肺炎鏈球菌-媒介性C3降解作用的方法，其包括的步驟為將肺炎鏈球菌細(xì)菌接觸一抗體，該抗體能夠與SEQ ID NO2有至少80％序列一致性之蛋白質(zhì)結(jié)合。
本發(fā)明亦涉及一種抑制C3-媒介性發(fā)炎反應(yīng)及異種移植時排斥作用之方法，其包括在異種移植時所用的動物器官表面上表達具有SEQ ID NO2氨基酸序列之蛋白質(zhì)。此方法特別有利于在例如豬腎引發(fā)本發(fā)明所述蛋白質(zhì)之表達，且藉此抑制異種移植后之C3媒介性發(fā)炎。
本發(fā)明亦涉及一分離核酸分子，其包含一至少15個核苷酸的區(qū)域而可與SEQID NO1或其互補鏈中至少一區(qū)域在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。在一具體例中，分離核酸分子可與SEQ ID NO1或其互補鏈中至少一區(qū)域在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。較佳的是，至少一區(qū)域系包括SEQ ID NO1之核苷酸1-174或320-492。
在另一具體例中，本發(fā)明亦涉及一分離核酸分子，其包含一至少15個核苷酸的區(qū)域而可與SEQ ID NO4或其互補鏈中至少一區(qū)域在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。在一具體例中，分離核酸分子可與SEQ ID NO4或其互補鏈中至少一區(qū)域在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。較佳的是，至少一區(qū)域系包括SEQ ID NO4之核苷酸507-681或827-999。
在另一具體例中，SEQ ID NO4中至少一部份的核酸分子編碼一蛋白質(zhì)的至少一部份。較佳的是，該部份具有如SEQ ID NO5所示之預(yù)測氨基酸序列，且具有經(jīng)例如SDS-PAGE測定中約75kDa至約85kDa之分子量。
本發(fā)明亦涉及具有如SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8及SEQ ID NO9之核酸序列之分離DNA片段或引物。
在本發(fā)明另一方面，本發(fā)明涉及一免疫系統(tǒng)-刺激性組合物或疫苗，其包含治療有效量之一蛋白質(zhì)之至少一部份，其中編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQ ID NO4或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交件下雜交。本發(fā)明涉及一種在哺乳動物(特別是人類)產(chǎn)生對抗肺炎鏈球菌的免疫反應(yīng)的方法，其包括將一組合物施用至動物的步驟以產(chǎn)生對抗該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，該組合物包括治療有效量之一蛋白質(zhì)的至少一部份，其中編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQ ID NO4或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。
在另一具體例中，本發(fā)明涉及一疫苗或免疫系統(tǒng)-刺激性組合物，其包含治療有效量之一蛋白質(zhì)之至少一部份以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該蛋白質(zhì)可有效地免疫接種或治療哺乳動物以對抗肺炎鏈球菌的感染或侵入繁殖。該蛋白質(zhì)系衍生自可與SEQ ID NO4所示核酸序列或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交件下雜交之核酸分子。較佳的是，該蛋白質(zhì)系以能夠?qū)τ谠摬溉閯游飩€體(特別是人類個體)有效提供治療效果的份量予以供給。
圖式簡單說明

圖1提供本發(fā)明之一C3-降解性蛋白酶基因之翻譯部份的核酸序列(SEQ IDNO1)。
圖2提供本發(fā)明之一C3-降解性蛋白酶基因之氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3提供本發(fā)明之一C3-降解性蛋白酶基因之氨基酸序列，其與編碼本發(fā)明之一C3-降解性蛋白酶基因之核酸序列并列(SEQ ID NO2-3)。
圖4提供預(yù)測79kDa氨基酸序列之核酸序列(SEQ ID NO4)。
圖5提供預(yù)測79kDa氨基酸序列(SEQ ID NO5)。
圖6顯示SEQ ID NO1與SEQ ID NO4之序列比對。
圖7顯示SEQ ID NO2與SEQ ID NO5中對應(yīng)氨基酸169-331之序列比對。
較佳具體例之詳述本發(fā)明涉及鑒定及分離分子量約為20kDa(±5kDa)(在10％SDS-PAGE膠上)之人類補體C3降解性蛋白酶及編碼C3降解性蛋白酶之核酸。已觀察到來自數(shù)個血清型之肺炎鏈球菌在對數(shù)期生長階段的培養(yǎng)物能首先降解C3之α-鏈隨后降解β-鏈，不會產(chǎn)生既有定義之C3切割片段(Angel等人，J．Infect．Dis．170600-608，1994)。此類不發(fā)生切割之降解型態(tài)實質(zhì)上不同于其它微生物之產(chǎn)物，如綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)之彈性蛋白酶及溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)之半胱氨酸蛋白酶。
在本文中所使用的術(shù)語“降解”意指將氨基酸自蛋白質(zhì)性分子移除，產(chǎn)生肽或多肽。如同在聚丙烯酰胺膠上的觀察，本發(fā)明的蛋白質(zhì)降解C3而不會產(chǎn)生特異性的切割片段。本發(fā)明之C3-降解性蛋白酶對于C3有一些程度之較佳，例如，該C3-降解性蛋白酶并不會降解其它的蛋白質(zhì)，如白蛋白。
約20kDa之C3-降解性蛋白酶系自一插入性中斷的肺炎鏈球菌基因庫中鑒定出與野生型肺炎鏈球菌相比具有減弱之C3降解活性的克隆而予以分離。實施例1提供評估克隆之C3-降解活性之例示性試驗。鑒定具有減弱C3降解活性的克隆并基于該顯示減弱C3降解活性的克隆選出一546bp之SmaI嵌入物。此SmaI片段用作由CP1200菌株制得的肺炎鏈球菌基因庫的探針。來自肺炎鏈球菌基因庫而能與該SmaI片段雜交之陽性克隆被分離，并鑒定與C3-降解活性相關(guān)基因之開放閱讀框。下列與PspA之一部份具有序列一致性之寡核苷酸(SEQ ID NO10)在區(qū)別性雜交反應(yīng)中被用于證實編碼C3-降解性蛋白酶之基因與編碼PspA的基因截然不同。
SEQ ID NO10GAAAACAATAATGTAGAAGACTACTTTAAAGAAGCTTTAGA20kDa蛋白質(zhì)之完整開放閱讀框有492個堿基對(SEQ ID NO1)，預(yù)測分子量約為20kDa(+／-5kDa)或約有163個氨基酸(SEQ ID NO2)之蛋白質(zhì)。編碼C3-降解性蛋白質(zhì)之例示性基因序列示于圖1(SEQ ID NO1)，而該蛋白質(zhì)之氨基酸序列示于圖2(SEQ ID NO2)。圖3將較佳的基因序列與對應(yīng)之較佳翻譯蛋白質(zhì)結(jié)合成為SEQ ID NO3。
使用SEQ ID NO2，確定該蛋白質(zhì)之氨基酸序列與在GenBank或瑞士Prot數(shù)據(jù)庫中的其它蛋白質(zhì)無關(guān)。預(yù)測的蛋白質(zhì)具有原核細(xì)胞膜蛋白質(zhì)之富含脯氨酸(特別是介于氨基酸第80-108個之間)之序列特征，此建議該蛋白質(zhì)系表達于細(xì)胞表面。該氨基酸序列并無顯示明顯的膽堿-結(jié)合性重復(fù)序列。將來自CP1200培養(yǎng)物之肺炎鏈球菌溶解物及上清液在以C3浸潤之SDS-PAGE膠上進行電泳，在上清液及溶解物兩者均鑒定出約20kDa(±5kDa)之條帶(band)，證實具有如SEQID NO2所預(yù)測大小的蛋白質(zhì)擁有C3-降解活性(見實施例2)。如實施例3所述，編碼該20kDa之C3-降解性蛋白酶的基因在至少代表5個血清型(血清型1，3，4，14，及19F)之24個肺炎鏈球菌分離株中俱有保守性。
編碼本發(fā)明C3-降解性蛋白酶之全長基因被嵌入一基因表達載體以于大腸桿菌(E．coli)中表達。如實施例所述，將重組性C3-降解性蛋白酶進行分離。本領(lǐng)域中一般技術(shù)人士將會了解，就一特定基因序列(如SEQ ID NO1所提供者)而言，可以使用不同的表達載體來表達該基因。進而，可以使用本領(lǐng)域中不同的熟知方法來生產(chǎn)及分離本發(fā)明之重組蛋白質(zhì)，且本領(lǐng)域中一般技術(shù)人士亦會了解，本發(fā)明之C3降解性試驗將測定除了在實施例中所提出的表達系統(tǒng)以外的特定表達系統(tǒng)是否具有功能，而毋須進一步的試驗。在基礎(chǔ)技術(shù)文獻中可以發(fā)現(xiàn)許多不同的分子及免疫學(xué)技術(shù)，如Sambrook等人(Molecular Cloning-A LaboratoryManual，1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)及Harlow等人(Antibodies；A Laboratory Manual．Cold Spring Harbor，NY；Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)。
編碼本發(fā)明C3降解性蛋白質(zhì)之基因系使用來自CP1200菌株之肺炎鏈球菌基因組DNA片段所制得之質(zhì)粒基因庫進行鑒定。雖然已知有許多不同的方法可以得到質(zhì)?；驇?，以較佳的策略而言，質(zhì)?；驇熘畼?gòu)筑系將來自肺炎鏈球菌CP1200菌株(得自D．A．Morrison，University of Illinois，Champagne-Urbana，Illinois，且如Havarstein LF等人Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)1995；9211140-11144所描述)之經(jīng)Sau3A切割之肺炎鏈球菌基因組DNA片段(O．5-4．0kb)，插入一嵌入性穿梭(shuttle)載體pVA891(ermr，cmr；具有大腸桿菌的復(fù)制源)之BamHI位置。將此基因庫利用電擊穿孔去轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αMCR菌株。自一些隨機選擇的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株中抽取質(zhì)粒，顯示所有轉(zhuǎn)化株俱含有重組性質(zhì)粒。
質(zhì)?；驇霥NA可以自大腸桿菌轉(zhuǎn)化株中抽取，并用于轉(zhuǎn)化CP1200親代肺炎鏈球菌株，該轉(zhuǎn)化系使用藉由同構(gòu)型重組之插入性突變技術(shù)完成。
肺炎鏈球菌菌株CP1200細(xì)胞可以在CTM培養(yǎng)基中使用以HCl移動pH之步驟轉(zhuǎn)變?yōu)閯偃渭?xì)胞。將勝任細(xì)胞以少量分裝方式貯于-70℃直到需要使用為止。
本發(fā)明之分離蛋白質(zhì)與人類補體C3在PBS的存在下于37℃培育4小時以檢測C3降解作用。不具有分離肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)之對照組樣本可以作為具比較性目的之對照組。
本發(fā)明之蛋白質(zhì)于10％SDS-聚丙烯酰胺膠上具有明顯分子量約20kDa(±5kDa)且較佳的是具有分子量約15kDa至約25kDa。一示范性蛋白質(zhì)序列示于SEQ IDNO2。本領(lǐng)域之一般技術(shù)人士將了解，在氨基酸序列中有一些變異是可以預(yù)期的，且這些變異不應(yīng)自本發(fā)明之范圍內(nèi)排除。例如，保守性突變并不自本發(fā)明范圍中排除，氨基酸序列一致性中少于約80％氨基酸序列一致性(且較佳的是少于約90％氨基酸序列一致性)之變異亦不自本發(fā)明范圍中排除，其中該蛋白質(zhì)能夠降解人類補體蛋白質(zhì)C3且特別是該蛋白質(zhì)系分離或原始得自一肺炎鏈球菌細(xì)菌。該蛋白質(zhì)之片段亦在本發(fā)明之范圍中，特別是當(dāng)這些片段能降解人類補體蛋白質(zhì)C3時。
在肺炎鏈球菌菌株及血清型中可以預(yù)期有一些核酸序列變異，正如預(yù)期會有一些氨基酸變異一樣。保守性氨基酸取代系本領(lǐng)域中已知的，且包括，例如，使用與該氨基酸屬于同一類的其它成員氨基酸取代。例如，非極性氨基酸包括丙氨酸，白氨酸，異白氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯基丙氨酸，及色氨酸。極性電中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天門冬酰胺及谷胺酰胺。陽性電荷(堿性)之氨基酸包括精氨酸，賴氨酸及組氨酸。陰性電荷(酸性)之氨基酸包括天門冬氨酸及谷氨酸。此類改變預(yù)期不會影響聚丙烯酰胺膠電泳所測定的分子量或等電點。特別較佳的保守性取代作用包括，但不限于，將Lys置換為Arg(且反之亦然)以維持陽性電荷；將Glu置換為Asp(且反之亦然)以維持陰性電荷；將Ser置換為Thr以維持自由態(tài)OH；且將Gln置換為Asn以維持自由態(tài)NH2。
本發(fā)明較佳的蛋白質(zhì)包括具有氨基酸序列SEQ ID NO2之蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中規(guī)劃之其它蛋白質(zhì)包括可降解人類補體蛋白質(zhì)C3之蛋白質(zhì)，且編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQ ID NO1在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交，高度嚴(yán)格之雜交條件為例如以6X SSC，5X Denhardt，0．5％SDS(十二烷基磺酸鈉)，及100微克／毫升片段化及變性之鮭魚精子DNA在65℃進行雜交一整夜，并一次在2X SSC，0．1％SDS中于室溫下清洗約10分鐘，接著一次于65℃清洗約15分鐘，接著至少有一次在0．2X SSC，0．1％SDS中于室溫下清洗至少3-5分鐘。典型上，SSC溶液包含氯化鈉，檸檬酸鈉及水以制備貯存溶液。亦可使用該蛋白質(zhì)之肽或多肽。本發(fā)明之較佳蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO2中約第1個至約第50個氨基酸。
本發(fā)明蛋白質(zhì)可以蛋白質(zhì)的形式予以分離或制備。換言之，編碼該蛋白質(zhì)或該蛋白質(zhì)一部份之核酸可以被嵌入表達載體或嵌入細(xì)胞的染色體中，以便在該細(xì)胞中表達該蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)可以自細(xì)菌或另一細(xì)胞(較佳的是真核細(xì)胞，且更優(yōu)選的是動物細(xì)胞)中純化?；蛘撸摰鞍踪|(zhì)可以自表達該蛋白質(zhì)之細(xì)胞中分離，如肺炎鏈球菌細(xì)胞。肽或多肽亦與本發(fā)明中慮及。該肽或多肽較佳為至少15個氨基酸的長度且較佳的肽或多肽具有至少來自SEQ ID NO2之15個連續(xù)氨基酸。
編碼該20kDa蛋白質(zhì)之核酸亦為本發(fā)明之一部份。SEQ ID NO1為編碼C3-降解性蛋白酶之優(yōu)選核酸片段。本領(lǐng)域中一般技術(shù)人士將了解，一些取代并不會使C3-降解性蛋白酶序列改變致使該C3-降解性蛋白酶之特征及性質(zhì)到達實質(zhì)上改變的程度。例如，本發(fā)明亦規(guī)劃與SEQ ID NO1具有至少80％一致性的核酸。決定一特別核酸序列是否落于本發(fā)明范圍的方法應(yīng)思考該特別核酸序列是否編碼C3-降解性蛋白酶及與SEQ ID NO1相較是否具有至少80％之核酸一致性。編碼C3蛋白酶的其它核酸序列包括那些編碼C3蛋白酶的核酸，其中該C3蛋白酶與SEQ ID NO2相較具有相同序列或至少90％序列一致性，且包括涉及該核酸序列之簡并性情形。簡并性密碼子意指有不同三字密碼子可用于指定相同的氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中熟知下列的RNA密碼子(且因此，相關(guān)的DNA密碼子，其中以T取代U)可以互相交換用于編碼每個特定氨基酸苯丙氨酸(Phe或F)UUU，UUC，UUA或UUG白氨酸(Leu或L) CUU，CUC，CUA或CUG異白氨酸(Ile或I)AUU，AUC或AUA甲硫氨酸(Met或M)AUG纈氨酸(Val或V) GUU，GUC，GUA，GUG絲氨酸(Ser或S) AGU或AGC脯氨酸(Pro或P) CCU，CCC，CCA，CCG蘇氨酸(Thr或T) ACU，ACC，ACA，ACG丙氨酸(Ala或A) GCU，GCG，GCA，GCC色氨酸(Trp) UGG酪氨酸(Tyr或Y) UAU或UAC組氨酸(His或H) CAU或CAC谷胺酰胺(GIn或Q)CAA或CAG天門冬酰胺(Asn或N) AAU或AAC賴氨酸(Lys或K) AAA或AAG天門冬氨酸(Asp或D) GAU或GAC谷氨酸(Glu或E) GAA或GAG半胱氨酸(Cys或Q)UGU或UGC精氨酸(Arg或R) AGA或AGG甘氨酸(Gly或G) GGU或GGC或GGA或GGG終止密碼子 UAA，UAG或UGA進而，可以將一特別的DNA序列進行修正而使用一特別細(xì)胞類別所偏好的密碼子。例如，對于大腸桿菌之偏好密碼子之使用，以及動物(包括人類)之偏好密碼子均為已知。這些改變?yōu)楸绢I(lǐng)域中一般技藝人士熟知，且因此這些基因序列被認(rèn)為是本發(fā)明之一部份。其它的核酸序列包括來自SEQ ID NO1之長度為至少15個(且較佳為至少30個)核酸之核酸片段，或其它長度為至少15個(且較佳為至少30個)核酸之核酸片段，其中該片段可與SEQ ID NO1在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交，高度嚴(yán)格之雜交條件例如以6X SSC，5X Denhardt，0．5％SDS(十二烷基磺酸鈉)，及100微克／毫升片段化及變性之鮭魚精子DNA在65℃進行雜交一整夜，并一次在2X SSC，0．1％SDS于室溫下清洗約10分鐘，接著一次于65℃清洗約15分鐘，接著至少一次在0．2X SSC，0．1％SDS中于室溫下清洗至少3-5分鐘。
本發(fā)明之核酸片段可編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO5之全部，可不含SEQ ID NO2或SEQ ID NO5(即無法轉(zhuǎn)錄的片段，包括基因調(diào)節(jié)性區(qū)域之片段或其它類似者)或可編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO5之部份，較佳的是包含編碼來自SEQ ID NO2或SEQ ID NO5之至少9個氨基酸之連續(xù)性核酸片段。因為在本發(fā)明中規(guī)劃編碼C3蛋白酶之一部份的核酸片段，將可了解的是并非所有的核酸片段都編碼具C3-降解活性之蛋白質(zhì)或肽或多肽。進而，本發(fā)明之核酸可以進行突變以移除(或用其它方式不活化)該蛋白質(zhì)之C3降解活性。因此，本發(fā)明亦規(guī)劃符合上述雜交條件而具C3-降解活性之片段。使核酸序列突變或以其它方式改變核酸序列的方法已于本領(lǐng)域中詳述，且在免疫產(chǎn)生性及酵素特性方面不活化之蛋白質(zhì)生產(chǎn)可以針對治療用途進行測試。
本發(fā)明之核酸片段可以被并入核酸載體中或穩(wěn)定地并入宿主基因組中以生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，包括重組性嵌合(chimeric)蛋白質(zhì)。在一具體例中，C3-降解性蛋白質(zhì)系由在載體中的基因所編碼，且該載體系在細(xì)胞中。較佳的是該細(xì)胞為原核性細(xì)胞，如細(xì)菌?；蚣盎蚱慰梢栽摶虻娜炕虿糠菖c另一基因融合之方式存在，且該C3-降解性蛋白質(zhì)可以一個或多個蛋白質(zhì)之融合蛋白質(zhì)方式存在，該融合蛋白質(zhì)系以單一蛋白質(zhì)方式表達。本發(fā)明之許多相異核酸載體為本領(lǐng)域已知的且包括許多商業(yè)上可用的表達質(zhì)?；虿《据d體。這些載體的使用為本領(lǐng)域中一般技術(shù)人士所已知的。在實施例中所使用者系一些例示性載體，但不應(yīng)被認(rèn)為對本發(fā)明范圍有所限制。
本發(fā)明亦涉及能結(jié)合(典型上專一性結(jié)合)至來自肺炎鏈球菌之約20kDa之蛋白質(zhì)(較佳的是約15kDa至約25kDa之蛋白質(zhì))之抗體，且較佳的是其中該蛋白質(zhì)能夠降解人類補體C3?？梢葬槍υ摰鞍踪|(zhì)之全部或一部份制備多株抗體。類似地，可以針對本發(fā)明之約20kDa之C3降解性蛋白質(zhì)之全部或其中一肽或多肽(片段)制備單株抗體。針對蛋白質(zhì)制備抗體的方法詳見于，例如，Harlow等人，(Antibodies；A Laboratory Manual．Cold Spring Harbor，NY；Cold SpringHarbor Laboratory Press，1988)。在一較佳的實例中，該抗體可自人類，大鼠，小鼠，山羊，雞，或兔子衍生。蛋白質(zhì)結(jié)合性抗體片段及嵌合片段亦屬熟知且在本發(fā)明之范圍中。
本發(fā)明亦涉及免疫刺激性組合物的使用。術(shù)語“免疫刺激性”或“免疫系統(tǒng)刺激性”組合物意指本發(fā)明之蛋白質(zhì)，肽或多肽組合物，它激活個體(如一哺乳動物)免疫系統(tǒng)中至少一種細(xì)胞型態(tài)，較佳的是，該免疫刺激性組合物在正常(未感染的)個體內(nèi)可提供一種免疫接種反應(yīng)或預(yù)防效果，其典型上為一疫苗。然而，在治療應(yīng)用或過程中任何可測得的免疫反應(yīng)均有利于個體。免疫系統(tǒng)中優(yōu)選的被活化細(xì)胞包括吞噬性細(xì)胞，如嗜中性白血球或巨噬細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞，上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。包括本發(fā)明之肽，多肽或蛋白質(zhì)之免疫刺激性組合物可被用于在動物中產(chǎn)生抗體，如大鼠，小鼠，山羊，雞，兔子或人類，或用于研究肺炎鏈球菌感染之動物模式。較佳的免疫刺激性組合物包括免疫刺激性份量(例如治療有效量)之至少一種肽或多肽，其包括來自該C3降解性蛋白酶之至少15個氨基酸。
術(shù)語“疫苗”意指用于免疫接種之組合物。免疫作用的過程可包括施用蛋白質(zhì)，肽，多肽，抗原，核酸序列或互補性(例如反義)序列，或抗體或其懸浮液，其中施用該分子將可產(chǎn)生活性免疫力及提供保護以對抗肺炎鏈球菌感染或侵入繁殖。典型上，此等疫苗被制成可注射之液體溶液或懸浮液。亦可制成適合在注射前溶解或懸浮于液體中的固體形式。該疫苗制備物可選擇性地加以乳化，或被包裹于微脂體中。
該免疫刺激性組合物(如一疫苗)可進而包括在藥學(xué)上可接受的緩沖液或載劑中的其它蛋白質(zhì)，這些緩沖液或載劑如PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)，或在本領(lǐng)域中其它被認(rèn)為適合及安全用于將蛋白質(zhì)導(dǎo)入宿主以刺激免疫系統(tǒng)之緩沖液。該免疫刺激性組合物亦可包括其它免疫系統(tǒng)刺激性蛋白質(zhì)，如佐劑或來自肺炎鏈球菌或其它生物之免疫刺激性蛋白質(zhì)，肽或多肽。例如，控制肺炎鏈球菌感染最有利的可能是肽或多肽之調(diào)配混合物(cocktail)。較佳的是在一疫苗制備物中使用本發(fā)明蛋白質(zhì)之一個或多個片段以對抗或限制肺炎鏈球菌之侵入繁殖或肺炎鏈球菌侵入繁殖所帶來之致病結(jié)果。
在本文中所使用“治療有效量”意指有效產(chǎn)生一意欲結(jié)果之份量。該份量視個體免疫系統(tǒng)的健康或物理(即抗體合成)狀況，意欲保護的程度，制備的劑型及其它相關(guān)因素而定?？深A(yù)期的是該份量將落于一相當(dāng)廣泛的范圍，且可經(jīng)由例行性試驗進行決定。
活性免疫刺激性成份經(jīng)常與賦形劑或稀釋劑混合，這些賦形劑或稀釋劑為藥學(xué)上可接受的載劑且與活性成份兼容。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載劑”意指在與一組合物中其它成份兼容且不危害接受者之意義上為“可接受的”載劑。合適的賦形劑為，例如，水，鹽水，右旋糖，甘油，乙醇或類似物，以及其混合物。此外該免疫刺激性組合物(包括疫苗)可依喜好包含少量之輔助性物質(zhì)，如濕潤或乳化劑，pH緩沖劑，和／或可以增進該免疫刺激性組合物效果之佐劑。
有效的佐劑或載劑包括但不限于氫氧化鋁，N-乙?；?壁?；?L-蘇胺酰基-D-異谷胺酰胺(thr-MDP)；N-乙酰基-新-壁?；?L-丙胺酰基-D-異谷胺酰胺(CGP11637，被稱為nor-UDP)，N-乙酰基壁?；?L-丙胺酰基-D-異谷胺?；?L-丙氨酸-2-(1’，2’-二棕櫚?；?sn-甘油-3-羥基磷?；?-乙基胺(CGP 19835A，被稱為MTP-PE)，及RIBI，其于2％之角鯊烯／Tween 80乳化液中包含三種自細(xì)菌抽取的成份，單磷?；珹，二霉菌酸海藻糖及細(xì)胞壁架構(gòu)(MPL+TDM+CWS)。
本發(fā)明亦涉及抑制肺炎鏈球菌-媒介性C3降解作用的方法，包括將肺炎鏈球菌與一蛋白質(zhì)(如一抗體)接觸，或另一能與來自肺炎鏈球菌之約15kDa至約25kDa之分離蛋白質(zhì)結(jié)合之蛋白質(zhì)。能與約15kDa至約25kDa之分離蛋白質(zhì)結(jié)合之蛋白質(zhì)可為一抗體或其片段，或該蛋白質(zhì)可為嵌合蛋白質(zhì)，該嵌合蛋白質(zhì)包括來自抗體之抗體結(jié)合區(qū)域(如一可變性區(qū)域)，該抗體能專一性辨識來自肺炎鏈球菌之約15kDa至約25kDa且具有C3降解活性之分離蛋白質(zhì)。
本發(fā)明之分離肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)可被分離，且可選擇性地予以純化，且可以使用該分離蛋白質(zhì)或其免疫產(chǎn)生性片段來產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，在一實施例中，其包括在人類或?qū)嶒瀯游锷砩现贵w反應(yīng)。該蛋白質(zhì)不具有C3降解活性之肽或多肽片段可針對其限制肺炎鏈球菌感染影響的能力進行試驗。類似地，本發(fā)明之蛋白質(zhì)之修正可例如經(jīng)由突變來中斷或不活化該蛋白質(zhì)之C3降解活性?？梢允褂媚軌蛞种票景l(fā)明蛋白質(zhì)之C3-降解活性之抗體作為經(jīng)由調(diào)理性路徑來預(yù)防C3降解作用及促進肺炎鏈球菌清除之策略。該分離蛋白質(zhì)可于試驗中使用來檢測對抗肺炎鏈球菌之抗體，或作為肺炎鏈球菌治療用之疫苗之一部份，或作為包含一多價性或多個蛋白質(zhì)，肽或多肽之疫苗。
因此，在本文所使用之術(shù)語“處理”意指對于正常哺乳動物個體或遭各種肺炎鏈球菌感染入侵，診斷為各種肺炎鏈球菌感染，或表達各種肺炎鏈球菌感染之特征或癥狀之哺乳動物個體進行預(yù)防或治療。術(shù)語“治療”意指對于哺乳動物個體提供治療性效果，使得該個體表達甚少或不表達肺炎鏈球菌感染或其它相關(guān)疾病之癥狀。此類處理可伴隨本發(fā)明之核酸分子(具意義或反義者)，蛋白質(zhì)，肽或多肽或抗體之施用。
進一步的規(guī)劃為本發(fā)明之蛋白質(zhì)可以表達于脊椎動物細(xì)胞的表面且用于降解C3，例如，當(dāng)補體沉積(或活化)成為難題時，例如在異種移植或補體-媒介性腎小球腎炎的情況。例如，完整的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)，重組蛋白質(zhì)，或以上兩者任一之一部份，可以被并入異種移植細(xì)胞中，并以表面蛋白質(zhì)或分泌蛋白質(zhì)的方式表達以預(yù)防補體沉積(和／或補體-媒介性發(fā)炎反應(yīng))或使其減至最小。
本發(fā)明另一特別方面涉及使用表達分離蛋白質(zhì)及由其而來之肽或多肽之疫苗載體。據(jù)此，在進而一方面，本發(fā)明提供一種在哺乳動物引發(fā)免疫反應(yīng)的方法，其包括將表達本發(fā)明分離蛋白質(zhì)和／或肽或多肽之至少一種或其混合物之疫苗載體提供至一哺乳動物。本發(fā)明之蛋白質(zhì)及肽或多肽可使用活的疫苗載體傳送至哺乳動物，特別是使用活的重組細(xì)菌，病毒或其它活的物質(zhì)，其包含以外來多肽方式表達該蛋白質(zhì)和／或肽或多肽時所需之遺傳物質(zhì)。特別是那些在胃腸道內(nèi)繁殖的細(xì)菌己被發(fā)展成為疫苗載體，如沙門氏桿菌(Salmonella)，志賀氏桿菌(Shigella)，耶爾辛氏桿菌(Yersinia)，弧菌(Vibrio)，埃希氏菌(Escherichia)及BCG，以上及其它實例在J．Holmgren等人，Immunobiol．184，157-179(1992)及J．McGhee等人，Vaccine，10，75-88(1992)中討論。
本發(fā)明之額外具體例涉及在一個體(如哺乳動物)引發(fā)免疫反應(yīng)的方法，包括將一份量之編碼本發(fā)明之分離蛋白質(zhì)和／或自其而來之肽或多肽之DNA分子(選擇性聯(lián)合一種感染-協(xié)助性因子)施用至該個體，其中該蛋白質(zhì)和／或肽或多肽保留免疫產(chǎn)生性，且當(dāng)該蛋白質(zhì)和／或肽或多肽并入一免疫刺激性組合物(例如疫苗)并施用至人類時，可提供保護而不會在人類由肺炎鏈球菌病原引發(fā)后續(xù)感染時加重病情。感染-協(xié)助性因子為本領(lǐng)域中已知的。
進一步的規(guī)劃為編碼該20kDa蛋白質(zhì)之基因之反義序列可作為抗肺炎鏈球菌感染之疫苗或治療性處理。反義DNA被定義為非-編碼性序列，其與SEQ ID NO1之全部或部份互補(即一互補鏈)。例如，5’-ATGTCAAGC-3’之反義序列為3’-TACAGTTCG-5’。將反義序列或寡核苷酸傳送至動物可造成動物產(chǎn)生抗體，或造成該序列并入活菌或其它細(xì)胞中致使該20kDa基因產(chǎn)物之全部或部份之轉(zhuǎn)錄和／或翻譯受到抑制。
反義核酸序列的導(dǎo)入可例如經(jīng)由將反義核酸裝載于合適的載體(如微脂體)上而導(dǎo)入肺炎鏈球菌或受感染細(xì)胞內(nèi)。典型上，具有8個或更多核苷酸之反義核酸序列能結(jié)合至細(xì)菌核酸或細(xì)菌訊息RNA上。反義核酸序列典型上包含至少約15個核苷酸(較佳為至少約30個核苷酸或更多核苷酸)，以對于細(xì)菌核酸或細(xì)菌訊息RNA之雜交產(chǎn)物提供所需的穩(wěn)定性。序列的導(dǎo)入較佳的是抑制至少一個內(nèi)源性肺炎鏈球菌核酸序列之轉(zhuǎn)錄或翻譯。裝載反義核酸的方法在本領(lǐng)域中為熟知的，例如U．S．專利第4，242，046號。
本發(fā)明亦提供具有2163堿基之開放閱讀框(SEQ ID NO4)之核酸，其包括開放閱讀框(SEQ ID NO1)之核酸，其編碼具有分子量約20kDa(SEQ IDNO2)之蛋白質(zhì)。在本文所述之該20kDa蛋白質(zhì)進而被定性為一C3-降解性蛋白質(zhì)。較大的開放閱讀框，例如2163bp(SEQ ID NO4)，編碼約79kDa(SEQ IDNO5)之假設(shè)性蛋白質(zhì)。
在本文中所有引用的參考文獻及發(fā)表文獻俱并入本說明書作為參考資料。對于熟習(xí)該項技術(shù)者而言，有許多不同的可用替代技術(shù)及步驟可以類似地使實施者根據(jù)本說明書成功實施規(guī)劃之發(fā)明。熟習(xí)該項技術(shù)者將會了解，雖然本發(fā)明已于上文中依據(jù)特定具體例及實例加以描述，本發(fā)明并未當(dāng)然受到如此限制，且可以進行許多其它具體例，實例，用途，修正以及在這些具體例，實例及用途以外之情形，而不會偏離本申請案之發(fā)明范圍。
實施例1具有減弱C3-降解活性之嵌入性突變株之鑒定嵌入性突變株系得自Elaine Tuomanen博士(Rockefeller Inst．，New York，New York)。具有嵌入物之克隆于試驗中進行測試以檢測減弱C3-降解活性。137個克隆經(jīng)由使該等細(xì)胞于Todd Hewitt培養(yǎng)液中在室溫下于微效價盤上生長一整夜而進行測試。該等細(xì)胞以供肺炎鏈球菌之合成性培養(yǎng)基(見Sicard A．M．，Genetics 5031-44，1984)進行1∶10之稀釋，且剩余的細(xì)胞被冷凍于微效價盤中。將在100微升之培養(yǎng)基(包含1毫克／毫升在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)之0．1％BSA)中的63納克(ng)或83納克之C3加入約200微升之經(jīng)稀釋細(xì)胞內(nèi)。將細(xì)胞于37℃培育4小時。將100微升之混合物加入ELISA盤中并于4℃培育一整夜。將該盤以清洗緩沖液進行清洗三次，且將在PBS中的0．05％Tween 20加入孔洞中，在每次清洗前進行5分鐘培育?？笴3之100微升抗體(對人類C3-IgG部份具專一性之多株西洋山俞菜過氧化氫酶-結(jié)合之山羊抗體，ICN Cappel，Costa Mesa，CA)以在PBS中之3％BSA進行1∶1200之稀釋。該ELISA盤于37℃在黑暗中培育約30分鐘至1小時，并以上述清洗緩沖液進行清洗。將該試驗使用12毫克OPD(在30毫升0．1M檸檬酸鈉緩沖液中)以及12微升之30％過氧化氫進行顯影。試驗結(jié)果于一ELISA盤讀測儀上在490微毫米經(jīng)由光學(xué)密度讀數(shù)而決定。
每個克隆進行試驗四次。與非突變對照組相較具有少于40％之C3降解作用之19個克隆被選出。這19個克隆以上述試驗進行篩選六次，且由結(jié)果選出與非突變對照組相較具有少于40％之C3降解作用之6個克隆。這6個克隆每個進行篩選11次，且選出具有最低C3-降解活性的2個克隆作進一步研究。
得到其中之一克隆之部份序列，且將一546bp之SmaI片段以32P進行隨機引物標(biāo)定(得自Stratagene之套組，LaJolla，CA)。來自SEQ ID NO1之546bp之SmaI片段與來自許多肺炎鏈球菌菌株經(jīng)EcoRI及Kpnl處理之切割物在Southern印跡上進行雜交。此相同的片段亦用于篩選得自肺炎鏈球菌菌株CP1200之基因組DNA之Sau3A片段基因庫。
自CP1200基因庫鑒定出3．5kb之嵌入物。將該嵌入物進行定序，并鑒定出一492個堿基對之開放閱讀框，包括終止密碼子。該開放閱讀框編碼163個氨基酸且預(yù)測分子量約為18，500道爾頓之蛋白質(zhì)。
構(gòu)筑PCR引物以擴增開放閱讀框；該5’PCR引物包括一BamHI位置；該3’引物包括一PstI位置。被擴增的嵌入物依符合閱讀框方式連接至His-標(biāo)記之大腸桿菌表達載體pQE30(Qiagen，San Diego，CA)。將得到的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(Novagen，Madison，WI)，其包含lac抑制物(repressor)質(zhì)粒pREP4(Qiagen)。將大腸桿菌培養(yǎng)物進行誘發(fā)以表達His-標(biāo)記之蛋白質(zhì)，且該蛋白質(zhì)以Ni-NTA樹脂(Qiagen)進行管柱純化。該純化之蛋白質(zhì)經(jīng)由SDS-PAGE膠進行確認(rèn)。
實施例220kDa之C3-降解性蛋白酶之鑒定為了測定20kDa蛋白質(zhì)之C3-降解能力，將0．5毫克／毫升之C3(根據(jù)Tack等人，Meth．Enzymol．8064-101，1984進行制備)于含有15％丙烯酰胺之十二烷基磺酸鈉(SDS)膠(15％SDS-PAGE膠)上進行共聚。肺炎鏈球菌上清液系得自于Todd Hewitt培養(yǎng)液中生長至對數(shù)期之肺炎鏈球菌菌株CP1200培養(yǎng)物，肺炎鏈球菌溶解物經(jīng)由將5×108個細(xì)胞與5％SDS在室溫下培育30分鐘而得到。經(jīng)溶解物使用具10，000MW分離值之Centricon過濾裝置(Amicon，Beverly，MA)進行濃縮10倍。樣本在電泳前不進行加熱。將上清液及溶解物的樣本加入15％包含C3之SDS-PAGE膠，且電泳系于4℃在150V進行，直到染料前緣跑出為止。將膠連續(xù)以50毫升在水中的2．5％Triton X-100清洗(2次，10分鐘)，以在50Mm Tris-HCl中的2．5％Triton X-100，pH7．4(2次，10分鐘)清洗，及以50mm Tris-HCl，pH7．4清洗(2次，10分鐘)以移除SDS。清洗后，將50毫升之50mM Tris-HCl，pH 7．4，倒入含有這些膠的盤皿中，將盤皿加蓋并于37℃培育1．5小時及一整夜(約16小時)。將膠以考馬士(Coomassie)藍染色10分鐘，隨后完全地脫色。
對照在溶解物及上清液中的暗藍色背景，可以觀察到兩個溶解性條帶，其中之一約為20kDa大小。在肺炎鏈球菌溶解物中的C3蛋白酶活性于37℃培育1．5小時后觀察到，然而在Pn上清液中C3蛋白酶活性經(jīng)一整夜培育后才觀察到。因此，C3蛋白酶活性顯然主要與細(xì)胞相關(guān)。
實施例3編碼該20kD蛋白質(zhì)之基因在一些肺炎鏈球菌菌株中具保守性自各種不同的肺炎鏈球菌菌株(第1型，第3型，L002及L003(第3型)，第4型，第14型之臨床分離株及CP1200，WU2，R6X，6303，109，110，JY1119，JY182，及JY53之實驗室分離株)得到DNA，并將SEQ ID NO3作為探針以檢測編碼該20kD蛋白質(zhì)之核酸是否存在于來自這些菌株之DNA中。分離染色體DNA以EcoRI進行切割并經(jīng)由電泳分開。將DNA轉(zhuǎn)移至固體支持物上，并與末端-標(biāo)定的SEQ ID NO3進行雜交，雜交及清洗條件為以6X SSC，5X Denhardt’s，0．5％SDS及100微克／毫升片段化且變性之鮭魚精子DNA在65℃進行雜交一整夜，并一次在2X SSC，0．1％SDS于室溫下清洗約10分鐘，接著一次于65℃清洗約15分鐘，接著兩次在0．2X SSC，0．1％SDS中于室溫下清洗3分鐘。
結(jié)果指出SEQ ID NO3在每個受試DNA樣本中同樣有雜交反應(yīng)，指出該蛋白質(zhì)顯然在各菌株間具有保守性。在一些菌株中，編碼20kDa之C3-降解性蛋白質(zhì)之DNA顯然為一較大之2163bp開放閱讀框的一部份，該開放閱讀框假設(shè)性編碼79kDa蛋白質(zhì)。
實施例4肺炎鏈球菌DNA／5F1探針之Southern印跡分析自11個肺炎鏈球菌菌株得到基因組DNA之5微克樣本。每個樣本以限制酶KpnI切割。這些樣本隨后裝載于瓊脂糖膠上并經(jīng)由電泳進行解析。包含在膠中的樣本隨后經(jīng)由毛細(xì)移轉(zhuǎn)而轉(zhuǎn)移至得自Amersham(Upsafla，Sweden)之Hybond-N+膜上。得自5F1分離株之一540bp之SmaI片段使用T7QuickPrime套組(Pharmacia，Piscathaway，NJ)以32P進行隨機引物標(biāo)定，并使用NucTrap管柱(Stragene，La Jolla，CA)自非-并入的核苷酸中純化，并進行雜交。
雜交條件為以6X SSC，5X Denhardt，0．5％SDS，及100微克／毫升片段化及變性鮭魚精子DNA在65℃進行雜交一整夜，并一次在2X SSC，0．1％SDS于室溫下清洗約10分鐘，接著一次于65℃清洗約15分鐘，接著至少一次在0．2XSSC，0．1％SDS中于室溫下清洗至少3-5分鐘。漬膜顯示該20kDa基因系存在于所有肺炎鏈球菌的受試菌株。
實施例5自SEQ ID NO1制得兩個DNA引物并用于擴增來自肺炎鏈球菌(血清型3)基因體DNA之20kDa基因序列。第一個引物為5’-引物(SEQ ID NO6)，其自該20kDa基因之ATG起始密碼子開展，其中插入一NcoI位置，且在ATG起始密碼子之后具Ala殘基以維持正確的閱讀框。第二個引物為3’-引物(SEQ ID NO7)，其自該20kDa基因之終止密碼子開展，其中插入一BamHI位置。
5’-GGGGG CCA TGG CC TCA AGC CTT TTA CGT GAA TTG-3’；(SEQ ID NO6)5’-GGGGG GGA TCC CTA GCT ATA TGA GAT AAA CTT TCC TGC T-3’；(SEQ ID NO7)該兩個引物系于Applied Biosystems 380A DNA合成儀(Foster City，CA)中使用購自Glen Research(Sterling，VA)之反應(yīng)劑進行合成。擴增反應(yīng)系使用Perkin Elmer Thermocycler(ABI)根據(jù)制造商的指示進行。經(jīng)鑒定之PCR產(chǎn)物被連接至以TA為尾端之PCR選殖載體pCR2．1(其系得自Invitrogen，Carlsbad，CA)，并用于轉(zhuǎn)化OneShot Top10F’勝任細(xì)胞(Invitrogen)。卡那霉素(Kanamycin)抗藥性轉(zhuǎn)化株經(jīng)由將堿性溶解法制得之質(zhì)粒DNA進行限制酶分析而加以篩選。鑒定出一約為500bp之嵌入物片段并隨后以限制酶NcoI及BamHI進行切割。將該500bp片段自低融點瓊脂糖膠中分離，且隨后連接至得自Novagen(Madison，WI)之T7激活性表達載體pET28a之NcoI-BamHI位置。
該連接混合物隨后經(jīng)轉(zhuǎn)化送入Top1OF’細(xì)胞(Invitrogen)，且卡那霉素抗藥性轉(zhuǎn)化株經(jīng)由將堿性溶解法制得之質(zhì)粒DNA進行限制酶分析而加以篩選。重組性質(zhì)粒(pLP505)隨后經(jīng)轉(zhuǎn)化送入BL21(Novagen)細(xì)胞并使其于添加30微克／毫升之卡那霉素之SOB培養(yǎng)基中生長。細(xì)胞生長至0．D．600值0．6，并隨后以0．4mMIPTG(Boehringer Mannheirn，Indianapolis，Indiana)進行誘發(fā)2-4小時。制備全細(xì)胞溶解物并于14％SDS-PAGE膠上進行電泳。將膠以考馬士(Coomassie)藍染色并檢測到表達產(chǎn)物。該考馬士藍染色的膠顯示在28kDa及18kDa分子量標(biāo)記之間的條帶，且經(jīng)測定約為20kDa。
在該重組性pLP505質(zhì)粒中嵌入物之DNA序列使用ABI 370A DNA測序儀得到。將該DNA序列與SEQ ID NO1之DNA序列使用Pustell之MacVector DNA矩陣點繪特征(Oxford Molecular Group，Campbell，CA)進行比對。將得自pLP505質(zhì)粒，SEQ ID NO1及肺炎鏈球菌(血清型4)基因組之DNA序列進行比對，顯示編碼該20kD蛋白質(zhì)之開放閱讀框(ORF)可能為一較大ORF之部份，即在血清型4之基因組中編碼具有約79kDa預(yù)測分子量之蛋白質(zhì)之2163bp(SEQ IDNO4)。DNA SEQ ID NO4編碼如SEQ ID NO5所示之預(yù)測氨基酸序列。
肺炎鏈球菌(血清型4)基因組序列系使用MacVector之ClustalW特征(OxfordMolecular Group，Campbell，CA)自網(wǎng)址為www．tigr．org之Institute for GenomicResearch和／或經(jīng)由網(wǎng)址為www．ncbi．nlm．nih．gov之NCBI而得到。在該20kDa之氨基酸序列(SEQ ID NO2)及預(yù)測為79kDa之氨基酸序列(SEQ ID NO5)之間進行序列比較?？梢杂^察到SEQ ID NO2中第1-58個氨基酸和第90-132個氨基酸分別與SEQ ID NO5中第170-227個氨基酸和第258-300個氨基酸的序列基本上一致。包含這些特別區(qū)域的蛋白質(zhì)及肽或多肽為本發(fā)明較佳的具體例。
基于可得的基因組DNA(血清型4)序列，設(shè)計在2163bpORF兩側(cè)的引物并隨后使用ABI 380A DNA合成儀進行合成(SEQ ID NO8及9)。SEQ ID NO8為一肺炎鏈球菌5＇-引物，其具有插入的NcoI位置且在ATG起始密碼子之后加入Glu殘基以維持一正確的開放閱讀框。SEQ ID NO9為一肺炎鏈球菌3’-引物，其具有插入的HindIII位置。
5’-AGA GCT CCT CCC ATG GAA GAT CCG AAT TAT CAG-3’；(SEQ ID NO8)5’-CCG GGC AAG CTT TTA CTT ACT CTC CT-3’；(SEQ ID NO9)一約2100bpDNA片段隨后自4個不同的肺炎鏈球菌血清型(血清型3，5，6B及7)擴增，得到4個片段。4個片段隨后各自連接至PCR選殖性載體PCR2．1(Invitrogen)，并用于轉(zhuǎn)化OneShot Top10F’細(xì)胞(Invitrogen)?？敲顾乜顾幮赞D(zhuǎn)化株經(jīng)由將堿性溶解法制得之質(zhì)粒DNA進行限制酶分析而加以篩選。含有血清型7之PCR產(chǎn)物之重組性質(zhì)粒被鑒定出來，例如為pLP512。使用ABI型號370ADNA測序儀得到血清型7之克隆之DNA序列。該DNA序列基本上同于SEQ ID NO4并編碼一基本上同于SEQ ID NO5之預(yù)測氨基酸序列。
熟習(xí)該項技術(shù)者將會了解，雖然本發(fā)明已于上文中依據(jù)特定具體例及實施例加以描述，本發(fā)明并未當(dāng)然受到如此限制，且可以進行許多其它具體例，實例，用途，修正以及在這些具體例，實例及用途以外之情形，而不會偏離本申請案之
權(quán)利要求
1．一種分離蛋白質(zhì)，其特征在于，其與SEQ ID NO2具至少80％之序列一致性，其能夠降解人類補體蛋白質(zhì)C3。
2．如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其系自肺炎鏈球菌分離。
3．如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其為重組蛋白質(zhì)。
4．如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其分子量為約15kDa至約25kDa。
5．一種分離肽或多肽，其特征在于，其包括來自如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)中至少15個連續(xù)氨基酸。
6．一種分離肽或多肽，其特征在于，其包括SEQ ID NO2中至少15個連續(xù)氨基酸。
7．一種分離蛋白質(zhì)，其特征在于，其包括SEQ ID NO2。
8．如權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其分子量為約15kDa至約25kDa。
9．如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其系自肺炎鏈球菌分離。
10．如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其降解人類補體蛋白質(zhì)C3。
11．如權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其為SEQ ID NO2。
12．一種分離蛋白質(zhì)，其特征在于，其包括SEQ ID NO2中自約第1個至約第58個氨基酸。
13．如權(quán)利要求12所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其進而包括SEQ ID NO2中自約第90個至約第132個氨基酸。
14．一種分離蛋白質(zhì)，其特征在于，其包括SEQ ID NO5中自約第170個至約第227個氨基酸。
15．如權(quán)利要求14所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其進而包括SEQ ID NO5中自約第258個至約第300個氨基酸。
16．一種降解人類補體蛋白質(zhì)C3之分離蛋白質(zhì)，其特征在于，編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQ ID NO1或其互補鏈在高度嚴(yán)格雜交條件下雜交。
17．一種來自肺炎鏈球菌之約15kDa至約25kDa之分離蛋白質(zhì)，其特征在于，其能夠降解人類補體C3。
18．一種免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，其包括一有效量之免疫系統(tǒng)刺激性肽或多肽，該肽或多肽具有衍生自一種蛋白質(zhì)之至少15個連續(xù)氨基酸，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2有至少80％序列一致性且能降解人類補體蛋白質(zhì)C3。
19．如權(quán)利要求18所述的免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，該蛋白質(zhì)系自肺炎鏈球菌分離。
20．如權(quán)利要求19所述的免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，其進而包括至少一種來自肺炎鏈球菌分離之其它免疫系統(tǒng)刺激性蛋白質(zhì)，肽或多肽。
21．一種免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，其包括治療有效量之一蛋白質(zhì)的至少一部份，其中編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQ ID NO1或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。
22．一種免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，其包含有效份量之如權(quán)利要求17所述的蛋白質(zhì)之至少一部份以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該蛋白質(zhì)可有效地免疫或治療哺乳動物個體以對抗肺炎鏈球菌的感染或侵入繁殖。
23．如權(quán)利要求22所述的免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，該蛋白質(zhì)系以能夠?qū)τ谠摬溉閯游飩€體有效提供治療效果的份量予以供給。
24．一種抗體，其特征在于，其能夠與SEQ ID NO2有至少80％序列一致性且能降解人類補體蛋白質(zhì)C3之蛋白質(zhì)結(jié)合。
25．如權(quán)利要求24所述的抗體，其特征在于，其為單株抗體。
26．如權(quán)利要求24所述的抗體，其特征在于，其系得自小鼠，大鼠，山羊，雞，人類，或兔。
27．一種能夠與一蛋白質(zhì)之至少一部份結(jié)合的抗體，其特征在于，編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQ ID NO1或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交件下雜交。
28．一種分離核酸片段，其特征在于，其可與SEQ ID NO1或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交件下雜交。
29．如權(quán)利要求28所述的核酸片段，其特征在于，其系自肺炎鏈球菌分離。
30．如權(quán)利要求28所述的核酸片段，其特征在于，該核酸片段編碼一蛋白質(zhì)之至少一部份。
31．如權(quán)利要求30所述的核酸片段，其特征在于，該蛋白質(zhì)降解人類補體C3。
32．如權(quán)利要求28所述的核酸片段，其特征在于，其在核酸載體中。
33．如權(quán)利要求32所述的核酸片段，其特征在于，該載體為能夠生產(chǎn)一蛋白質(zhì)之至少一部份之表達載體。
34．一種細(xì)胞，其特征在于，其包括如權(quán)利要求28所述的核酸。
35．如權(quán)利要求34所述的細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞為細(xì)菌或真核細(xì)胞。
36．一種分離核酸片段，其特征在于，其包括SEQ ID NO1或其互補鏈中約第1個至約第174個核苷酸。
37．如權(quán)利要求34所述的分離核酸片段，其特征在于，其進而包括SEQ ID NO1或其互補鏈中約第320個至約第492個核苷酸。
38．一種分離核酸片段，其特征在于，其包括SEQ ID NO1或其互補鏈之核酸序列。
39．一種RNA片段，其特征在于，其系由包括SEQ ID NO1或其互補鏈之雙鏈DNA序列所轉(zhuǎn)錄。
40．一種在哺乳動物產(chǎn)生對抗肺炎鏈球菌的免疫反應(yīng)的方法，其特征在于，其包括將一組合物施用至哺乳動物的步驟以產(chǎn)生對抗該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，該組合物包括治療有效量之一蛋白質(zhì)的至少一部份，其中編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQID NO1或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。
41．如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，該免疫反應(yīng)可為B細(xì)胞反應(yīng)，T細(xì)胞反應(yīng)，上皮細(xì)胞反應(yīng)或內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)。
42．如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，一蛋白質(zhì)之至少一部份為至少15個氨基酸長度。
43．如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，該組合物進而包括至少一種來自肺炎鏈球菌之其它免疫系統(tǒng)刺激性肽，多肽或蛋白質(zhì)。
44．如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，一蛋白質(zhì)之至少一部份包括SEQID NO2中至少15個氨基酸。
45．一種抑制肺炎鏈球菌-媒介性C3降解作用的方法，其特征在于，其包括的步驟為將肺炎鏈球菌細(xì)菌接觸一抗體，該抗體能夠與SEQ ID NO2有至少80％序列一致性之蛋白質(zhì)結(jié)合。
46．一種抑制C3-媒介性發(fā)炎反應(yīng)及異種移植時排斥作用之方法，其特征在于，其包括在異種移植時所用的動物器官表面上表達具有SEQ ID NO2氨基酸序列之蛋白質(zhì)。
47．一種分離核酸分子，其特征在于，其包含一至少15個核苷酸的區(qū)域而可與SEQ ID NO1或其互補鏈中至少一區(qū)域在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。
48．一種分離核酸分子，其特征在于，其包含可與SEQ ID NO1或其互補鏈中至少一區(qū)域在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交之序列，其中該區(qū)域系選自核苷酸1-174及320-492。
49．一種分離核酸分子，其特征在于，其包含一至少15個核苷酸的區(qū)域而可與SEQ ID NO4或其互補鏈中至少一區(qū)域在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。
50．一種分離核酸分子，其特征在于，其包含可與SEQ ID NO4或其互補鏈中至少一區(qū)域在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交之序列，其中該區(qū)域系選自核苷酸507-681及827-999。
51．如權(quán)利要求49所述的核酸分子，其特征在于，其編碼一蛋白質(zhì)的至少一部份。
52．如權(quán)利要求51所述的核酸分子，其特征在于，該蛋白質(zhì)具有如SEQ ID NO5所示之預(yù)測氨基酸序列。
53．一種分離核酸片段，其特征在于，其具有選自包括SEQ ID NO6，SEQ IDNO7，SEQ ID NO8及SEQ ID NO9之群組之核酸序列。
54．一種包含治療有效量之一蛋白質(zhì)之至少一部份之免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其中編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQ ID NO4或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交件下雜交。
55．一種在哺乳動物產(chǎn)生對抗肺炎鏈球菌的免疫反應(yīng)的方法，其特征在于，其包括將一組合物施用至哺乳動物的步驟以產(chǎn)生對抗該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，該組合物包括治療有效量之一蛋白質(zhì)的至少一部份，其中編碼該蛋白質(zhì)之核酸可與SEQID NO4或其互補鏈在高度嚴(yán)格之雜交條件下雜交。
56．一種免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，其包含治療有效量之如權(quán)利要求51所述的一蛋白質(zhì)之至少一部份以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該蛋白質(zhì)可有效地免疫接種或治療哺乳動物以對抗肺炎鏈球菌的感染或侵入繁殖。
57．如權(quán)利要求56所述的免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，該蛋白質(zhì)系以能夠?qū)τ谠摬溉閯游飩€體有效提供治療效果的份量予以供給。
58．如權(quán)利要求56所述的免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，該組合物為疫苗。
59．一種多肽，其特征在于，其具SEQ ID NO5。
60．如權(quán)利要求23所述的免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，該核酸序列或其互補鏈所編碼之蛋白質(zhì)可抑制至少一個內(nèi)源性肺炎鏈球菌核酸序列之轉(zhuǎn)錄或翻譯。
61．如權(quán)利要求56所述的免疫系統(tǒng)刺激性組合物，其特征在于，該核酸序列或其互補鏈所編碼之蛋白質(zhì)可抑制至少一個內(nèi)源性肺炎鏈球菌核酸序列之轉(zhuǎn)錄或翻譯。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定及使用肺炎鏈球菌所表達之一群人類補體C3降解性蛋白酶。該蛋白質(zhì)具有約15kD至約25kD之分子量。本發(fā)明較佳之蛋白酶包括SEQIDNO:2之氨基酸序列。
文檔編號C12N15/57GK1291233SQ98809460
公開日2001年4月11日 申請日期1998年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月24日
發(fā)明者馬格列特K·賀斯泰特, 大衛(wèi)J·芬科爾, 程希, 布魯斯A·葛林, 愛美W·馬西 申請人:美國明尼蘇達州大學(xué), 美國氰胺公司