專利名稱：來自肺炎鏈球菌的降解人類補(bǔ)體c3的蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，且特別的是本發(fā)明關(guān)于一種可降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)的鑒定。
背景技術(shù)：
本申請所請求的是于1997年8月24日申請且以“來自肺炎鏈球菌的降解人類補(bǔ)體C3的蛋白酶”為標(biāo)題的一臨時申請案(申請?zhí)?0/044,316)所請求者。
受到肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)的呼吸道感染造成每年估計有500,000個肺炎的案例及47,000個死亡案例。有細(xì)菌性肺炎感染的高危險性的那些人是兩歲以下的嬰孩及老人，在這些族群中，肺炎鏈球菌是為細(xì)菌性肺炎及腦膜炎的主要致病原因。此外，肺炎鏈球菌是所有年齡的兒童耳部感染的主要細(xì)菌性病因，在細(xì)菌形成菌落(colonization)、局部或全身性感染、或以純化的多糖類免疫接種之后，兒童及老人都有合成對抗肺炎球菌莢膜多糖類的保護(hù)性抗體的缺陷。肺炎鏈球菌是感染人體免疫不全病毒(HIV)的成人及兒童中侵入性的細(xì)菌性呼吸道疾病之主要病因，且會在這些患者中產(chǎn)生造血的感染(Connor等；.Current Topicsin AIDS1987；1185-209 and Janoff等Ann.Intern.Med.1992；1117(4)314-324)。
證實為嚴(yán)重感染的高危險性的個體無法產(chǎn)生對抗目前莢膜多糖類疫苗的抗體，因此，目前有四種結(jié)合性(conjugate)疫苗用于臨床試驗，結(jié)合性疫苗是由與蛋白質(zhì)載體或佐劑聯(lián)結(jié)的肺炎球菌的莢膜多糖所組成以嘗試追加抗體反應(yīng)。但是，仍有其他目前用于臨床試驗中結(jié)合性疫苗的潛在問題存在，例如，最廣泛存在于美國的肺炎球菌血清型與最常見于如以色列、西歐或斯堪的那為亞半島地方的血清型不同，因此，可有效用于一地理區(qū)域的疫苗并不一定有效用于其他地區(qū)，改良目前可得的莢膜多糖類疫苗或發(fā)展莢膜疫苗的蛋白質(zhì)結(jié)合物(conjugate)，以適合地理的血清型變化的潛在需求，造成過高的財務(wù)及技術(shù)復(fù)雜性。因而，尋找在全世界多種致命的血清型中有保守性(conserved)的免疫原、表面暴露的蛋白質(zhì)在預(yù)防肺炎球菌感染以及廣泛保護(hù)性的肺炎球菌疫苗上極為重要。此外，對盤尼西林(penicillin)及頭孢霉素(cephalosporin)具抵抗性的肺炎球菌在全球的出現(xiàn)造成對有效性疫苗的急切需求(Baquero等J.Antimicrob.Chemother.1991；28S；31-8)。
一些肺炎球菌蛋白質(zhì)已被提出與肺炎球菌莢膜多糖類結(jié)合或以單獨的免疫原來刺激對抗肺炎鏈球菌的免疫性，表面蛋白質(zhì)被報導(dǎo)為與肺炎鏈球菌對呼吸道上皮細(xì)胞的黏著性有關(guān)，包括PsaA，PspC/CBP 112，及IgAl蛋白酶(Sampson等Infect.Immun.1994；62319-324，Sheffield等Microb.Pathogen.1992；13261-9，以及Wani等Infect.Immun.1996；643967-3974)。對抗這些黏著素(adhesins)的抗體可抑制肺炎球菌結(jié)合至呼吸道上皮細(xì)胞，并因此降低其形成菌落。其他細(xì)胞溶解性肺炎球菌蛋白質(zhì)，例如肺炎溶解素(pneumolysin)，自溶素(autolysin)，神經(jīng)胺酸酶(neuraminidase)，或玻璃酸酶(hyaluronidase)，被提出作為疫苗抗原，因為于受到肺炎鏈球菌感染的患者中抗體可有效地阻斷這些蛋白質(zhì)的毒性效應(yīng)。然而，這些蛋白質(zhì)一般并非位于肺炎鏈球菌的表面上，而是當(dāng)細(xì)胞溶解且死亡時會由細(xì)菌分泌或釋放出來(Lee等Vaccine1994；12875-8以及Berry等Infect.Immun.1994；621101-1108)。雖然使用作為免疫原的這些細(xì)胞溶解性蛋白質(zhì)可改良肺炎鏈球菌感染的最后結(jié)果，但抗這些蛋白質(zhì)的抗體不會促進(jìn)肺炎球菌的死亡，也不能預(yù)防最初或后續(xù)的肺炎球菌形成菌落。
被測試為肺炎球菌疫苗的原型(prototypic)表面蛋白質(zhì)是為肺炎球菌的表面蛋白質(zhì)A(PspA)，PspA是一種約70至140kDa的異源性蛋白質(zhì)，PspA的結(jié)構(gòu)包括在安基端的(螺旋體，接著一富含脯氨酸的序列，以及在唆基端11個結(jié)合膽鹼的重復(fù)序列系列中止。雖然有許多關(guān)于PspA的結(jié)構(gòu)資料，但是PspA在多種肺炎球菌血清型中不具有結(jié)構(gòu)上的保守性(conserved)，且其作用完全為未知的(Yother等J.Bacteriol.1994；1762976-2985)。研究已確認(rèn)PspA于動物體中的免疫生成性(McDaniel等Microb.Pathogen.1994；17323-337)，即使PspA有免疫生成性，但是PspA的異質(zhì)性(heterogeniety)、其存在于四個結(jié)構(gòu)群(或clades)中、以及其未定特性的功能使得其作為疫苗抗原的能力復(fù)雜化。
在無法產(chǎn)生抗類型專一性的多糖類莢膜的保護(hù)性抗體的患者中，補(bǔ)體的第三個成分C3以及替代補(bǔ)體路徑的有關(guān)蛋白質(zhì)是構(gòu)成對抗肺炎鏈球菌感染的宿主防御第一線。因為補(bǔ)體蛋白質(zhì)不能穿透肺炎鏈球菌的堅固細(xì)胞壁，故在肺炎球菌表面上調(diào)理性(opsonic)C3b的沉積是為清除肺炎球菌的主要介導(dǎo)物(mediator)。已知肺炎球菌與血漿C3的相互作用發(fā)生在肺炎球菌菌血癥期間，當(dāng)C3b(即C3的調(diào)理性活性片段)共價結(jié)合時，會使巨噬細(xì)胞的辨識及攝入開始(Johnson等J.Exp.Med1969；1291275-1290，Hasin HE，J.Immunol.1972；10926-31以及Hostetter等J.Infect.Dis.1984；150653-61)，C3b會沉積于肺炎球菌的莢膜上以及細(xì)胞壁上，此種控制肺炎鏈球菌感染的方法相當(dāng)無效率，增強(qiáng)肺炎鏈球菌調(diào)理作用(opsonization)的方法可改善由此微生物所誘發(fā)的疾病過程，因此目前對限制肺炎鏈球菌感染的方法及療法存在有強(qiáng)烈的需求。
本發(fā)明關(guān)于鑒定及使用由肺炎鏈球菌表現(xiàn)的降解人類補(bǔ)體C3蛋白。此蛋白質(zhì)具有約24kDa至約34kDa的分子量，其是于10％SDS聚丙烯酰胺凝膠上所測定。本發(fā)明包括可由不同降解C3的肺炎鏈球菌菌株中分離出來的一些蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明關(guān)于一種包含至少與序列編號2(SEQ ID NO2)有80％序列相同性且可降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3的分離蛋白質(zhì)。在一較佳具體實施例中，此蛋白質(zhì)是由肺炎鏈球菌中分離出來，或者此蛋白質(zhì)為一種重組蛋白質(zhì)，較好的是此蛋白質(zhì)會與人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3結(jié)合。在一個較佳具體實施例中，此蛋白質(zhì)具有于10％SDS聚丙烯酰胺凝膠上所測定的約24kDa至約34kDa之分子量。本發(fā)明的一種較佳蛋白質(zhì)為包括序列編號2的分離蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也關(guān)于來自本發(fā)明降解C3蛋白酶的肽類，以及較佳的是來自含有與序列編號2至少80％相同性序列且能降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3的分離蛋白質(zhì)的至少15個連續(xù)氨基酸序列的骕類，且更佳是來自序列編號2的至少15個連續(xù)氨基酸序列的肽類。
根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)，為一種重組蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明關(guān)于來自序列編號2的至少15個連續(xù)氨基酸的肽類。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可包含序列編號2，且較佳具有于10％聚丙烯酰胺凝膠所測定的約24kDa至約34kDa間的分子量，另外較佳的是該蛋白質(zhì)可降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3。本發(fā)明的較佳蛋白質(zhì)或多肽類包括一種包含序列編號2的氨基酸1至50的蛋白質(zhì)以及一種包含

圖1A的核酸1246至1863的核酸片段。
在本發(fā)明另一方面，本發(fā)明關(guān)于一種降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3的蛋白質(zhì)，且其中編碼該蛋白質(zhì)的核酸可與序列編號1(SEQ ID NO1)雜交，此雜交條件是在6XSSC、5X Denhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且變性的鮭魚精子DNA于65℃下雜交隔夜且以2X SSC、0.1％ SDS在室溫下清洗一次約10分鐘，接著在65℃下清洗一次約15分鐘，再后續(xù)至少一次以0.2X SSC、0.1％ SDS于室溫下清洗至少3至5分鐘。
本發(fā)明也關(guān)于一種刺激免疫系統(tǒng)的組成物，其包含一有效量的刺激免疫系統(tǒng)的肽類或多肽類，此等肽類或多肽類包含與序列編號2至少80％相同性序列且能降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3的分離蛋白質(zhì)的至少15個連續(xù)氨基酸序列。
較佳的是，該蛋白質(zhì)可由肺炎鏈球菌中分離出來。在一個具體實施例中，刺激免疫系統(tǒng)的組成物進(jìn)一步包含至少一種其他刺激免疫系統(tǒng)的來自肺炎鏈球菌的肽類、多肽類或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)而關(guān)于一種可專一性與含有序列編號2至少80％相同性序列且能降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。在一個具體實施例中，該抗體是一種單株抗體，且在另一個具體實施例中，此抗體為一種多株抗體，在另外的具體實施例中，此抗體是一個抗體片段，此抗體或抗體片段可得自一老鼠、大鼠、人類或兔子中。
本發(fā)明也關(guān)于一種可與序列編號1雜交的核酸片段，此雜交條件是在6X SSC、5X Denhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且變性的鮭魚精子DNA于65℃下雜交隔夜且以2X SSC、0.1％SDS在室溫下清洗一次約10分鐘，接著在65℃下清洗一次約15分鐘，再后續(xù)至少一次以0.2XSSC、0.1％ SDS于室溫下清洗至少3至5分鐘。在一個具體實施例中，此核酸片段是由肺炎鏈球菌基因組中分離出來，且在另一個具體實施例中，此核酸片段編碼至少蛋白質(zhì)的一部分。在一個具體實施例中，此蛋白質(zhì)會降解人類補(bǔ)體C3，且在另一個具體實施例中，此核酸片段編碼一種不會降解人類補(bǔ)體C3的蛋白質(zhì)。
在另一具體實施例中，此核酸片段是在一種核酸載體上，且此載體可為一種能制造蛋白質(zhì)至少一部分的表現(xiàn)載體。包括該核酸片段的細(xì)胞也涵蓋于本發(fā)明中。在一個具體實施例中，此細(xì)胞是一細(xì)菌或真核細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于一種包含下列核酸序列的分離核酸片段gctccagtatgcgtactcgtaaggtagggaagaaaaaaactagctag在本發(fā)明的另一個具體實施例中，本發(fā)明關(guān)于一種在動物中對肺炎鏈球菌產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，其包括下列步驟施用一種包含一治療上有效量的蛋白質(zhì)至少一部分的組成物于動物體中，其中編碼該蛋白質(zhì)的核酸可與序列編號1雜交，此雜交條件是在6X SSC、5X Denhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且變性的鮭魚精子DNA于65℃下雜交隔夜且以2X SSC、0.1％ SDS在室溫下清洗一次約10分鐘，接著在65℃下清洗一次約15分鐘，再后續(xù)至少一次以0.2XSSC、0.1％ SDS于室溫下清洗至少3至5分鐘；以及得到對該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。在一個具體實施例中，此免疫反應(yīng)是B細(xì)胞反應(yīng)，且在另一具體實施例中，此免疫反應(yīng)是T細(xì)胞反應(yīng)。在一個較佳具體實施例中，此組成物是一種疫苗組成物，較佳的是此蛋白質(zhì)的至少一部分是至少15個氨基酸長，且較佳的是此組成物進(jìn)一步包含至少一種來自肺炎鏈球菌的其他蛋白質(zhì)。在一具體實施例中，此蛋白質(zhì)包含序列編號2的至少15個氨基酸。
在一另外的具體實施例中，本發(fā)明關(guān)于一種包含插入性突變(insertional mutation)的細(xì)菌，其中此插入性突變物是位于一個編碼可降解人類補(bǔ)體C3的蛋白質(zhì)的基因上。在一個具體實施例中，此細(xì)菌包含一插入性復(fù)制突變。
本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于一種來自肺炎鏈球菌的能與人類補(bǔ)體C3結(jié)合并降解的約24kDa至約34kDa的蛋白質(zhì)，以及關(guān)于一種抑制肺炎鏈球菌所介導(dǎo)的C3降解作用的方法，此方法包含步驟將肺炎鏈球菌與一抗體接觸，此抗體能與具有序列編號2至少80％氨基酸序列相同性的蛋白質(zhì)結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于一種包含序列編號1核酸序列的分離核酸片段，以及由包含序列編號1的雙股DNA序列所轉(zhuǎn)錄的RNA片段。
以下結(jié)合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體結(jié)構(gòu)特征及目的。
附圖簡述圖1A提供一種本發(fā)明降解C3蛋白酶的基因序列，且圖1B提供提供一種本發(fā)明降解C3蛋白酶的氨基酸序列。
圖2是一個根據(jù)本發(fā)明的插入性復(fù)制突變株的圖示。
圖3是一個來自本發(fā)明插入性復(fù)制突變株的插入物(insert)的限制酶分析圖示。
較佳具體實施例詳述本發(fā)明關(guān)于一種降解C3的蛋白酶的鑒定及分離，此蛋白酶具有于10％ SDS-PAGE凝膠上約29kDa(±5kDa)的分子量(基于序列編號1的約27.5kDa預(yù)測大小)，以及編碼降解C3的蛋白酶的核酸。此蛋白質(zhì)起初是以在浸泡C3的SDS-PAGE凝膠上的肺炎球菌溶解物(lysates)電泳而鑒別出來。已發(fā)現(xiàn)來自一些血清型的肺炎球菌的呈指數(shù)生長的培養(yǎng)物能夠首先降解C3的β鏈且接著降解C3的α鏈而不會產(chǎn)生一定的C3裂解片段(Angel等J.Infect.Dis.170600-608，1994)，此種不會裂解的降解模式實質(zhì)上與其他微生物產(chǎn)物不同，例如綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的彈性蛋白酶及溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)的半胱氨酸蛋白酶。根據(jù)本發(fā)明的編碼降解C3蛋白質(zhì)的基因序列(序列編號1)提供于圖1A中，且該蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列編號2)提供于圖1B中。
在此使用的″降解″一詞是指能夠裂解蛋白質(zhì)為氨基酸、肽類及/或多肽類片段的酵素。如在一聚丙烯酰胺凝膠上所觀察，本發(fā)明的蛋白質(zhì)會降解C3而不會產(chǎn)生特定的裂解片段。
約29kDa的降解C3的蛋白酶是由插入性阻斷的肺炎球菌基因庫(library)中分離出來，其是由鑒定與野生型肺炎鏈球菌相較有增加降解C3活性的轉(zhuǎn)殖株(clone)。對于C3而言，至少較佳的是本發(fā)明降解C3的蛋白酶，舉例而言，降解C3的蛋白酶不會大量降解其他的蛋白質(zhì)(例如白蛋白)。進(jìn)行插入性復(fù)制突變以及鑒定具有提高降解C3活性的轉(zhuǎn)殖株的代表行方法提供于實例1中。
編碼降解C3蛋白酶的基因是包含在一個包括四個開放譯讀框架(openreadingframe)的區(qū)域中，且其第三個開放譯讀框架受到同源性重組作用阻斷而嚴(yán)重?fù)p害C3的降解作用。ORF3包括約726個核苷酸，且轉(zhuǎn)譯的蛋白質(zhì)序列不具有與GenBank或SwissProt資料庫中登錄蛋白質(zhì)的基本同質(zhì)性。
使編碼本發(fā)明降解C3的蛋白酶的基因全長插入于一種基因表現(xiàn)載體中以于大腸桿菌中表現(xiàn)。降解C3的重組蛋白酶是以敘述于實例中的方式被分離出來，一般熟悉此技術(shù)人士可了解到，若一特定的基因序列已知，例如提供于圖1者，有許多表現(xiàn)載體可用于表現(xiàn)該基因。此外，有許多此技術(shù)上已知的方法可用于制造及分離本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)，且除了那些提供于實例中的表現(xiàn)系統(tǒng)以外，熟悉此類技術(shù)的人員將可決定一特定表現(xiàn)系統(tǒng)是否有功用，而不需要過度的實驗。許多不同的分子及免疫技術(shù)可見于基礎(chǔ)技術(shù)教科書中，例如Sambrook等人(Molecular Cloning，ALaboratoryManual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY)以及Harlow等人(AntibodiesALaboratory Manual.Cold Spring Harbor，NY；ColdSpringHarbor Laboratory Press，1988)所著。
編碼本發(fā)明降解C3蛋白酶的基因是使用以得自CP 1200株的肺炎球菌基因組DNA片段所得到的質(zhì)體庫(library)而鑒定。雖然有許多不同方法已知用于得到一質(zhì)體庫，但以一較佳的策略，一質(zhì)體庫的建構(gòu)是以來自肺炎球菌株CP 1200(得自D.A.Morrison，University oflllinois，Champagne-Urbana，Illinois，且敘述于Harvarstein LF，et al.Proc.Natl.Acad.Sci(USA)1995，9211140-11144)的Sau 3A所切割的肺炎球菌基因組DNA片段(0.5至4.0kb)，且插入整合的往返載體(shuttle vector)pVA 891(ermr，cmr；具有大腸桿菌的復(fù)制起點)的Bam HI位置中。此質(zhì)體庫由電擊穿透法(electroporation)被轉(zhuǎn)形至大腸桿菌DHL(MCR株，由電擊穿透法(electroporation)總共得到14000個大腸桿菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞，一些隨機(jī)選擇的大腸桿菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞的質(zhì)體提取物顯示所有轉(zhuǎn)形細(xì)胞皆含有重組質(zhì)體。
質(zhì)體庫(library)DNA是由大腸桿菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞中提取，且用于以插入性突變同源性重組使CP 1200親代肺炎球菌株轉(zhuǎn)形。
肺炎球菌株CP 1200細(xì)胞是于CTM培養(yǎng)基中以HCl步驟使pH值改變而成為可勝任的(competent)，此勝任細(xì)胞是以小分量儲存于-70℃下直到需要時，八千個肺炎球菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞以這些方法制造。
各肺炎球菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞是以ELISA基于其等降解C3能力的改變表現(xiàn)型特性來篩選。細(xì)菌培養(yǎng)物是以C3(每毫升培養(yǎng)物0.83微克C3)來培養(yǎng)約2小時至約4小時，且存留于樣品中未降解的C3量是以使用對人類補(bǔ)體C3具專一性的結(jié)合HRP羊多株抗體的酵素結(jié)合免疫吸附分析(ELISA)來偵測。使此分析標(biāo)準(zhǔn)化以使包含未降解C3的凹槽(well)具有O.D.490＝～1.0，包含降解C3的凹槽由于結(jié)合抗-C3抗體的能力降低而具有降低的光學(xué)密度，突變株及親代株的光學(xué)密度是與負(fù)對照組相比較，負(fù)對照組是含有不同濃度C3的培養(yǎng)基，降解C3活性的百分率是以樣品相對于對照組的光學(xué)密度的比率而定。相較于由親代株CP1200而來的約29kDa降解C3蛋白質(zhì)的活性，四個突變株(SN3，SN4，SN5及SN6)被鑒定具有提高的降解C3活性(約2至2.2倍較高的活性)。此發(fā)現(xiàn)是由西方印漬分析(Western BlotAnalysis)而獲得確認(rèn)。
由突變株SN3，SN4，SN5及SN6而來的全部DNA被分離且用于電擊穿透法送入大腸桿菌DH5(MCR中，肺炎球菌基因組(genome)內(nèi)來自完整質(zhì)體的質(zhì)體DNA的低剪切率(excision rate)可產(chǎn)生少量的游離質(zhì)體DNA，且在當(dāng)此DNA轉(zhuǎn)形入大腸桿菌時此DNA可被回復(fù)，此使得可進(jìn)一步定出該質(zhì)體的特徵，將該質(zhì)體再次轉(zhuǎn)形入肺炎球菌中證明原始突變株的表現(xiàn)型。
來自原本的降解C3蛋白質(zhì)以及來自突變物SN3，SN4，SN5及SN6的蛋白質(zhì)樣品是以C3培養(yǎng)且在還原條件下于7.5％SDS-PAGE凝膠上被分離。降解C3的活性是使用抗C3的結(jié)合HRP抗體以西方印漬分析來評定，突變株SN4及突變株SN4-4G用于進(jìn)一步的實驗中。突變株SN4-4G是在使自SN4中得到的重組質(zhì)體pLSN4a轉(zhuǎn)形至CP1200后而鑒定。突變株SN4及突變株SN4-4G均在培養(yǎng)4小時后幾乎完全降解C3，雖然原始的降解C3的蛋白質(zhì)在經(jīng)過4小時培養(yǎng)之后降解C3，但是與以突變株SN4及突變株SN4-4G相同培養(yǎng)下相較，其C3降解作用是不完全的。
編碼來自突變株SN4蛋白質(zhì)的質(zhì)體被選擇用于進(jìn)一步的研究。質(zhì)體pLSN4a(編碼突變株SN4)用于再轉(zhuǎn)形入野生型CP 1200株中，此得到48個具有提高降解C3活性的肺炎球菌突變株，以限制內(nèi)核酸酶Hind III切割證實質(zhì)體pLSN4a是約～7.8kb且包含一個約～2.3kb的插入物。
質(zhì)體pLSN4a是作為南方雜交實驗(southern hybridizationexperiment)中的雜交探針，以證明來自肺炎球菌突變物的染色體DNA樣品中插入物的存在。此結(jié)果確認(rèn)具有突變物SN3及SN4中插入物(pLSN4a)和插入物起點的載體被并入染色體DNA中。突變株SN3及突變株SN4均由兩個約～2.2kb及約～5.8kb大小的雜交連接片段所組成，這些片段也存在于它們的親代株CP1200中，另外有兩個約～4.2kb及約～3.5kb大小的雜交片段且這兩個片段總共為約～7.8kb(pLSN4a為～7.8kb)，這兩個條帶(band)也存在于具有插入樣品的載體中，插入物及載體兩者均包含EcoRI位置且代表重組質(zhì)體。此分析顯示基因復(fù)制是發(fā)生在SN4突變株中；因此，增進(jìn)的C3降解活性可歸因于SN4突變物中增加的降解C3蛋白質(zhì)。
2338bp插入物的約1kb的序列是使用整個pLSN4a質(zhì)體作為模板(template)而測得，以插入物(PCR產(chǎn)物)作為模板的剩下序列(約～1338kb)是以ICBR(佛羅里達(dá)大學(xué))來定序，兩個互補(bǔ)股被定序。此結(jié)果顯示有相對位置的四個開放譯讀框架是提供于下列構(gòu)圖中
ORF1 ORF2 ORF3
(462bp) 144bp)(726bp)ORF4(358bp)5’___________________________________________________________________3”3’___________________________________________________________________5”在上述ORFs衍生的氨基酸序列及來自測試蛋白質(zhì)資料庫的蛋白質(zhì)序列之間沒有顯著的同質(zhì)性，編碼本發(fā)明降解C3蛋白酶的ORF3核酸序列提供于圖1A中且稱為序列編號1(SEQ ID NO1)，此降解C3蛋白酶的氨基酸序列提供于圖1B中且稱為序列編號2(SEQ ID NO2)。
在插入物中四個開放譯讀框架(三個完整且一個部分)中，因為ORF3包含最大的插入物，故ORF3被選來進(jìn)一步檢測。ORF3(PCR產(chǎn)物)區(qū)域的一個620bp內(nèi)部分(圖1A中由核酸1246至核酸1863)被接合(ligated)至質(zhì)體pVA891的Hind III位置，且此構(gòu)筑體(construct)轉(zhuǎn)形至CP 1200勝任細(xì)胞中以將蛋白酶活性去除。在使用西方印漬分析于SDS-PAGE上分離之后，測試轉(zhuǎn)形細(xì)胞降解C3的能力，與其親代株CP 1200相較，ORF3被破壞的突變株具有低活性。
ORF3基因(PCR產(chǎn)物)整個被轉(zhuǎn)殖入pet-28b(+)的Nde I及BamH I位置中，載體在蛋白質(zhì)N-端的位置有組氨酸標(biāo)記(His-Tag)。在該質(zhì)體構(gòu)筑體被轉(zhuǎn)形入大腸桿菌(BL21 DE3)蛋白質(zhì)缺失株中以使蛋白質(zhì)表現(xiàn)之前，其被轉(zhuǎn)形至大腸桿菌(DHLαMCR)株以使其穩(wěn)定。
包含此構(gòu)筑體(具有ORF3的pet 28b(+))的BL 21 DE3株被誘導(dǎo)以使ORF3蛋白質(zhì)表現(xiàn)，測試被誘導(dǎo)及未被誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的總細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物的降解C3活性。來自不可溶蛋白質(zhì)部分的被誘導(dǎo)樣品中，于10％SDS-PAGE凝膠上表現(xiàn)的有His標(biāo)記(His-tagged)的ORF3蛋白質(zhì)為約～29ka(±5kDa)。
使來自誘導(dǎo)的BL21 DE3培養(yǎng)物的ORF3蛋白質(zhì)溶解化，是通過將樣品以下列方式處理而進(jìn)行a)TES(50mM，1mM，1M)；b)6mM G-HCl+1mM DTT；c)6mMG-HCl+1mM DTT+1％Tween 20；以及d)6mM G-HCl+1mMDTT+1％TritonX-100?！錭″處理是用來制造溶解化的重組降解C3蛋白質(zhì)，以用于進(jìn)一步的蛋白質(zhì)研究中。
鳥嘌呤-HCl及DTT是由表現(xiàn)的有His標(biāo)記(His-Tagged)的ORF3蛋白質(zhì)樣品中以透析法(dialysis)去除。將該蛋白質(zhì)進(jìn)行尼克氏管柱純化(Nickel column)，且洗提出來的有His標(biāo)記(His-Tagged)蛋白質(zhì)可見于10％ SDS-PAGE凝膠上。
由ORF3所編碼的分離蛋白質(zhì)在PBS存在下于37℃以人類補(bǔ)體C3培養(yǎng)4小時。不含蛋白質(zhì)樣品的對照組樣品作為負(fù)對照組以用于比較目的上，這些樣品在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE，并以西方印漬分析使用抗人類補(bǔ)體C3的多株抗體分析C3的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示樣品包括一種由ORF3區(qū)域所編碼的蛋白質(zhì)且此蛋白質(zhì)會降解人類C3蛋白質(zhì)，C3分子的α及β鏈均受到降解。在這些實驗中，當(dāng)α鏈完全被降解時，β鏈也會被降解，但至一較小的程度。
本發(fā)明降解C3的蛋白質(zhì)稱為CppA蛋白酶，且本發(fā)明的基因稱為cppA。本發(fā)明的蛋白質(zhì)于10％ SDS-聚丙烯酰胺凝膠上具有一明顯分子量約29kDa(±5kD)，且最佳具有一分子量約24kDa至約34kDa。如上所述，實例5顯示該蛋白酶在肺炎鏈球菌中具有保守性(conserved)，但是，一般熟悉該技術(shù)的人員將了解到氨基酸上的一些變化是可預(yù)期的，且此變化性并不應(yīng)減少本發(fā)明的范圍。舉例而言，保守性突變(conserved mutations)不會減少本發(fā)明的范圍，氨基酸序列相同性的變化也不會小于約80％氨基酸序列相同性且較佳約90％氨基酸序列相同性，其中此蛋白質(zhì)可降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3，且特別是其中此蛋白質(zhì)是由肺炎鏈球菌中分離出來或原先得到的。
因為有一些氨基酸的變化性，一些核酸序列的變化性被預(yù)期存于菌株間。保守性氨基酸取代在此技術(shù)中為已知的，且其包括例如使用來自與此氨基酸所屬相同族的其他成員的氨基酸取代。舉例而言，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸(alanine)、白氨酸(leucine)、異白氨酸、纈氨酸(valine)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、色氨酸(tryptophan)以及酪氨酸(tyrosine)，極性的中性氨基酸包括甘氨酸(glycine)、絲氨酸(serine)、蘇氨酸(threonine)、半胱氨酸(cysteine)、酪氨酸、天冬酰胺(asparagine)以及谷酰氨酸(glutamine)，帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸(arginine)、離氨酸(lysine)以及組織氨酸(histidine)，帶負(fù)電荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸(asparticacid)以及谷氨酸(glutamic acid)。這種改變不預(yù)期會影響以聚丙烯酰胺凝膠電泳或等電點所測定的明顯分子量。特別較佳的保守性取代(conservative substitution)包括但非限于以Lys取代Arg及相反以保持一正電荷；以Glu取代Asp及相反以保持一負(fù)電荷；以Ser取代Thr以保持一游離的-OH；以及以Gln取代Asn以保持一游離的NH2。本發(fā)明的一個較佳蛋白質(zhì)包括具有序列編號2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其他蛋白質(zhì)包括那些降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3且具有編碼在雜交條件下與序列編號1雜交的蛋白質(zhì)的核酸序列的蛋白質(zhì)，此雜交條件是在6X SSC、5X Denhardt、0.5％SDS以及100微克/毫升片段化且變性的鮭魚精子DNA于65℃下雜交隔夜，且以2XSSC、0.1％ SDS在室溫下清洗一次約10分鐘，接著在65℃下清洗一次約15分鐘，再后續(xù)至少一次以0.2X SSC、0.1％SDS于室溫下清洗至少3至5分鐘進(jìn)行，且也涵蓋于本發(fā)明中。該蛋白質(zhì)的多肽類或肽類片段也可使用，且本發(fā)明的一較佳蛋白質(zhì)包含序列編號2的氨基酸1至50。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可分離或制備為重組蛋白質(zhì)，也就是說，編碼此蛋白質(zhì)的核酸或此蛋白質(zhì)部分的核酸可插入一表現(xiàn)載體中或插入一細(xì)胞的染色體中，以于細(xì)胞中表現(xiàn)此蛋白質(zhì)。此蛋白質(zhì)可由一細(xì)菌或其他細(xì)胞中純化出來，較佳由一真核細(xì)胞以及更佳由一動物細(xì)胞中純化，或者，此蛋白質(zhì)可由表現(xiàn)此蛋白質(zhì)的細(xì)胞(例如肺炎鏈球菌細(xì)胞)中分離出來。CppA蛋白酶的肽類也被包含于本發(fā)明中，該肽類較佳為至少15個氨基酸長，且較佳的肽類為具有來自序列編號2的至少15個氨基酸的肽類，另外較佳的蛋白質(zhì)片段包括序列編號2的氨基酸1至50。
編碼Cpp蛋白酶的核酸也是本發(fā)明的一部分。序列編號1是編碼CppA蛋白酶的較佳核酸片段，一般熟悉該技術(shù)的人員將了解一些取代作用不會使CppA蛋白酶序列改變至CppA蛋白酶特性或本質(zhì)有實質(zhì)上改變的程度。舉例而言，具有與序列編號1至少80％相同性的核酸也涵蓋于本發(fā)明中。一種決定一特定核酸序列是否于本發(fā)明范圍中的方法，是在于考慮是否有一特定核酸序列編碼降解C3的蛋白酶及具有與序列編號1相較有至少80％的核酸相同性。其他編碼CppA蛋白酶的核酸序列包括其中CppA有與序列編號2相同的序列或至少90％序列相同性的編碼CppA的核酸，但其包括相關(guān)于核酸序列的簡并性(degeneracy)。一個簡并的密碼子是表示有不同的三個字母的密碼子用于界定相同的氨基酸，舉例而言，此技術(shù)中已知下列RNA密碼子(及因此相對的DNA密碼子，其中一個T取代U)可互換以用于編碼每一個特定的氨基酸
苯丙氨酸 (Phe或F) UUU或UUC白氨酸 (Leu或L) UUA，UUG，CUU，CUC，CUA或CUG異白氨酸 (Ile或I) AUU，AUC或AUA甲硫氨酸 (Met或M) AUG纈氨酸 (Val或V) GUU，GUC，GUA，GUG絲氨酸 (Ser或S) UCU，UCC，UCA，UCG，AGU，AGC脯氨酸 (Pro或P) CCU，CCC，CCA，CCG蘇氨酸 (Thr或T) ACU，ACC，ACA，ACG丙氨酸 (Ala或A) GCU，GCG，GCA，GCC酪氨酸 (Tyr或Y) UAU或UAC組織氨酸 (His或H) CAU或CAC谷酰氨酸 (Gln或Q) CAA或CAG天冬酰胺 (Asn或N) AAU或AAC離氨酸 (Lys或K) AAA或AAG天冬氨酸 (Asp或D) GAU或GAC谷氨酸 (Glu或E) GAA或GAG半胱氨酸 (Cys或C) UGU或UGC精氨酸 (Arg或R) CGU，CGC，CGA，CGG，AGA，AGC甘氨酸 (Gly或G) GGU或GGC或GGA或GGG終止密碼子 UAA，UAG或UGA此外，一特定的DNA序列可被修飾以使用較佳的密碼子于一特定的細(xì)胞類型上，例如，用于大腸桿菌較佳的密碼子為已知的，因為其為動物及人類較佳的密碼子。這些改變對于一般熟知此技術(shù)人士而言為已知的，且因此這些基因序列被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。其他核酸序列包括來自序列編號1的至少30個核酸長的核酸片段，或是其他至少30個核酸長的核酸片段，其中這些片段在雜交條件下與序列編號1雜交，此雜交條件是在6X SSC、5X Denhardt、0.5％SDS以及100微克/毫升片段化且變性的鮭魚精子DNA于65℃下雜交隔夜，且以2X SSC、0.1％ SDS在室溫下清洗一次約10分鐘，接著在65℃下清洗一次約15分鐘，再后續(xù)至少一次以0.2XSSC、0.1％ SDS于室溫下清洗至少3至5分鐘。
本發(fā)明的核酸片段可編碼所有、無(如不能轉(zhuǎn)錄的片段、包含基因調(diào)節(jié)部分的片段、或類似物)或序列編號2的部分，以及較佳包括一個編碼來自序列編號2的至少九個氨基酸的連續(xù)核酸片段。由于編碼CppA蛋白酶一部分的核酸片段包含于本發(fā)明中，所以將了解的是并非所有的核酸片段會編碼一具有降解C3蛋白酶的蛋白質(zhì)、多肽類或肽類。此外，本發(fā)明的核酸可突變而使此蛋白質(zhì)降解C3的活性去除或者失活，因此，上述符合雜交需求的不具有降解C3活性的片段也涵蓋于本發(fā)明中。使核酸序列突變或者改變的方法于此技術(shù)中已被詳細(xì)敘述，且可測試制造一免疫原性(immunogenic)但酵素活性失去的蛋白質(zhì)的治療效用，較佳的核酸片段包括gct ccc agtatg(權(quán)利要求34)。
本發(fā)明的核酸片段可被插入核酸載體中或穩(wěn)定插入宿主基因組中以制造重組蛋白質(zhì)，包括重組混雜性(chimeric)蛋白質(zhì)。許多的核酸載體于此技術(shù)中為已知的，且包括一些商業(yè)上可獲得的表現(xiàn)質(zhì)體或病毒載體。這些載體的使用是在一般此技術(shù)所熟知的范圍內(nèi)，代表性載體被使用于實施例中，但是不應(yīng)認(rèn)為在限制本發(fā)明范圍。
本發(fā)明也關(guān)于可專一性與來自肺炎鏈球菌約29kDa、且較佳為約24kDa至約34kDa的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，且其中該蛋白質(zhì)可較佳地降解人類補(bǔ)體C3。多株抗體可制備為該蛋白質(zhì)一部分或該蛋白質(zhì)全部。類似地，單株抗體可制備為本發(fā)明降解C3約29kDa蛋白質(zhì)的全部或骕類片段。制備抗蛋白質(zhì)的抗體的方法是已知且已被詳細(xì)敘述的，舉例而言，如Harlow等(supra)所述。在一個較佳實施例中，抗體可源自于人類、大鼠、老鼠或兔子，結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體片段及混雜性片段是已知的且在本發(fā)明的范疇中。
本發(fā)明也關(guān)于刺激免疫的組成物的用途?！宕碳っ庖摺寤颉宕碳っ庖呦到y(tǒng)″一詞是指根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽類組成物會活化至少一種細(xì)胞類型的免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)的較佳活化細(xì)胞包括吞噬細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞、以及T細(xì)胞及B細(xì)胞。包含本發(fā)明肽類、多肽類或蛋白質(zhì)的刺激免疫組成物可用于在動物中制造抗體，例如大鼠、老鼠、兔子、人類或動物模型，以研究肺炎鏈球菌的感染。較佳的刺激免疫組成物包括一刺激免疫量的至少一種包含來自CppA蛋白酶至少15個氨基酸的酶類，刺激免疫組成物進(jìn)一步包括于一醫(yī)藥上可接受的緩沖液中的其他蛋白質(zhì)，例如PBS或此技術(shù)中認(rèn)知的另一種緩沖液，適合及安全用于將蛋白質(zhì)導(dǎo)入一宿主以刺激免疫系統(tǒng)。這種刺激免疫的組成物也可包括其他刺激免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，例如佐劑或來自肺炎鏈球菌或其他生物的刺激免疫的蛋白質(zhì)或肽類片段，舉例而言，肽類片段的混合物(cocktail)可最有效用于控制肺炎鏈球菌感染。較佳的是，本發(fā)明蛋白質(zhì)的一個或更多個片段被用于疫苗制劑中，以保護(hù)免于或限制肺炎鏈球菌形成菌落(colonization)或肺炎鏈球菌形成菌落的致病結(jié)果。
本發(fā)明也關(guān)于一種抑制肺炎鏈球菌所介導(dǎo)的C3降解作用的方法，其包括使肺炎鏈球菌與一蛋白質(zhì)接觸，該蛋白質(zhì)例如可與來自肺炎鏈球菌的約24kDa至約34kDa分離蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體或其他蛋白質(zhì)，可與約24kDa至約34kDa分離蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)可為一種抗體或其片段，或者該蛋白質(zhì)可為一種包含來自抗體的抗體結(jié)合區(qū)域(例如可變區(qū)域)的混雜性蛋白質(zhì)，該抗體可專一性確認(rèn)來自肺炎鏈球菌且具有降解C3活性的約24kDa至約34kDa分離蛋白質(zhì)。
本發(fā)明分離的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)可被分離及純化，且分離的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段可用于制造抗體?？蓽y試不具降解C3活性的此蛋白質(zhì)肽類片段或多肽片段對限制肺炎鏈球菌感染影響的能力。類似地，可改良本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如經(jīng)由突變來中斷或使蛋白質(zhì)降解C3的能力失活。分離的蛋白質(zhì)可用于分析中以偵測抗肺炎鏈球菌的抗體，或作為用于肺炎鏈球菌療法的疫苗一部分或是含有多價或多蛋白質(zhì)或肽類的疫苗。
進(jìn)一步考慮的是，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可表現(xiàn)于脊椎動物細(xì)胞表面上且用于降解C3，舉例而言，其中補(bǔ)體沉積(或活化)成為一問題，例如于異種器官移植(xenotransplantation)或補(bǔ)體所介導(dǎo)的血管球性腎炎(glomerulonephritis)。舉例而言，重組的蛋白質(zhì)或其部分可并入異種移植細(xì)胞中且以一表面蛋白質(zhì)表現(xiàn)，或作為一分泌蛋白質(zhì)以預(yù)防或使補(bǔ)體沉積減至最少(及/或補(bǔ)體介導(dǎo)的發(fā)炎反應(yīng))。
實例1產(chǎn)生插入性復(fù)制突變株及由選擇的突變株中回復(fù)重組質(zhì)體在一個較佳實施例中，是利用插入性復(fù)制突變來分離編碼本發(fā)明的來自肺炎鏈球菌降解C3蛋白酶的基因。一質(zhì)體庫是以最初得自伊利諾大學(xué)芝加哥分校的莫里森博士(Dr.Morrison)實驗室的肺炎球菌株CPl200(RXl的衍生物；Morrison，D.A.等J.Bacteriol.，156281-290，1983)的0.5至4.0kb染色體片段而構(gòu)成，且插入往返載體(shuttle vector)pVA891的BamHI位點(erm′，cm′，Marcina，F(xiàn).L.等Gene 25145-150，1983，得自Virginia Commonwealth University，Richmond，VA的馬西那博士(Dr.Marcina))。pVA891具有紅霉素(erm)及氯霉素(cm)抗性標(biāo)記，此載體具有大腸桿菌的復(fù)制起始點(origin of replication)，但該起始點在鏈球菌中為非復(fù)制性的。當(dāng)重組質(zhì)體經(jīng)由同源性重組作用而并入肺炎球菌染色體DNA內(nèi)時其可存活。
大腸桿菌DH5(MCR勝任細(xì)胞是根據(jù)Bio-Rad Laboratories manual(Richmond，CA)所提供的程序制得，且以Bio-Rad Gene Pulser裝置(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)將DNA庫轉(zhuǎn)形入勝任細(xì)胞中。
大腸桿菌細(xì)胞是于有10％甘油存在下的LB培養(yǎng)基中，以小量冷凍儲存物在-80℃保存，細(xì)胞生長于含有適當(dāng)抗體(紅霉素200微克/毫升或氯霉素15或30微克/毫升或卡那霉素(kanamycin)30微克/毫升)的LB或TB培養(yǎng)液(broth)中或在LB瓊脂培養(yǎng)基上。
電擊穿透法(electroporation)是在1至2kV/cm電壓及200(電流容量下于0.1公分的小管(cuvette)中進(jìn)行。轉(zhuǎn)形細(xì)胞是在含有氯霉素(cm，30微克/毫升)或紅霉素(erm，300微克/毫升)或erm及cm的結(jié)合(200微克/毫升+15微克/毫升)的LB培養(yǎng)基上篩選。
由該資料庫(library)中得到總共14000個大腸桿菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞，隨機(jī)篩選的大腸桿菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞的質(zhì)體抽取及限制酶分析顯示重組質(zhì)體的存在。
以聚乙二醇沉淀程序(Kreig，P.及Melton.D.，in Promega Protocol and Applicationsp.106，1985-86)或改良的堿性溶解少量制備步驟(Xiang，C.等，Biotechniques.1730-32，1994)或改良的堿性抽取程序(Bimboimm H C及J.Doly.，Nucl.Acids Res.71513-1523，1979)或CsCl-溴化乙錠(ethidium bormide)梯度方法或Qiagen套組(Kit)(Plasmidmidikit，Chartsworth，CA)由大腸桿菌株中抽取質(zhì)體或重組質(zhì)體。含有DNA的溶液是直接以GeneClean II套組(BIO 101，La Jolla，CA)或Qiagen套組(由凝膠中抽取DNA，Chartsorth，CA)由瓊脂凝膠(agarose gel)中清潔。DNA是以Wizard DNA清潔套組(Promega Corp.，Madison，WI)，放大的基因產(chǎn)物也以Wizard PCR清潔套組(PromegaCorp.，Madison，WI)來清潔。
此等質(zhì)體轉(zhuǎn)形至肺炎球菌細(xì)胞中，肺炎球菌株一直于10％甘油存在下的THB中以小量冷凍儲存物在-80℃保存，肺炎球菌細(xì)胞在CAT培養(yǎng)基(Morrison，D.A.，etal.，1983，supra)或THB培養(yǎng)基(培養(yǎng)液或瓊脂)中生長而不須搖瓶。在轉(zhuǎn)形實驗上，使用完整轉(zhuǎn)形(CTM)培養(yǎng)液(Morrison，D.A.等，1983)或THB+0.5％酵母菌培養(yǎng)液(Yeastbroth)(Yother Janet.等J.Bacteriol.1681463-1465，1986)，及在ELISA實驗上，使用SMP，即一種合成培養(yǎng)基(參見表1)。使用紅霉素(0.05微克/毫升)作為肺炎球菌突變株的選擇性抗生素。
表1.SMP-合成培養(yǎng)基SMP溶液#1(最終體積2公升)NaCl 10.0克；NH4Cl 4.0克；KCl 0.8克；Na2HPO4 0.24克；MgSO4 0.048克；CaCl2 0.020克；FeSO4.7H2O 0.0001克；Tribase 9.68克；加入蒸餾水至1公升，pH值為7.55，且接著加入下列氨基酸L-精氨酸400毫克；L-天冬氨酸20毫克(單水合物22.8毫克)；甘氨酸240毫克；L-組織氨酸300毫克；L-異白氨酸13.10毫克；L-白氨酸13.10毫克；L-離氨酸840毫克；L-甲硫氨酸360毫克；(低甲硫氨酸2.6毫克)；L-纈氨酸11.70毫克；尿嘧啶2毫克，使得最后體積2毫升。
SMP溶液2(維生素)生物素(biotin)0.075毫克；膽堿(choline)25毫克；尼古丁酰胺(nicotinamide)3.0毫克；泛酸鹽(pantothenate)12.0毫克；釘哆醛(pyridoxal)HCl 3.0毫克；核黃素(riboflavin)1.5毫克；維生素B1(thiamine)3.0毫克；L-半胱氨酸HCl 0.5克；L-谷酰氨酸0.1克；乙酰甲酸鈉(Na pyruvate)4.0克；加入水且接著達(dá)到50毫升。
再組成SMP開始以 毫升溶液#1 100加入溶液#2 1溶液#3(25％葡萄糖) 1.6溶液#4(4％BSA) 2肺炎球菌株CP 1200細(xì)胞以″以pH變化的勝任性誘導(dǎo)(competence induction)″(得自Dr.Morrison的實驗室，伊利諾州伊利諾大學(xué)芝加哥分校)于CTM培養(yǎng)基中成為勝任的，且勝任細(xì)胞是以小量冷凍于-70℃，直到需要時。在此程序中，加入1.20毫升的1M HCl(最終濃度9mM)及4毫升的0.2 O.D.(550nm)的冷凍肺炎球菌儲存細(xì)胞于125毫升的CTM中。培養(yǎng)物是在37℃培養(yǎng)且培養(yǎng)物的O.D.數(shù)值是在培養(yǎng)3小時后開始的20分鐘間隔讀取，當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到O.D.值0.156(550nm)時，1.2毫升的1NNaOH在37℃加入。在溫和混合培養(yǎng)物之后，1毫升的培養(yǎng)物是以″0″時間點樣品被移開、以100微升的甘油混合且保留在預(yù)冷卻的金屬塊(block)上。相似地，10毫升樣品是在每13、17、21及25分鐘的時間點取出且每一個樣品直接加入預(yù)冷卻的1毫升甘油中，每一時間點的樣品是以小量于-70℃冷凍。每一時間點的樣品的相容性測試是通過加入1微克的DNA(約250毫微克)至100微升的細(xì)胞且培養(yǎng)于37℃ 25分鐘以轉(zhuǎn)形而進(jìn)行。轉(zhuǎn)形培養(yǎng)物被稀釋且使其在選擇性培養(yǎng)基(紅霉素0.05微克/毫升)上生長，使用顯示最高轉(zhuǎn)形功效的時間點樣品未來的轉(zhuǎn)形實驗。由大腸桿菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞抽取出來的重組質(zhì)體資料庫(library)被轉(zhuǎn)形至肺炎球菌株CP1200中得到約8,000個肺炎球菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞，顯示此質(zhì)體經(jīng)由同源性重組作用而插入CP 1200染色體中。
肺炎球菌染色體DNA的抽取是以伊利諾大學(xué)芝加哥分校的Dr.Donald A.Morrison實驗室所使用的方法稍微改良而進(jìn)行。肺炎球菌細(xì)胞生長于THB中使在550nm的O.D.值達(dá)到0.3至0.4間，接著快速冷卻于冰上且加入0.5M EDTA至最后濃度為10mM，使細(xì)胞在4℃以10,000g旋轉(zhuǎn)10分鐘，且片狀物(pellets)在1∶10體積的冷STE(50mM Tri-HCl(pH 8.0)，10mMEDTA(pH8.0)及0.1M NaCl)中再懸浮，在第二次離心之后，細(xì)胞在1/100體積的冷STE中再懸浮，以1％TritonX-100溶解，且在37℃培養(yǎng)5至10分鐘以自我分解(autolysis)。在加入1％ SDS之后，細(xì)胞在50至60℃的水浴中旋轉(zhuǎn)5分鐘。RNase(100微克/毫升)及蛋白酶K(50微克/毫升)分別培養(yǎng)2小時及1小時連續(xù)加入。細(xì)胞以一個體積的酚/氯仿抽取兩次，且以一個體積的氯仿抽取一次，并將上清液收集以進(jìn)行乙醇沉淀，沉淀物以70％乙醇清洗兩次，且收集片狀物(pellet)并再懸浮于TE(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)或如需要時水中。
質(zhì)體資料庫(library)DNA是由收集的大腸桿菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞中以聚乙二醇沉淀程序(Kreig.P.及Melton.D.1985 supra)來抽取，且依照得自伊利諾大學(xué)芝加哥分校的Dr.Morison的方法用于轉(zhuǎn)形至CP 1200(即親代肺炎球菌)。在肺炎球菌轉(zhuǎn)形作用上，冷凍的肺炎球菌勝任細(xì)胞在冰上融解，且在100微升的這些勝任細(xì)胞中加入200毫微克至1000毫微克的質(zhì)體庫于一不同的離心小管中。此管在37℃于水浴中培養(yǎng)約25至35分鐘，且混合物稀釋1/10于CAT培養(yǎng)基中并進(jìn)一步培養(yǎng)約1至1.7小時。在最后培養(yǎng)之后，混合物以覆蓋(overlay)程序傾倒培養(yǎng)(方法得自Dr.Morison，伊利諾大學(xué)芝加哥分校)，此覆蓋程序包含傾倒四種不同的瓊脂層(THB或CAT)于一小培養(yǎng)基上，如下列a)第一或基底層3毫升的瓊脂；b)第二或細(xì)胞層1.5毫升的瓊脂及1.5毫升含有所需濃度的細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)液(broth)；c)第三層3毫升的瓊脂；d)第四層或頂層3毫升含有4倍所需濃度的抗生素(紅霉素，0.05微克/毫升x4＝6微克/毫升)的瓊脂，這些培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)。以刺入接種將各別的轉(zhuǎn)形細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有100微升的THB及紅霉素(0.05微克/毫升)的微量培養(yǎng)板(microtitre plates)的各別凹槽(well)中，在微量培養(yǎng)板中回復(fù)的轉(zhuǎn)形細(xì)胞在SMP培養(yǎng)基中稀釋1∶10且使其生長至早期的對數(shù)期，并以ELISA篩選其等降解C3的能力。
重組載體的自然切割是以低頻率發(fā)生在這些類型的肺炎球菌突變株中，因此，這些突變株的染色體DNA制劑常包括低含量的質(zhì)體DNA(Pearce B J.等，Mol.Microb.9(5)1037-1050，1993)。大腸桿菌的電擊穿透法(electroporation)為一種分離大腸桿菌中質(zhì)體構(gòu)筑體的高效率方式以進(jìn)一步研究，由有興趣的各別肺炎球菌突變株中而來的染色體DNA(最終體積2微升中100毫微克至200毫微克)被電擊穿透至大腸桿菌DH5(MCR勝任細(xì)胞中，以得到具有重組質(zhì)體的大腸桿菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞。一個回復(fù)的重組質(zhì)體(pLSN4a)(參見表2)以轉(zhuǎn)形作用被重新導(dǎo)入野生型CP 1200肺炎球菌株中，再次以ELISA評估轉(zhuǎn)形細(xì)胞SN4-4G降解C3的活性。
DNA片段是以含有Tris-硼酸鹽EDTA(TBE)緩沖液或Tris-乙酸EDTA(TAE)緩沖液(Sambrook，J.E.Fritsch及T.Maniatis，1989)的瓊脂糖凝膠(0.5％至1.0％)上水平式電泳(horizontal electrophoresis)來分析。使用來自GibcoBRL的1kb梯度(ladder)或來自Boehringer Mannheim的HindiIII或HindIII/EcoRI切割的(DNA作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
得自Gibco BRL Life Technology，Grand Island，N.Y.，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN.，Promega Corp.，Madison，WI.，Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD.，或New England Biolabs.，Inc.，Beverly，MA.的限制內(nèi)核酸酶、牛腸磷酸酶(phosphotase)及T4 DNA接合酶(ligase)是以制造商說明而使用。
DNA片段是以南方雜交法(Southern hybridization)來分析，DNA是由凝膠轉(zhuǎn)移至MSI Magnagraph尼龍膜(Micron Separation，Inc.，Westboro，MA)上以進(jìn)行雜交及使用Genius非輻射性DNA標(biāo)記的偵測以及偵測套組(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，其依照套組所提供的說明進(jìn)行。來自肺炎球菌或大腸桿菌培養(yǎng)物的染色體或質(zhì)體DNA是以先前段落所敘述的方式分離出來，約100毫微克至400毫微克的每一個樣品是以所需的限制酵素切割且在0.7％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行，并轉(zhuǎn)印(transblotted)至Magnagraph-尼龍膜上隔夜，其余程序是以制造商所指示來進(jìn)行。
使用于此實例及后續(xù)實例的細(xì)菌菌株及質(zhì)體簡述于以下表2中。
表2.細(xì)菌菌株以及質(zhì)體構(gòu)筑體宿主 質(zhì)體或 大腸桿菌中回復(fù)的菌株或轉(zhuǎn)形細(xì)胞 質(zhì)體或構(gòu)筑體的菌株 構(gòu)筑體 重組質(zhì)體代號(具有質(zhì)體) 代號及變異體大腸桿菌DH5αMCR pVA891質(zhì)體 DH-pVA89 pVA 891大腸桿菌DH5αMCRpVA891∷插入物3 LSN3 pLSN3大腸桿菌DH5αMCRpVA891∷插入物4 LSN4 pLSN4大腸桿菌DH5αMCRpVA891∷插入物5 LSN5a pLSN5大腸桿菌DH5αMCRpVA891∷插入物6a.b LSN6a.b pLSN6a-c大腸桿菌DH5αMCR pVA891∷ORF3a**DH-pVA/ORF3a**PVA-ORF3a**大腸桿菌DH5αMCR pET28(+)∷ORF3a*DH-pET/ORF3 PET-ORF3大腸桿菌BL 21 DE 3 PVA 891質(zhì)體BL-pVA891 pVA891大腸桿菌BL 21 DE 3 pLSN4 BL-pLSN4 pLSN4大腸桿菌BL 21 DE 3 pET 28(+)∷ORF3*BL0pET/ORF3*pET-ORF3*肺炎球菌突變株 插入的重組質(zhì)體 突變株代號回復(fù)的重組質(zhì)體代號肺炎鏈球菌CP 1200 pVA891∷插入物3 SN3 pLSN3肺炎鏈球菌CP 1200 pVA891∷插入物4 SN4 pLSN4肺炎鏈球菌CP 1200 pVA891∷插入物5 SN5 pLSN5肺炎鏈球菌CP 1200 pVA891∷插入物6a.b SN6 pLSN6a-c肺炎鏈球菌CP 1200 pLSN4 SN4-4GpLSN4-4G肺炎鏈球菌CP 1200 pVA891∷ORF3a**SN4-S10a，這些是以肺炎球菌株CP1200的任意染色體片段構(gòu)筑，接合至往返載體pVA891的Emr決定部位，且轉(zhuǎn)形至CP1200，以作為插入性復(fù)制突變的目的。b，插入的質(zhì)體是來自敘述于內(nèi)文中有興趣的肺炎鏈球菌突變株且于大腸桿菌中回復(fù)。參見表3中來自每一個肺炎鏈球菌突變株所回復(fù)的重組質(zhì)體的不同變異物的詳述。
*，cppA基因。*，620bp，一種cppA基因片段。
實例2具有改變降解C3活性的突變株的鑒定以ELISA篩選各別肺炎球菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞的改變降解C3活性，使肺炎球菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞各別生長于微量滴定平盤中存在紅霉素(0.05微克/毫升)的THB中至達(dá)到對數(shù)期，且稀釋1/0于SMP培養(yǎng)基(0.05微克的紅霉素/毫升)中，此SMP細(xì)菌培養(yǎng)物生長至對數(shù)期且以C3(0.83微克C3/毫升培養(yǎng)物)來培養(yǎng)2至4小時，在以C3培養(yǎng)之后，100微升的每一個各別的轉(zhuǎn)形細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至ELISA結(jié)合平盤上且在4℃培養(yǎng)隔夜，平盤以PBS(10(M磷酸緩沖溶液鹽水+0.05％ Tween-20)清洗三次。100微升對于人類補(bǔ)體C3有專一性的HRP結(jié)合羊多株抗體(48毫克/毫升稀釋1∶10000)被加入每一凹槽中，且平盤在37℃培養(yǎng)一至二小時，每一微量滴定平盤如上述以PBS清洗。100微升的30％OPD(于30毫升檸檬酸緩沖溶液(200mM Na2HPO4及100mM檸檬酸-pH 5.0)的12毫克O-次苯基二胺(Zymed，SouthSan Francisco，CA)及12微升的H2O2)加入每一個凹槽中，且平盤在黑暗中培養(yǎng)30分鐘。反應(yīng)是在加入50微升的2.5M H2SO4至每一凹槽中而停止，樣品中所留存未降解C3的量是由對人類補(bǔ)體C3具專一性的結(jié)合HRP羊多株抗體來偵測。將此分析標(biāo)準(zhǔn)化以使含有為降解C3的凹槽具有O.D.490＝～1.0，含有降解C3的凹槽由于對抗C3抗體結(jié)合性的降低而具有降低的光學(xué)密度讀值。將突變株及親代株與負(fù)對照組(有不同濃度C3的培養(yǎng)基)的光學(xué)密度相比較來計算降解C3活性的百分率，四個具有提高降解C3活性(2.2倍-表3)的突變株SN3，SN4，SN5及SN6與親代株CP 1200的活性比較，后續(xù)以對肺炎球菌突變株SN4的西方免疫印漬法來確認(rèn)此發(fā)現(xiàn)，SN4-S10(具破壞的cppA基因)也是具有降低的降解C3活性的CP 1200突變株。
表3.以肺炎球菌親代株及高活性突變株進(jìn)行C3降解作用的ELISA結(jié)果菌株 在490毫微米的*每一個樣品或?qū)φ战M的ELISA讀值 C3降解百分率**負(fù)對照組 0.608 0％CP1200(親代) 0.30 51％SN3(突變株)0.20 67.2％SN4(突變株)0.162 73.4％SN5(突變株)0.23 60.0％SN5(突變株)0.23 60.0％*不同時間點進(jìn)行最少四個各別實驗的平均值**負(fù)樣品是僅含有C3且不含細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)基(THB或SMP)使用ECL西方印漬步驟(Amersham Life Sciences，Arlington Heights，IL)進(jìn)行免疫印漬法。有或無質(zhì)體的肺炎球菌突變株或大腸桿菌培養(yǎng)物是來自冷凍儲存培養(yǎng)物且生長于THB或LB直到達(dá)對數(shù)期，并以C3(0.83微克的C3/毫升)培養(yǎng)2至4小時。培養(yǎng)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)離心(在4℃以3,500rpm離心15分鐘)且收集上清液，在培養(yǎng)物以C3培養(yǎng)之前，小心監(jiān)控培養(yǎng)物的光學(xué)密度且將樣品平均化(equalized)，將相等量的所有收集到含有未降解C3的上清液在還原狀況下施用于7.5％或10％的SDS-PAGE凝膠上，使凝膠轉(zhuǎn)印(transblotted)至硝化纖維膜(75伏特；4℃)進(jìn)行一小時，在此實例及在后續(xù)實例中蛋白質(zhì)以Hoeffer轉(zhuǎn)移裝置于Towbin緩沖液(1公升體積pH 8.3的3.03克Tris，14.4克甘氨酸以及200毫升甲醇；Towbin等(1979)PNAS4350-4354))在70伏特進(jìn)行1小時由凝膠被轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜，或凝膠以于50％甲醇及10％乙酸中制備的0.125％考馬斯亮藍(lán)(Coomassie BrilliantBlue)R-250(Pierce，Rockford，IL)來染色。
印漬(blot)是以輕微搖動培養(yǎng)于10％脫脂牛乳(脫脂牛乳粉)中1小時(室溫)或隔夜(4℃)，將此印漬在TTBS(0.1％ Tween，20mM Tris，137mM鹽水緩沖液)中清洗數(shù)次，且以輕微搖動培養(yǎng)于3X TTBS+3％BSA中制備的1∶1000稀釋液的結(jié)合HRP羊抗人類C3多株抗體，IgG部分(ICN Pharmaceuticals/Cappel，Costa Mesa，CA)來培養(yǎng)，此培養(yǎng)的印漬再次于TTBS中清洗數(shù)次且在化學(xué)發(fā)光試劑(1∶1比例的2X胺基苯二酰胼(luminol)/促進(jìn)劑及2X穩(wěn)定的過氧化氫溶液，Pierce，Rockford，IL)中培養(yǎng)1分鐘，此印漬在黑暗中暴露于底片且使底片顯影。SDS-PAGE凝膠總是含有預(yù)染色的范圍在200kd至19kd的高分子量標(biāo)記(Bethesda Research laboratories，Life Sciences，GrandIsland，NY)，除非另外言明時，清洗及培養(yǎng)是在室溫以輕微搖動進(jìn)行。
將來自過度活性的肺炎球菌突變株SN3，SN4，SN5及SN6的染色體DNA電擊穿透至大腸桿菌DH5(MCR勝任細(xì)胞，會得到具有回復(fù)重組質(zhì)體的大腸桿菌轉(zhuǎn)形細(xì)胞。大腸桿菌DH5(MCR轉(zhuǎn)形細(xì)胞，LSN3，LSN4，LSN5，LSN6，LSN4G含有質(zhì)體(由表2的肺炎球菌突變株，分別為SN3，SN4，SN5，SN6及SN4-4G突變株)，含有不同構(gòu)筑體的大腸桿菌的詳細(xì)資料列于表2中(supra)。限制分析(HimdIII)顯示插入物確實為重組質(zhì)體，不同大小的重組質(zhì)體是得自每一個過度活性的肺炎球菌突變株?；貜?fù)自突變株SN3及SN4的重組質(zhì)體pLSN3及pLSN4為相同的大小(～7.8kb)且其等插入物大小為～2.4kb，得自肺炎球菌突變株SN5的～11kb的重組質(zhì)體pLSN5的插入物大小為約5.6kb。第四個肺炎球菌突變株SN6得到兩個分別具有1.1kb及5.1kb插入物的～6.5kb及～10.5kb的不同重組質(zhì)體pLSN6a及pLSN6b。這些肺炎球菌突變株也以南方雜交法來檢測，過度活性的肺炎球菌突變株SN4被選擇來進(jìn)一步研究C3的降解作用，且因此完全檢查回復(fù)自(rescued)突變株SN4的重組質(zhì)體pLSN4。
使用質(zhì)體pLSN4作為一種對抗肺炎球菌突變株受到EcoRI切割的染色體DNA樣品的探針，且此確認(rèn)了突變株SN3及SN4中載體+插入物(pLSN4)的并入，SN3及SN4過度活性的突變株包括兩個大小為～2.2kb及～5.8kb的雜交片段，該等兩片段也存在于親代株CP 1200中。兩個其他的雜交載體/插入物連接片段為～4.2及～3.5kb且這兩個片段一起總共為～7.8kb(pLSN4為～7.8kb)。這兩個條帶(bands)也存在于EcoRI切割的pLSN4 DNA樣品中，插入物及載體兩者均有EcoRI切點且代表重組質(zhì)體。其他過度活性的突變株SN5及SN6的模式顯示這些突變株可能在其等并入的重組質(zhì)體中有不同插入物。
使用相同的質(zhì)體pLSN4來轉(zhuǎn)形至親代肺炎球菌株CP1200中，以確認(rèn)其有關(guān)過度活性(hyperactivity)。如所預(yù)期的，得到的突變株SN4-4G(表2)復(fù)制增進(jìn)C3降解的表現(xiàn)型。
實例3降解C3基因的分離及鑒定進(jìn)行對重組質(zhì)體pLSN4插入部分的雙股DNA序列分析。由于此插入物與降解C3的過度活性有關(guān)，故預(yù)期插入物可見于相對基因的調(diào)控區(qū)域或基因的復(fù)制上，但是，基于蛋白質(zhì)資料基礎(chǔ)搜尋，未顯示調(diào)控區(qū)域中有插入，此建議基因復(fù)制的可能性。有三個完整的開放譯讀框架(ORFs)及一個部分開放譯讀框架在上述ORFs與GenBank，Blast and SwissProt資料庫搜尋所提供的蛋白質(zhì)的衍生氨基酸間不具有明顯的同質(zhì)性。初步資料(CathrynA S等，J.Inf.Dis.170600-608，1994)顯示降解C3的蛋白酶可能與細(xì)胞壁相關(guān)(輸出蛋白質(zhì))，且因而尋找訊息序列(signal sequence)，即富含脯氨酸區(qū)域或LPXTG域(motif)的存在。四個ORFs皆不具有這些序列模式，并選擇ORF3(最大的ORF)以進(jìn)一步分析。
使用CsCl梯度/溴化乙錠分離來制備質(zhì)體pLSN4a的雙股DNA，并作為模板(template)，寡核苷酸引子(primer)是以施用的Biosystems 391自動合成儀(Gibco BRL)或以O(shè)ligo 1000M DNA合成儀(Beckman Instruments Inc.La Brea，CA)來合成，使用雙脫氧鏈中止方法(dideoxy chain terminatormethod)(Sanger F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)821074-1078，1977)以及使用Sequenase2.0(U.S.Biochem)及[(-35]dATP(Amersham Life Sciences，ArlingtonHeights，IL)定序法，是以如Sequenaseversion 2.0(Amersham life sciences)所示的裝置20110 Macrophor Electrophoresisunit(LKB Bromma)來進(jìn)行。
回復(fù)自過度活性的肺炎球菌同源性重組突變株SN4的重組質(zhì)體pLSN4中插入物(參見圖3)在測試的20個酵素中似乎有Hinc II，Ntu I，EcoR I，Cla I，EcoR V及Hpa I的限制酶切點，且此數(shù)據(jù)與序列資料相關(guān)聯(lián)。
在審視序列資料之后，cppA基因的內(nèi)部片段620bp(插入物的ORF3)是由含有Hind III限制酶切點的基因放大法(參見表2的引子)產(chǎn)生。此片段被次轉(zhuǎn)殖(subcloned)至載體pVA891的HindIII位點、電擊穿透送至大腸桿菌中且測試此插入物的存在。最后，將次轉(zhuǎn)殖體(subclone)轉(zhuǎn)形至野生型CP 1200肺炎球菌勝任細(xì)胞中，以使野生型CP 1200中原來的cppA基因失活。
使用與所需DNA片段5′及3′端互補(bǔ)的引子(參見表4中引子序列及放大周期條件)的Hybaid Omnigene機(jī)器進(jìn)行DNA放大作用，所有引子被構(gòu)筑為兩端上包含限制酶切點。放大反應(yīng)(最終體積0.1毫升體積)使用10微升的10X vent緩沖液(最終濃度，1X包含10mM KCl，10mM(NH4)SO4，20mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，4微升的100mM MgSO4(最終濃度4mM)，3微升的10mMdNTPs(最終濃度300(M)，50毫微克的模板(template)，1(M引子(primer)以及1微升2000單位/毫升的vent聚合酶(最終濃度2單位；酵素是施用于10mM KCl，0.1MEDTA，10(M Tris-HCl(pH 7.4)，1mM DTT，0.1％Triton X-100)于加入水的最終體積100微升。Vent緩沖液，vent聚合酶酵素以及MgSO4是購自New England Biolabs，MA且dNTPs是購自Gibco BRL。
表4.引子的序列以及基因放大周期條件放大的基因片段及大小(kb) 引子的序列*pLSN4插入物(～2.338kb) PCR-1(LSN4a-L)CAG GAA GCT TGA TCT TGA AAT TTC TAT GAC TCC(SEQ ID NO3)PCR-1(LSN4a-R)CGA GAA GCT TGA TCC TGT CGA AAT CAA AGC AGG ACG(SEQ ID NO4)*ORF3a(～0.62kb)左PCR-2CAG GAA GCT TTG AAA CAA TTT ATA TTG AAA CCC(SEQ ID NO5)(cppA的內(nèi)片段) 右PCR-2CGA GAA GCT TCA AGG AAG AAT TTT TCA GAC TTA GG(SEQ IDNO6)*ORF3(～0.726kb)左PCR-4GGG GAA TTC CAT ATG AAT GTA AAT CAG ATT GTA CGG(SEQ ID NO7)(cppA基因) 右PCR-4CGC CGC GGA TCC TCA TAC TTC TTC AAA CCA CAA TTC(SEQ ID NO8)放大周期的條件 pLSN4插入物(～2.338kb) ORF3a(～0.62kb) ORF3(～0.720kb)變性(Denaturing)98℃，3分鐘，1個周期 98℃，3分鐘，1個周期 98℃，3分鐘，1個周期變性 94℃，30秒94℃，30秒黏接(Annealing)53℃，30秒3個周期 59℃，30秒3個周期延長(Extension)72℃，45秒72℃，54秒變性94℃，30秒 94℃，30秒94℃，30秒黏接(Annealing) 55℃，30秒5個周期 53℃，30秒3個周期 59℃，30秒3個周期延長(Extension) 72℃，45秒 72℃，45秒72℃，54秒完成維持72℃，5分鐘，1個周期 72℃，5分鐘，1個周期 72℃，5分鐘，1個周期*pLSN4，一種回復(fù)自過度活性的肺炎鏈球菌突變株SN4的重組質(zhì)體會參見前述的表及內(nèi)文)；其為完全定序的；ORF3，稱為cppA，是一種存在于pLSN4且編碼降解C3蛋白酶的插入物的開放譯讀框架之一；ORF3a是cppA(ORF3)基因的內(nèi)部分，其用來在親代肺炎球菌株CP1200中破壞cppA(ORF3)基因。
其他序列是以Applied Biosystems Model 373a DNA定序儀(sequencer)(DNASequencing Core Facility，Interdiseiplinary Center for Biotechnology Research(ICBR)，University of Florida，Gainesville，F(xiàn)L)經(jīng)由螢光定序法來產(chǎn)生。Robotlo Workstation(ABI Catalyst 800)以及Perkin Elmer-CetusPEC 9600熱循環(huán)機(jī)(thermocycler)用于周期定序反應(yīng)中。模板，即代表來自質(zhì)體pLSN4a的全部插入物的放大基因產(chǎn)物，是在其用于自動化定序之前以Qiagen套組(kit)直接由0.7％瓊脂凝膠上洗滌。定序分析是根據(jù)GCG軟體組package中可知的計劃(fasta，blast及其他計劃)來進(jìn)行。
實例4降解C3蛋白質(zhì)的分離及研究過度活性的突變株及其等親代株的對數(shù)期培養(yǎng)物以C3培養(yǎng)2至4小時，且培養(yǎng)物的懸浮液于還原條件下在7.5％ SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，并使用對抗C3的結(jié)合HRP多株抗體的免疫印漬法來檢測其等降解C3的活性。此實驗結(jié)果證實突變株SN4及SN4-4G(以回復(fù)自SN4的重組質(zhì)體pLSN4再轉(zhuǎn)形至CP 1200中而得)具有比親代株CPl200有降解C3更高的活性。在突變株培養(yǎng)4小時后C3的(及(鏈兩者幾乎完全被降解，而親代株的降解作用則不完全。CppA蛋白質(zhì)似乎較佳降解C3的α鏈。
cppA基因的620bp內(nèi)部分被接合至pVA891的Hind III切點上，且構(gòu)筑體被轉(zhuǎn)形至CP 1200勝任細(xì)胞中。測試所得到轉(zhuǎn)形細(xì)胞降解C3的能力，是通過SDS-PAGE及西方印漬分析與親代株CP 1200比較，發(fā)現(xiàn)ORF3突變株具有不良的活性，C3分子的α鏈被降解而β鏈則降解較少。突變株中的活性降低而非活性完全喪失顯示突變株有另一個編碼對另外降解C3蛋白酶具完全功能的基因存在的可能性。
全部的cppA基因被放大且轉(zhuǎn)殖入pet-28b(+)的NdeI及BamHI切點(Novagen，Inc.Madison，WI)上，并將其N端區(qū)域的組織氨酸標(biāo)記(His-Tag)并入此基因中。如以序列分析來確認(rèn)，全部基因在載體上的邊緣位置(in frame)，使質(zhì)體構(gòu)筑體轉(zhuǎn)形至大腸桿菌DH5α MCR株以使其穩(wěn)定化，且插入物的存在是在該載體及插入物轉(zhuǎn)形至大腸桿菌BL21 D3 (Novagen)蛋白酶缺失株中表現(xiàn)之前確認(rèn)，含有該質(zhì)體構(gòu)筑物的菌落是在含有卡那霉素(kanamycin，30微克/毫升)的LB培養(yǎng)基上選擇。
蛋白質(zhì)的分離是根據(jù)Pet System Manual(Madison，WI)以小規(guī)?；虼笠?guī)模制備。含有此構(gòu)筑體(pet 28b(+)∷ORF3(cppA基因))的BL21 DE3菌株是以IPTG誘導(dǎo)，且表現(xiàn)蛋白質(zhì)CppA被溶解。為進(jìn)行溶解作用(solubilization)，將被誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物離心且片狀物(pellet)再懸浮于TES(50mM Tris；1mM EDTA；100mM NaCl)中，使此再懸浮液于冰上進(jìn)行超音波振蕩(6×15秒脈沖，于高輸出設(shè)定約50瓦特)，且快速使之旋轉(zhuǎn)以收集片狀物，此片狀物在TES(50mM Tris；lmM EDTA；100mM NaCl)中清洗兩次，并在最后以6mM G-HCl+1mM DTT+1％Tween-20于4C處理此片狀物3小時。
被溶解的蛋白質(zhì)于TTS(1％Tween，50mM Tris，0.7M NaCl)中稀釋1∶10對TTS(1％ Tween，50mM Tris，0.7M NaCl)進(jìn)行透析，以去除G-HCl、DTT及EDTA。使用Pet系統(tǒng)手冊說明(Novagen，INC.Madison，WI)，透析后的CppA蛋白質(zhì)是以尼克氏(Nickel)管柱層析來純化。傾倒尼克氏(Nickel)管柱(2.5毫升)，且在去除G-HCl、DTT及EDTA后，將表現(xiàn)的有組織氨酸標(biāo)記(His-Tagged)的CppA蛋白質(zhì)施用于Nickel管柱上以純化。洗提(eluted)出來的部分是由10％SDS-PAGE凝膠及考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)R-250染色來測試His-Tagged CppA蛋白質(zhì)。在需要之前，該蛋白質(zhì)保存于4℃冰上或以小量冷凍于-80℃。
CppA蛋白質(zhì)(反應(yīng)混合物中約600毫微克/毫升)是以人類補(bǔ)體C3(每毫升反應(yīng)混合物中0.83微克的C3)在37℃及PBS存在下培養(yǎng)4小時，并同時設(shè)定不含蛋白質(zhì)的負(fù)對照組，樣品在還原條件下于7.5％或10％SDS-PAGE凝膠上及西方印漬法(ECL西方印漬程序-Amersham Life Sciences，ArlingtonHeights，IL)分析。
如上所述，所有ORF3基因的PCR產(chǎn)物被次轉(zhuǎn)殖到氨基端位置內(nèi)有組織氨酸標(biāo)記(His-tag)的pet載體pET28b(+)(Novagen，Madison，WI)中，且此構(gòu)筑體在大腸桿菌DH5(MCR中穩(wěn)定化后被導(dǎo)入蛋白酶缺失株大腸桿菌BL21 DE3(表2)。使具有此構(gòu)筑體的大腸桿菌BL21 DE3受到IPTG的誘導(dǎo)。測試被誘導(dǎo)及未被誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的總細(xì)胞蛋白質(zhì)抽取物，于10％SDS-PAGE凝膠上鑒定出表現(xiàn)的有組織氨酸標(biāo)記(His-tagged)的ORF3蛋白質(zhì)(～29kd)于該被誘導(dǎo)蛋白質(zhì)樣品的不可溶部分中。
穩(wěn)定作用上，是使用下列試劑在4℃進(jìn)行三小時或室溫進(jìn)行一小時TES(50mMTris，1mM EDTA，1 MNaCl)；(b)6mM G-HCl+1mM DTT；(c)6mM G-HCl+1mM DTT+1％ Tween 20；(d)6mMG-HCl+1mM DTT+1％ TritonX-100?！錭″及″d″兩種處理使在10％SDS-PAGE凝膠上觀察到表現(xiàn)的蛋白質(zhì)為可溶性。選擇以″c″試劑的處理為后續(xù)大規(guī)模的制備，溶解的蛋白質(zhì)被透析，接著經(jīng)由Nickel管柱被純化，且檢測其對抗C3的功能。
對用于此實例及上述中的SDS-PAGE凝膠而言，總細(xì)胞蛋白質(zhì)或可溶性蛋白質(zhì)部分是根據(jù)Pet系統(tǒng)手冊(Madison，WI)而抽取。這些蛋白質(zhì)是由Laemmli的非連續(xù)系統(tǒng)(Laemmli，U.K.，Nature 227680-685，1970)中的SDS-PAGE凝膠(7.5％或10％或15％解析凝膠(resolving gel)及4.5％堆積凝膠(stacking gel))來分離。簡而言之，樣品與裝載緩沖液(樣品中最終濃度為7.57毫克/毫升的Tris，2％SDS，10％甘油及1.25毫克/毫升的溴酚藍(lán)，±5％β-巰基乙醇(mercaptoethanol)結(jié)合，且使之煮沸5分鐘或直接裝載于解析凝膠上。預(yù)染色的高分子量標(biāo)準(zhǔn)物(standard)(蛋白質(zhì)標(biāo)記(kd)溶酶體(lysosome)，14,300；β-乳球蛋白(lactoglobulin)，18,400；碳化酐酶(carbonicanhydrase)，29,000；卵白蛋白，43,000；牛血清白蛋白，68,000；磷酸酶B，97,400；肌凝蛋白(myosin)，200,00(Bethesda research laboratories，lifesciences，GrandLand，NY)包含于凝膠上。大的SDS-PAGE凝膠是在15mA進(jìn)行14小時或是在10mA進(jìn)行20小時電泳，小型凝膠是在一恒定電壓(100-150伏特)進(jìn)行電泳約2至3小時。
表現(xiàn)的蛋白質(zhì)是以C3來培養(yǎng)，且C3的量是以西方免疫印漬法來測定。
免疫印漬分析顯示含有表現(xiàn)蛋白質(zhì)的樣品會降解C3分子，未降解的C3是由對人類補(bǔ)體C3具專一性的多株抗體來偵測，且若為負(fù)樣品時可清楚地見于顯影的底片上。與不包括任何ORF3蛋白質(zhì)的負(fù)對照組相較，C3分子的(及(鏈兩者似乎易受到ORF3蛋白質(zhì)的活性作用；但是，在ORF樣品中，α鏈幾乎完全被降解，而β鏈則是部分降解。
實例5臨床分離株中降解C3基因的轉(zhuǎn)換為檢測基因cppA的轉(zhuǎn)換(conversion)，以cppA的內(nèi)部片段作為一探針以經(jīng)由南方雜交法來測定不同肺炎球菌分離株的臨床型(血清型)以Eco RI切割的基因組DNA中基因cppA的存在。在相同實驗中，也包括肺炎球菌親代株CP 1200以及過度活性的突變株SN4及SN4-4G(兩個突變株含有相同的質(zhì)體-參見表2)來確認(rèn)在突變株中cppA基因的復(fù)制。南方雜交法是使用非放射性的DIG標(biāo)記的該基因內(nèi)部片段作為探針來進(jìn)行。臨床分離株，第1型、第3型、第14F型及致病型23F，顯示出約2.3kb的雜交條帶(band)，其亦出現(xiàn)于對照組肺炎球菌株CP 1200及SN4突變株中，此共同的條帶表示cppA基因出現(xiàn)于所有測試的分離株中。SN4突變株也包括大小約3.5kb的第二條帶，表示基因復(fù)制的存在。此3.5kb大小是與質(zhì)體pLSN4具有兩個對EcoRI限制內(nèi)核酸酶位點(一個在插入物區(qū)域且第二個在載體中)所觀察到者一致，因此，以Eco RI切割會自該重組質(zhì)體產(chǎn)生兩個片段約4.175kb(載體3.531kb+插入物0.649kb)以及3.539kb(插入物的～1.67kb+載體的約1.869kb)。cppA基因是位于插入物1.67kb部分，因而重組質(zhì)體的～3.539kb限制酶切割片段包含cppA基因，且只有此條帶可與作為探針的cppA基因內(nèi)部片段雜交；因此對于具有復(fù)制cppA基因的突變株，在～3.5kb的第二個雜交條帶代表復(fù)制的cppA基因。
權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白質(zhì)，其特征在于包含與序列編號2(SEQ ID NO2)至少80％序列相同性且可降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)是分離自肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)與人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)為一種重組蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)為一種分離蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于具有在10％聚乙烯酰胺凝膠上所測定介于24kDa至約34kDa的分子量。
7.一種肽類，其特征在于包含來自權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的至少15個連續(xù)氨基酸。
8.一種分離蛋白質(zhì)，其特征在于包含序列編號2(SEQ ID NO2)的分離蛋白質(zhì)。
9.一種肽類，其特征在于包含來自序列編號2(SEQ ID NO2)的至少15個連續(xù)氨基酸。
10.一種包含序列編號2(SEQ ID NO2)的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)具有于10％聚乙烯酰胺凝膠上測定介于約24kDa至約34kDa的分子量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)是由肺炎鏈球菌中分離出來。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)是一種重組蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)會降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3。
14.一種蛋白質(zhì)，其特征在于包含序列編號2(SEQ ID NO2)的氨基酸1至50。
15.一種核酸片段，其特征在于包含圖1A中的核酸1246至1863。
16.一種降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3的蛋白質(zhì)，其特征在于編碼該蛋白質(zhì)的核酸可與序列編號1(SEQ ID NO1)雜交，此雜交條件是在6X SSC、5X Denhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且變性的鮭魚精子DNA于65℃下雜交隔夜且以2XSSC、0.1％SDS在室溫下清洗一次約10分鐘，接著在65℃下清洗一次約15分鐘，再后續(xù)至少一次以0.2X SSC、0.1％ SDS于室溫下清洗至少3至5分鐘進(jìn)行。
17.一種刺激免疫系統(tǒng)的組成物，其包含一有效量的刺激免疫系統(tǒng)的肽類或多肽，其特征在于該肽類或多肽包含來自與含序列編號2(SEQ ID NO2)至少80％序列相同性且可降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3的蛋白質(zhì)的至少15個氨基酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組成物，其特征在于該蛋白質(zhì)可由肺炎鏈球菌中分離出來。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的刺激免疫系統(tǒng)的組成物，其特征在于還包含至少一種來自肺炎鏈球菌的其他刺激免疫系統(tǒng)的肽類、多肽或蛋白質(zhì)。
20.一種抗體，其特征在于可與含序列編號2(SEQ ID NO2)至少90％序列相同性且可降解人類補(bǔ)體蛋白質(zhì)C3的蛋白質(zhì)專一性結(jié)合。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗體，其特征在于該抗體是一種單株抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗體，其特征在于該抗體是一種抗體片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗體，其特征在于該抗體是一種多株抗體。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗體，其特征在于該抗體是得自老鼠、大鼠、人類或兔子。
25.一種可與序列編號1(SEQ ID NO1)雜交的核酸片段，其雜交條件是在6XSSC、5X Denhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且變性的鮭魚精子DNA于65℃下雜交隔夜且以2XSSC、0.1％ SDS在室溫下清洗一次約10分鐘，接著在65℃下清洗一次約15分鐘，再后續(xù)至少一次以0.2X SSC、0.1％ SDS于室溫下清洗至少3至5分鐘進(jìn)行。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的核酸，其特征在于是由肺炎鏈球菌基因組中分離出來。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的核酸，其特征在于該核酸片段編碼一蛋白質(zhì)的至少一部分。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的核酸，其特征在于該蛋白質(zhì)會降解人類補(bǔ)體C3。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的核酸，其特征在于該核酸片段編碼一種不會降解人類補(bǔ)體C3的蛋白質(zhì)。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的核酸，其特征在于位于核酸載體上。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的核酸，其特征在于該載體是一種可產(chǎn)生一蛋白質(zhì)至少一部分的表現(xiàn)載體。
32.一種細(xì)胞，其特征在于，含有權(quán)利要求25所述之核酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的細(xì)胞，其特征在于該細(xì)胞是一種細(xì)菌或真核細(xì)胞。
34.一種分離的核酸片段，其特征在于包含下列核酸序列g(shù)ctcccagtatgcgtactcgtaaggtagagggaagaaaaaaactagctag。
35.一種于動物中產(chǎn)生對肺炎鏈球菌免疫反應(yīng)的方法，其特征在于，包含步驟施用一種包含一治療有效量的蛋白質(zhì)至少一部分的組成物于一哺乳動物中，其中編碼該蛋白質(zhì)的核酸可與序列編號1(SEQ ID NO1)雜交，其雜交條件是在6X SSC、5XDenhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且變性的鮭魚精子DNA于65℃下雜交隔夜且以2XSSC、0.1％ SDS在室溫下清洗一次約10分鐘，接著在65℃下清洗一次約15分鐘，再后續(xù)至少一次以0.2XSSC、0.1％ SDS于室溫下清洗至少3至5分鐘進(jìn)行；以及得到對該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于該免疫反應(yīng)是B細(xì)胞反應(yīng)。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于該免疫反應(yīng)是T細(xì)胞反應(yīng)。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于該蛋白質(zhì)的至少一部分為至少15個氨基酸長。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于該組成物進(jìn)一步包含至少一種來自肺炎鏈球菌的其他蛋白質(zhì)。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于該蛋白質(zhì)包含序列編號2(SEQ IDNO2)的至少15個氨基酸。
41.一種包含一插入性突變的細(xì)菌，其特征在于該插入性突變是在一個編碼可降解人類補(bǔ)體C3蛋白質(zhì)的基因上。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的細(xì)菌，其特征在于該細(xì)菌包含一插入性復(fù)制突變。
43.一種來自肺炎鏈球菌的約24kDa至約34kDa的分離蛋白質(zhì)，其特征在于可結(jié)合并降解人類補(bǔ)體C3。
44.一種抑制肺炎鏈球菌所介導(dǎo)的C3降解作用的方法，其特征在于，包含步驟使肺炎鏈球菌與抗體接觸，該抗體可與具有序列編號2(SEQ ID NO2)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合。
45.一種分離核酸片段，其特征在于包含序列編號1(SEQ ID NO1)的核酸序列。
46.一種RNA片段，其特征在于由包含序列編號1(SEQ ID NO1)的雙股DNA序列所轉(zhuǎn)錄。
全文摘要
本發(fā)明涉及肺炎鏈球菌所表現(xiàn)降解人類補(bǔ)體C3的蛋白酶一族的監(jiān)定及使用。該蛋白酶具有于10%SDS聚丙烯醯胺凝膠上所測定的約24kD至約34kD的分子量。本發(fā)明的一個較佳蛋白酶包括序列編號2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。
文檔編號C12N5/10GK1253589SQ98804470
公開日2000年5月17日 申請日期1998年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月24日
發(fā)明者馬格列特·K·霍斯泰特, 蓋瑞·唐尼, 拉克施米·S·南狄瓦答 申請人:美國明尼蘇達(dá)州大學(xué)