專利名稱：利用單一微生物將可發(fā)酵碳源生物轉(zhuǎn)化為1,3－丙二醇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括利用單一微生物將一種可發(fā)酵的碳源生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的方法。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇是一種在生產(chǎn)聚酯纖維中和在制造聚亞胺酯及環(huán)狀化合物中具有潛在應(yīng)用價值的單體。
已經(jīng)知道有多種化學途徑能夠生產(chǎn)1，3-丙二醇。例如，可以利用一種催化劑，在存在磷化氫、水、一氧化碳、氫氣和一種酸的情況下，通過丙烯醛的催化溶液相水合，然后還原，將環(huán)氧乙烷轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇?；蛴锰細浠衔锶绺视?，在存在一氧化碳和氫氣的條件下，使用含周期表第八族原子的催化劑進行反應(yīng)來制備。雖然使用這些方法都能產(chǎn)生1，3-丙二醇，但它們非常昂貴，并且會產(chǎn)生含有環(huán)境污染物的廢物。
人們在一個世紀前就已經(jīng)知道，1，3-丙二醇可以通過發(fā)酵甘油來生產(chǎn)。已經(jīng)在多種細菌例如檸檬酸桿菌屬、梭菌屬、腸桿菌屬、泥桿菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬和暗桿菌屬中發(fā)現(xiàn)了能夠生產(chǎn)1，3-丙二醇的菌株。在每種已經(jīng)研究的情況中，甘油都經(jīng)兩個酶促反應(yīng)序列步驟轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，第一步，一種脫水酶催化甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛(3-HP)和水，方程1。第二步，3-HP被一種NAD+相連的氧化還原酶還原為1，3-丙二醇，方程2。1，3-丙二醇不再被進一步代謝，因而在培養(yǎng)基中高濃度積累。整個反應(yīng)消耗等當量的還原性輔助因子-還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，NADH被氧化成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。
(方程1)(方程2)由甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇一般以甘油為唯一碳源在厭氧條件下進行，并且沒有其它外源的還原性等價受體。在這種條件下，在如檸檬酸桿菌屬，梭菌屬，和克雷伯氏菌屬的菌株中，起作用的是一種甘油代謝的平行途徑，這一途徑包括，甘油首先被一種NAD+-(或NADP+-)連接的甘油脫氫酶氧化為二羥基丙酮(DHA)，方程3。DHA在一種DHA激酶的作用下磷酸化后產(chǎn)生磷酸二羥基丙酮(DHAP)(方程4)，就可通過如糖酵解途徑用于生物合成和支持ATP的產(chǎn)生。相對于1，3-丙二醇途徑，這一途徑可以為細胞提供碳源和能量，并且產(chǎn)生而不是消耗NADH。
(方程3)(方程4)在肺炎克雷伯氏菌和弗氏檸檬酸桿菌中，編碼功能相連的甘油脫水酶(dhaB)、1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)、甘油脫水酶(dhaD)和二羥基丙酮激酶(dhaK)活性的基因都包含在調(diào)節(jié)子dha中。檸檬酸桿菌屬和克雷伯氏菌屬的dha調(diào)節(jié)子已在大腸桿菌中獲得了表達，并且都顯示能將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。
制備甘油的生物過程已經(jīng)知道，除一些細菌外，絕大多數(shù)甘油生產(chǎn)者是酵母，其它真菌和藻類也已知可產(chǎn)生甘油。細菌和酵母都通過糖酵解途徑中的果糖-1，6-二磷酸途徑或Embden Meyerhof Parnas途徑轉(zhuǎn)化葡萄糖或其它碳水化合物來生產(chǎn)甘油，但是，某些特定的藻類將葉綠體中溶解的二氧化碳和碳酸氫鹽轉(zhuǎn)化成卡爾文循環(huán)中的三碳中間產(chǎn)物。在一系列步驟中，這種三碳中間產(chǎn)物-磷酸甘油被轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛很容易互變?yōu)槠渫悩?gòu)體-磷酸二羥丙酮，并最終轉(zhuǎn)化為甘油。雖然生產(chǎn)甘油和1，3-丙二醇的生物方法都已經(jīng)知道，但一直沒能證明整個過程能由單一有機體來完成。
上面介紹的生產(chǎn)1，3-丙二醇的化學方法和生物方法都不能很好地適應(yīng)于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，因為化學過程消耗大量的能量，而生物過程需要昂貴的起始物質(zhì)-甘油。因此需要一種只要求低能量輸入和廉價起始物的方法。更需要這樣一種方法，它應(yīng)含有一種微生物，這種微生物能將基本碳源如碳水化合物或糖轉(zhuǎn)化為所需的1，3-丙二醇終產(chǎn)物。
雖然需要能將可發(fā)酵碳源而不是甘油或二羥基丙酮轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的單一有機體轉(zhuǎn)化，但已經(jīng)證明這種努力需要克服重大的困難。例如，Gottschalk等人(EP 373 230)指出，多數(shù)對生產(chǎn)1，3-丙二醇有用的菌株如弗氏檸檬酸桿菌、Clostridium autobutylicum、丁酸梭菌和肺炎克雷伯氏菌，其生長會因存在氫供體如果糖或葡萄糖而受到干擾。短乳桿菌和布氏乳桿菌的菌株在甘油與果糖或葡萄糖中共發(fā)酵時能生產(chǎn)1，3-丙二醇，但在用甘油作唯一碳源時卻不能生長，而且，雖然已經(jīng)顯示靜止細胞能代謝葡萄糖或果糖，但它們不產(chǎn)生1，3-丙二醇(Veiga DA Cunha等，細菌學雜志》174卷，1013頁(1992))。同樣，已經(jīng)顯示多養(yǎng)泥桿菌的一個菌株，當提供甘油和乙酸時能產(chǎn)生1，3-丙二醇，但在沒有甘油時不能由碳水化合物包括果糖和葡萄糖產(chǎn)生1，3-丙二醇。(Steib，《微生物學叢刊》(Arch.Microbiol.)140卷，139頁(1984))。最后，Tong等人(《應(yīng)用生物化學和生物技術(shù)》34卷，149頁(1992))指出，轉(zhuǎn)化有編碼甘油脫水酶的dha調(diào)節(jié)子的重組大腸桿菌在沒有外源甘油時，不能由葡萄糖或木糖產(chǎn)生1，3-丙二醇。
提高由甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的產(chǎn)量的努力已經(jīng)有了報導(dǎo)，這些方法包含能提供還原性等價物的輔助底物，典型的輔助底物為可發(fā)酵的糖類。已有人宣稱弗氏檸檬酸桿菌和肺炎克雷伯氏菌DSM4270的靜止細胞在共發(fā)酵甘油和葡萄糖時，產(chǎn)量能夠提高(Gottschalk等，上文；Tran-Dinh等，DE 3734 764)；但肺炎克雷伯氏菌ATCC25955的生長細胞在共發(fā)酵甘油和葡萄糖時不能產(chǎn)生1，3-丙二醇(I-T.Tong，Ph.D.論文，Wisconsin-Madison大學(1992))。用重組大腸桿菌在甘油與葡萄糖或果糖中共發(fā)酵時也有產(chǎn)量提高的報導(dǎo)；但在沒有甘油時，不能產(chǎn)生1，3-丙二醇(Tong，上文)。在這些系統(tǒng)中，單一有機體將碳水化合物用作產(chǎn)生NADH的原料，并為細胞的維持和生長提供能量和碳。這些公開內(nèi)容提示，糖類并沒有進入產(chǎn)生1，3-丙二醇的碳流動。沒有一種情況是在不含外源甘油的情況下產(chǎn)生了1，3-丙二醇。因此文獻清楚地提示，用單一有機體由一種碳水化合物生產(chǎn)1，3-丙二醇是不可能的。
本發(fā)明解決的難題是用單一有機體由廉價的碳底物如葡萄糖或其它糖類生物生產(chǎn)1，3-丙二醇。這種生產(chǎn)1，3-丙二醇的生物法需要甘油作為一個兩步順序反應(yīng)的底物，在這個兩步順序反應(yīng)中，一種脫水酶(典型的酶是一種依賴輔酶B12的脫水酶)將甘油轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物3-羥基丙醛，后者隨后被一種依賴于NADH-(或NADPH)的氧化還原酶還原成1，3-丙二醇。由于所需的輔助因子非常復(fù)雜，因此用這種反應(yīng)順序生產(chǎn)1，3-丙二醇的工業(yè)方法必須使用完整細胞作為催化劑。而且，為使這種生產(chǎn)方法在經(jīng)濟上可行，需要比甘油或二羥基丙酮便宜一些的原料。葡萄糖和其它碳水化合物是合適的底物，但正如上面所討論的，它們干擾1，3-丙二醇的生產(chǎn)。結(jié)果沒有一種單一的有機體顯示出能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇。
本發(fā)明的申請者已經(jīng)解決了上述難題，本發(fā)明提供使用單一有機體將一種可發(fā)酵碳源直接生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的方法。葡萄糖被用作為模式底物，而且這種生物轉(zhuǎn)化方法可應(yīng)用于任何存在的微生物。攜帶一種脫水酶基因的微生物能將葡萄糖和其它糖類通過甘油降解途徑轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇，產(chǎn)量和選擇性都非常好。而且，本發(fā)明還可通用于包括任何一種能方便地轉(zhuǎn)化為1)甘油、2)二羥基丙酮、或3)甘油氧化而成的C3化合物(例如甘油3-磷酸)或4)二羥基丙酮氧化而成的C3化合物(例如磷酸二羥基丙酮或甘油醛3-磷酸)的碳底物。
發(fā)明概述本發(fā)明包括使用單一微生物將一種碳底物生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的方法，這種方法通過將所說的微生物與所說的底物接觸來進行，所說的微生物至少帶有一個能表達一種脫水酶的基因。這種微生物可以是野生型的，或者是遺傳性狀改變了的，例如一種重組微生物或微生物的一種突變體。脫水酶優(yōu)選為一種甘油脫水酶或一種二醇脫水酶。
本發(fā)明進一步包括上述方法的產(chǎn)物。
本發(fā)明進一步包括一種粘粒，這種粘粒含有一個從肺炎克雷伯氏菌中分離的35kb的DNA片斷，其中所說的DNA片斷編碼一種有活性的甘油脫水酶，其限制酶切圖譜見

圖1的泳道1和泳道2。這種粘粒在轉(zhuǎn)入一種微生物時，能代謝一種碳底物特別是葡萄糖產(chǎn)生1，3-丙二醇。
本發(fā)明進一步包括一種轉(zhuǎn)化的微生物，這種轉(zhuǎn)化的微生物包含宿主微生物和上面所說的粘?；蛩f粘粒的編碼一種活性功能蛋白但不是甘油脫水酶的任何DNA片斷。
本發(fā)明還包括一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的生物轉(zhuǎn)化方法，這種生物轉(zhuǎn)化方法包括，在合適的條件下將甘油與至少帶有一個能表達一種脫水酶的基因的單一微生物接觸，所用的微生物選自曲霉屬、酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基菌屬、沙門氏菌屬、芽胞桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬。
本發(fā)明還包括一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的生物轉(zhuǎn)化方法，這種生物轉(zhuǎn)化方法包括，在合適的條件下將一種碳底物與至少帶有一個能表達一種脫水酶的基因的單一微生物接觸，其中所說的基因編碼甘油脫水酶，并分離自克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、暗桿菌屬、泥桿菌屬和梭菌屬。
本發(fā)明還包括一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的生物轉(zhuǎn)化方法，這種生物轉(zhuǎn)化方法包括，在合適的條件下將一種碳底物與至少帶有一個能表達一種脫水酶的基因的單一微生物接觸，其中所說的基因編碼甘油脫水酶，并分離自克雷伯氏菌屬和沙門氏菌屬。
優(yōu)選的宿主微生物選自檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、氣桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬、酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、芽胞桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬。
本發(fā)明包含的重組微生物在生物保藏物簡述中進行闡述。
附圖簡述圖1顯示粘粒pKP1、pKP2和pKP4的限制酶(EcoRI、BamHI、EcoRV和NotI)消化物及其在0.8％瓊脂糖凝膠電泳上的分離圖譜，上述粘粒圖譜分別標記為泳道1、2和4。分子大小標準參照物上樣在末端泳道。標記為數(shù)字1和2的泳道代表含有一個甘油脫水酶的粘粒。
圖2顯示pKP1的部分物理圖譜和各基因以DNA序列為基礎(chǔ)的位置。這些基因的鑒定基于推導(dǎo)出的開放閱讀框與Genbank數(shù)據(jù)庫的比較，比較所用的軟件為Wisconsin大學的序列分析軟件提供的Tfasta程序(Genetics Computer Group，1991年4月，第7版，575 Science Drive，Madison，WI53711)。
生物保藏物和序列表簡述含有粘粒pKP1的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α依照《布達佩斯條約》于1995年4月18日保藏在ATCC，并被命名為ATCC69789，粘粒pKP1含有克雷伯氏菌基因組的編碼甘油脫水酶的部分。含有粘粒pKP4的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α依照《布達佩斯條約》于1995年4月18日保藏在ATCC，并被命名為ATCC69790，粘粒pKP4含有克雷伯氏菌基因組的編碼二醇脫水酶的部分。轉(zhuǎn)化有一個含dhaB操縱子的質(zhì)粒的銅綠假單胞菌菌株P(guān)AO 2845pDT9依照《布達佩斯條約》于1996年4月11日保藏在ATCC，并被命名為ATCC55760。轉(zhuǎn)化有非復(fù)制型質(zhì)粒的巴斯德畢赤酵母菌株MSP42.81依照《布達佩斯條約》于1996年4月11日保藏在ATCC，并被命名為ATCC74363，非復(fù)制型質(zhì)粒上含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT基因的表達盒。轉(zhuǎn)化有一個含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT操縱子的質(zhì)粒的啤酒酵母菌株pMCK1/10/17(HM)#A，在本國際申請?zhí)峤磺耙勒铡恫歼_佩斯條約》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名為ATCC74370。轉(zhuǎn)化有一個含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT操縱子的質(zhì)粒的淺青紫鏈霉菌菌株SL/14.2，在本國際申請?zhí)峤磺耙勒铡恫歼_佩斯條約》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名為ATCC98052。轉(zhuǎn)化有一個含有dhaB1、dhaB2和dhaB3操縱子的質(zhì)粒的地衣芽胞桿菌菌株BG188/pM26(克隆#8)，在本國際申請?zhí)峤磺耙勒铡恫歼_佩斯條約》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名為ATCC98051。轉(zhuǎn)化有一個含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT操縱子的質(zhì)粒的枯草芽胞桿菌菌株BG2864/pM27(克隆#1)，在本國際申請?zhí)峤磺耙勒铡恫歼_佩斯條約》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名為ATCC98050。轉(zhuǎn)化有一個含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT操縱子的質(zhì)粒的黑曲霉株TGR40-13，在本國際申請?zhí)峤磺耙勒铡恫歼_佩斯條約》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名為ATCC74369?！癆TCC”指位于12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 U.S.A的美國典型培養(yǎng)物保藏中心國際保藏處。命名是指保藏物的登記號。
本發(fā)明的申請人提供46個序列，這些序列遵循“專利申請中核苷酸和氨基酸序列標準表述的規(guī)定”(EPO局長決議的附錄I和附錄II，發(fā)表于OJ EPO的No 2增補件，12/1992)，并遵循37 C.F.R.1.821-1.825和附錄A和B(“含有核苷酸和/或氨基酸序列的申請文件的要求”)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一個在單一有機體中由可發(fā)酵的碳源生物生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法。這種方法包括一種含脫水酶的微生物，這種微生物與一種碳底物相接觸，而1，3-丙二醇從生長培養(yǎng)基中分離。這種單一有機體可以是野生型有機體，或者可以是攜帶有編碼脫水酶的基因的、遺傳性狀改變了的有機體。
本發(fā)明提供一個快速、廉價和符合環(huán)保的1，3-丙二醇單體來源，這種1，3-丙二醇單體在聚酯和其它聚合物的生產(chǎn)中非常有用。
在這里，下列詞可用于權(quán)利要求和說明書的解釋。
在這里，“核酸”一詞指由單體(核苷酸)組成的大分子，它可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。核苷酸包含一分子的糖、磷酸以及一分子的嘌呤或嘧啶?！昂怂崞瑪唷敝杆o核酸分子的一個部分。在高等植物中，脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質(zhì)，而核糖核酸(RNA)參與DNA到蛋白質(zhì)的信息轉(zhuǎn)移?！盎蚪M”指有機體中每個細胞所含的全部遺傳物質(zhì)?！昂塑账嵝蛄小币辉~指DNA或RNA的多聚物，它可以是單鏈的，也可以是雙鏈的，并可選擇地含有能摻入DNA或RNA多聚物的人工合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。
在這里，“基本上相同”指DNA序列可有并不引起所編碼氨基酸改變的堿基改變，或者堿基改變使一個或多個氨基酸改變，但并不影響DNA序列所編碼蛋白質(zhì)的功能特性。所以應(yīng)當理解本發(fā)明所包含的要大于序列特例。本發(fā)明也包括基本上不影響結(jié)果蛋白分子功能特性的序列修改，諸如在序列中產(chǎn)生沉默改變的刪除、插入或替換。例如，本發(fā)明包括反映遺傳密碼簡并性的基因序列改變，或在給定位點導(dǎo)致產(chǎn)生一個化學等價氨基酸的基因序列改變。因此，疏水性氨基酸丙氨酸的密碼子可被編碼另一個疏水性稍弱的氨基酸殘基如甘氨酸的密碼子取代，或可被編碼疏水性更強的氨基酸殘基的密碼子取代，如被編碼纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的密碼子取代。同樣，導(dǎo)致一個帶負電荷的殘基取代另一個帶負電荷的殘基的改變，如天冬氨酸取代谷氨酸，或一個帶正電荷的殘基取代另一個帶正電荷的殘基，如賴氨酸取代精氨酸，預(yù)計也可產(chǎn)生生物等價產(chǎn)物。導(dǎo)致蛋白分子的N末端部分和C末端部分改變的核苷酸改變也不一定改變蛋白的活性。在某些情況下，事實上需要使序列突變來研究改變對蛋白生物活性的影響。上面每種設(shè)想的修改和編碼產(chǎn)物保留的生物活性的鑒定都是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。而且，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)知道，本發(fā)明所包括的“基本上相同”的序列也可由它們與這里所舉的序列例子在嚴格條件下(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃)雜交的能力來定義。
“基因”指表達一個特殊蛋白的核酸片斷，包括編碼序列前面(5′非編碼區(qū))和后面(3′非編碼區(qū))的調(diào)節(jié)序列?！疤烊弧被颉耙吧汀钡幕蛑缸匀唤缰邪l(fā)現(xiàn)的帶有其自身調(diào)節(jié)序列的基因。
“遺傳改變的或遺傳改變的微生物”指適用于本發(fā)明的、天然遺傳機制經(jīng)歷了改變的任何微生物。微生物的遺傳改變可通過含異源核酸片斷的載體轉(zhuǎn)化、誘變劑(例如，UV燈，乙磺酸)誘變、或其它任何能在細胞基因組中產(chǎn)生穩(wěn)定改變的方法來進行。
“構(gòu)建物”一詞指任何來源的質(zhì)粒、病毒、自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，它們可以是線型的或環(huán)狀的、單鏈的或雙鏈的DNA或RNA，在它們中，多種核苷酸序列組合或重組成一個獨特的結(jié)構(gòu)，這種獨特的結(jié)構(gòu)能將一個啟動子片斷、所選基因產(chǎn)物的DNA序列以及合適的3′非翻譯序列導(dǎo)入一個細胞。
“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”指細胞在整合核酸后獲得新的基因。所獲得的基因可以整合在染色體中，也可作為染色體外復(fù)制序列導(dǎo)入?！稗D(zhuǎn)化子”指轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物?！斑z傳改變的”指用轉(zhuǎn)化或突變的方法改變遺傳物質(zhì)的過程。
“表達”指由編碼基因產(chǎn)物序列的基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯得到基因產(chǎn)物。
在這里，“質(zhì)?！被颉拜d體”或“粘?！敝溉旧w外的遺傳元件，它們常常帶有不是細胞中心代謝的一部分的基因，并且通常為雙鏈環(huán)狀的DNA分子形式。
“脫水酶”指任何能夠?qū)⒏视头肿赢悩?gòu)或轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛產(chǎn)物的酶。根據(jù)本發(fā)明的目的，脫水酶包括甘油脫水酶或二醇脫水酶，它們的優(yōu)選底物分別為甘油和1，2-丙二醇。
“碳底物”或“碳源”的意思是任何能被一種微生物代謝的碳源，其中底物中至少有一個碳原子。本發(fā)明的前提是，碳底物不是甘油或二羥基丙酮。
重組有機體的構(gòu)建本發(fā)明的重組有機體含有將碳底物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的酶促途徑的編碼基因，重組有機體可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進行構(gòu)建。在本發(fā)明中，編碼脫水酶的基因可從一個天然宿主如克雷伯氏菌中分離，并用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌株DH5α、ECL707和AA200。
從一個細菌的基因組中獲取所需基因的方法在分子生物學領(lǐng)域中非常普通和熟知。例如，如果基因的序列是已知的，就用限制性內(nèi)切酶消化來構(gòu)建合適的基因組文庫，并可用與所需基因序列互補的探針進行篩選。一旦分離到序列，就可用標準的引物指導(dǎo)下的擴增方法如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(U.S.4,683,202)擴增DNA，來獲得大量適于用載體進行轉(zhuǎn)化的DNA。
另外，可以構(gòu)建粘粒文庫，即可將大片斷的基因組DNA(35-45kb)包裝到載體中，用于轉(zhuǎn)化合適的宿主。粘粒載體的獨特性在于能容納大量的DNA。粘粒一般至少有一個拷貝的cos DNA序列，cos序列對于外源DNA的包裝及隨后的環(huán)化是必需的。除了cos序列外，這些載體還含有復(fù)制的起始區(qū)域(Col E1)和藥物抗性標記(如抗氨芐青霉素或抗新霉素的基因)。用粘粒來轉(zhuǎn)化合適細菌宿主的方法在Sambrook，J.等，《分子克隆實驗指南》，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press中有詳細的介紹，在此引入作為參考。
對典型的粘?？寺碚f，外源DNA分離后，使用合適的限制性內(nèi)切酶將其連接到粘粒載體的cos區(qū)域。然后含有線性外源DNA的粘粒載體與一個DNA包裝載體如λ噬菌體反應(yīng)。在包裝過程中，cos位點被切割，外源DNA被包裝到細菌病毒顆粒的頭部。然后這些顆粒被用于轉(zhuǎn)染合適的宿主細胞，例如大腸桿菌。一旦注射到細胞內(nèi)部，外源DNA在cos粘性末端的影響下環(huán)化。通過這種方式，外源DNA的大片斷能被導(dǎo)入重組宿主細胞，并在其中表達。
粘粒載體和粘粒轉(zhuǎn)化方法在本發(fā)明的上下文中被用來從已知能將甘油加工成1，3丙二醇的細菌種屬中克隆基因組DNA的大片斷。特別是，來自肺炎克雷伯氏菌的基因組DNA用本領(lǐng)域熟知的方法進行了分離，并用限制性內(nèi)切酶Sau 3A消化，然后插入到粘粒載體Supercos 1TM，并用GigapackII包裝抽提物包裝。載體構(gòu)建后，用此粘粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue MR細胞。使細胞在存在甘油的條件下生長，并分析培養(yǎng)基中1，3-丙二醇的形成，來篩選能夠?qū)⒏视娃D(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化子。
對兩個1，3-丙二醇陽性的轉(zhuǎn)化子進行了分析，并將其粘粒命名為pKP1和pKP2。DNA測序表明它們與來自弗氏檸檬酸桿菌的甘油脫水酶有著廣泛的同源性，這證明這些轉(zhuǎn)化子含有編碼甘油脫水酶基因的DNA。對其它1，3-丙二醇陽性的轉(zhuǎn)化子也進行了分析，它們的粘粒命名為pKP4和pKP5。DNA測序表明這些粘粒帶有編碼二醇脫水酶基因的DNA。
雖然本發(fā)明使用了來自一個克雷伯氏菌屬粘粒的分離基因，脫水酶基因的其它來源還可包括但不限于檸檬酸桿菌屬、梭菌屬和沙門氏菌屬。
能正向影響1，3-丙二醇產(chǎn)生的其它基因可在合適的宿主中表達。例如很可能非常需要甘油降解途徑和/或其它途徑中的特定酶超量表達，比現(xiàn)在在野生型細胞中發(fā)現(xiàn)的表達水平要高得多。這可通過將編碼這些酶的基因選擇性克隆到多拷貝質(zhì)粒中或?qū)⑦@些基因置于一個誘導(dǎo)型或組成型的強啟動子的后面來完成。超量表達所需蛋白的方法在分子生物學領(lǐng)域非常普通和熟知，在以上Sambrook文中可找到例子。而且，用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法對特定基因進行特異性地刪除，會明顯影響1，3-丙二醇的產(chǎn)生。這些方法的例子可在《酶學方法》，217卷，R.Wu編，Academic PressSan Diego(1993)中找到。
突變體應(yīng)當理解，除了舉例所用的細胞，本發(fā)明還能使用有著單一或多個突變的細胞，這些突變被特別設(shè)計來增加1，3-丙二醇的產(chǎn)量。通常將碳原料偏離到不能產(chǎn)生1，3-丙二醇的途徑的細胞，或出現(xiàn)明顯的分解代謝產(chǎn)物阻遏的細胞，都可通過突變來消除這些表型缺陷。例如，許多野生型細胞可因培養(yǎng)基中的葡萄糖和副產(chǎn)物產(chǎn)生分解代謝阻遏?？梢岳斫膺@些有機體的突變株，如能抵抗葡萄糖的阻遏而生產(chǎn)1，3-丙二醇，將在本發(fā)明中特別有用。
產(chǎn)生突變體的方法在本領(lǐng)域中非常普通和熟知。例如，野生型細胞可暴露在各種試劑如輻射或化學誘變劑中，然后篩選所需要的表型。當用輻射來產(chǎn)生突變時，紫外線(UV)或離子輻射都可以使用。用于遺傳突變的合適短波紫外線的波長范圍為200nm至300nm，優(yōu)選波長為254nm。這個波長的UV輻射原則上導(dǎo)致核酸序列中的鳥嘌呤和胞嘧啶改變?yōu)橄汆堰屎托叵汆奏?。因為所有的細胞都有DNA修復(fù)機制，能修復(fù)多數(shù)UV誘導(dǎo)的突變，可加入試劑如咖啡堿和其它抑制劑來干擾修復(fù)過程，使有效突變的數(shù)量變得最大。使用波長在300nm至400nm范圍的長波UV誘變也可以，但除非與多種激活劑如能與DNA作用的補骨質(zhì)素染料聯(lián)用，一般不如短波UV有效。
用化學試劑來產(chǎn)生突變體也非常有效，常用的物質(zhì)包括能影響非復(fù)制DNA的化合物如HNO2和NH2OH，以及影響復(fù)制DNA的試劑如吖啶染料，吖啶染料因能引起移碼突變而非常引人注目。用輻射或化學試劑產(chǎn)生突變體的特殊方法在本領(lǐng)域中文獻非常多。例如見，Thomas DBroc k，《生物技術(shù)工業(yè)微生物教程》，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或Deshpande，Mukund V.，《應(yīng)用生物化學和生物技術(shù)》，36卷，227頁，(1992)，這里引入作為參考。
誘變發(fā)生后，具有所需表型的突變體可用多種方法進行選擇。隨機篩選是最常用的，即選擇能產(chǎn)生所需產(chǎn)物或中間產(chǎn)物的誘變細胞。另外，可使誘變?nèi)后w在只有抗性克隆能夠生長的選擇培養(yǎng)基上生長來選擇性地分離突變體。突變體選擇的方法在工業(yè)微生物領(lǐng)域已經(jīng)非常完備和熟知。見Brook上文，DeMancilha等，《食品化學》，14卷，313頁，(1984)。
1，3-丙二醇產(chǎn)生途徑中的突變和轉(zhuǎn)化代表性的酶途徑。從葡萄糖產(chǎn)生1，3-丙二醇可由下面的系列步驟來完成。這個步驟系列是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的多種途徑的代表。葡萄糖經(jīng)過一系列步驟在糖酵解途徑的酶催化下轉(zhuǎn)化為磷酸二羥基丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛(3-PG)。然后，甘油可由DHAP水解成二羥基丙酮(DHA)后還原形成，或由DHAP還原成甘油3-磷酸(G3P)后水解來形成。水解步驟可由各種已知沒有底物特異性的細胞磷酸酶催化，或者這種活性可用轉(zhuǎn)化來導(dǎo)入宿主。還原步驟可由一種NAD+(或NADP+)相連的宿主酶催化，或者這種活性可用轉(zhuǎn)化來導(dǎo)入宿主。值得注意的是dha調(diào)節(jié)子含有一個甘油脫氫酶(E.C.1.1.1.6)，這個酶催化方程3的逆反應(yīng)。
(方程1)(方程2)(方程3)甘油經(jīng)3-羥基丙醛(3-HP)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，這已在前面作了詳細介紹。從甘油產(chǎn)生3-HP(方程1)是由脫水酶催化的，脫水酶可以由宿主編碼或用轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入宿主。這種脫水酶可以是甘油脫水酶(E.C.4.2 1.30)、二醇脫水酶(E.C.4.2.1.28)或任何能夠催化這個轉(zhuǎn)化的酶。甘油脫水酶是由dha調(diào)節(jié)子編碼的，而二醇脫水酶不是。從3-HP產(chǎn)生1，3-丙二醇(方程2)是由一種NAD+(或NADP+)相連的宿主酶催化，或者這種活性可用轉(zhuǎn)化來導(dǎo)入宿主。這個產(chǎn)生1，3-丙二醇的最后反應(yīng)可由1，3-丙二醇脫氫酶(E.C.1.1.1.202)或其它乙醇脫氫酶催化。
影響碳通道的突變和轉(zhuǎn)化。多種在1，3-丙二醇產(chǎn)生途徑含有變異的突變有機體在本發(fā)明中非常有用。例如將一個丙糖磷酸異構(gòu)酶突變(tpi-)引入本發(fā)明的微生物是一個應(yīng)用突變來促進碳通道運行的例子。突變可直接針對一個結(jié)構(gòu)基因來修復(fù)或提高一個酶的活性，或直接針對一個調(diào)節(jié)基因來調(diào)節(jié)一個酶活性的表達水平。
另外，轉(zhuǎn)化和突變可組合使用來控制特定的酶活性，從而增加1，3-丙二醇的生成。因此，對能提高1，3-丙二醇產(chǎn)生的全細胞催化能力的修飾也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
培養(yǎng)基和碳底物本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳底物。合適的碳底物包括但不局限于單糖(如葡萄糖和果糖)、寡糖(如乳糖和蔗糖)、多糖(如淀粉或纖維素)或其混合物和從可再生的原料(如酪清、玉米漿、蔗糖甜菜漿、大麥麥芽)獲得的未純化的混合物。另外，碳底物還可以是已經(jīng)證明可代謝轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵生物化學中間物的一碳底物如二氧化碳或甲醇。由單一碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸)生產(chǎn)甘油在嗜甲基酵母(K.Yamada等，《農(nóng)業(yè)生物化學》，53卷第2期，541-543頁，(1989))和細菌(Hunter等，《生物化學》，24卷，4148-4155頁，(1985))中都已有報導(dǎo)。這些有機體能同化氧化狀態(tài)的范圍從甲醇到甲酸的單碳化合物，并產(chǎn)生甘油。碳同化的途徑可通過核酮糖單磷酸、絲氨酸、或木酮糖單磷酸(Gottschalk，《細菌代謝》，第二版，Springer-VerlagNew York(1986))等途徑。核酮糖單磷酸途徑包括甲酸與核酮糖-5-磷酸結(jié)合而形成一個六碳糖，然后這個六碳糖轉(zhuǎn)化為果糖并最終轉(zhuǎn)化為三碳產(chǎn)物甘油醛-3-磷酸。同樣，絲氨酸途徑經(jīng)過亞甲基四氫葉酸將一碳化合物同化到糖酵解途徑中。
除了一種或兩種碳底物外，嗜甲基有機體還已知有著利用多種含碳化合物(如甲胺和葡萄糖胺)和多種氨基酸的代謝活性。例如，嗜甲基酵母已知可利用甲胺的碳來形成海藻糖和甘油(Bellion等，《微生物在一碳化合物上的生長》(Microb.Growth Cl Compd)，[Int.Symp]，第7期(1993)，415-32頁.編輯Murrel，J.Collin；Kelly，Don P.出版Intercept，Andover，UK)。同樣，假絲酵母屬的許多種能代謝丙氨酸或油酸(Sulter等，《微生物學叢刊》，(1990)，153卷第5期，485-9頁)。應(yīng)當理解本發(fā)明所用的碳源可包括多種含碳底物，并僅由有機體的選擇來限制。
雖然可以理解上述所有提到的碳底物及其混合物在本發(fā)明中都是適用的，但優(yōu)選的底物是葡萄糖、果糖、蔗糖或甲醇。
除了一種合適的碳源，發(fā)酵培養(yǎng)基還必須含有本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的合適的礦物質(zhì)、鹽、輔助因子、緩沖液和其它成分，這些成分應(yīng)適于培養(yǎng)物的生長和啟動1，3-丙二醇產(chǎn)生所必需的酶促途徑。特別應(yīng)當注意Co(II)的鹽類和/或維生素B12或其前體。
培養(yǎng)條件細胞一般在合適的培養(yǎng)基中30℃進行培養(yǎng)。本發(fā)明優(yōu)選的生長培養(yǎng)基為普通的商業(yè)制備培養(yǎng)基，例如Luria Bertani(LB)肉湯、SabouraudDextrose(SD)肉湯、或酵母培養(yǎng)基(YM)肉湯。其它的精確或合成的生長培養(yǎng)基也可以使用，而且特殊微生物生長的合適培養(yǎng)基應(yīng)為微生物學和發(fā)酵科學領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。還可在反應(yīng)培養(yǎng)基中使用已知能直接或間接調(diào)節(jié)代謝終產(chǎn)物抑制的試劑，如環(huán)腺苷2′∶3′-單磷酸。同樣，還可將已知能調(diào)節(jié)酶活性從而導(dǎo)致1，3-丙二醇產(chǎn)生增加的化合物(如甲基紫精)與遺傳操作結(jié)合使用，或用來代替遺傳操作。
發(fā)酵的合適pH范圍在pH5.0至pH9.0之間，其中pH6.0至pH8.0為優(yōu)選的初始條件。
反應(yīng)可在有氧或無氧的條件下進行，其中，優(yōu)選的條件是無氧或微氧。
分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵本方法包括一個分批發(fā)酵的方法。經(jīng)典的分批發(fā)酵是一個封閉的系統(tǒng)，培養(yǎng)基的成分在發(fā)酵開始時設(shè)置好，并在發(fā)酵過程中不再人為改變。因此，在發(fā)酵開始時培養(yǎng)基與所需的有機體或有機體混合物一起接種，在發(fā)酵開始后不再向系統(tǒng)中加入任何東西。在典型情況下，“分批”發(fā)酵是就碳源的加入而言的，人們常常需要控制某些因素如pH和氧濃度。在分批發(fā)酵系統(tǒng)中，系統(tǒng)的代謝和各組分的生物量持續(xù)改變直到發(fā)酵結(jié)束。在分批培養(yǎng)物中，細胞從靜止的延遲期進入高速生長的對數(shù)期并最后進入穩(wěn)定期，在穩(wěn)定期中，細胞的生長率降低或停止。如果不進行處理，處于穩(wěn)定期的細胞會最終死亡。處于對數(shù)期的細胞通常產(chǎn)生大多數(shù)的終產(chǎn)物和中間物。
補料分批系統(tǒng)是標準分批系統(tǒng)的一個變化。補料分批發(fā)酵方法也適用于本發(fā)明，它除了包括經(jīng)典的分批系統(tǒng)外，還包括在發(fā)酵過程中增加底物的量。補料分批系統(tǒng)在分解代謝物抑制細胞代謝時非常有用，因為在這種情況下需要限制培養(yǎng)基中的底物量。測定補料分批系統(tǒng)中的實際底物濃度非常困難，因而只能以可測量因素的變化為基礎(chǔ)進行估計，例如用pH、溶解氧和廢氣如CO2的分壓的變化進行估計。分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵在本領(lǐng)域非常普通和熟知，相應(yīng)的例子可在以上Brock文中找到。
雖然本發(fā)明以分批模式進行，但應(yīng)當理解這些方法也適合于連續(xù)發(fā)酵方法。連續(xù)發(fā)酵是一個開放系統(tǒng)，在連續(xù)發(fā)酵中，一種精確發(fā)酵培養(yǎng)基被連續(xù)加入生物反應(yīng)器中，同時等量的反應(yīng)培養(yǎng)基被移出。連續(xù)發(fā)酵一般使培養(yǎng)物維持持續(xù)的高濃度，而細胞主要處于對數(shù)生長期。
連續(xù)發(fā)酵允許對影響細胞生長或終產(chǎn)物濃度的一個因素或多種因素進行調(diào)節(jié)。例如，一種方法能嚴格保持限制性養(yǎng)分如碳源或氮水平，而讓其它參數(shù)改變。在其它系統(tǒng)中，可以連續(xù)改變多種影響生長的因子，而細胞濃度(用細胞濁度進行測量)保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)盡量保持穩(wěn)定的生長環(huán)境，因此，發(fā)酵中由于取出培養(yǎng)基而造成的細胞損失必須與細胞生長率相平衡。在連續(xù)發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)養(yǎng)分和生長因子的方法以及使產(chǎn)物形成率達到最大的技術(shù)在工業(yè)微生物領(lǐng)域是眾所周知的，而且多種方法已由Brock，上文，作了詳細介紹。
應(yīng)當理解，本發(fā)明可使用分批、補料分批或連續(xù)的方法實現(xiàn)，任何已知的發(fā)酵模式都是適用的。另外，應(yīng)當理解細胞可作為全細胞催化物固定在底物上，為1，3-丙二醇的生成提供發(fā)酵環(huán)境。
1，3-丙二醇的純化和鑒定從發(fā)酵培養(yǎng)基中純化1，3-丙二醇的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，丙二醇可用下述方法從細胞培養(yǎng)基中獲得，這個方法包括用一種有機溶劑抽提反應(yīng)混合物、蒸餾和柱層析(U.S.5,356,812)。在這個過程中，一個特別好的有機溶劑是環(huán)己烷(U.S.5,008,473)。
可以通過對培養(yǎng)基進行高壓液相色譜(HPLC)來直接鑒定1，3-丙二醇。在本發(fā)明中優(yōu)選的方法是在一個分析用離子交換柱上，使用等梯度的0.01N的硫酸作流動相對發(fā)酵培養(yǎng)基進行分析。
細胞適用于本發(fā)明的細胞包括那些攜帶脫水酶的細胞。應(yīng)當理解，合適的細胞既可以是原核細胞也可以是真核細胞，并僅受它們表達活性脫水酶的能力的限制。在本發(fā)明中特別有用的細胞是能方便地應(yīng)用于大規(guī)模發(fā)酵方法的細胞。這樣的有機體在工業(yè)生物工程領(lǐng)域是眾所周知的，它們的例子可在《應(yīng)用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)的重組微生物》，Murooka等編輯，Marcel Dekker，Inc.，New York，New York(1994)中找到，包括發(fā)酵型的細菌以及酵母和絲狀真菌。典型的酶可以是甘油脫水酶也可以是二醇脫水酶，其特異性底物分別為甘油和1，2-丙二醇。脫水酶能將甘油轉(zhuǎn)化為羥基丙醛(3-HPA)，然后3-HPA轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。含有這個途徑的細胞可包括來自檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、沙門氏菌屬和乳桿菌屬的突變或重組有機體。為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的能通過發(fā)酵產(chǎn)生甘油的微生物都可以作為重組脫水酶的宿主，例如曲霉屬、酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、Dunaliella、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬和甲基菌屬。其它在本發(fā)明中適合用作宿主的細胞包括芽胞桿菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬和鏈霉菌屬。若不囿于理論，可以認為，自然界中存在的、屬于上面所提到種類的有機體都適用于本發(fā)明。
在申請人的實驗工作基礎(chǔ)上，應(yīng)當理解多種細胞可用于本發(fā)明。例如申請人已經(jīng)證明，在遺傳和表型組合上差別很大的多種細胞都能將一種合適的碳底物生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，所舉的細胞例子包括一個組合有dha基因的肺炎克雷伯氏菌突變菌株、含有克雷伯氏菌屬基因組中甘油或二醇脫水酶編碼基因的元件的重組大腸桿菌菌株、和也用克雷伯氏菌屬的元件轉(zhuǎn)染并在編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因上帶有一個突變的重組大腸桿菌(tpi-)菌株。
雖然，即使在存在葡萄糖和木糖的情況下，含有來自肺炎克雷伯氏菌的dha調(diào)節(jié)子的大腸桿菌重組子也能將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇(Tong等，《應(yīng)用生物化學和生物技術(shù)》，34卷，149頁(1992))。但在僅有葡萄糖存在的情況下，在這些有機體中不能檢測到1，3-丙二醇。與這一公開內(nèi)容不同，本發(fā)明的申請人發(fā)現(xiàn)，三株大腸桿菌在沒有外源加入甘油存在的情況下由葡萄糖原料產(chǎn)生1，3-丙二醇，這三株大腸桿菌攜帶兩種獨立分離的、含來自肺炎克雷伯氏菌的dha調(diào)節(jié)子的粘粒中的一種。攜帶有含肺炎克雷伯氏菌dha調(diào)節(jié)子的粘粒載體pKP-1或pKP-2的大腸桿菌菌株ECL707，顯示在沒有外源加入甘油的情況下可以檢測到由葡萄糖產(chǎn)生的1，3-丙二醇，雖然產(chǎn)量不高(實施例4)。從另一個宿主有機體-DH5α構(gòu)建而來的重組大腸桿菌菌株也含有pKP-1或pKP-2粘粒載體，這種菌株被發(fā)現(xiàn)在合適的條件下由葡萄糖產(chǎn)生1，3-丙二醇比ECL707重組體有效得多，(實施例3)。在實施例4的條件下，由葡萄糖產(chǎn)生1，3-丙二醇更有效的菌株是含有粘粒載體pKP-1或pKP-2的重組大腸桿菌菌株AA200，實施例2，大腸桿菌AA200含有一個有缺陷的丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi-)。
從轉(zhuǎn)化反應(yīng)獨立分離株的混合物中選擇了AA200-pKP1的一個菌株作進一步的研究，這株細菌經(jīng)過一個兩階段反應(yīng)將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。在第一階段，菌株AA200-pKP1-5在不含葡萄糖和甘油的條件下生長到高細胞濃度。在第二階段，將培養(yǎng)好的細胞懸浮在含有葡萄糖但沒有甘油的培養(yǎng)基中，細胞就會以很高的轉(zhuǎn)化率和選擇性將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，實施例5。雖然在免疫化學、色譜和遺傳上不同，依賴于輔酶B12的酶-甘油脫水酶(E.C.4.2.1.30)和二醇脫水酶(E.C.4.2.1 28)都能催化甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛。dha調(diào)節(jié)子中包含甘油脫水酶，但不含二醇脫水酶。肺炎克雷伯氏菌ATCC8724含有一個二醇脫水酶而不是甘油脫水酶，它能將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇(Forage等，《細菌學雜志》，149卷，413頁，(1982))。重組大腸桿菌菌株ECL707和AA200均含有能編碼二醇脫水酶的粘粒pKP4，它們都能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，實施例2和實施例4。
肺炎克雷伯氏菌ECL2106是從一個天然存在的菌株通過誘變制備而來的(Ruch等，《細菌學雜志》124卷，348頁，(1975))，它能夠組成型表達dha調(diào)節(jié)子(Ruch等，上文；Johnson等，《細菌學雜志》164卷，479頁(1985))。用同樣方法制備了具有同樣表型的肺炎克雷伯氏菌ATCC25955的一個衍生菌株(Forage等，《細菌學雜志》149卷，413頁(1982))?？死撞暇鷮賒ha結(jié)構(gòu)基因的表達部分受一個抑制子的控制(dha R的產(chǎn)物)(Sprenger等，《普通微生物學雜志》135卷，1255頁(1989))。本發(fā)明的申請人已經(jīng)證示，含有組成型dha結(jié)構(gòu)基因的ECL2106能在沒有外源加入甘油的條件下，由葡萄糖原料生產(chǎn)1，3-丙二醇，實施例6。這與野生型的肺炎克雷伯氏菌ATCC25955相反。肺炎克雷伯氏菌ATCC25955在相同條件下不能產(chǎn)生可檢測水平的1，3-丙二醇，實施例6。
ECL2016中dha結(jié)構(gòu)基因的表達進一步受到分解代謝物表達的控制(Sprenger等，《普通微生物學雜志》135卷，1255頁，(1989))。將必需的結(jié)構(gòu)基因置于另外的啟動子控制下能夠消除分解代謝物抑制。這一點已在弗氏檸檬酸桿菌的1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的二醇脫水酶中得到了證實(Daniel等，《細菌學雜志》177卷，2151頁(1995)和Tobimatsu等，《生物與化學雜志》270卷，7142頁，(1995))。通過這種方式在ECL2106中消除分解代謝物抑制，成功地提高了在沒有外源甘油的情況下由葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇的產(chǎn)量。按前述的方法使用合適的碳通道可進一步提高1，3-丙二醇產(chǎn)量，例如使用tpi-突變。
因為檸檬酸桿菌和克雷伯氏菌的dha調(diào)節(jié)子非常相似。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，在克雷伯氏菌中用來在沒有外源甘油的條件下由葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇的技術(shù)也可用于檸檬酸桿菌。而且，因為丁酸梭菌的甘油代謝與肺炎克雷伯氏菌相同(Zeng等，《生物技術(shù)與生物工程》44卷，902頁，(1994))，這些技術(shù)也可用于梭菌。
實施例通用方法磷酸化、連接和轉(zhuǎn)化的過程是本領(lǐng)域眾所周知的，在下面的實施例中適用的技術(shù)可在Sambrook，J等，《分子克隆實驗指南》，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)中找到。
適用于細菌培養(yǎng)物維持和生長的材料和方法是本領(lǐng)域眾所周知的。在下面的實施例中適用的技術(shù)可在《(普通細菌學方法手冊》(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，WillisA.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，編輯)，美國微生物學會，Washington，DC(1994)中，或在Thomas D.Brock的《生物技術(shù)工業(yè)微生物教程》，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.中找到。除非另行說明，所有用于細菌生長和維持的試劑和材料都購自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)和Sigma Chemical Company(St Louis，MO)。
縮寫的含義如下“h”指小時，“min”指分鐘，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“L”指升，50amp為50ug/mL的氨芐青霉素，LB-50amp為含50ug/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani肉湯。
在表中使用了下列縮寫。“Con”為轉(zhuǎn)化，“Sel”是以碳為基礎(chǔ)的選擇性，“nd”指沒有檢測。酶試驗無細胞抽提物中的甘油脫水酶用1，2-丙二醇作底物來測定。這個試驗的基礎(chǔ)是醛與甲基苯并-2-噻唑酮腙反應(yīng)，詳見Forage和Foster的介紹(《生物物理與生物化學學報》(B.B.A)569，249，(1979))。1，3-丙二醇氧化還原酶有時被稱為1，3-丙二醇脫氫酶，其活性可按照Johson和Lin，《細菌學雜志》169卷，2050頁(1987)介紹的方法進行測定。1，3-丙二醇的分離和鑒定甘油到1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化用HPLC來監(jiān)測，使用色譜領(lǐng)域的技術(shù)人員常用的標準技術(shù)和材料進行分析。一個合適的方法是使用一臺WatersMaxima 820 HPLC系統(tǒng)，并用UV(210nm)和RI進行檢測。樣品注入一個已裝有Shodex SH-1011P預(yù)裝柱(6mm×50mm)的Shodex SH-1011柱(8mm×300mm，購自Waters，Milford，MA)，溫度控制在50℃，使用0.01NH2SO4作流動相，流速為0.5mL/min。當需要進行定量分析時，樣品與作為外部標準的一定量的三甲基乙酸一起制備。一般來說，甘油(RI檢測)、1，3-丙二醇(RI檢測)和三甲基乙酸(UV和RI檢測)的保留時間分別為20.67分、20.68分和35.03分。
1，3-丙二醇的產(chǎn)生用GC/MS來證實。使用GC/MS領(lǐng)域的技術(shù)人員常用的技術(shù)和材料進行分析。一個合適的方法是使用一臺與HewlettPackard 5971系列質(zhì)量選擇檢測器(EI)偶聯(lián)的Hewlett Packard 5890系列II氣相色譜和一個HP-INNOWax柱(30m長，0.25mm i.d.，0.25 micro film厚)。所產(chǎn)生的1，3-丙二醇的保留時間和質(zhì)譜圖與確定的1，3-丙二醇(m/e57,58)進行比較。
另一個GC/MS方法包含樣品的衍生。在1.0mL樣品(例如，培養(yǎng)物上清)中加入30uL濃(70％v/v)高氯酸，混勻后將樣品冷凍并干燥。在干燥物中加入雙(三甲基硅)三氯乙胺∶吡啶的1∶1混合物(300uL)，劇烈混勻，在65℃放置1小時。離心除去不溶物，獲得的液體分為兩相，用上層液體進行分析。在一個DB-5柱(48m，0.25mm I.D.，0.25um film厚；獲自J&W Scientific)上對樣品進行層析。從培養(yǎng)物上清中獲得的1，3-丙二醇衍生物的保留時間和質(zhì)譜圖與確定的標準物進行比較。TMS衍生的1，3-丙二醇的質(zhì)譜圖包括205、177、130和115AMU的特征離子。肺炎克雷伯氏菌粘粒文庫的構(gòu)建肺炎克雷伯氏菌(ATCC25955)在100mLLB培養(yǎng)基中37℃通氣培養(yǎng)8小時。使用DuPont SorvallGLC2.B離心機在室溫下將細菌(每管25ml)3000rpm離心15分鐘。取細菌沉淀并棄去上清。將細菌沉淀在-20℃冷凍。按下面指出的方法分離染色體DNA，并注意避免DNA剪切(即避免渦旋)。將每管細菌重新懸浮在2.5mL的50mM Tris-10mM EDTA中，加入500uL溶菌酶(1mg/mL)。溫和懸浮細菌，并將懸液在37℃保溫15分鐘。在懸液中加入十二烷基硫酸鈉至終濃度為0.5％。這會導(dǎo)致溶液變清。在懸液中加入蛋白酶K(50ug/mL)并55℃保溫2小時。將試管取出轉(zhuǎn)至一個冰槽中，并加入氯化鈉至終濃度0.4M。在溶液中加入兩倍體積的乙醇。用一根玻璃管插入界面使DNA溫和地纏繞在其上。將DNA浸入一個含70％乙醇的試管中。真空干燥后，將DNA重新懸浮于50uL水中，并用分光光度法測定DNA的濃度。取小份DNA稀釋后在0.5％的瓊脂糖凝膠上觀察DNA的完整性。
染色體DNA按Sambrook等，上文，介紹的方法用Sau 3A部分消化，DNA(0.2ug)用2單位的Sau 3A(Promega，Madison，WI)在室溫下消化，反應(yīng)總體積為200uL。在0、5、10和20分鐘分別取樣(50uL)，轉(zhuǎn)入含5umol EDTA的試管中，將這些試管在70℃保溫10分鐘。取一份(2uL)在0.5％的瓊脂糖凝膠上電泳分析，確定消化的水平，剩余的樣品(48uL)在-20℃保存。將凝膠用溴化乙啶染色并在UV下觀察來測定染色體的部分消化。觀察到染色體DNA的大小隨時間的延長而變小，這表明染色體DNA的變小是由于Sau 3A作用。用標準程序方法從剩余樣品中抽提DNA(Sambrook等，上文)。
肺炎克雷伯氏菌的部分消化DNA粘粒文庫用Supercos粘粒載體試劑盒和GigapackII包裝抽提物制備，所用的試劑購自Stratagene(La Jolla，CA)。操作按廠家提供的說明進行。包裝后的肺炎克雷伯氏菌用轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-Blue MR來測定，含有4×104至1.0×105的噬菌體滴度。
從6個大腸桿菌轉(zhuǎn)化子中分離到了粘粒DNA，并發(fā)現(xiàn)它們含有大的DNA插入片斷(25至30kb)。
實施例1用粘粒DNA克隆和轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞來表達1，3-丙二醇培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基S12用來篩選能產(chǎn)生1，3-丙二醇的細菌轉(zhuǎn)化子。S12培養(yǎng)基含有10mM硫酸銨、50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0、2mMMgCl2、0.7mM CaCl2、50uM MnCl2、1uM FeCl3、1uM ZnCl2、1.7uM CuSO4、2.5uM CoCl2、2.4uM Na2MoO4和2uM鹽酸硫胺素。
培養(yǎng)基A用于生長和發(fā)酵，它包含10mM硫酸銨、50mMMOPS/KOH緩沖液，pH7.5、5mM磷酸鉀緩沖液，pH7.5、2mMMgCl2、0.7mM CaCl2、50uM MnCl2、1uM FeCl3、1uM ZnCl2、1.72uM CuSO4、2.53uM CoCl2、2.4uM Na2MoO4、2uM鹽酸硫胺素、0.01％酵母抽提物、0.01％酪蛋白氨基酸、0.8ug/mL維生素B12和50amp。根據(jù)需要，培養(yǎng)基A可補加0.2％的甘油或0.2％的甘油加0.2％的D-葡萄糖。細胞肺炎克雷伯氏菌ECL2106(Ruch等，《細菌學雜志》124卷，348頁(1975))在文獻中也被稱為產(chǎn)氣克雷伯氏菌或產(chǎn)氣氣桿菌。該菌獲自E.C.C.Lin(Harvard Medical School，Cambridge，MA)，并作為實驗室培養(yǎng)物保藏。
肺炎克雷伯氏菌ATCC25955購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville MD)。
大腸桿菌DH5α購自Gibco/BRL，并用分離自肺炎克雷伯氏菌ATCC25955、含有編碼甘油或二醇脫水酶的基因的粘粒DNA進行了轉(zhuǎn)化。含有甘油脫水酶的粘粒被確定為pKP1和pKP2，含有二醇脫水酶的粘粒被確定為pKP4。轉(zhuǎn)化后的DH5α細胞被確定為DH5α-pKP1、DH5α-pKP2和DH5α-pKP4。
大腸桿菌ECL707(Sprenger等，《普通微生物學雜志》135卷，1255頁(1989))獲自E.C.C.Lin(Harvard Medical School，Cambridge，MA)，并轉(zhuǎn)化有相同的來自肺炎克雷伯氏菌的粘粒DNA。含有甘油脫水酶基因的轉(zhuǎn)化子被確定為ECL707-pKP1和ELC707-pKP2，含有二醇脫水酶基因的轉(zhuǎn)化子被確定為ECL707-pKP4。
大腸桿菌AA200(Anderson等，《普通微生物學雜志》62卷，329頁(1970))購自Genetic Stock Center，Yale University(New Haven，CT)，這個菌株在tpi基因上有一個突變。用克雷伯氏菌粘粒DNA轉(zhuǎn)化該菌株得到含有甘油脫水酶基因的AA200-pKP1和AA200-pKP2重組有機體，和含二醇脫水酶基因的AA200-pKP4重組有機體。DH5α用肺炎克雷伯氏菌DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-Blue MR，選取約含1000個菌落的六個轉(zhuǎn)化平板，用5mL LB培養(yǎng)基洗滌平板并離心。收集菌體并重新懸浮在5mL LB培養(yǎng)基+甘油中。取一份(50uL)接種到裝有S12合成培養(yǎng)基并含有0.2％甘油+400ng/毫升的維生素B12+0.001％酵母抽提物+50amp的15mL試管中。試管中裝滿培養(yǎng)基直至頂部，用封口膜封好并在30℃保溫。48小時后觀察到輕微的渾濁。按上面所述方法分別在78小時和132小時取一份培養(yǎng)物來分析產(chǎn)物的分布。各份培養(yǎng)物均為1，3-丙二醇陽性，時間點越后，產(chǎn)生的1，3-丙二醇越多。
將檢測為1，3-丙二醇生成陽性的細菌系列稀釋后涂布到LB-50amp平板上來分離單個的菌落。共分離到48個單菌落并再次檢測它們能否產(chǎn)生1，3-丙二醇。從6個獨立克隆中分離粘粒DNA并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中。再次檢測轉(zhuǎn)化子能否產(chǎn)生1，3-丙二醇。對兩個轉(zhuǎn)化子做了進一步的分析，并將它們命名為DH5α-pKP1和DH5α-pKP2。
將pKP1中一段12.1kb的EcoRI-SalI片斷亞克隆到pIBI31(IBIBiosystem，New Haven，CN)中，對這段序列做序列分析并將其命名為pHK28-26(SEQ ID NO1)。測序結(jié)果揭示了編碼甘油脫水酶的dhaT操縱子的相關(guān)開放閱讀框和必需調(diào)節(jié)基因的位置，參見SEQ ID NO1，在堿基1-399上發(fā)現(xiàn)了一個編碼二羥基丙酮激酶的開放閱讀框dhaK；在堿基983-2107上發(fā)現(xiàn)了編碼甘油脫氫酶的開放閱讀框dhaD；在堿基2209-4134上發(fā)現(xiàn)了編碼抑制子的開放閱讀框dhaR；在堿基5017-6180上發(fā)現(xiàn)了編碼1，3-丙二醇氧化還原酶的開放閱讀框dhaT；在堿基7044-8711上發(fā)現(xiàn)了編碼甘油脫水酶α亞單位的開放閱讀框dhaB1；在堿基8724-9308上發(fā)現(xiàn)了編碼甘油脫水酶β亞單位的開放閱讀框dhaB2；在堿基9311-9736上發(fā)現(xiàn)了編碼甘油脫水酶γ亞單位的開放閱讀框dhaB3；并在堿基9749-11572上發(fā)現(xiàn)了編碼未知功能蛋白的開放閱讀框dhaBX。
用來自肺炎克雷伯氏菌的包裝好的粘粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-BlueMR，挑取單個菌落接種到含有200uLS15培養(yǎng)基(硫酸銨，10mM、磷酸鉀緩沖液，pH7.0，1mM、MOPS/KOH，pH7.0、50mM、MgCl2，2mM、CaCl2，0.7mM、MnCl2，50uM、FeCl3，1uM、ZnCl2，1uM、CuSO4，1.72uM、CoCl2，2.53uM、Na2MoO4，2.42uM和鹽酸硫胺素，2uM)+0.2％甘油+400ng/mL維生素B12+0.001％酵母抽提物+50ug/mL氨芐青霉素的微滴定孔中。除了接種微滴定孔外，還接種一個含LB-50amp的主平板，96小時后，取出100uL，在一個含0.2微米尼龍纖維膜的Rainin微離心管中離心，細菌留在膜上，將膜處理后做HLPC分析。在篩選了240個克隆后，鑒定到了證明能產(chǎn)生1，3-丙二醇的陽性克隆。共鑒定到了三個陽性克隆，其中兩個能在LB-50amp上生長，另一個不能。從兩個能在LB-50amp上生長的陽性克隆的一個中分離了一個單菌落，并證實這個菌落能產(chǎn)生1，3-丙二醇。這個菌落被命名為pKP4。從含有pKP4的大腸桿菌菌株中分離粘粒DNA，并用它來轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將一個獨立的轉(zhuǎn)化子命名為.DH5α-pKP4。這個轉(zhuǎn)化子證實能產(chǎn)生1，3-丙二醇。ECL707用對應(yīng)于pKP1、pKP2、pKP4的肺炎克雷伯氏菌DNA粘粒和Supercos空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌ECL707菌株，所獲得的轉(zhuǎn)化子分別命名為ECL707-pKP1、ECL707-pKP2、ECL707-pKP4和ECL707-pKP-sc。ECL707含有缺陷的glpK、gld和ptsD，這三個基因分別編碼ATP依賴的甘油激酶、NAD+相連的甘油脫氫酶和磷酸烯醇式丙酮酸依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的催化磷酸二羥基丙酮的酶II。
在LB-50amp平板上，從每次粘粒轉(zhuǎn)化中分離20個單菌落，并從Supercos空載體(陰性對照)轉(zhuǎn)化中分離5個單菌落，將它們轉(zhuǎn)入一個LB-50amp主平板。同樣檢測這些菌落將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的能力，從而確定它們是否含有脫水酶活性。用無菌牙簽將這些轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入微滴定板。微滴定板中含有200uL的培養(yǎng)基A，并補加有0.2％甘油或0.2％甘油+0.2％D-葡萄糖，再30℃保溫48小時后，將微滴定板小孔中的內(nèi)容物濾過一個0.45u的尼龍濾器，然后用HLPC進行層析。這些檢測的結(jié)果在表1中給出。
表1轉(zhuǎn)化的ECL707將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇陽性菌落的數(shù)目/檢測菌落的數(shù)目轉(zhuǎn)化子 甘油 甘油+葡萄糖ECL707-pKP1 19/20 19/20ECL707-pKP2 18/20 20/20ECL707-pKP4 0/20 20/20ECL707-sc0/5 0/5AA200用對應(yīng)于pKP1、pKP2、pKP4的肺炎克雷伯氏菌DNA粘粒和Supercos空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌AA200菌株，所獲得的轉(zhuǎn)化子分別命名為AA200-pKP1、AA200-pKP2、AA200-pKP4和AA200-pKP-sc。菌株AA200在磷酸丙糖異構(gòu)酶上有缺陷，(tpi-)。
按在大腸桿菌ECL707中介紹的方法，從每次粘粒轉(zhuǎn)化中分離20個單菌落，并從Supercos空載體轉(zhuǎn)化中分離5個單菌落，檢測這些菌落將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的能力，這些檢測的結(jié)果見表2。
表2轉(zhuǎn)化的AA200將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇陽性菌落的數(shù)目/檢測菌落的數(shù)目轉(zhuǎn)化子 甘油 甘油+葡萄糖AA200-pKP1 17/20 17/20AA200-pKP2 17/20 17/20AA200-pKP4 2/20 16/20AA200-sc0/50/5實施例2轉(zhuǎn)化有含脫水酶活性的肺炎克雷伯氏菌DNA的大腸桿菌AA200菌株將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇從含有肺炎克雷伯氏菌dha調(diào)節(jié)子粘粒pKP1或pKP2、肺炎克雷伯氏菌pdu操縱子粘粒pKP4或Supercos空載體的大腸桿菌菌株AA200中挑取單菌落，接種到裝滿培養(yǎng)基(約14mL實施例1中介紹的培養(yǎng)基A，并補加有10ug/mL的卡那霉素和0.2％的D-葡萄糖，加上或減去0.5-1.0mM的環(huán)腺苷酸-2′∶3′單磷酸(cAMP))的玻璃血清瓶中。為避免與甘油接觸，接種可用一個LB-50amp瓊脂)平板或用相同培養(yǎng)基制備的液體培養(yǎng)物來進行。整個反應(yīng)可在30℃保溫約72小時并250rpm振蕩。細菌的生長用600nM處的光吸收值的變化來測定，起始OD600為0.020AU。葡萄糖減少和產(chǎn)物分布的量用HLPC來測定。單菌落用編號的后綴“-x”來表示。例如，AA200-pKP1-x。積累的結(jié)果見表3和表4。
表3轉(zhuǎn)化的大腸桿菌AA200菌株將0.2％的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇無cAMP轉(zhuǎn)化子 OD6001，3-丙二醇(mM) 轉(zhuǎn)化率(％) 選擇性(％)AA200-pKP1-30.056 0.05 17 1AA200-pKP1-50.115 nd 0.. 0.007 nd 0.. 0.076 0.2 14 5AA200-pKP1-20 0.116 nd 27 0
0.2050.3178AA200-pKP2-10 0.0980.2137AA200-pKP2-14 0.1170.51714.. 0.1290.2195AA200-pKP2-20 0.094nd 110AA200-pKP4-4 0.1980.1282AA200-pKP4-19 0.1970.2343AA200-pKP4-20 0.2060.1381AA200-sc-1 0.097nd 220.. 0.176nd 460表4轉(zhuǎn)化的大腸桿菌AA200菌株將0.2％的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇有cAMP轉(zhuǎn)化子 OD6001，3-丙二醇(mM) 轉(zhuǎn)化率(％) 選擇性(％)AA200-pKP1-3 0.102 0.5 19 12AA200-pKP1-5 0.088 1.5 21 37.. 0.236 1.4 24 28.. 0.071 0.8 15 23A200-pKP1-20 0.153 nd40 0.. 0.185 0.9 27 16AA200-pKP2-10 0.098 0.2 13 7AA200-pKP2-14 0.213 2.0 26 27.. 0.155 0.6 25 12AA200-pKP2-20 0.198 1.2 40 14AA200-pKP4-4 0.218 0.1 31 2AA200-pKP4-19 0.223 0.2 37 3AA200-pKP4-20 0.221 0.2 35 3AA200-sc-1 0.111 nd23 00.199 nd49 00.122 nd25 0a1，3-丙二醇的鑒定用通用方法中介紹的GC/MS方法證實。
實施例3轉(zhuǎn)化有含脫水酶活性的肺炎克雷伯氏菌DNA的大腸桿菌DH5α菌株將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇按實施例2的方法，檢測含肺炎克雷伯氏菌dha調(diào)節(jié)子粘粒pKP1或pKP2的大腸桿菌DH5α菌株將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的能力。結(jié)果列于表5。
表5轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株DH5α將0.2％的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇加上(+)和減去(-)cAMP轉(zhuǎn)化子 OD6001，3-丙二醇(mM) 轉(zhuǎn)化率(％) 選擇性(％)DH5α-pKP1(-) 0.630 0.5 100 2DH5α-pKP1(+) 0.774 0.6 100 3DH5α-pKP2(-) 0.584 0.6 100 3DH5α-pKP2(+) 0.699 0.7 100 3實施例4轉(zhuǎn)化有含脫水酶活性的肺炎克雷伯氏菌DNA的大腸桿菌ECL707菌株將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇按實施例2的方法，檢測含肺炎克雷伯氏菌dha調(diào)節(jié)子粘粒pKP1或pPK2、肺炎克雷伯氏菌pdu操縱子粘粒pKP4或Supercos空載體的大腸桿菌ECL707菌株將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的能力。在每次實驗中，對轉(zhuǎn)化進行定量。結(jié)果列于表6。
表6轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株ECL707將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇有和沒有cAMP轉(zhuǎn)化子 OD6001，3-丙二醇(mM) OD6001，3-丙二醇(mM)(沒有cAMP) (有cAMP)ECL707-pKP1-1 0.607 0.1 0.475 0.1ECL707-pKP1-3 0.619 0.1 0.422 0.1ECL707-pKP1-7 0.582 0.2 0.522 0.2ECL707-pKP1-10 0.593 0.1 0.408 0.1ECL707-pKP1-18 0.584 0.1 0.433 0.1ECL707-pKP2-4 0.5880.10.4080.1ECL707-pKP2-5 0.6300.10.5160.2ECL707-pKP2-8 0.5420.10.4860.1ECL707-pKP2-15 0.5890.10.4850.1ECL707-pKP2-19 0.5770.10.5040.1ECL707-pKP4-8 0.499nd 0.361＜0.1ECL707-pKP4-9 0.544nd 0.354ndECL707-pKP4-10 0.515nd 0.265＜0.1ECL707-pKP4-14 0.512nd 0.318＜0.1ECL707-pKP4-17 0.545nd 0.388＜0.1ECL707-sc-10.592nd 0.385nd實施例5大腸桿菌菌株AA200-pKP1-5經(jīng)過兩個階段將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇將AA200-pkp1-5的單菌落接種在含50mL LB-amp培養(yǎng)基的Baffled瓶(250m1)中，細胞在30℃或37℃振蕩(250rmp)生長增殖過夜。
將生長好的培養(yǎng)物離心(10分鐘，10,000rpm，4℃)，并重新懸浮于不含葡萄糖的生產(chǎn)培養(yǎng)基中(10mM硫酸銨、5mM磷酸鉀緩沖液，pH7.5、50mM MOPS緩沖液，pH75、0.01％酵母抽提物、001％酪蛋白氨基酸、0.8ug/mL維生素B12和50ug/mL氨芐青霉素)。培養(yǎng)基中含有痕量的金屬A(0.08uM CoCl2、0.06uM CuCl2、7uM FeSO4、2uM H3BO4、0.2uM MnCl2、0.1uM Na2MoO4、0.08uM NiCl2、0.3uMZnSO4和0.03mM硫胺素)，或含有痕量的金屬B(0.7mM CaCl2、2.53uMCoCl2、1.72uM CuSO4、1.0uM FeCl3、2mM MgCl2、0.05mMMnCl2、2.42uM Na2MoO4、1.0uM ZnCl2和0.03mM硫胺素)。再次將細胞.離心，并重新懸浮于50mL含D-葡萄糖的新鮮生產(chǎn)培養(yǎng)基中，將重新懸浮的細胞裝入一個60mL用異丁烯橡膠隔膜封口的血清瓶中。將血清瓶振蕩(250rpm)，并用一個注射器穿過隔膜取樣，取出的樣品在分析前用0.2u的濾膜過濾。結(jié)果見表7和表8。殘留的葡萄糖用酶促分析(Biochemistry Analyzer，Yellow Srings Instruments Co，Inc)進行測定，1，3-丙二醇用HLPC分析。
表7大腸桿菌AA200-pKP1-5將0.2％的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇先進行增殖反應(yīng)a實驗 時間(天) 葡萄糖(mM) 1，3-丙二醇(mM) 轉(zhuǎn)化率(％) 選擇性(％)#11 0.1 2.399 10#14 0.1 2.399 10#21 2.8 2.375 14#24 0.1 2.499 11a含有痕量金屬A的反應(yīng)物在37℃進行接種。
表8大腸桿菌AA200-pKP1-5a將1％的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇時間(天) 葡萄糖(mM) 1，3-丙二醇(mM) 轉(zhuǎn)化率(％) 選擇性(％)0 53 0 0 01 395.6 26 202 358.3 34 233 338.4 38 21ba含有痕量金屬B的反應(yīng)物在30℃進行接種。b在反應(yīng)結(jié)束時，1，3-丙二醇的存在用GC/MS和13C-NMR(300MHz)來證實。
實施例6肺炎克雷伯氏菌ECL2106將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-甘油醇但肺炎克雷伯氏菌ATCC25955不能轉(zhuǎn)化從一個含有肺炎克雷伯氏菌ECL2106或ATCC25955的LB瓊脂平板中挑取細菌，小心接種到裝滿培養(yǎng)基(約14mL)的血清瓶中。培養(yǎng)基中含有50mM葡萄糖、3mM(NH4)2SO4、0.9mM CaCl2、4uM CoCl2、0.06uM CuCl2、7uM FeSO4、2uM H3BO4、0.8mM MgSO4、0.2uMMnCl2、0.1uM Na2MoO4、0.08uM NiCl2、0.3uM ZnSO4、0.1mg/mLDL-半胱氨酸、10uM乙二胺四乙酸、0.8ug/mL維生素B12、表9中標明的磷酸鉀，以及50mM的HEPES或者MOPS緩沖液，PH7.5。反應(yīng)物在30℃振蕩(250rpm)47小時?；蛘叻磻?yīng)按實施例2介紹的方法進行。結(jié)果在表9中給出。
表9肺炎克雷伯氏菌ECL2106將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3甘油醇但肺炎克雷伯氏菌ATCC25955不能轉(zhuǎn)化菌株 緩沖液 Pi(mM) 葡萄糖(mM) 1，3-丙二醇(mM)2106 MOPS 5.0 11.4 0.22106 MOPS 2.5 13.9 0.22106 MOPS 1.3 14.8 0.12106 MOPS 0.6 15.8 0.12106 HEPES5.0 21.1 0.12106 HEPES2.5 23.4 0.12106 HEPES1.3 26.4 0.12106 HEPES0.6 27.5 0.125955 MOPS 5.0 4.4 nd25955 MOPS 2.5 5.4 nd25955 MOPS 1.3 2.8 nd25955 MOPS 0.6 7.8 nd25955 HEPES5.0 7.0 nd25955 HEPES2.5 13.5 nd25955 HEPES1.3 10.2 nd25955 HEPES0.6 17.8 nd實施例7用重組巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)1，3-丙二醇通用表達質(zhì)粒的構(gòu)建用來自pAO815(Invitrogen，San Diego，CA)的0.9kbEcoRI/XbalI片斷取代pHIL-D4(Phillips，Petroleum，Bartlesville，OK)中的0.9kb EcoRI/XbalI片斷，產(chǎn)生了含有下列元件的質(zhì)粒pHIL-D4B25′AOX1，為巴斯德畢赤酵母的甲醇誘導(dǎo)型乙醇氧化酶I(AOX1)啟動子；AOX1 term，為巴斯德畢赤酵母AOX1的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域；HIS4，為用于在his4宿主中進行篩選的巴斯德畢赤酵母組氨醇脫氫酶編碼基因；Ran，是從轉(zhuǎn)座子Tn903中獲得的序列，它編碼氨基糖苷-3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶，從而可在多種宿主中提供卡那霉素、新霉素和G418抗性，并可用作盒拷貝數(shù)目的指示；3′AOX1，為巴斯德畢赤酵母中AOX1的下游序列，與5′AOX1一起用于定點的載體整合；ori，為pBR322的DNA復(fù)制起點，使質(zhì)粒能在大腸桿菌中操作；和amp，為來自pBR322的β-內(nèi)酰胺酶基因，提供青霉素抗性。pHIL-D4B2的另一個特征是用將Bgl2/Xbal片段上的盒亞克隆到BamHI/Xba1位點的方法，能很容易地將多個表達盒(5′AOX1-基因-AOX1term)放置在一個質(zhì)粒上。
dhaB1和dhaB2共表達質(zhì)粒的構(gòu)建使用5′端含有EcoRI位點的引物(dhaB1和dhaB2的引物分別為SEQID N02、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4、SEQ ID NO5)，用PCR的方法從粘粒pKP1中擴增dhaB1和dhaB2的開放閱讀框(10mM Tris pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.0001％明膠，200uM dATP，200uMdCTP，200uM dGTP，200uM dTTP，1uM每種引物，1-10ng靶DNA，25單位/mL AmplitaqDNA聚合酶Perkin Elmer Cetus，Norwalk CT)。PCR的參數(shù)為94℃，1分鐘、55℃，1分鐘、72℃，1分鐘，共進行35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pHIL-D4B2的EcoRI位點中，從而產(chǎn)生分別含有dhaB1和dhaB2的表達質(zhì)粒pMP19和pMP20。
將pMP19的Bgl2/Xbal片斷上的dhaB1表達盒亞克隆到pMP20的BamHI/Xba1位點上，從而產(chǎn)生pMP21。質(zhì)粒pMP21含有dhaB2和dhaB1兩者的表達盒，并含有HIS4選擇標記。dhaB3和dhaT共表達質(zhì)粒的構(gòu)建使用5′端含有EcoRI位點的引物(dhaT和dhaB3的引物分別為SEQ IDNO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8、SEQ ID NO9)，用PCR的方法從粘粒pKP1中擴增dhaT和dhaB3的開放閱讀框。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pHIL-D4B2的EcoRI位點中，從而產(chǎn)生分別含有dhaT和dhaB3的表達質(zhì)粒pMP17和pMP18。
將pMP17的Bgl2/Xba1片斷上的dhaT表達盒亞克隆到pMP18的BamHI/Xba1位點上，從而產(chǎn)生pMP22。質(zhì)粒pMP22含有dhaT和dhaB3兩者的表達盒。
從pRK20(Phillips Petroleum，Bartlesville，OK)中刪除4.1kb的含有SUC2的EcoRI片斷，產(chǎn)生pMP2。SUC2編碼一個蔗糖酶，這個基因在畢赤酵母中可用作二級選擇標記。從pMP2中刪除4.0kb的含有l(wèi)acZ的Hind3片斷，產(chǎn)生pMP3。將pHIL-D4B2中含AOX1term的0.4kb Hind3片斷亞克隆到pMP3的Hind3位點中，產(chǎn)生pMP10。
用來自pMP22的含有dhaB3和dhaT表達盒的5.0kbBgl2/Xba1片斷取代pMP10中的2.0kb的Bgl2/Xba1片斷，產(chǎn)生pMP23。將來自pRK20含SUC2的5.4kb的Pst1/Bgl2片斷亞克隆到pSP73(Progema，Madison，WI)的Pst1/Bgl2位點中，產(chǎn)生pMP11a。用EcoRI切割質(zhì)粒pMP11a，然后用T4 DNA聚合酶補齊并重新連接，產(chǎn)生pMP11b。用來自pMP11b的含有SUC2.的5.4kb Bgl2/Pst1片斷取代pMP10中的1.1kb的Pst/Bgl2片斷，產(chǎn)生pMP12。
用來自pMP12含SUC2的5.2kb Sca1/Bgl2片斷取代pMP23的1.0kbSca1/Bgl2片斷，產(chǎn)生pMP24質(zhì)粒pMP24含dhaT和dhaB3兩者的表達盒和SUC2選擇標記。用dhaB1/dhaB2表達質(zhì)粒pMP21轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母使用Gregg等介紹的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(《分子細胞生物學》第5卷，3376頁，(1985))，用1-2ug Bgl線性化的質(zhì)粒pMP21轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌株GTS 115(his4)(Phillips Petroleum，Bartlesville，OK)。細胞在不含組氨酸的平板上30℃再生3-4天。質(zhì)粒整合到染色體上后，轉(zhuǎn)化子開始生長。將轉(zhuǎn)化子收集到一個YPD(1％Bacto酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)主平板上。篩選含有dhaB1和dhaB2的巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子從上面介紹的his+轉(zhuǎn)化子中制備染色體DNA，并用dhaB1和dhaB2特異的引物進行PCR分析。使轉(zhuǎn)化子在補加有G418(Sigma，St.Louis，MO)的YPD培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)基中補加的G418的水平不斷提高直至2000ug/mL。用這種方法可從含有dhaB1和dhaB2兩者的轉(zhuǎn)化子中選擇高拷貝數(shù)的菌株。能夠抵抗高水平的G418表明表達盒的明顯增加。用dhaB3/dhaT表達質(zhì)粒pMP24第二次轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，用質(zhì)粒pMP24再次轉(zhuǎn)化上面介紹的對高水平G418有抗性的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化后的細胞首先在非選擇平板上30℃培養(yǎng)2天進行再生，從平板上刮取含再生細胞的上層瓊脂，在20mL水中渦旋混勻。使細胞通過四層薄棉布后，離心沉淀細胞，并重新懸浮于10mL水中。將懸液分成200uL的小份，涂布到蔗糖平板上，30℃溫育2天。質(zhì)粒整合到染色體上后，所有的轉(zhuǎn)化子開始生長。轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)為小菌落背景上的大菌落，分離轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子在Msu培養(yǎng)基(每升，13.4克有/無氨基酸的酵母氮源，10克蔗糖，0.4克生物素)中30℃振蕩培養(yǎng)24小時。然后在Msu平板(Msu培養(yǎng)基加15g/mL的瓊脂)劃線并30℃培養(yǎng)2天。將分離的大菌落點種到一個YPD主平板上。篩選含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT以及它們對應(yīng)的酶活性的巴斯德畢赤酵母雙重轉(zhuǎn)化子從上面介紹的suc+雙重轉(zhuǎn)化子中制備染色體DNA，用dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT特異的引物對染色體做PCR分析。從而證明所有四個開放閱讀框的存在。
使用體外酶試驗來證明活性的甘油脫水酶(dhaB)和1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)的存在。另外，用Western印跡可以證實所有開放閱讀框表達的蛋白。用來分析上述蛋白的無細胞抽提物按下面的方法進行制備。含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT的雙重轉(zhuǎn)化子在MGY(每升，13.4克有/無氨基酸的酵母氮源，0.4毫克生物素，10毫升甘油)中30℃通氣振蕩培養(yǎng)2天。離心沉淀細胞，重新懸浮在MM(每升，13.4克有/無氨基酸的酵母氮源，0.4克生物素，5毫升甲醇)中，按上面的方法溫育，約24小時后，收集細胞，重新懸浮在緩沖液(0.1M tricene/KOH緩沖液，pH8.2，50mM KCl，2％1，2-丙二醇)中，機械破碎(使用玻棒，在存在玻璃珠的情況下渦旋)，然后離心。
有一菌株對dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT以及它們對應(yīng)的酶活性的存在都顯示出陽性，將這株菌命名為MSP42.81，并用于進一步的研究。用重組的巴斯德畢赤酵母體內(nèi)生產(chǎn)1，3-丙二醇在一個裝有1.5L基本培養(yǎng)基的BiostatB發(fā)酵罐中(B Braun Biotech，Inc.)培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母MSP42.81(ATCC74363)，基本培養(yǎng)基含有8.5g/L KH2PO4、2.1g/L(NH4)2SO4、10g/L甘油、2.3g/L MgSO47H2O、0.18g/L CaSO42H2O和0.29mL/L PTMI。PTMI是礦物質(zhì)溶液的儲存液，它包含24mM CuSO4、4.8mM KI、18mM MnSO4、0.8mMNa2MoO4、0.3mM H3BO3、2.1mM CoCl2、70mM ZnSO4、26mMH2SO4、234mM FeSO4和0.8mM生物素。發(fā)酵罐的pH值用加入2MNH4OH的方法控制在pH5.0，溫度控制在30℃，溶解氧分壓用通氣控制的方法控制在30％。使用在YM肉湯中培養(yǎng)的巴斯德畢赤酵母MSP42.81作種子培養(yǎng)物。發(fā)酵罐中接種20mL種子培養(yǎng)物。
當甘油被消耗后(接種后約24小時)，加入甲醇原料來誘導(dǎo)AOX啟動子。甲醇原料中含有1升甲醇、5mL PTMI和5mL用水制備的濃度為0.2g/L生物素儲存液。甲醇用手工方式加入并使其平均濃度為0.5％，甲醇的濃度用HPLC分析來測定。誘導(dǎo)15小時后，從反應(yīng)器中取出50mL的細胞(OD600＝20AU)。
將50mL細胞懸液沉淀，重新懸浮于12.5mL充有氮氣的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(6.7g/L酵母氮源，3.0g/L酵母抽提物，1.0g/L K2HPO4，1.0g/L KH2PO4，3.0g/L(NH4)2SO4，滴定至pH7.2，過濾除菌)。在細胞懸液中加入輔酶B12至終濃度為20ug/mL。輔酶B12事先在充有氮氣的水中制備成2mg/mL的儲存液。用基本培養(yǎng)基制備三種培養(yǎng)基儲存液，它們分別含有1％的葡萄糖、0.5％的葡萄糖和0.5％甘油(w/v)、和1％甘油(w/v)，同時還制備氯喹儲存液(1.06g/50mL，pH7.2)。
在10mL縐紋(crimp)密封的血清瓶中裝入2mL培養(yǎng)基儲存液和1mL氯喹與水的混合物，使其終濃度為表10中列出的濃度，并且在加入1mL的細胞和輔酶Bi2混合物前充入氮氣。將血清瓶在30℃振蕩溫育，用HPLC分析加入細胞后立即取出的樣品和溫育24小時后取出的樣品。結(jié)果見表10。
表10用重組巴斯德畢赤酵母體內(nèi)生產(chǎn)1，3-丙二醇反應(yīng)培養(yǎng)基a氯喹(mM) 1，3-丙二醇(mM)1 葡萄糖b0 0.042 葡萄糖 2.5 0.23 葡萄糖 5 0.14 葡萄糖 100.15 葡萄糖b/甘油 0 0.26 葡萄糖/甘油 2.5 0.47 葡萄糖/甘油 5.0 0.48 葡萄糖/甘油 10.0 1.2c9 甘油 0 0.210 甘油 2.5 0.311 甘油 5.0 0.312 甘油 101.4c
a除非指明，24小時內(nèi)各底物的利用率均低于10％。
b24小時后沒有葡萄糖殘留。
c1，3-丙二醇的存在用通用方法中介紹的GC/MS來證實。
實施例8用巴斯德畢赤酵母雙重轉(zhuǎn)化子由D-葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇在一個裝有1.5L基本培養(yǎng)基的BiostatB發(fā)酵罐中(B Braun Biotech，Inc.)培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母MSP42.81，基本培養(yǎng)基含有8.5g/L KH2PO4、2.1g/L(NH4)2SO4、10g/L葡萄糖、2.3g/L MgSO47H2O、0.18g/LCaSO42H2O和0.29mL/L PTMI?；蛘?，發(fā)酵和誘導(dǎo)條件與實施例7中介紹的相同。誘導(dǎo)15小時后，從發(fā)酵罐中取出50mL細胞。
細胞懸液按實施例7中介紹的方法進行處理，不同之處在于使用一個調(diào)整的基本培養(yǎng)基(6.7g/L酵母氮源，1.0g/L K2HPO4，1.0g/L KH2PO4，3.0g/L(NH4)2SO4，滴定至pH7.2，過濾除菌)。三種培養(yǎng)基儲存液也用這種調(diào)整的基本培養(yǎng)基制備。其它的溶液都相同。按已介紹的方法制備反應(yīng)混合物，30℃振蕩溫育。用HPLC對加入細胞后立即取出的樣品和接種75小時后取出的樣品進行分析。在含有葡萄糖作為碳源和5mM氯喹的反應(yīng)中，產(chǎn)生了0.17mM的1，3-丙二醇。
實施例9構(gòu)建用于在啤酒酵母中轉(zhuǎn)化和表達dhaB和dhaT的質(zhì)粒通用表達質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建了兩種類型的表達質(zhì)粒，一種是能通過重組整合到染色體中的質(zhì)粒，另一種是以游離復(fù)制元件形式存在的質(zhì)粒。每種類型的通用質(zhì)粒都含有一個酵母啟動子。酵母啟動子和酵母轉(zhuǎn)錄終止子為含有一個或多個限制性內(nèi)切酶識別位點的DNA片斷分隔，每種類型的通用表達載體還含有β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因，用于在含有氨芐青霉素的平板上對大腸桿菌進行篩選；一個復(fù)制起始區(qū)域，使質(zhì)粒在大腸桿菌中維持；以及一個2微米的游離元件復(fù)制起始區(qū)域或者與在啤酒酵母染色體中發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)DNA重組或整合到染色體中的序列同源的序列。在酵母中使用并存在于表達質(zhì)粒的營養(yǎng)選擇標記為下列中的一個編碼咪唑甘油磷酸酯脫水酶的HIS3基因、編碼乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶的URA3基因、編碼N-(5′-磷酸核糖)鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶的TRP1基因和編碼β-異丙基蘋果酸脫氫酶的LEU2基因。所用的酵母啟動子為ADH1或GAL1，轉(zhuǎn)錄終止子為ADH1、CYC1或AOX1，后者來自巴斯德畢赤酵母。
質(zhì)粒pGADGH(Clontech，Palo Alto，CA)用HindIII消化，然后與HindIII-XmnI和EcoRI-XmnI接頭(New England Biolabs，Beverly，MA)連接，使單鏈末端轉(zhuǎn)變?yōu)镋coRI末端。含有正確EcoRI末端的質(zhì)粒按如下方法進行選擇將上述處理的質(zhì)粒與質(zhì)粒pUC4K(Pharmacia Biotech，Uppsala)的含卡那霉素抗性基因的EcoRI片斷連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在含有25mg/mL卡那霉素的平板上進行篩選。得到的質(zhì)粒(pGAD/KAN2)用SnaBI和EcoRI消化，分離出帶有ADH1啟動子的1.8kb片斷。質(zhì)粒pGBT9(Clontech，Palo Alto，CA)用SnaBI和EcoRI消化，用從SnaBI和EcoRI消化的pGAD/KAN2中分離的1.8kb ADH1啟動子片斷取代其中的1.5kb ADH1/GAL4片斷。得到的載體(pMCK11)為帶有一個ADH1啟動子和終止子以及一個TRP1標記的復(fù)制型酵母質(zhì)粒。
質(zhì)粒pGADGH用SnaBI和HindIII消化，并分離含有ADH1啟動子的1.8kb片斷。將此片斷與事先用SmaI和HindIII消化的載體pRS405(Stratagene，La Jolla，CA)連接。用質(zhì)粒編碼的LacZα肽的插入失活和ADH1啟動子的存在來挑選陽性克隆。得到的質(zhì)粒(pMCK4)含有一個ADH1啟動子和一個LEU2標記。
將pGBT9的含有ADH1終止子的大約0.2kb NaeI-EcoRI片斷與用EcoRI-HindIII消化的pRS403(Stratagene，La Jolla，CA)連接，產(chǎn)生約4.8kb的質(zhì)粒pRVN5。將pGAD/KAN2中含有ADH1啟動子的約2.0kb的SnaBI-EcoRI片斷與用SmalI-EcoRI消化的pRVN5連接，產(chǎn)生約6.8kb的質(zhì)粒pRVN6。質(zhì)粒pRVN6帶有ADH1啟動子和終止子以及它們之間的一個單一EcoRI克隆位點。
pGADGH的0.4kb的HindIII片斷含有一個額外的XmnI位點。將這一片斷刪除，載體重新連接產(chǎn)生7.0kb的載體pGAD-D3。載體pGAD-D3用XmnI消化，純化含有ADH1啟動子和終止子以及它們之間的一個HindIII克隆位點的約2.4kb片斷。pRS404(Stratagene，La Jolla，CA)用PvuII消化，純化3.8kb的含有TRP1的較大片斷，將其與pGAD-D3的XmnI啟動子和終止子片斷連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pRVN11。
使用5′端含有EcoRI位點的引物(dhaT、dhaB3和dhaB1的引物分別為SEQ ID NO6和SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ ID NO9、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)，用PCR的方法從質(zhì)粒pHK28-26(SEQID No1)中擴增dhaT、dhaB3和dhaB1的開放閱讀框(10mM Tris pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.0001％明膠，200uL dATP，200uMdCTP，200uM dGTP，200uM dTTP，1uM每種引物，1-10ng靶DNA，25單位/mL AmplitaqDNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk CT))。PCR的參數(shù)為94℃，1分鐘、55℃，1分鐘、72℃，1分鐘，共進行35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pHIL-D4(Phillips Petroleum，Bartlesville，OK)的EcoRI位點中，從而產(chǎn)生分別含有dhaT、dhaB3和dhaB1的質(zhì)粒pMP13、pMP14和pMP15。dhaT表達質(zhì)粒的構(gòu)建復(fù)制型質(zhì)粒pGAD/KAN2用EcoRI消化，去除卡那霉素抗性片斷，去磷酸化后與pMP13的dhaT EcoRI片斷連接，得到的質(zhì)粒(pMCK13)含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaT，并含有一個LEU2標記。
質(zhì)粒pRNV6用EcoRI消化，并與pMP13的dhaT EcoRI片斷連接，得到的質(zhì)粒(pRVN6T)含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaT，并含有一個HIS3標記。dhaB1表達質(zhì)粒的構(gòu)建復(fù)制型質(zhì)粒pGADGH用HindIII消化，去磷酸化后與pMP15的dhaB1HindIII片斷連接，得到的質(zhì)粒(pMCK10)含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB1，并含有一個LEU2標記。dhaB2表達質(zhì)粒的構(gòu)建復(fù)制型質(zhì)粒pMCK11用EcoRI消化，去磷酸化后與pMP20的dhaB2EcoRI片斷連接，得到的質(zhì)粒(pMCK17)含有從ADh1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB2，并含有一個TRP1標記。
質(zhì)粒pRS403用SmaI消化，并與pCMK17的SnaBI/NaeI dhaB2片斷連接，得到的質(zhì)粒(pMCK21)含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB2，并含有一個HIS3標記。dhaB3表達質(zhì)粒的構(gòu)建復(fù)制型質(zhì)粒pYES2(Invitrogen，San Diego，CA)用EcoRI消化，去磷酸化后與pMP14的dhaB3 EcoRI片斷連接，得到的質(zhì)粒(pMCK1)含有從GAL1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB3，并含有一個URA3標記。
復(fù)制型質(zhì)粒pGAD/KAN2用EcoRI消化，去磷酸化后與pMP14的dhaB3 EcoRI片斷連接，得到的質(zhì)粒(pMCK15)含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB3，并含有一個LEU2標記。
質(zhì)粒pRS404用Pst和HincII消化，并與pCMK15的PstI/EcoRV dhaB3片斷連接，得到的質(zhì)粒(pMCK20)含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB3，并含有一個TRP1標記。用dhaT表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化啤酒酵母應(yīng)用Stratagene發(fā)表的LiCl/聚乙二醇程序(Catalog#217406)，用1-2ug質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株YPH499(ura3-52 lys2-801 ade2-101 trpl-del63 his3-del200 leu2-dell)(Stratagene，La Jolla，CA)。另外也可用一個Zymo Reserach(Orange，CA)的Frozen-EZ酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(Caralog#T2001)進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化克隆在補加有下列成分中的一種或多種的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SMM-0.67％無氨基酸的酵母氮源，2％葡萄糖)中29℃培養(yǎng)3～4天，補加成分為腺嘌呤硫酸(20mG/L)、尿嘧啶(20mg/L)、L-色氨酸(20mg/L)、L-組氨酸(30mg/L)、L-亮氨酸(30mG/L)、L-賴氨酸(30mg/L)。取菌落在選擇平板上劃線和接種到液體培養(yǎng)基。根據(jù)所用的載體，菌落或者在質(zhì)粒整合到染色體上后開始生長，或者在游離體復(fù)制后開始生長。除了用單一類型的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化，還可用兩種或更多的質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)化。dhaB的活性在轉(zhuǎn)化的啤酒酵母中的表達用質(zhì)粒pMCK1、pMCK10和pMCK17轉(zhuǎn)化的菌株YPH499在含有0.67％無氨基酸的酵母氮源、2％半乳糖、2％蜜三糖、20mg/L腺嘌呤硫酸、30mG/L L-賴氨酸、和20mg/L組氨酸的加富的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。將細胞勻漿后，用抽提物分析其dhaB活性。結(jié)果得到0.021單位/mg的特異活性。
實施例10構(gòu)建其它用于啤酒酵母轉(zhuǎn)化的復(fù)制型和整合型質(zhì)粒分離pGAD/KAN2的SnaBI/EcoRI ADH1片斷，將此片斷與事先用HincIII和EcoRI消化的載體pRS406(Stratagene，La Jolla，CA)連接，構(gòu)建了一個通用表達載體。陽性克隆用質(zhì)粒編碼的lacZα肽插入失活和ADH1啟動子片段的存在來鑒定。得到的質(zhì)粒(pMCK3)用EcoRI和SmaI消化，并與EcoRI和NaeI消化的pGBT9的0.2kb ADH1終止子片段連接，得到的質(zhì)粒(pMCK5)含有ADH啟動子和終止子兩者的序列，并含有一個URA3標記。dhaT表達質(zhì)粒的構(gòu)建載體pMCK5用EcoRI消化，并去磷酸化，從質(zhì)粒pMP13中切下含dhaT的EcoRI片斷，并與pMCK5連接，得到的質(zhì)粒(pMCK7)含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaT，并含有一個URA3標記。
整合載體pRS404用KpnI和SacI消化，從質(zhì)粒pMCK7中切下含有dhaT基因及其兩翼的啟動子和終止子的KpnI/SacI片斷，并與pRS404連接，得到的質(zhì)粒含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaT，并含有一個TRP1標記。dhaB1表達質(zhì)粒的構(gòu)建載體pMCK5用EcoRI消化，并去磷酸化，從質(zhì)粒pMP15中切下含dhaB1的EcoRI片斷，并與pMCK5連接，得到的質(zhì)粒(pMCK8)含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB1，并含有一個URA3標記。
整合載體pRS403用ClaI和AatII消化，從質(zhì)粒pMCK8中切下含有dhaB1基因及其兩翼的啟動子和終止子的ClaI/AatII片斷，并與pRS403連接，得到的質(zhì)粒含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB1，并含有一個HIS3標記。
復(fù)制型質(zhì)粒pYES2用HindIII和SnaBI消化，與用SnaBI和HindIII消化的pGAGH的ADH1啟動子片斷連接，來取代其GAL1啟動子元件。將pMP19的dhaB1 HindIII和XbaI片斷與經(jīng)過修飾的含有ADH1啟動子的pYES2的相應(yīng)位點連接，得到的質(zhì)粒含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB1，并含有一個URA3標記。
載體pMCK4用HindIII消化，并去磷酸化，從質(zhì)粒pMP15中切下含dhaB1的HindIII片斷，并與pMCK4連接，得到的質(zhì)粒含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB1，并含有一個LEU2標記。dhaB2表達質(zhì)粒的構(gòu)建載體pRS404、pRS405和pPRS406用SmaI消化，從質(zhì)粒pMCK17中切下含有dhaB2基因及其兩翼的啟動子和終止子的SnaBI/NaeI片斷，并分別與上述三種整合載體連接，得到的質(zhì)粒含有從ADH1啟動子可正確轉(zhuǎn)錄的dhaB2，并含有一個LEU2、TRP1或URA3標記。
實施例11在啤酒酵母中篩選dhaT轉(zhuǎn)化子及其將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇篩選含有dhaT基因的啤酒酵母從按照實施例9和實施例10的方法構(gòu)建的Ura+、His+、Trp+或Leu+轉(zhuǎn)化子中提取染色體DNA，使用在巴斯德畢赤酵母中介紹的(SEQ IDNO2-9)每個基因的特異引物，用PCR進行分析。轉(zhuǎn)化有dhaT基因的啤酒酵母由D-葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇按照實施例9和10中介紹的方法構(gòu)建的含有dhaT、dhaB1、dhaB2和dhaB3的轉(zhuǎn)化子，在補加有20mg/L腺嘌呤硫酸、30mg/L L-賴氨酸和1mg/L維生素B12的SMM中29℃有氧或無氧條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，用HPLC測定1，3-丙二醇的存在。啤酒酵母轉(zhuǎn)化子pMCK1/10/17(HM)#A申請了保藏，并被命名為ATCC＿＿＿。
實施例12巴斯德梭菌ATCC6013在氫氣環(huán)境下由D-葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇巴斯德梭菌的一般生長條件除非特別指明，巴斯德梭菌ATCC6013在裝有10mL培養(yǎng)基縐紋密封的血清瓶中進行培養(yǎng)，裝有培養(yǎng)基的縐紋瓶在接種前無菌操作充入氫氣?；A(chǔ)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基A)的pH值調(diào)節(jié)至pH7.2，它包含以下成分(g/L)KH2PO4，1.4、NaH2PO4，0.69、NH4Cl，1.8-2.5、KCl，0.50、MgSO47H2O，0.50、CaCl2，0.025、NaCl，1.0、酵母抽提物，2.0、半胱氨酸HCl，0.50、碳酸氫鈉，2.5、對氨基苯甲酸，0.0080、生物素，0.000040、檸檬酸鈉2H2O，0.10、FeSO47H2O，0.050、CoCl26H2O，0.010、MnCl24H2O，0.0010、ZnCl2，0.00050、Na2MoO42H2O，0.0025、NiCl26HO，0.010和CuSO45H2O，0.0050，并按下面的指示在培養(yǎng)基A中加入碳源。所有的溫育均在30℃、250rpm振蕩進行。
在一批10mL補加有5％葡萄糖的培養(yǎng)基A中，接種1mL約含15％(v/v)甘油的巴斯德梭菌ATCC6013凍存液進行增菌。96小時后，取0.5mL培養(yǎng)的細胞懸液轉(zhuǎn)接到10mL新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。24小時后，用氫氣將新接種小瓶中的氣壓調(diào)至30psi。繼續(xù)培養(yǎng)96小時。在最后96小時階段的開始和結(jié)尾分別取水相樣品，用通用方法中介紹的HPLC進行分析。結(jié)果見表11。
表11在氫氣氣體條件下巴斯德梭菌ATCC6013將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇時間(小時)增菌 葡萄糖(mM) 甘油(mM) 1，3-丙二醇(mM)a0 A 114 nd 2.796 A 47nd 3.4
0 B 119 0.12.096B 59 0.12.5a1，3-丙二醇的存在用通用方法中介紹的GC/MS來證實。
實施例13巴斯德梭菌ATCC6013在甲基紫精存在的條件下由D-葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇實驗1。所有細胞均按照實施例12中的程序進行培養(yǎng)。在一批10mL補加有5％葡萄糖的培養(yǎng)基A(實施例12中介紹)中，接種1mL含15％(v/v)甘油的巴斯德梭菌ATCC6013凍存液進行增菌。96小時后，取0.5mL培養(yǎng)的細胞懸液轉(zhuǎn)接到10mL新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。24小時后，在新接種小瓶中加入甲基紫精(1，1′-2甲基-4，4′-二氯聯(lián)吡啶)至終濃度為1mM。繼續(xù)培養(yǎng)96小時。在最后96小時階段的開始和結(jié)尾分別取水相樣品，用通用方法中介紹的HPLC進行分析。結(jié)果見表12。
表12在甲基紫精存在的條件下巴斯德梭菌ATCC6013將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇時間(小時) 增菌 葡萄糖(mM) 甘油(mM) 1，3-丙二醇(mM)a0 A 113 0.3 2.496A 28 1.8 3.40 B 87 0.3 2.196B 40 3.2 4.4a1，3-丙二醇的存在用通用方法中介紹的GC/MS來證實。
實驗2。在補加有1％(v/v)甘油+1％(w/v)葡萄糖的培養(yǎng)基中接種巴斯德梭菌ATCC6013的凍存物，該凍存物中含有約15％(v/v)的甘油，接種量為每20mL接種0.2mL凍存物。48小時后，取10mL細胞懸液加入到90mL新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。將100mL細胞懸液在冰上冷卻，在無氧條件下離心收集細胞。用無氧的緩沖液(50mM磷酸緩沖液，pH7.2+0.5g/L半胱氨酸HCl，事先充有氮氣并在氮氣環(huán)境下高壓滅菌)洗滌3次，并重新懸浮于8mL體積的無氧緩沖液中。在增菌試驗中，將1mL這種細胞懸液接種到10mL補加有1％葡萄糖和0mM、1mM、5mM或10mM甲基紫精的培養(yǎng)基A中，溫育240小時，在最后240小時階段的開始和結(jié)尾分別取水相樣品，用通用方法中介紹的HPLC進行分析。結(jié)果見表13。
表13在甲基紫精(MV)存在的條件下巴斯德梭菌ATCC6013將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇MV(mM) 時間(小時) 增菌 葡萄糖(mM) 甘油(mM) 1，3-丙二醇(mM)a0 0 A 38 nd nd.. 240 Ab40 nd nd.. 0 B nd nd nd.. 240 Bbnd nd nd1 0 A 40 nd nd.. 240 Abnd 41.. 0 B 45 nd nd.. 240 Bbnd 525 0 A 37 nd nd.. 240 A nd 42.. 0 B 38 nd nd.. 240 B nd 3110 0 A 40 nd nd.. 240 A nd 25.. 0 B 43 nd nd.. 240 B nd 31a1，3-丙二醇的存在用通用方法中介紹的GC/MS來證實。
b在120小時，葡萄糖消耗后，加入外源甘油至終濃度為1％。
實驗3。在下面的所有研究中，巴斯德梭菌TACC 6013首先維持在巰基乙醇酸鹽培養(yǎng)基(Difco)中，然后轉(zhuǎn)接到補加有0.4％葡萄糖的培養(yǎng)基A中。在后一種培養(yǎng)基中多次傳代后，在10mL上面介紹的培養(yǎng)基中接種1mL分裝的儲存培養(yǎng)物培養(yǎng)過夜制備種子培養(yǎng)物。在一系列裝有新鮮培養(yǎng)基并含有表14指示的甲基紫精濃度的血清瓶中，接種1mL過夜培養(yǎng)物，按表14標出的時間再次培養(yǎng)。從各瓶中間隔取樣分析葡萄糖的利用并用通用方法中介紹的HPLC分析1，3-丙二醇和葡萄糖的存在。表14概括了分析的結(jié)果。
表14巴斯德梭菌ATCC 6013由葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇瓶 甲基紫精(mM) 時間(天) 葡萄糖(mM)1，3-丙二醇(mM)a100 22.5 0105 0 020.1 0 26.5 020.1 5 0 031.0 0 25.3 031.0 5 10.0 2.431.0 9 0 2.4a1，3-丙二醇的鑒定用通用方法中介紹的GC/MS來證實。
實施例14構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬的種類的通用表達質(zhì)粒表達載體pTacIQ大腸桿菌表達載體pTacIQ含有插入在pBR322(Sutcliffe等，ColdSpring Harb.Symp.Quant.Biol 43卷，77頁(1979))的EcoRI位點的lacIq基因(Farabaugh，《自然》274卷，5673頁(1978))和tac啟動子(Amann等，《基因》25卷，167頁(1983))。一個多克隆位點和終止序列(SEQ IDNO10)取代了pBR322的EcoRI和SphI之間的序列。亞克隆甘油脫水酶基因(dhaB1、2、3)使用5′末端含有一個EcoRI位點、3′末端含有一個XbaI位點的引物(SEQ ID NO41和42)，用PCR從pHK28-26擴增dhaB3基因的開放閱讀框。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pLitmus29(New England Biolab，Inc.，Beverly，MA)中，產(chǎn)生含有dhaB3的質(zhì)粒pDHAB3。
使用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI，將包含有dhaB3操縱子的四個基因的全部編碼區(qū)的區(qū)域從pHK28-26中亞克隆到pBluescriptIIKS+(Stratagene，La Jolla，CA)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pM7。
用ApaI和XbaI消化含有dhaB(1，2，3，4)的質(zhì)粒pM7，移去dhaBX基因(刪除部分的dhaB3和全部的dhaBX)。將剩下的5.9kb片斷純化，并與質(zhì)粒pDHAB3的325-bp的ApaI-XbaI片斷連接(恢復(fù)dhaB3基因)，產(chǎn)生含有dhaB(1、2、3)的pM11。
使用5′末端含有一個HindIII位點和一個共有的RBS核糖體結(jié)合位點、3′末端含有一個XbaI位點的引物(SEQ ID NO11和SEQ IDNO12)，用PCR從pHK28-26擴增dhaB1基因的開放閱讀框。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pLitmus28(New England Biolab，Inc.，Beverly，MA)中，產(chǎn)生含有dhaB1的質(zhì)粒pDT1。
pM11的NotI-XbaI片斷含有dhaB1的部分基因、dhaB2基因和dhaB3基因，將這一片斷插入pDT1中產(chǎn)生dhaB表達質(zhì)粒pDT2。將含有dhaB(1、2、3)的pDT2的HindIII-XbaI片斷插入pTacIQ，產(chǎn)生pDT3。亞克隆1，3-丙二醇脫氫酶基因(dhaT)將含有全部1，3-丙二醇脫氫酶(dhaT)基因的pHK28-26的KpnI-SacI片斷亞克隆到pBluescrptII KS+中，產(chǎn)生質(zhì)粒pAH1。使用5′末端含有一個XbaI位點、3′末端含有一個BamHI位點的合成引物(SEQ ID NO13和SEQ ID NO14)，以pAH1為模板DNA用PCR擴增dhaT基因。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pCR-Script(Stratagene)的SrfI位點，產(chǎn)生含有dhaT的質(zhì)粒pAH4和pAH5。質(zhì)粒pAH4含有從pCR-Script的lac啟動子可正確表達的dhaT基因，而質(zhì)粒pAH5則含有相反方向的dhaT基因。將來自pAH4、含有dhaT基因的XbaI-BamHI片斷插入pTacIQ產(chǎn)生質(zhì)粒pAH8將含有RBS和dhaT基因的pAH8的HindIII-BamHI片斷插入pBluescriptII KS+，產(chǎn)生pAH11。將含有RBS、dhaT基因和終止子的pAH8的HindIII-SalI片斷插入pBluescriptII SK+，產(chǎn)生pAH12。構(gòu)建dhaB(1、2、3)和dhaT的表達盒應(yīng)用分子生物學的標準方法，用上面介紹的單個的dhaB(1、2、3)和dhaT亞克隆裝配了一個dhaB(1、2、3)和dhaT表達盒。將含有RBS、dhaT基因和終止子的pAH8的SpeI-KpnI片斷插入pDT3的XbaI-KpnI位點，產(chǎn)生pAH23。將dhaB3和dhaT基因之間的SmaI-EcoRI片斷移去，產(chǎn)生pAH26。用含有一個EcoRI位點的pDT2的SpeI-NotI片斷取代pAH26的SpeI-NotI片斷，產(chǎn)生pAH27。構(gòu)建dhaT和dhaB(1、2、3)的表達盒應(yīng)用分子生物學的標準方法，用上面介紹的單個的dhaB(1、2、3)和dhaT亞克隆裝配了一個dhaT和dhaB(1、2、3)表達盒。將含有dhaB(1、2、3)基因的pDT3的SpeI-SacI片斷插入pAH11的SpeI-SacI位點，產(chǎn)生pAH24。
實施例15用重組的淺青紫鏈霉菌生產(chǎn)1，3-丙二醇葡萄糖異構(gòu)酶啟動子的亞克隆使用5′末端含有一個SpeI位點和一個EcoRI位點、3′末端含有一個HindIII位點的引物(SEQ ID NO17和18)，用PCR從pCOs121(SEQ IDNO15)或pCO121low(SEQ ID NO16)中擴增兩個版本的葡萄糖異構(gòu)酶啟動子。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pLitmus29(New England Biolab，Inc.，Beverly，MA)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pDT7和pDT8。
構(gòu)建dhaB(1、2、3)和dhaT的表達盒使用限制性內(nèi)切酶HindIII和SalI，將pAH27中4.1kb的dhaB(1、2、3)和dhaT的表達盒(實施例14)插入到pDT7或pDT8中，分別產(chǎn)生pDT11和pDT12。構(gòu)建在鏈霉菌中共表達dhaB(1、2、3)和dhaT的質(zhì)粒用EcoRI和SalI消化pDT11或pDT12，移去4.3kb的dhaB(1、2、3)和dhaT的表達盒。載體pIJ488-101用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI消化。表達盒和載體與SalI-XbaI接頭SEQ ID No19和SEQ ID No20連接，分別產(chǎn)生pDT13和pDT14。
pIJ488-101含有淺青紫鏈霉菌的pIJ101(Kendall和Cohen，《細菌學雜志》170卷，4634頁(1988))和大腸桿菌的pUC18(Norrander等，《基因》26卷，101頁(1983))的復(fù)制起始區(qū)域。序列來源如下堿基1-2086來自pIJ101(1-2086)，堿基7688-8437來自pIJ101(8080-8830)。堿基2087-3368來自遠青鏈霉菌(Thompson等，《基因》20卷，51頁(1982))的硫鏈絲菌肽抗性基因。堿基3369-7687來自pUC18并在KpnI位點插入有紅色糖多孢菌的紅霉素抗性基因(Thompson等，上文)。用dhaB(1、2、3)和dhaT轉(zhuǎn)化淺青紫鏈霉菌使用標準的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)(Hopwood等，《鏈霉菌的遺傳操作》，TheJohn Innes Foundation(1985))，將質(zhì)粒pDT13和pDT14轉(zhuǎn)化至淺青紫鏈霉菌TK23。在含有50ug/mL硫鏈絲菌肽的平板上30℃溫育選擇轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子的孢子重新鋪板以獲得純培養(yǎng)。甘油脫水酶活性的檢測鏈霉菌轉(zhuǎn)化子在25mL補加有1％葡萄糖、2％甘油、1mg/L維生素B12、50ug/mL硫鏈絲菌肽的TSB(大豆蛋白胨肉湯，Difco，Detroit，MI)中30℃培養(yǎng)3天。離心收集細胞并重新懸浮在1mL的100mM Tris緩沖液，pH7.4中。用弗氏壓碎器(20,000psi)破碎細胞，用細胞抽提物按通用方法中的介紹分析其甘油脫水酶活性。轉(zhuǎn)化有pDT13(克隆8#)或pDT14(克隆2#)的淺青紫鏈霉菌TK23的細胞抽提物含有特異活性為0.1U/mg的甘油脫水酶。在重組淺青紫鏈霉菌中生產(chǎn)1，3-丙二醇淺青紫鏈霉菌TK23/pDT14(克隆2#)(ATCC，也被鑒定為淺青紫鏈霉菌菌株SL 14.2)從一個TSA平板上接種到一個250mL的瓶中進行培養(yǎng)，瓶中裝有25mL補加有1％葡萄糖、2％甘油、1mg/L維生素B12、50ug/mL硫鏈絲菌肽的TSB(大豆蛋白胨肉湯，Difico，Detroit，MI)。搖瓶在30℃溫育并劇烈振蕩三天，培養(yǎng)三天后，按通用方法中的介紹，用GC-MS分析(TMS衍生)在上清中檢測到3mg/mL的1，3-丙二醇。
實施例16用重組的淺青紫鏈霉菌由D-葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇在證明含有pDT13或pDT14的淺青紫鏈霉菌TK23生產(chǎn)1，3-丙二醇時，細菌培養(yǎng)在30℃通氣的搖瓶(錐形瓶，液體體積為總體積的1/10)中進行。
加富培養(yǎng)基搖瓶中的培養(yǎng)用兩天的TSA-平板(tryticase大豆瓊脂；BBL#11043)接種開始。加富培養(yǎng)基可以是TSB(tryticase大豆肉湯.BBL#11768)、液體肉湯(每升含有16g蛋白胨，10g酵母抽提物，和5gNaCl)、培養(yǎng)基B(TSB每升補加100g葡萄糖，2mLNTA被檸檬酸取代的調(diào)整的Balch′s痕量元素溶液，2.0g Na2CO3，4.0g K2HPO4，1mg維生素B12，最終pH＝7.2)、或培養(yǎng)基C(培養(yǎng)基B，pH＝6.4)。調(diào)整的Balch′s痕量元素溶液的組分可在《普通和分子細菌學方法》(P.Gerhardt等編輯，158頁，美國微生物學會，Washington，DC(1994))中查到?；九囵B(yǎng)基搖瓶中的培養(yǎng)用兩天的TSB液體培養(yǎng)物接種開始，接種量為1/30(v/v)?；九囵B(yǎng)基可以是MM322(每升含有12.0g葡萄糖，113g K2HPO4，1.0g(NH4)2SO4，0.2g Difco酵母抽提物，0.1g NaCl，2mg維生素B12，和10mL上面介紹的調(diào)整的Balch′s痕量元素溶液，最終pH6.7(HCl))；培養(yǎng)基D(補加有2.0g Na2CO3/L的培養(yǎng)基MM322，最終pH7.2)、或培養(yǎng)基E(培養(yǎng)基D，最終pH6.4)。培養(yǎng)基B和C以及基本培養(yǎng)基用過濾除菌，其它培養(yǎng)基用高壓滅菌。
搖瓶在30℃溫育兩天并劇烈振蕩，然后上清取樣做HPLC分析。加入葡萄糖，培養(yǎng)物在有氧條件下溫育1小時，然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個25mL體積的玻璃試管中(接近裝至頂部)。然后這些試管在無氧條件下30℃繼續(xù)溫育。溫育2-5天后，用通用方法中介紹的HPLC檢測上清中的1，3-丙二醇。
實施例17構(gòu)建通用質(zhì)粒、質(zhì)粒用于在芽孢桿菌中超量表達dhaB(1-3)和dhaT以及用重組的地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產(chǎn)1，3-丙二醇構(gòu)建通用表達質(zhì)粒復(fù)制型高拷貝穿梭載體pVS02用于在芽孢桿菌中共表達dhaB(1-3)和dhaT。pVS02是通過將與枯草芽孢桿菌的apr啟動子融合且攜帶一個堿性絲氨酸蛋白酶的EcoRI/BamHI片斷克隆到pBS19中構(gòu)建而來。pBS19是pBS42(Band和Henner，《DNA》第3卷，17頁(1984))的一個衍生物，在pBS19中pBS42的EcoRI/BamHI片斷被pUC19(Boehringer Mannheim)的EcoRI/HindIII多接頭取代。為了便于測序和PCR反應(yīng)，用PCR方法將一個45 bp的合成接頭(SEQ ID NO21)引入蛋白酶基因末端與轉(zhuǎn)錄終止子之間。
復(fù)制型低拷貝穿梭載體pSS15-B用于在芽孢桿菌中共表達dhaB(1-3)和dhaT。質(zhì)粒pSS15-B的構(gòu)建方法如下用HindIII/SalI(位點在多接頭中)消化質(zhì)粒pHP13(Haima等，《分子和普通遺傳學》209卷，335頁(1987))，用T4DNA聚合酶將末端補齊，重新連接產(chǎn)生pSS13。將pVS02的2 kb的EcoRI/BamHI片斷插入pSS13的EcoRI/BamHI位點，就產(chǎn)生了pSS15-B。超量表達dhaB(1-3)和dhaT盒的質(zhì)粒為在dhaT的5′末端產(chǎn)生一個芽孢桿菌共有的核糖體結(jié)合位點，將一個由合成引物(SEQ ID NO22和SEQ ID NO23)退火得到的EcoRI/XbaI接頭插入pAH23的EcoRI/XbaI位點，產(chǎn)生pM17。為在dhaB1的5′末端引入一個SalI位點，將一個用合成引物(SEQ ID NO24和SEQ IDNO25)退火得到的HindII/bglII接頭加到pM17的HindII/bglII位點，產(chǎn)生pM20。將質(zhì)粒pM20的0.3kb的MluI/KpnI片斷用質(zhì)粒pAH4的0.3kb的MluI/KpnI片斷取代，引入一個HindIII位點，從而產(chǎn)生pM21
將一個SalI-XbaI接頭(SEQ ID NO26和27)插入到用限制性內(nèi)切酶SalI-XbaI消化的pAH5中，產(chǎn)生pDT15。這個接頭消除了XbaI位點并改變了閱讀框，使dhaT基因與質(zhì)粒pSS15-B和pVS2的蛋白酶編碼序列的開放閱讀框融合。然后，將pDT15的1kb的SalI-MluI片斷插入到pAH24中，取代原來的SalI-MluI片斷，產(chǎn)生pDT17。
將一個SalI-XbaI接頭(SEQ ID NO28和29)插入到用限制性內(nèi)切酶SalI-XbaI消化的pAH5中，產(chǎn)生pDT16。這個接頭消除了XbaI位點并改變了閱讀框，使dhaT基因與pUSH1(Schon和Schuman，《基因》147卷，91頁(1994))的poly-His編碼序列的開放閱讀框融合。然后，將pDT16的1kb的SalI-MluI片斷插入到pAH24中，取代原來的SalI-MluI片斷，產(chǎn)生pDT18。
質(zhì)粒pDT4(含有dahB(1-3))用將pDT2的2.7kb的EcoRI/XbaI片斷引入用EcoRI/XbaI消化的pUC18(Boehringer Mannheim)來構(gòu)建。在芽孢桿菌中超量表達dhaB(1-3)和dhaT盒的質(zhì)粒pDT17用SacI消化，末端用T4聚合酶補齊，DNA用SalI消化以釋放含有dahT和dahB的片斷。將此片斷與用HindIII(末端用T4聚合酶補平)和SalI消化的pSS15-B連接，產(chǎn)生pM27。使用乳糖誘導(dǎo)系統(tǒng)在芽孢桿菌中超量表達dhaB(1-3)的質(zhì)粒將含有dahB(1-3)的質(zhì)粒pDT4的2.7kbBglII/HindIII片斷克隆到pUSH1的多接頭的HindIII/BamHI位點，產(chǎn)生pM26。dahB1基因與pUSH1的poly-His編碼序列的開放閱讀框融合。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進芽孢桿菌用自然轉(zhuǎn)化的方法(McCuen和Thorne，《細菌學雜志》107卷，636-645頁(1971))將質(zhì)粒pM26和pM27轉(zhuǎn)化進地衣芽孢桿菌BG307。并分別在10ug/mL卡那霉素和30ug/mL氯霉素中進行篩選。用標準的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)(Pragai等，《微生物學》140卷，305頁(1994))將同樣的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進地衣芽孢桿菌BG188，并按前述的方法進行篩選?？莶菅挎邨U菌BG2864按自然轉(zhuǎn)化的方法用pM27進行轉(zhuǎn)化。含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在含有10ug/mL氯霉素的LA平板上進行篩選。
還將pM26轉(zhuǎn)化進枯草芽孢桿菌菌株1E62(Saito等，《分子和普通遺傳學》170卷，117頁(1979))，含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在含有10ug/mL紅霉素和20ug/mL卡那霉素的LA平板上進行篩選。
所有的轉(zhuǎn)化子均生長在30℃。甘油脫水酶活性的檢測轉(zhuǎn)化有pM26(克隆#8)的地衣芽孢桿菌菌株BG188在25mL補加有1％葡萄糖和10ug/mL卡那霉素的LB(Difco)中30℃生長過夜。離心收集細胞并重新懸浮在1mL的0.1M Tricine/KOH緩沖液，pH8.2，50mMKCl，1mM二硫蘇糖醇和200uM苯甲基磺酰氟中。在弗氏壓碎器(20，000psi)中破碎細胞并收集細胞抽提物，按通用方法中的介紹分析其甘油脫水酶活性。得到了0.036U/mg的特異活性。按通用方法中的介紹，測量1，3-丙二醇脫氫酶的特異活性，為0.2U/mg。在重組芽孢桿菌中生產(chǎn)1，3-丙二醇轉(zhuǎn)化有pM26(克隆#8)的地衣芽孢桿菌菌株BG188(ATCC＿＿＿)在裝有25mL補加了1％葡萄糖和10ug/mL卡那霉素的LB(Difco)的搖瓶中30℃劇烈振蕩生長過夜。然后取1mL接種到裝有25mL補加了1％葡萄糖、1％甘油、0.33ug/mL維生素B12、和10ug/mL卡那霉素的LB的250mL搖瓶中。搖瓶在30℃溫育并劇烈振蕩，生長9小時后，按通用技術(shù)中的介紹，用GC/SM(TMS衍生)檢測到300ug/mL的1，3-丙二醇。
轉(zhuǎn)化有pM27(克隆#1)的枯草芽孢桿菌菌株BG2864(ATCC＿＿＿)在裝有25mL補加了1％葡萄糖、1％甘油、0.33ug/mL維生素B12、和10ug/mL氯霉素的LB的250mL搖瓶中進行生長。搖瓶在30℃溫育并劇烈振蕩，生長43小時后，檢測1，3-丙二醇。重組芽孢桿菌生產(chǎn)3-羥基丙醛芽孢桿菌發(fā)酵在一個總體積為15.5升的Biolafitte發(fā)酵罐中進行，開始的工作體積為7升，在發(fā)酵過程中增加到9.5升。有氧環(huán)境用650rpm的葉輪速率和0.8bar的負壓、7升/分鐘的通氣速率來保證(有氧環(huán)境用％溶解氧(100％DO為大氣壓時的溶解氧)來定義，這一值用安裝的DO-探針進行測量；35％DO被認為是有氧的最小值)。pH值用自動加入H2SO4或28％NH4OH的方法維持在pH6.70。溫度維持在30℃。
將下列組分分批加入罐內(nèi)，121℃滅菌30分鐘(克/升)6NaH2PO4H2O、10K2HPO4、1.5NaCl、10(NH4)2SO4、0.2FeCl3、15蛋白胨、6酵母抽提物、10mL Balch′s調(diào)整的痕量元素溶液(《(普通和分子細菌學方法》(P.Gerhardt等，編輯)，158頁，美國微生物學會，Washington，DC(1994))和2MAZU DF204(一種常規(guī)消泡劑)。滅菌后，加入350克50％的葡萄糖原料，并同時加入卡那霉素和氯霉素(均至終濃度為10mg/mL)從在LBG1％(＝10g蛋白胨，5g酵母抽提物，5gNaCl，10g葡萄糖)的搖瓶中生長了24小時的地衣芽孢桿菌BG188/pM26(克隆#8)中取0.6升接種發(fā)酵罐。然后使培養(yǎng)物生長，消耗葡萄糖。當pH升至6.60時，加入葡萄糖原料(50％葡萄糖，高壓滅菌，0.7克/分鐘)。45小時后，加入營養(yǎng)物質(zhì)(50mL Balch′s痕量元素溶液，14克K2HPO4，14克酵母抽提物，14ml維生素溶液，pH調(diào)至6.60，過濾除菌)。70小時后，加入維生素B12至終濃度10mg/L。在前92小時，％DO保持在有氧水平。在發(fā)酵過程中葡萄糖為(少量)過量存在(有氧期為0.2-12g/L(前92小時)；O2-限制期為2.0-36g/L(92-164小時))。在87小時所取的樣品中，懷疑有3-羥基丙醛存在，通過用還原劑硼氫化鈉處理樣品后檢測1，3-丙二醇得到了證實。
實施例18其它在芽孢桿菌中超量表達dhaT和dhaB(1-3)盒的質(zhì)粒在芽孢桿菌中超量表達dhaT和dhaB(1-3)盒的質(zhì)粒將含有dhaB(1-3)和dhaT的質(zhì)粒pM21的SalI/HindIII片斷與5kb的Sal/HindIII pVS02載體連接，產(chǎn)生pM22。pM22含有處于一個高拷貝載體上的apr啟動子控制下的dhaB和dhaT。
將pM21的SalI/HindIII片斷與5.8kb的pSS15-B的Sal/HindIII片斷連接，產(chǎn)生pM23。pM23含有處于一個低拷貝載體上的apr啟動子控制下的dhaB和dhaT。在芽孢桿菌中超量表達dhaT和dhaB(1-3)盒的質(zhì)粒pDT17用SacI消化，末端用T4DNA聚合酶補齊，DNA用SalI消化以釋放含有dahT和dahB的片斷。將此片斷與用HindIII(末端用T4聚合酶補平)和SalI消化的pVS02連接，產(chǎn)生pM25。使用乳糖誘導(dǎo)系統(tǒng)在芽孢桿菌中超量表達dhaB(1-3)和dhaT盒的質(zhì)粒pDT18用SacI消化，末端用T4DNA聚合酶補齊，DNA用SalI消化以釋放含有dahT和dahB的片斷，兩個基因都含有一個芽孢桿菌共有的核糖體結(jié)合位點。將此片斷與用HindIII(末端用T4聚合酶補平)和SalI消化的pUSH1連接，產(chǎn)生pM24。
實施例19重組芽孢桿菌將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇芽孢桿菌的生長條件在證明地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產(chǎn)1，3-丙二醇時，細菌的生長在一個搖瓶(錐形瓶)和15.5L(總體積)Biolafitte發(fā)酵罐(工作體積為7-10L)中、30℃或35℃(按照指示)有氧條件下進行。
在LBG(每升含有16g蛋白胨，10g葡萄糖，10g酵母抽提物和5gNaCl)搖瓶中的培養(yǎng)用培養(yǎng)了一天的TSA(Trypticase大豆瓊脂，BBL#11043)平板接種起始。然后用這些搖瓶去接種發(fā)酵罐或搖瓶，來證明D-葡萄糖確實轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。搖瓶中的分批培養(yǎng)物加富培養(yǎng)基可以是TSB(Trypticase大豆肉湯，BBL#1 1768)、LBG、培養(yǎng)基B(TSB每升補加10.0g葡萄糖，2mL NTA被檸檬酸取代的調(diào)整的Balch′s痕量元素溶液，2.0g Na2CO3，4.0g K2HPO4，1mg維生素B12，最終pH＝7.2)、或培養(yǎng)基C(培養(yǎng)基B，pH＝6.4)。調(diào)整的Balch′s痕量元素溶液的組分可在《普通和分子細菌學方法》(P.Gerhardt等，編輯，158頁，美國微生物學會，Washington，DC(1994))中查到?；九囵B(yǎng)基可以是MM322(每升含有12.0g葡萄糖，11.3g K2HPO4，10g(NH4)2SO4，0.2gDifco酵母抽提物，0.1g NaCl，2mg維生素B12，和10mL上面介紹的調(diào)整的Balch′s痕量元素溶液，最終pH6.7(HCl))、培養(yǎng)基D(補加有2.0g/LNa2CO3的培養(yǎng)基MM322，最終pH7.2)、或培養(yǎng)基E(培養(yǎng)基D，最終pH6.4)。培養(yǎng)基B和C以及基本培養(yǎng)基用過濾除菌，其它培養(yǎng)基用高壓滅菌。
搖瓶在30℃溫育一天并劇烈振蕩，然后上清取樣做HPLC分析。加入葡萄糖，培養(yǎng)物在有氧條件下溫育1小時，然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個25mL體積的玻璃試管中(接近裝至頂部)。然后這些試管在無氧條件下30℃繼續(xù)溫育。溫育1-5天后，用通用方法中介紹的HPLC檢測上清中的1，3-丙二醇。在發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)從一個搖瓶中取總體積為600mL的培養(yǎng)物(LBG培養(yǎng)基)，接種到裝有6.4L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基為分批加入并高壓滅菌30分鐘(基本培養(yǎng)基)或45分鐘(加富培養(yǎng)基)。發(fā)酵罐中典型的基本培養(yǎng)基是培養(yǎng)基D，典型的“加富”培養(yǎng)基是另加有50g酵母抽提物/L的培養(yǎng)基D。發(fā)酵罐滅菌后，用注射器和發(fā)酵罐蓋上的隔膜接口加入濾膜除菌的添加物(維生素B12或營養(yǎng)缺陷型的補償物)。
對負壓(BP，0.1-0.5bar)、通氣(升空氣每分鐘，0.4-1vvm)、攪拌(rpm，200-600)、溫度(T，30-37℃)、溶解氧(％DO)、和pH(5.8-7.2，加入NH4OH和H2SO4或H3PO4)進行監(jiān)測，并按照指示控制在所需值。
接種后，細胞以分批發(fā)酵模式先生長14小時，然后開始加入葡萄糖原料。對于厭氧生長/生產(chǎn)，可以按照指示通過降低rpm和BP或用N2取代空氣使％DO降至0。
從發(fā)酵罐和搖瓶中取上清樣品進行OD550讀數(shù)(生長)和酶促葡萄糖試驗；同時制備上清樣品按照通用技術(shù)中列出的標準程序進行HPLC分析。上清中存在1，3-丙二醇。
實施例20用dhaB(1-3)和dhaT轉(zhuǎn)化假單胞菌并證明其生產(chǎn)1，3-丙二醇構(gòu)建在假單胞菌中共表達dhaB(1-3)和dhaT的質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI，將pAH27的4.1 kb的dhaB(1-3)和dhaT表達盒插入載體pMMB66EH(Füste等，《基因》48卷，119頁(1986))和pMMB207(Morales等，《基因》97卷，39頁(1991))，分別產(chǎn)生pDT10和pDT9。用pDT9表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化銅綠假單胞菌PAO2845轉(zhuǎn)化用的銅綠假單胞菌PAO2845通過在L-肉湯中37℃200rpm振蕩培養(yǎng)過夜來制備。將種子培養(yǎng)物按1∶25接種到25mL經(jīng)過預(yù)熱和預(yù)通氣的新鮮L-肉湯中。將此新鮮培養(yǎng)物在37℃200rpm溫育2-3小時至對數(shù)期早期。離心收集細胞，用10ml冰冷的含5％二甲基亞砜的0.15MMgCl2洗滌兩次，并懸浮于2mL的二甲基亞砜溶液。將細胞懸液(0.2mL)與100-200ng的pDT9 DNA混合，冰上放置60分鐘。反應(yīng)混合物在37℃熱刺激2分鐘，然后轉(zhuǎn)置冰上5分鐘。加入L-肉湯(0.5mL)，細胞在37℃溫育20分鐘。從補加有37.5ug/mL氯霉素的營養(yǎng)瓊脂平板中挑取單菌落。將pDT10接合轉(zhuǎn)移至銅綠假單胞菌PAO1質(zhì)粒pDT10用Figurski和Helinski的方法(《美國國家科學院院報》，76卷，1648頁(1979))接合轉(zhuǎn)移至PAO1。將pDT10轉(zhuǎn)化到大腸桿菌AC80(Chakratrty等，《美國國家科學院院報》，75卷，3109頁(1978))中來產(chǎn)生一個供體菌株。輔助菌株是含有pRK2013(Figurski和Helinski，上文)的大腸桿菌HB101。受體菌株是銅綠假單胞菌PAO1(Royle等，《細菌學雜志》145卷，145頁(1981))。每種菌株的培養(yǎng)物(5ml)均在LB中37℃生長過夜。細胞用0.9％NaCl洗滌，并重新懸浮于200uL。將細胞混合在一起并涂布到LA平板(Luria瓊脂，Difco)上。平板在37℃溫育6小時。將細胞從平板中取出，轉(zhuǎn)移到含有250ug/mL羧芐青霉素的PIA(Difco)平板中，生長過夜。在相同培養(yǎng)基上挑選單菌落。檢測甘油脫水酶活性和1，3-丙二醇脫氫酶活性銅綠假單胞菌PAO1/pDT10在25mL補加有250ug/mL羧芐青霉素、0.1mM IPTG的2XYT(16g/L酵母抽提物，16g/L蛋白胨，5g/L NaCl)中37℃過夜培養(yǎng)。離心收集細胞，并重新懸浮在1mL 100mM的Tris緩沖液pH 7.4中。細胞用弗氏壓碎器在/5,000 psi進行破碎。然后用粗抽提物按標準方法分析甘油脫水酶活性和1，3-丙二醇脫氫酶活性。蛋白測定使用Bio-Rad(Bradford)蛋白試驗。甘油脫水酶的特異活性為5U/mg。1，3-丙二醇脫氫酶的特異活性為20U/mg。用同樣方法制備轉(zhuǎn)化有pDT9的銅綠假單胞菌PAO2845粗抽提物，它含有0.05U/mg的甘油脫水酶活性。用含有pDT9質(zhì)粒的銅綠假單胞菌生產(chǎn)1，3-丙二醇含有pDT9的銅綠假單胞菌PAO2845(ATCC55760)在補加有25 ug/mL氯霉素的2XYT培養(yǎng)基中37℃和200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。生長過夜后，取一份細胞懸液轉(zhuǎn)移到生長培養(yǎng)基(3份2XYT培養(yǎng)基+1份HEPES 0.1培養(yǎng)基，補加有0.25％(w/v)葡萄糖，0.2％(w/v)KNO3，25ug/mL氯霉素，50mg/L酵母抽提物，和80mg/L營養(yǎng)肉湯)中，使細胞懸液的OD660nm達到0.5-0.8AU。HEPES 0.1培養(yǎng)基含有以下組分NH4Cl，9.52mM；MgCl26H2O，0.523mM；K2SO4，0.276mM；HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])，40mM；tricine(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)，4mM；FeSO47H2O，0.010mM；K2HPO4，0.132mM；和下列組分的痕量礦物質(zhì)并使其終濃度(g/L)如下檸檬酸鈉6H2O，0.001；FeSO47H2O，0.0005；CoCl26H2O，0.0001；MnCl24H2O，0.00001；ZnCl2，0.000005，Na2MoO42H2O，0.000025；NiCl26H2O，0.0001；CuSO22H2O，0.00005。30℃250rpm振蕩培養(yǎng)約1小時后，在生長培養(yǎng)基中加入0.5mM的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，讓細胞繼續(xù)生長。在生長約5小時后，在室溫下離心收集細胞。細胞用生產(chǎn)培養(yǎng)基洗滌三次，生產(chǎn)培養(yǎng)基為補加有0.25％(w/v)葡萄糖、0.2％(w/v)KNO3、25ug/mL氯霉素、50mg/L酵母抽提物和80mg/L營養(yǎng)肉湯的HEPES 0.1培養(yǎng)基。在增菌時，洗滌后的細胞用原收集體積的含有0.2％(v/v)甘油的生產(chǎn)培養(yǎng)基重新懸浮。細胞懸液在氮氣環(huán)境下37℃250rpm振蕩溫育。約1小時后，在細胞懸液中加入5ug/mL的輔酶B12(5，6-二甲基-苯并咪唑鈷胺-5-脫氧腺苷)并繼續(xù)在30℃250rpm振蕩溫育。從細胞懸液中周期取樣進行產(chǎn)物分析。在收集樣品時，從樣品中離心去除細胞，在分析前將上清水相凍存在-20℃。
HPLC分析用已知的標準物校準后顯示這些細胞懸液產(chǎn)生了1，3-丙二醇。結(jié)果見表15。按照通用方法中的介紹用GC/MS分析來證實產(chǎn)物。
表15含有pDT9質(zhì)粒的銅綠假單胞菌生產(chǎn)1，3-丙二醇樣品 時間(小時) 1，3-丙二醇(mM)A 0 0A 245.1B 0 0B 245.6實施例21用銅綠假單胞菌由D-葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇一般生長條件獲自PGSC(Pseudomonas Genetic Stock Center，East Carolina School ofMedicine，Greenville，NC)的銅綠假單胞菌PAO2845在基礎(chǔ)培養(yǎng)基-HEPES0.1中進行培養(yǎng)，HEPES0.1含有以下組分NH4Cl，9.52mM；MgCl26H2O，0.523mM；K2SO4，0.276mM；HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])，40mM；Tricine(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)，4mM；FeSO47H2O，0.010mM；2HPO4，0.132mM；和下列組分的痕量礦物質(zhì)并使其終濃度(g/L)如下檸檬酸鈉6H2O，0.001；FeSO47H2O，0.0005；CoCl26H2O，0.0001；MnCl24H2O，0.00001；ZnCl2，0.000005；Na2MoO42H2O，0.000025；NiCl26H2O，0.0001；CuSO22H2O，0.00005HEPES0.1用于所有的實驗，在補加其它物質(zhì)時會注明。用基因間斷的方法構(gòu)建銅綠假單胞菌PAO2845的甘油陰性突變體銅綠假單胞菌PAO2845在營養(yǎng)肉湯(Difco，Detroit，MI)中37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。離心回收細胞，用標準的堿裂解程序(Sambrook，1989)從細胞中抽提DNA。使用5′末端帶有EcoRI位點的引物JJ-gplR-5′和JJ-glpR-3′(分別為SEQ ID NOS30和31)，用PCR方法從銅綠假單胞菌PAO2845中擴增glpR(甘油分解代謝調(diào)節(jié)蛋白基因，GenbankACCESSION#M60805)的開放閱讀框。然后將這個DNA片斷插入到質(zhì)粒pARO180(Parke，《基因》93卷，135頁，(1990))的單一EcoRI位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pJJ10。用pJJ10連接混合物的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并涂布到含有50ug/mL氨芐青霉素和0.08mg/mL Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的營養(yǎng)瓊脂(Difco，Detroit，MI)上。將很可能含有g(shù)lp插入的白色菌落挑出，轉(zhuǎn)至補加有50ug/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。37℃、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜后收集細胞，并從細胞中回收pJJ10。
用PCR方法從pUC4K(Pharmacia Cat.No.27-4958-01)中擴增卡那霉素盒區(qū)域，引物(SEQ ID No32和33)除設(shè)計用來擴增該區(qū)域外，還將擴增片斷的末端修飾，使之能被限制性內(nèi)切酶Styl(Promega，Madison，WI)識別。擴增的結(jié)果得到4 kb的pUC4K-styl片斷。將pUC4K-styl DNA片斷亞克隆到質(zhì)粒pJJ10上glpR基因內(nèi)的Styl位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pJJ11。用pJJ11連接混合物的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并涂布到補加有25ug/mL卡那霉素和50ug/mL氨芐青霉素的LB瓊脂上。挑取5-20個單菌落，在補加有25ug/mL卡那霉素和50ug/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜后，分別回收DNA。用凝膠電泳證實所需質(zhì)粒DNA的存在。
按照標準程序用pJJ11DNA轉(zhuǎn)化銅綠假單胞菌PAO2845。主要過程是，銅綠假單胞菌在L-肉湯中37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，來制備用于轉(zhuǎn)化的細胞。將此過夜培養(yǎng)物1∶25接種至25ml預(yù)熱并預(yù)先通氣的新鮮L-肉湯中。新鮮的培養(yǎng)物在37℃、200rpm振蕩溫育2-3小時(至對數(shù)期早期)。離心細胞并棄上清。將收集的細胞重新懸浮在10ml無菌的、冰冷的、含5％二甲基亞砜的0.15MMgCl2中，并冰上放置5-10分鐘。離心將細胞與上清分離，重新懸浮在10ml無菌的、冰冷的、含5％二甲基亞砜的0.15MMgCl2中，并冰上放置5-10分鐘。最后再次離心棄去上清，將細胞重新懸浮在2ml無菌的、冰冷的、含5％二甲基亞砜的0.15MMgCl2中。將每份0.2ml的冰冷細胞濃縮物與100-200ngpJJ11DNA混合在預(yù)冷的1.5ml聚丙烯離心管中，并將混合物在冰上放置60分鐘。然后將離心管迅速轉(zhuǎn)移到37℃水浴槽內(nèi)2分鐘，并立即放回冰上5分鐘。加入大約0.5ml L-肉湯，在37℃輕輕振蕩溫育0.3-1小時。溫育復(fù)蘇后，取每份10uL和50uL的細胞懸液涂布到補加有50ug/mL卡那霉素的營養(yǎng)瓊脂平板上。從選擇平板上長出的菌落中篩選能在補加有1％琥珀酸或1％甘油的HEPES0.1培養(yǎng)基瓊脂平板上生長的克隆。不能在甘油上生長但能在琥珀酸上生長的克隆凍存于15％的甘油以備后用。用pDT9轉(zhuǎn)化gplR--銅綠假單胞菌PAO2845按上面介紹的方法制備轉(zhuǎn)化用的銅綠假單胞菌。將每份0.2ml的冰冷細胞濃縮物與100-200ng pDT9 DNA混合在預(yù)冷的1.5ml聚丙烯離心管中，并將混合物在冰上放置60分鐘。然后將離心管迅速轉(zhuǎn)移到37℃水浴槽內(nèi)2分鐘，并立即放回冰上5分鐘。加入大約0.5ml L-肉湯，在37℃輕輕振蕩溫育0.3-1小時。溫育復(fù)蘇后，取每份10uL和50uL的細胞懸液涂布到補加有37.5ug/mL氯霉素的營養(yǎng)瓊脂平板上。篩選含有pDT9的gplR--銅綠假單胞菌PAO2845轉(zhuǎn)化子將上面的轉(zhuǎn)化子在補加有37.5ug/mL氯霉素的營養(yǎng)瓊脂平板上鋪板并37℃培養(yǎng)過夜。從這些選擇平板上長出的菌落中挑取約20個，轉(zhuǎn)至10mL含有37.5ug/mL氯霉素的營養(yǎng)肉湯(Difco，Detroit，MI)中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。為證實所選的轉(zhuǎn)化子中存在pDT9質(zhì)粒，將質(zhì)粒DNA抽提、純化并用EcoRI(Promega，Madison，WI)酶切。用凝膠電泳分析線型DNA的分子量。另外，在用凝膠電泳分析線型DNA的分子量后，使用與dhaT、dhaB1、dhaB2和dhaB3序列相同的引物對(分別為SEQ ID NO34和35，36和37，8和9，4和5)，用PCR擴增的方法來證實所需基因的存在。對轉(zhuǎn)化有pDT9的gplR--銅綠假單胞菌PAO2845進行分解代謝篩選從上面的陽性轉(zhuǎn)化子中選擇1至20個克隆做進一步分析。細胞在補加有37.5ug/L氯霉素的營養(yǎng)肉湯中37℃、250rpm振蕩有氧生長過夜。將細胞按1∶8的稀釋比例轉(zhuǎn)入加有1.5mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的相同培養(yǎng)基中，繼續(xù)生長4-6小時。離心收集細胞，并用補加有10g/L甘油、0.03g/L小牛抽提物、0.05g/L蛋白胨、0.05g/L酵母抽提物(均為Difco，Detroit，MI)和0.2％KNO3的HEPES1.0培養(yǎng)基洗滌一次。然后將細胞重新懸浮于1/5的原始體積，裝入一個小瓶使瓶中沒有空間剩余。在30℃、100rpm振蕩溫育18-72小時。離心去除細胞，用HPLC分析上清中1，3-丙二醇的存在。另外，用氣相色譜-質(zhì)譜鑒別了1，3-丙二醇。轉(zhuǎn)化有pDT9的gplR--銅綠假單胞菌PAO2845(ATCC55760)由D-葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇按照上面的篩選程序，選擇1至5個能最大量地由甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的克隆。在補加有37.5ug/L氯霉素的營養(yǎng)肉湯中30℃250rpm振蕩有氧生長過夜。將細胞按1∶8的稀釋比例轉(zhuǎn)入加有15mM IPTG的相同培養(yǎng)基中，繼續(xù)生長4-6小時。離心收集細胞，并用補加有10g/L甘油、0.03g/L小牛抽提物、0.05g/L蛋白胨、0.05g/L酵母抽提物和0.2％KNO3的HEPES0.1培養(yǎng)基洗滌一次。然后將細胞重新懸浮于1/5的原始體積，裝入一個小瓶使瓶中沒有空間剩余。在30℃、100rpm振蕩溫育約36小時。離心去除細胞，用HPLC分析上清中1，3-丙二醇的存在。另外，用氣相色譜-質(zhì)譜鑒別了1，3-丙二醇。
實施例22構(gòu)建在黑曲霉中表達dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT的表達盒通用表達盒(pAEX)質(zhì)粒pGPTpyrG(Berka等，“發(fā)展絲狀真菌的表達系統(tǒng)”《生物技術(shù)進展》第7卷，127-154頁(1989))的1.4 kb的SpeI-EcoRV片斷含有足夠用于適當調(diào)節(jié)黑曲霉glaA啟動子和終止子的部分，將此片斷連接到pLITMUS39(New England Biolabs，Beverly，MA)的多接頭的SpeI和EcoRV位點。黑曲霉的單個克隆表達盒使用相同的克隆策略，分別克隆單個的肺炎克雷伯氏菌dhaB亞單位和dhaT的開放閱讀框(ORF′s)，并將它們與通用表達載體(pAEX)連接根據(jù)已知的完整基因操縱子的序列，設(shè)計用于PCR擴增單個的dhaBORF和dhaT ORF的引物對，使它們與每種ORF的5′末端和3′末端的序列匹配(dhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaBX和dhaT的引物對分別為SEQID NO38和12，39和40，41和42，45和46，43和44)。除了序列匹配外，每種ORF的5′末端引物還設(shè)計包含一個EcoRI限制酶切位點，在5′最末端還含有一個BglII限制酶切位點，并在每種ORF的第一個ATG上游還有5個堿基的CAGCA序列。設(shè)計用來與每種ORF的3′末端匹配的引物在克隆的3′最末端、轉(zhuǎn)錄終止子的下游還含有一個XbaI限制酶切位點。
dhaB和dhaT ORF′s的單個克隆片斷，使用上面介紹的引物，用PCR方法從含有完整的肺炎克雷伯氏菌dhaT操縱子的質(zhì)粒pHK26-28中擴增。單個ORF克隆片斷根據(jù)它們各自的分子量進行分離(dhaB1＝1540bp；dhaB2＝607bp；dhaB3＝448bp；dhaBX＝1846bp；dhaT＝1187bp)。利用PCR引物中設(shè)計的EcoRI和XbaI限制酶切位點，將每種單個的dhaB和dhaTORF片斷連接到pLITMUS29(New England Biolabs，Beverly，MA)的多接頭的EcoRI和XbaI位點。測序證明pLITMUS29中的dhaB2和dhaB3克隆是正確的。將pLITMUS29中dhaB1克隆編碼區(qū)的1363bp的單一NcoI-EcoRV片斷去除，用pHK26-28的相同酶切片斷取代。將pLITMUS29中dhaT克隆編碼區(qū)的783bp的單一Tth111I-MluI片斷用pHK26-28的相同酶切片斷取代。將pLITMUS29中dhaBX克隆編碼區(qū)的1626bp的單一EcoRV片斷用pM7(含有肺炎克雷伯氏菌的dhaB操縱子)的相同酶切片斷取代。對dhaB1、dhaBX和dhaT的5′和3′末端各測序約250bp，證明其序列是正確的，但都含有一些取代片斷的序列.
將pLITMUS29的分別含有dhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaBX和dhaT克隆的ORF的單一BglII-XbaI限制酶切片斷，分別連接到通用表達載體pAEX的BglII-XbaI限制酶切位點上，使每個克隆的表達均置于黑曲霉glaA啟動子和終止子的控制下。獲得的載體根據(jù)其ORF進行命名，即pAEXdhaB1、pAEXdhaB2、pAEXdhaB3、pAEXdhaBX和pAEXdhaT。黑曲霉的雙表達盒載體從載體pAEXdhaB1中分離含有dhaB1表達盒的單一SnaB1-StuI限制酶切片斷(包括黑曲霉的glaA啟動子、dhB1的ORF和終止子)，將該片斷連接到pAEXdhaB2載體的單一SnaB1限制酶切位點上。將含有構(gòu)巢曲霉pyrG營養(yǎng)缺陷型選擇標記的pBH2(Ward等，《實驗真菌學》13卷(Exp.Myc.)，289頁(1989))的約2.2kb的ScaI-SmaI限制酶切片斷，連接到含有dhaB1和dhaB2表達盒的載體的單一StuI限制酶切位點上，這一載體命名為pAEXB1+B2。
分別從pAEXdhaB3和pAEXdhaT載體中，分離含有dhaB3和dhaT完整表達盒的單一SpeI-HindIII限制酶切片斷。將這兩個表達盒片斷同時按順序連接到載體pUC18的單一HindIII限制酶切位點上，這一載體命名為pAEXB3+T。dhaB和dhaT基因在曲霉屬中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子分離、表達盒整合的證實和表達應(yīng)用(Campbell等的方法，“使用硝酸鹽還原酶的同源niaD基因提高黑曲霉的轉(zhuǎn)化效率”，《當代遺傳》16卷，53-56頁(1989))用兩種表達載體pAEXB1+B2和pAEXB3+T共轉(zhuǎn)化黑曲霉株FS1(pyrG-)。根據(jù)在不含尿嘧啶核苷的選擇培養(yǎng)基上的生長能力選擇轉(zhuǎn)化子。用HindIII和SpeI消化轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，來釋放預(yù)知分子量的片斷，從而證明完整表達盒的整合。每種表達盒的檢測通過分別使用單個基因的探針用Southern分析來完成。dhaB2蛋白的存在使用抗-dhaB抗體用Western分析進行檢測。
每種ORF的表達按下述方法進行檢測，將整合有pAEXB1+B2和pAEXB3+T載體的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在10％CLS培養(yǎng)基(玉米漿(50％固體)，10％(w/v)；NaH2PO4H2O，1.0g/L；MgSO4，0.50g/L；麥芽糖，100.0g/L；葡萄糖，10.0g/L；Mazu消泡劑，0.003％(v/v))中，作為種子培養(yǎng)物。按1/10體積將這種種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入MBM碳培養(yǎng)基(NaH2PO4，0.70g/L；K2HPO4，0.70g/L；KH2PO4，0.70g/L；MgSO47H2O，1.40g/L；(NH4)2SO4，10.5g/L；CaCl22H2O，0.70g/L；NH4NO3，3.50g/L；檸檬酸鈉，14g/L；FeCl24H2O，1.0mg/L；ZnCl2，5.87mg/L；CuCl2H2O，0.42mg/L；MnCl24H2O，0.21mg/L；Na2B4O710H2O，0.07mg/L；葉酸，0.174mg/L；吡哆醇HCl，6.12mg/L；核黃素，1.83mg/L；泛酸，23.60mg/L；煙酸，26.66mg/L；生物素，0.49mg/L；硫胺素HCI，1.39mg/L；麥芽糖，120.0g/L；羧芐青霉素，0.035mg/L；鏈霉素，0.035mg/L，吐溫80，0.07％(w/v)；Mazu消泡劑，0.14％(v/v))中來誘導(dǎo)glaA啟動子。從轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物中分離mRNA(Fast Track 2 Kit，Invitrogen Corp.)，并用化學發(fā)光(GeniusSystem，Boehringer-Mannheim)做Nouthern分析來檢測每個基因的轉(zhuǎn)錄信息。使用每個dhaB和dhaTORF的基因片斷作探針，用Nouthern雜交證明了搖瓶培養(yǎng)物中dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT的協(xié)同轉(zhuǎn)錄。
選擇那些顯示能轉(zhuǎn)錄所有轉(zhuǎn)化基因的分離克隆，進一步用pAEXdhaBX轉(zhuǎn)化。用pAEXdhaBX和pAA10(3.2kb，pUC18的含有構(gòu)巢曲霉amdS選擇標記的Acc1-Asp718限制酶切片斷)共轉(zhuǎn)化這些克隆。新轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物在含有乙酰胺作為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行選擇。使用引物KpdhaBX-5′和KpdhaBX-3′(SEQ ID NO45和46)，用PCR從基因組DNA中擴增dhaBX ORF，證明了能利用乙酰胺作為唯一碳源的轉(zhuǎn)化子菌落含有整合的dhaBX ORF。黑曲霉株FS1生產(chǎn)甘油黑曲霉株FS1在10％CSL培養(yǎng)基中培養(yǎng)作為種子培養(yǎng)物，將種子培養(yǎng)物按1∶10的稀釋比例轉(zhuǎn)入MBM碳培養(yǎng)基+12％麥芽糖。培養(yǎng)物上清中含有6g/L的曲霉產(chǎn)生的甘油。甘油分析用HPLC進行。重組黑曲霉生產(chǎn)1，3-丙二醇曲霉發(fā)酵在一個總體積為15.5升的Biolafitte發(fā)酵罐中進行，開始的工作體積為8升，在發(fā)酵過程中增加到11升。有氧環(huán)境用700-800rpm的葉輪速率和1.1bar的負壓、10升/分鐘的通氣速率來保證(有氧環(huán)境用％溶解氧(100％DO為大氣壓時的溶解氧)來定義，這一值用安裝的DO-探針進行測量；35％DO被認為是有氧的最小值)。pH值用自動加入10％H3PO4或28％NH4OH的方法維持在pH5.60。溫度維持在32℃。
將下列組分分批加入罐內(nèi)，121℃滅菌30分鐘2g/LNaH2PO4H2O、17g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4、2g/L吐溫80、45g/L Promosoy-100(一種含70％蛋白的大豆?jié)饪s物)、6g/L玉米漿(50％固體)、10g/L麥芽糖、和2g/L MAZU DF204(一種傳統(tǒng)的消泡劑)。滅菌后，加入500克50％的Maltrm150原料，并同時加入羧芐青霉素和鏈霉素(均至終濃度為10mg/L)取1升在裝有10％CSL的搖瓶中生長了45小時、轉(zhuǎn)化有兩種表達載體pAEXB1+B2和pAEXB3+T的黑曲霉株(菌株TGR40)接種發(fā)酵罐。使培養(yǎng)物在有氧的情況下生長28小時，然后開始以0.8-1.0g/分鐘的速率加入原料(50％Maltrin150溶液，加熱滅菌)。讓培養(yǎng)繼續(xù)進行20小時，在這個過程中，由于細胞的O2需求，％DO降至實際上為零(在發(fā)酵的剩余階段，培養(yǎng)物維持在零至5％)。然后(接種后第48小時)，在8小時的一段時間內(nèi)加入甘油直至終濃度為163g/L。Maltrin原料在接種后第97小時停止加入，負壓和通氣量分別降至0.2bar和4L/分鐘(0.5vvm)，加入輔酶B12至終濃度為10mg/L。當培養(yǎng)至122小時后，收集肉湯，離心，并在1L上清中加入0.2L的乙醇。
取1L去除細胞的發(fā)酵肉湯在真空下蒸餾，產(chǎn)生約60mL的黑色漿狀物。將這種漿狀物離心，收集到約40mL的液體上清。然后用40mL乙醇處理這種液體，以通過離心來去除殘留的固體。從傾析的液體中取少量作樣品用HPLC進行分析，發(fā)現(xiàn)其中含有1，3-丙二醇1，3-丙二醇用GC/MS得以證實。
本發(fā)明的申請人已經(jīng)申請保藏了一個重組黑曲霉株TGR40-13(ATCC＿＿)，該菌株含有編碼dhaB(1-3)、dhaBx和dhaT的DNA片斷。
實施例23用重組黑曲霉從麥芽糖生產(chǎn)1，3-丙二醇曲霉發(fā)酵在一個總體積為15.5升的Biolafitte發(fā)酵罐中進行，開始的工作體積為8升，在發(fā)酵過程中增加到11升。有氧環(huán)境用700-800rpm的葉輪速率和1.1bar的負壓、10升/分鐘的通氣速率來保證(有氧環(huán)境用％溶解氧(100％DO為大氣壓時的溶解氧)來定義，這一值用安裝的DO-探針進行測量；35％DO被認為是有氧的最小值)。pH值用自動加入10％H3PO4或28％NH4OH的方法維持在pH5.60。溫度維持在32℃。
將下列組分分批加入罐內(nèi)，121℃滅菌30分鐘2g/LNaH2PO4H2O、17g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4、2g/L吐溫80、45g/LPromosoy-100(一種含70％蛋白的大豆?jié)饪s物)、6g/L玉米漿(50％固體)、10g/L麥芽糖、和2g/L MAZU DF204(一種傳統(tǒng)的消泡劑)。滅菌后，加入500克50％的Maltrin150原料，并同時加入羧芐青霉素和鏈霉素(均至終濃度為10mg/L)。
取1升在裝有10％CSL(見實施例22)的搖瓶中生長了40-48小時的轉(zhuǎn)化有dhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaB4、和dhaT基因的黑曲霉株接種發(fā)酵罐。使培養(yǎng)物生長30-35小時，然后開始以1g/分鐘的速率加入原料(50％Maltrin150溶液，加熱滅菌)。讓培養(yǎng)在O2限制條件下(％DO為零，完全通氣)繼續(xù)進行5小時。然后停止加入Maltrin原料，當測量到上清中的葡萄糖實際上為零時，將rpm降低至150，BP降低至0.2，并停止通氣。向發(fā)酵罐中以7L/分鐘的速率充入無氧氣體混合混合物(5％H2.5％CO2，90％N2)共30分鐘。然后關(guān)閉氣體的進口和出口，BP維持在0.4bar，加入輔酶B12至終濃度為5mg/L。最后，取肉湯樣品離心，制備用于HPLC和GC分析的上清。在上清中檢測到了1，3-丙二醇。
實施例2路氏乳桿菌(ATCC23272)由非甘油底物生產(chǎn)1.3-丙二醇路氏乳桿菌(ATCC23272)維持在MRS(Difco，Detroit，MI)平板上。將平板上的菌落接種到裝有70mL補加了25mM NaHCO3的乳桿菌MRS肉湯(Difco#0881-17)的250mL錐形瓶中。將瓶在無氧的氣體環(huán)境(5-7％H2，2-8％CO2，85-93％N2)下32℃溫育。
對乳桿菌MRS肉湯做HPLC分析顯示了甘油組分的保留時間。將乳桿菌MRS肉湯用堿煮沸法處理后，用HPLC和酶促試驗分析其甘油含量。在多數(shù)情況下，在起始培養(yǎng)基中可檢測到0.25g/L的甘油，如果所有這些甘油都轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。0.21g/L的1，3-丙二醇可以說是由甘油生產(chǎn)而來的。
經(jīng)過10天的溫育，從路氏乳桿菌培養(yǎng)瓶中取樣，用HPLC和GC-MS進行分析，并與起始培養(yǎng)基樣品進行比較。用培養(yǎng)基中存在的甘油校正后，135g/L的1，3-丙二醇是路氏乳桿菌由非甘油的底物生產(chǎn)而來的。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱E.I.DUPONT DE NEMOURS AND COMPAN Y(B)街道1007 MARKET STREET(C)城市WILMINGTON(D)州DELAWARE(E)國家U.S.A.
(F)郵政編碼(ZIP)19898(G)電話302-892-8112(H)傳真302-773-0164(i)申請人(A)名稱GENENCOR INTERNATIONAL，INC(B)街道4CAMBRIDGE PLACE1870 SOUTH WINTON ROAD(C)城市ROCHESTER(D)州NEW YORK(E)國家U.S.A(F)郵政編碼(ZIP)14618(G)電話
(H)傳真(ii)發(fā)明名稱利用單一微生物將可發(fā)酵碳源生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇(iii)序列數(shù)46(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型3.50英寸軟盤(B)計算機IBM(C)操作系統(tǒng)MICROSOFT WINDOWS 3.1(D)軟件MICROSOFT WORD 6.0(v)現(xiàn)申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(vi)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/440,293(B)申請日1995年5月12日(vii)代理人/代理機構(gòu)信息(A)姓名LINDA AXAMETHY FLOYD(B)登記號33,692(C)參考/備案號碼CR-9715-B(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度12145堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO1GTCGACCACC ACGGTGGTGA CTTTAATGCC GCTCTCATGC AGCAGCTCGG TGGCGGTCTC 60AAAATTCAGG ATGTCGCCGG TATAGTTTTT GATAATCAGC AAGACGCCTT CGCCGCCGTC 120AATTTGCATC GCGCATTCAA ACATTTTGTC CGGCGTCGGC GAGGTGAATA TTTCCCCCGG 180ACAGGCGCCG GAGAGCATGC CCTGGCCGAT ATAGCCGCAG TGCATCGGTT CATGTCCGCT 240GCCGCCGCCG GAGAGCAGGG CCACCTTGCC AGCCACCGGC GCGTCGGTGC GGGTCACATA 300CAGCGGGTCC TGATGCAGGG TCAGCTGCGG ATGGGCTTTA GCCAGCCCCT GTAATTGTTC 360ATTCAGTACA TCTTCAACAC GGTTAATCAG CTTTTTCATT ATTCAGTGCT CCGTTGGAGA 420AGGTTCGATG CCGCCTCTCT GCTGGCGGAG GCGGTCATCG CGTAGGGGTA TCGTCTGACG 480GTGGAGCGTG CCTGGCGATA TGATGATTCT GGCTGAGCGG ACGAAAAAAA GAATGCCCCG 540ACGATCGGGT TTCATTACGA AACATTGCTT CCTGATTTTG TTTCTTTATG GAACGTTTTT 600GCTGAGGATA TGGTGAAAAT GCGAGCTGGC GCGCTTTTTT TCTTCTGCCA TAAGCGGCGG 660TCAGGATAGC CGGCGAAGCG GGTGGGAAAA AATTTTTTGC TGATTTTCTG CCGACTGCGG 720GAGAAAAGGC GGTCAAACAC GGAGGATTGT AAGGGCATTA TGCGGCAAAG GAGCGGATCG 780GGATCGCAAT CCTGACAGAG ACTAGGGTTT TTTGTTCCAA TATGGAACGT AAAAAATTAA 840CCTGTGTTTC ATATCAGAAC AAAAAGGCGA AAGATTTTTT TGTTCCCTGC CGGCCCTACA 900GTGATCGCAC TGCTCCGGTA CGCTCCGTTC AGGCCGCGCT TCACTGGCCG GCGCGGATAA 960CGCCAGGGCT CATCATGTCT ACATGCGCAC TTATTTGAGG GTGAAAGGAA TGCTAAAAGT 1020TATTCAATCT CCAGCCAAAT ATCTTCAGGG TCCTGATGCT GCTGTTCTGT TCGGTCAATA 1080TGCCAAAAAC CTGGCGGAGA GCTTCTTCGT CATCGCTGAC GATTTCGTAA TGAAGCTGGC 1140GGGAGAGAAA GTGGTGAATG GCCTGCAGAG CCACGATATT CGCTGCCATG CGGAACGGTT 1200TAACGGCGAA TGCAGCCATG CGGAAATCAA CCGTCTGATG GCGATTTTGC AAAAACAGGG 1260CTGCCGCGGC GTGGTCGGGA TCGGCGGTGG TAAAACCCTC GATACCGCGA AGGCGATCGG 1320TTACTACCAG AAGCTGCCGG TGGTGGTGAT CCCGACCATC GCCTCGACCG ATGCGCCAAC 1380CAGCGCGCTG TCGGTGATCT ACACCGAAGG GGGCGAGTTT GAAGAGTATC TGATCTATCC 1440GAAAAACCCG GATATGGTGG TGATGGACAC GGCGATTATC GCCAAAGCGC CGGTACGCCT 1500GCTGGTCTCC GGCATGGGCG ATGCGCTCTC CACCTGGTTC GAGGCCAAAG CTTGCTACGA 1560TGCGCGCGCC ACCAGCATGG CCGGAGGACA GTCCACCGAG GCGGCGCTGA GCCTCGCCCG 1620CCTGTGCTAT GATACGCTGC TGGCGGAGGG CGAAAAGGCC CGTCTGGCGG CGCAGGCCGG 1680GGTAGTGACC GAAGCGCTGG AGCGCATCAT CGAGGCGAAC ACTTACCTCA GCGGCATTGG 1740CTTTGAAAGC AGTGGCCTGG CCGCTGCCCA TGCAATCCAC AACGGTTTCA CCATTCTTGA 1800AGAGTGCCAT CACCTGTATC ACGGTGAGAA AGTGGCCTTC GGTACCCTGG CGCAGCTGGT 1860GCTGCAGAAC AGCCCGATGG ACGAGATTGA AACGGTGCAG GGCTTCTGCC AGCGCGTCGG 1920CCTGCCGGTG ACGCTCGCGC AGATGGGCGT CAAAGAGGGG ATCGACGAGA AAATCGCCGC 1980GGTGGCGAAA GCTACCTGCG CGGAAGGGGA AACCATCCAT AATATGCCGT TTGCGGTGAC 2040CCCGGAGAGC GTCCATGCCG CTATCCTCAC CGCCGATCTG TTAGGCCAGC AGTGGCTGGC 2100GCGTTAATTC GCGGTGGCTA AACCGCTGGC CCAGGTCAGC GGTTTTTCTT TCTCCCCTCC 2160GGCAGTCGCT GCCGGAGGGG TTCTCTATGG TACAACGCGG AAAAGGATAT GACTGTTCAG 2220ACTCAGGATA CCGGGAAGGC GGTCTCTTCC GTCATTGCCC AGTCATGGCA CCGCTGCAGC 2280AAGTTTATGC AGCGCGAAAC CTGGCAAACG CCGCACCAGG CCCAGGGCCT GACCTTCGAC 2340TCCATCTGTC GGCGTAAAAC CGCGCTGCTC ACCATCGGCC AGGCGGCGCT GGAAGACGCC 2400TGGGAGTTTA TGGACGGCCG CCCCTGCGCG CTGTTTATTC TTGATGAGTC CGCCTGCATC 2460CTGAGCCGTT GCGGCGAGCC GCAAACCCTG GCCCAGCTGG CTGCCCTGGG ATTTCGCGAC 2520GGCAGCTATT GTGCGGAGAG CATTATCGGC ACCTGCGCGC TGTCGCTGGC CGCGATGCAG 2580GGCCAGCCGA TCAACACCGC CGGCGATCGG CATTTTAAGC AGGCGCTACA GCCATGGAGT 2640TTTTGCTCGA CGCCGGTGTT TGATAACCAC GGGCGGCTGT TCGGCTCTAT CTCGCTTTGC 2700TGTCTGGTCG AGCACCAGTC CAGCGCCGAC CTCTCCCTGA CGCTGGCCAT CGCCCGCGAG 2760GTGGGTAACT CCCTGCTTAC CGACAGCCTG CTGGCGGAAT CCAACCGTCA CCTCAATCAG 2820ATGTACGGCC TGCTGGAGAG CATGGACGAT GGGGTGATGG CGTGGAACGA ACAGGGCGTG 2880CTGCAGTTTC TCAATGTTCA GGCGGCGAGA CTGCTGCATC TTGATGCTCA GGCCAGCCAG 2940GGGAAAAATA TCGCCGATCT GGTGACCCTC CCGGCGCTGC TGCGCCGCGC CATCAAACAC 3000GCCCGCGGCC TGAATCACGT CGAAGTCACC TTTGAAAGTC AGCATCAGTT TGTCGATGCG 3060GTGATCACCT TAAAACCGAT TGTCGAGGCG CAAGGCAACA GTTTTATTCT GCTGCTGCAT 3120CCGGTGGAGC AGATGCGGCA GCTGATGACC AGCCAGCTCG GTAAAGTCAG CCACACCTTT3180GAGCAGATGT CTGCCGACGA TCCGGAAACC CGACGCCTGA TCCACTTTGG CCGCCAGGCG3240GCGCGCGGCG GCTTCCCGGT GCTACTGTGC GGCGAAGAGG GGGTCGGGAA AGAGCTGCTG3300AGCCAGGCTA TTCACAATGA AAGCGAACGG GCGGGCGGCC CCTACATCTC CGTCAACTGC3360CAGCTATATG CCGACAGCGT GCTGGGCCAG GACTTTATGG GCAGCGCCCC TACCGACGAT3420GAAAATGGTC GCCTGAGCCG CCTTGAGCTG GCCAACGGCG GCACCCTGTT TCTGGAAAAG3480ATCGAGTATC TGGCGCCGGA GCTGCAGTCG GCTCTGCTGC AGGTGATTAA GCAGGGCGTG3540CTCACCCGCC TCGACGCCCG GCGCCTGATC CCGGTGGATG TGAAGGTGAT TGCCACCACC3600ACCGTCGATC TGGCCAATCT GGTGGAACAG AACCGCTTTA GCCGCCAGCT GTACTATGCG3660CTGCACTCCT TTGAGATCGT CATCCCGCCG CTGCGCGCCC GACGCAACAG TATTCCGTCG3720CTGGTGCATA ACCGGTTGAA GAGCCTGGAG AAGCGTTTCT CTTCGCGACT GAAAGTGGAC3780GATGACGCGC TGGCACAGCT GGTGGCCTAC TCGTGGCCGG GGAATGATTT TGAGCTCAAC3840AGCGTCATTG AGAATATCGC CATCAGCAGC GACAACGGCC ACATTCGCCT GAGTAATCTG3900CCGGAATATC TCTTTTCCGA GCGGCCGGGC GGGGATAGCG CGTCATCGCT GCTGCCGGCC3960AGCCTGACTT TTAGCGCCAT CGAAAAGGAA GCTATTATTC ACGCCGCCCG GGTGACCAGC4020GGGCGGGTGC AGGAGATGTC GCAGCTGCTC AATATCGGCC GCACCACCCT GTGGCGCAAA4080ATGAAGCAGT ACGATATTGA CGCCAGCCAG TTCAAGCGCA AGCATCAGGC CTAGTCTCTT4140CGATTCGCGC CATGGAGAAC AGGGCATCCG ACAGGCGATT GCTGTAGCGT TTGAGCGCGT4200CGCGCAGCGG ATGCGCGCGG TCCATGGCCG TCAGCAGGCG TTCGAGCCGA CGGGACTGGG4260TGCGCGCCAC GTGCAGCTGG GCAGAGGCGA GATTCCTCCC CGGGATCACG AACTGTTTTA4320ACGGGCCGCT CTCGGCCATA TTGCGGTCGA TAAGCCGCTC CAGGGCGGTG ATCTCCTCTT4380CGCCGATCGT CTGGCTCAGG CGGGTCAGGC CCCGCGCATC GCTGGCCAGT TCAGCCCCCA4440GCACGAACAG CGTCTGCTGA ATATGGTGCA GGCTTTCCCG CAGCCCGGCG TCGCGGGTCG4500TGGCGTAGCA GACGCCCAGC TGGGATATCA GTTCATCGAC GGTGCCGTAG GCCTCGACGC4560GAATATGGTC TTTCTCGATG CGGCTGCCGC CGTACAGGGC GGTGGTGCCT TTATCCCCGG4620TGCGGGTATA GATACGATAC ATTCAGTTTC TCTCACTTAA CGGCAGGACT TTAACCAGCT4680GCCCGGCGTT GGCGCCGAGC GTACGCAGTT GATCGTCGCT ATCGGTGACG TGTCCGGTAG4740CCAGCGGCGC GTCCGCCGGC AGCTGGGCAT GAGTGAGGGC TATCTCGCCG GACGCGCTGA4800GCCCGATACC CACCCGCAGG GGCGAGCTTC TGGCCGCCAG GGCGCCCAGC GCAGCGGCGT4860CACCGCCTCC GTCATAGGTT ATGGTCTGGC AGGGGACCCC CTGCTCCTCC AGCCCCCAGC 4920ACAGCTCATT GATGGCGCCG GCATGGTGCC CGCGCGGATC GTAAAACAGG CGTACGCCTG 4980GCGGTGAAAG CGACATGACG GTCCCCTCGT TAACACTCAG AATGCCTGGC GGAAAATCGC 5040GGCAATCTCC TGCTCGTTGC CTTTACGCGG GTTCGAGAAC GCATTGCCGT CTTTTAGAGC 5100CATCTCCGCC ATGTAGGGGA AGTCGGCCTC TTTTACCCCC AGATCGCGCA GATGCTGCGG 5160AATACCGATA TCCATCGACA GACGCGTGAT AGCGGCGATG GCTTTTTCCG CCGCGTCGAG 5220AGTGGACAGT CCGGTGATAT TTTCGCCCAT CAGTTCAGCG ATATCGGCGA ATTTCTCCGG 5280GTTGGCGATC AGGTTGTAGC GCGCCACATG CGGCAGCAGG ACAGCGTTGG CCACGCCGTG 5340CGGCATGTCG TACAGGCCGC CCAGCTGGTG CGCCATGGCG TGCACGTAGC CGAGGTTGGC 5400GTTATTGAAA GCCATCCCGG CCAGCAGAGA AGCATAGGCC ATGTTTTCCC GCGCCTGCAG 5460ATTGCTGCCG AGGGCCACGG CCTGGCGCAG GTTGCGGGCG ATGAGGCGGA TCGCCTGCAT 5520GGCGGCGGCG TCCGTCACCG GGTTAGCGTC TTTGGAGATA TAGGCCTCTA CGGCGTGGGT 5580CAGGGCATCC ATCCCGGTCG CCGCGGTCAG GGCGGCCGGT TTACCGATCA TCAGCAGTGG 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ATAAGCAGCG TGTTGCCTCC GCGGTCAACT ACGGAAAACA CCACCGCCAC 6540GTTGATCTCA GTGGCTTTTT TTTCCACCGC CGCCGCCATT TGCTGGGCGG CGGCCAGGGT 6600GATTGTCTGA ACTTGTTGGC TCTTGTTCAT CATTCTCTGC CCCACCAGGA TAACGCTGGC 6660GCGAATAGTC AGTAGGGGGC GATAGTAAAA AACTATTACC ATTCGGTTGG CTTGCTTTAT 6720TTTTGTCAGC GTTATTTTGT CGCCCGCCAT GATTTAGTCA ATAGGGTTAA AATAGCGTCG 6780GAAAAACGTA ATTAAGGGCG TTTTTTATTA ATTGATTTAT ATCATTGCGG GCGATCACAT 6840TTTTTATTTT TGCCGCCGGA GTAAAGTTTC ATAGTGAAAC TGTCGGTAGA TTTCGTGTGC 6900CAAATTGAAA CGAAATTAAA TTTATTTTTT TCACCACTGG CTCATTTAAA GTTCCGCTAT 6960TGCCGGTAAT GGCCGGGCGG CAACGACGCT GGCCCGGCGT ATTCGCTACC GTCTGCGGAT 7020TTCACCTTTT GAGCCGATGA ACAATGAAAA GATCAAAACG ATTTGCAGTA CTGGCCCAGC 7080GCCCCGTCAA TCAGGACGGG CTGATTGGCG AGTGGCCTGA AGAGGGGCTG ATCGCCATGG 7140ACAGCCCCTT TGACCCGGTC TCTTCAGTAA AAGTGGACAA CGGTCTGATC GTCGAACTGG 7200ACGGCAAACG CCGGGACCAG TTTGACATGA TCGACCGATT TATCGCCGAT TACGCGATCA 7260ACGTTGAGCG CACAGAGCAG GCAATGCGCC TGGAGGCGGT GGAAATAGCC CGTATGCTGG 7320TGGATATTCA CGTCAGCCGG GAGGAGATCA TTGCCATCAC TACCGCCATC ACGCCGGCCA 7380AAGCGGTCGA GGTGATGGCG CAGATGAACG TGGTGGAGAT GATGATGGCG CTGCAGAAGA 7440TGCGTGCCCG CCGGACCCCC TCCAACCAGT GCCACGTCAC CAATCTCAAA GATAATCCGG 7500TGCAGATTGC CGCTGACGCC GCCGAGGCCG GGATCCGCGG CTTCTCAGAA CAGGAGACCA 7560CGGTCGGTAT CGCGCGCTAC GCGCCGTTTA ACGCCCTGGC GCTGTTGGTC GGTTCGCAGT 7620GCGGCCGCCC CGGCGTGTTG ACGCAGTGCT CGGTGGAAGA GGCCACCGAG CTGGAGCTGG 7680GCATGCGTGG CTTAACCAGC TACGCCGAGA CGGTGTCGGT CTACGGCACC GAAGCGGTAT 7740TTACCGACGG CGATGATACG CCGTGGTCAA AGGCGTTCCT CGCCTCGGCC TACGCCTCCC 7800GCGGGTTGAA AATGCGCTAC ACCTCCGGCA CCGGATCCGA AGCGCTGATG GGCTATTCGG 7860AGAGCAAGTC GATGCTCTAC CTCGAATCGC GCTGCATCTT CATTACTAAA GGCGCCGGGG 7920TTCAGGGACT GCAAAACGGC GCGGTGAGCT GTATCGGCAT GACCGGCGCT GTGCCGTCGG 7980GCATTCGGGC GGTGCTGGCG GAAAACCTGA TCGCCTCTAT GCTCGACCTC GAAGTGGCGT 8040CCGCCAACGA CCAGACTTTC TCCCACTCGG ATATTCGCCG CACCGCGCGC ACCCTGATGC 8100AGATGCTGCC GGGCACCGAC TTTATTTTCT CCGGCTACAG CGCGGTGCCG AACTACGACA 8160ACATGTTCGC CGGCTCGAAC TTCGATGCGG AAGATTTTGA TGATTACAAC ATCCTGCAGC 8220GTGACCTGAT GGTTGACGGC GGCCTGCGTC CGGTGACCGA GGCGGAAACC ATTGCCATTC 8280GCCAGAAAGC GGCGCGGGCG ATCCAGGCGG TTTTCCGCGA GCTGGGGCTG CCGGCAATCG 8340CCGACGAGGA GGTGGAGGCC GCCACCTACG CGCACGGCAG CAACGAGATG CCGCCGCGTA8400ACGTGGTGGA GGATCTGAGT GCGGTGGAAG AGATGATGAA GCGCAACATC ACCGGCCTCG8460ATATTGTCGG CGCGCTGAGC CGCAGCGGCT TTGAGGATAT CGCCAGCAAT ATTCTCAATA8520TGCTGCGCCA GCGGGTCACC GGCGATTACC TGCAGACCTC GGCCATTCTC GATCGGCAGT8580TCGAGGTGGT GAGTGCGGTC AACGACATCA ATGACTATCA GGGGCCGGGC ACCGGCTATC8640GCATCTCTGC CGAACGCTGG GCGGAGATCA AAAATATTCC GGGCGTGGTT CAGCCCGACA8700CCATTGAATA AGGCGGTATT CCTGTGCAAC AGACAACCCA AATTCAGCCC TCTTTTACCC8760TGAAAACCCG CGAGGGCGGG GTAGCTTCTG CCGATGAACG CGCCGATGAA GTGGTGATCG8820GCGTCGGCCC TGCCTTCGAT AAACACCAGC ATCACACTCT GATCGATATG CCCCATGGCG8880CGATCCTCAA AGAGCTGATT GCCGGGGTGG AAGAAGAGGG GCTTCACGCC CGGGTGGTGC8940GCATTCTGCG CACGTCCGAC GTCTCCTTTA TGGCCTGGGA TGCGGCCAAC CTGAGCGGCT9000CGGGGATCGG CATCGGTATC CAGTCGAAGG GGACCACGGT CATCCATCAG CGCGATCTGC9060TGCCGCTCAG CAACCTGGAG CTGTTCTCCC AGGCGCCGCT GCTGACGCTG GAGACCTACC9120GGCAGATTGG CAAAAACGCT GCGCGCTATG CGCGCAAAGA GTCACCTTCG CCGGTGCCGG9180TGGTGAACGA TCAGATGGTG CGGCCGAAAT TTATGGCCAA AGCCGCGCTA TTTCATACA 9240AAGAGACCAA ACATGTGGTG CAGGACGCCG AGCCCGTCAC CCTGCACATC GACTTAGTAA9300GGGAGTGACC ATGAGCGAGA AAACCATGCG CGTGCAGGAT TATCCGTTAG CCACCCGCTG9360CCCGGAGCAT ATCCTGACGC CTACCGGCAA ACCATTGACC GATATTACCC TCGAGAAGGT9420GCTCTCTGGC GAGGTGGGCC CGCAGGATGT GCGGATCTCC CGCCAGACCC TTGAGTACCA9480GGCGCAGATT GCCGAGCAGA TGCAGCGCCA TGCGGTGGCG CGCAATTTCC GCCGCGCGGC9540GGAGCTTATC GCCATTCCTG ACGAGCGCAT TCTGGCTATC TATAACGCGC TGCGCCCGTT9600CCGCTCCTCG CAGGCGGAGC TGCTGGCGAT CGCCGACGAG CTGGAGCACA CCTGGCATGC9660GACAGTGAAT GCCGCCTTTG TCCGGGAGTC GGCGGAAGTG TATCAGCAGC GGCATAAGCT9720GCGTAAAGGA AGCTAAGCGG AGGTCAGCAT GCCGTTAATA GCCGGGATTG ATATCGGCAA9780CGCCACCACC GAGGTGGCGC TGGCGTCCGA CTACCCGCAG GCGAGGGCGT TTGTTGCCAG9840CGGGATCGTC GCGACGACGG GCATGAAAGG GACGCGGGAC AATATCGCCG GGACCCTCGC9900CGCGCTGGAG CAGGCCCTGG CGAAAACACC GTGGTCGATG AGCGATGTCT CTCGCATCTA9960TCTTAACGAA GCCGCGCCGG TGATTGGCGA TGTGGCGATG GAGACCATCA CCGAGACCAT 10020TATCACCGAA TCGACCATGA TCGGTCATAA CCCGCAGACG CCGGGCGGGG TGGGCGTTGG 10080CGTGGGGACG ACTATCGCCC TCGGGCGGCT GGCGACGCTG CCGGCGGCGC AGTATGCCGA10140GGGGTGGATC GTACTGATTG ACGACGCCGT CGATTTCCTT GACGCCGTGT GGTGGCTCAA10200TGAGGCGCTC GACCGGGGGA TCAACGTGGT GGCGGCGATC CTCAAAAAGG ACGACGGCGT10260GCTGGTGAAC AACCGCCTGC GTAAAACCCT GCCGGTGGTG GATGAAGTGA CGCTGCTGGA10320GCAGGTCCCC GAGGGGGTAA TGGCGGCGGT GGAAGTGGCC GCGCCGGGCC AGGTGGTGCG10380GATCCTGTCG AATCCCTACG GGATCGCCAC CTTCTTCGGG CTAAGCCCGG AAGAGACCCA10440GGCCATCGTC CCCATCGCCC GCGCCCTGAT TGGCAACCGT TCCGCGGTGG TGCTCAAGAC10500CCCGCAGGGG GATGTGCAGT CGCGGGTGAT CCCGGCGGGC AACCTCTACA TTAGCGGCGA10560AAAGCGCCGC GGAGAGGCCG ATGTCGCCGA GGGCGCGGAA GCCATCATGC AGGCGATGAG10620CGCCTGCGCT CCGGTACGCG ACATCCGCGG CGAACCGGGC ACCCACGCCG GCGGCATGCT10680TGAGCGGGTG CGCAAGGTAA TGGCGTCCCT GACCGGCCAT GAGATGAGCG CGATATACAT10740CCAGGATCTG CTGGCGGTGG ATACGTTTAT TCCGCGCAAG GTGCAGGGCG GGATGGCCGG10800CGAGTGCGCC ATGGAGAATG CCGTCGGGAT GGCGGCGATG GTGAAAGCGG ATCGTCTGCA10860AATGCAGGTT ATCGCCCGCG AACTGAGCGC CCGACTGCAG ACCGAGGTGG TGGTGGGCGG10920CGTGGAGGCC AACATGGCCA TCGCCGGGGC GTTAACCACT CCCGGCTGTG CGGCGCCGCT10980GGCGATCCTC GACCTCGGCG CCGGCTCGAC GGATGCGGCG ATCGTCAACG CGGAGGGGCA11040GATAACGGCG GTCCATCTCG CCGGGGCGGG GAATATGGTC AGCCTGTTGA TTAAAACCGA11100GCTGGGCCTC GAGGATCTTT CGCTGGCGGA AGCGATAAAA AAATACCCGC TGGCCAAAGT11160GGAAAGCCTG TTCAGTATTC GTCACGAGAA TGGCGCGGTG GAGTTCTTTC GGGAAGCCCT11220CAGCCCGGCG GTGTTCGCCA AAGTGGTGTA CATCAAGGAG GGCGAACTGG TGCCGATCGA11280TAACGCCAGC CCGCTGGAAA AAATTCGTCT CGTGCGCCGG CAGGCGAAAG AGAAAGTGTT11340TGTCACCAAC TGCCTGCGCG CGCTGCGCCA GGTCTCACCC GGCGGTTCCA TTCGCGATAT11400CGCCTTTGTG GTGCTGGTGG GCGGCTCATC GCTGGACTTT GAGATCCCGC AGCTTATCAC11460GGAAGCCTTG TCGCACTATG GCGTGGTCGC CGGGCAGGGC AATATTCGGG GAACAGAAGG11520GCCGGCGAAT GCGGTCGCCA CCGGGCTGCT ACTGGCCGGT CAGGCGAATT AAACGGGCGC11580TCGCGCCAGC CTCTCTCTTT AACGTGCTAT TTCAGGATGC CGATAATGAA CCAGACTTCT11640ACCTTAACCG GGCAGTGCGT GGCCGAGTTT CTTGGCACCG GATTGCTCAT TTTCTTCGGC11700GCGGGCTGCG TCGCTGCGCT GCGGGTCGCC GGGGCCAGCT TTGGTCAGTG GGAGATCAGT11760ATTATCTGGG GCCTTGGCGT CGCCATGGCC ATCTACCTGA CGGCCGGTGT CTCCGGCGCG11820CACCTAAATC CGGCGGTGAC CATTGCCCTG TGGCTGTTCG CCTGTTTTGA ACGCCGCAAG 11880GTGCTGCCGT TTATTGTTGC CCAGACGGCC GGGCCCTTCT GCGCCGCCGC GCTGGTGTAT 11940GGGCTCTATC GCCAGCTGTT TCTCGATCTT GAACAGAGTC AGCATATCGT GCGCGGCACT 12000GCCGCCAGTC TTAACCTGGC CGGGGTCTTT TCCACGTACC CGCATCCACA TATCACTTTT 12060ATACAAGCGT TTGCCGTGGA GACCACCATC ACGGCAATCC TGATGGCGAT GATCATGGCC 12120CTGACCGACG ACGGCAACGG AATTC 12145(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO2GGGAATTCAT GAAAAGATCA AAACGATTTG(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度29堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO3GCGAATTCTT ATTCAATGGT GTCGGGCTG(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO4GCGAATTCAT GCAACAGACA ACCCAAATTC(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO5GCGAATTCAC TCCCTTACTA AGTCG(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO6GCGAATTCAT GAGCTATCGT ATGTTTG(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度28堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO7GCGAATTCAG AATGCCTGGC GGAAAATC(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度28堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO8GGGAATTCAT GAGCGAGAAA ACCATGCG(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO9GCGAATTCTT AGCTTCCTTT ACGCAGC(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度94堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO1OAGCTTAGGAG TCTAGAATAT TGAGCTCGAA TTCCCGGGCATGCGGTACCG GATCCAGAAA AAAGCCCGCA CCTGACAGTGCGGGCTTTTT TTTT(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO11GGCCAAGCTT AAGGAGGTTA ATTAAATGAA AAG(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO12GCTCTAGATT ATTCAATGGT GTCGGG(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度42堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO13GCGCCGTCTA GAATTATGAG CTATCGTATG TTTGATTATC TG(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO14TCTGATACGG GATCCTCAGA ATGCCTGGCG GAAAAT(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度181堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO15CGATCTGTGC TGTTTGCCAC GGTATGCAGC ACCAGCGCGAGATTATGGGC TCGCACGCTC GACTGTCGGA CGGGGGCACTGGAACGAGAA GTCAGGCGAG CCGTCACGCC CTTGACAATGCCACATCCTG AGCAAATAAT TCAACCACTA AACAAATCAACCGCGTTTCC CGGAGGTAAC C(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度149堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO16CGATCTGTGCTGTTTGCCACGGTATGCAGCACCAGCGCGAGATTATGGGCTCGCACGCTCGACTGTCGGACGGGGGCACTGGAACATGCCACATCCTGAGCAAATAATTCAACCACTAAACAAATCAACCGCGTTTCCCGGAGGTAACC(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO17GGAATTCACT AGTCGATCTG TGCTGTTTGC CAC(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO18GGGGAAGCTT GGTTACCTCC GGGAAACGCG GTT(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度16堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO19TCGACCACAA GGAGGA(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度16堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO20CTAGTCCTCC TTGTGG(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度45堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO21ACTGGCCGTC GTTTTACTCG AGTCGTGACT GGGAAAACCCTGGCG(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度14堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO22AATTCAAAGG AGGT(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度14堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO23CTAGACCTCC TTTG(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO24AGCTTGTCGA CCATGAAAA(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO25GATCTTTTCA TGGTCGACA(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度13堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO26TCGACCAGGA GGA(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長度13堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO27CTAGTCCTCC TGG(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO28TCGACGAATT CAGGAGGA(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO29CTAGTCCTCC TGAATTCG(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO30ATGTACAAGA TCCTGATCGC CGA(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長度22堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO31TCAGCGGCGC AGGTAGGCGG CG(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長度31堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO32ATGACCAAGG GCCGGATCCG TCGACCTGCA G(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長度32堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO33CTACCCTTGG CCCCGGATCC GTCGACCTGC AG(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO34CACGGCCTGG CGCAGGTTGC GGG(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO35GGCAGCCCGC ACGATTGCGG C(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO36GCGGAAAACC GCCTGGATCG C(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO37GGGTTCAGGG ACTGCAAAAC G(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)長度35堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO38GGAATTCAGA TCTCAGCAAT GAAAAGATCA AAACG(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)長度34堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO39GGAATTCAGA TCTCAGCAAT GCAACAGACA ACCC(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)長度28堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO40GCTCTAGATC ACTCCCCTTA CTAAGTCG(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)長度37堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO41GGAATTCAGA TCTCAGCAAT GAGCGAGAAA ACCATGC(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO42GCTCTAGATT AGCTTCCTTT ACGCAGC(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO43GGAATTCAGA TCTCAGCAAT GAGCTATCGT ATGTTTGA(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO44GCTCTAGATC AGAATGCCTG GCGG(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)長度35堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO45GGAATTCAGA TCTAGCAATG CCGTTAATAG CCGGG(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO46GCTCTAGATT AATTCGCCTG ACCGGC
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的生物轉(zhuǎn)化方法，包括在合適的條件下，使一種碳底物與一種至少含有一個能表達脫水酶的基因的單一微生物接觸。
2.一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的生物轉(zhuǎn)化方法，包括在合適的條件下，使甘油與一種至少含有一個能表達脫水酶的基因的單一微生物接觸，這種微生物選自曲霉屬、酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬。
3.權(quán)利要求1的方法，其中基因編碼甘油脫水酶，并分離自克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、暗桿菌屬、泥桿菌屬和梭菌屬。
4.權(quán)利要求1的方法，其中基因編碼二醇脫水酶，并分離自克雷伯氏菌屬和沙門氏菌屬。
5.權(quán)利要求1的方法，其中脫水酶是一種甘油脫水酶或二醇脫水酶。
6.權(quán)利要求1的方法，其中微生物轉(zhuǎn)化有至少一個編碼dhaB1、dhaB2和dhaB3和/或dhaT的DNA片斷，由此微生物表達活性的脫水酶。
7.權(quán)利要求1的方法，其中微生物選自檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、氣桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬、酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬。
8.權(quán)利要求7的方法，其中微生物選自轉(zhuǎn)化有一個編碼甘油脫水酶的基因或一個編碼二醇脫水酶的基因的重組微生物，或選自具有促進1，3-丙二醇產(chǎn)生的表型的突變微生物。
9.權(quán)利要求7的方法，其中微生物選自克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬和檸檬酸桿菌屬，或者是重組的埃希氏菌屬。
10權(quán)利要求9的方法，其中微生物是重組的大腸桿菌。
11.權(quán)利要求8的方法，其中微生物選自鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、酵母屬、曲霉屬、乳桿菌屬和畢赤酵母屬的重組菌株，這些重組微生物轉(zhuǎn)化有至少一個編碼dhaB1、dhaB2和dhaB3和/或dhaT的DNA片斷，由此微生物表達活性的脫水酶，而碳底物是一種單糖。
12.權(quán)利要求11的方法，其中微生物選自重組的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、巴斯德畢赤酵母和地衣芽孢桿菌，這些重組微生物轉(zhuǎn)化有至少一個編碼dhaB1、dhaB2和dhaB3和/或dhaT的DNA片斷，由此微生物表達活性的脫水酶，而碳底物是一種單糖。
13.權(quán)利要求1或10的方法，其中微生物是含有一個來自肺炎克雷伯氏菌的甘油脫水酶基因的重組大腸桿菌。
14.權(quán)利要求1的方法，其中碳底物如果不是甘油或二羥基丙酮則至少含有一個碳原子。
15.權(quán)利要求14的方法，其中碳底物選自單糖、寡糖和多糖。
16.權(quán)利要求15的方法，其中碳底物是葡萄糖。
17.權(quán)利要求14的方法，其中碳底物是一種醇。
18.權(quán)利要求1的方法，并進一步包括在微生物與碳底物接觸前，使微生物在一種培養(yǎng)基中生長。
19.用權(quán)利要求1或15的方法生產(chǎn)的1，3-丙二醇。
20.一種約35kb、分離自肺炎克雷伯氏菌的粘粒，該粘粒包含編碼一種活性甘油脫水酶的DNA片斷，其限制酶切圖譜見圖1的泳道1和2。
21.一種包含一個宿主微生物和權(quán)利要求20的粘粒的轉(zhuǎn)化微生物。
22.權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)化微生物，其中宿主微生物是大腸桿菌，其ATCC登記號為69789。
23.一種包含一個宿主微生物、一個分離自肺炎克雷伯氏菌的第一DNA片斷和至少一個分離自肺炎克雷伯氏菌的第二DNA片斷的轉(zhuǎn)化微生物，其中第一DNA片斷編碼活性甘油脫水酶，其限制酶切圖譜為圖1中泳道1和泳道2，第二DNA片斷編碼不是甘油脫水酶的一種活性功能蛋白。
24.一個重組的假單胞菌菌株，包含一個編碼dhaB1、dhaB2和dhaB3以及dhaT的DNA片斷，其ATCC登記號為55760。
25.一個重組的巴斯德畢赤酵母菌株，包含一個編碼dhaB1、dhaB2和dhaB3以及dhaT的DNA片斷，其ATCC登記號為74363。
26.一個重組的啤酒酵母菌株pMCK1/10/17(MH)#A，包含一個編碼dhaB1、dhaB2和dhaB3以及dhaT的DNA片斷，其ATCC登記號為＿＿。
27.一個重組的地衣芽孢桿菌菌株BG188/pM26(克隆#8)，包含一個編碼dhaB1、dhaB2和dhaB3的DNA片斷，其ATCC登記號為＿＿。
28.一個重組的枯草芽孢桿菌菌株BG2864/pM27(克隆#1)，包含一個編碼dhaB1、dhaB2和dhaB3以及dhaT的DNA片斷，其ATCC登記號為＿＿。
29.一個重組的淺青紫鏈霉菌菌株SL14-2，包含一個編碼dhaB1、dhaB2和dhaB3以及dhaT的DNA片斷，其ATCC登記號為＿＿。
30.一個重組的黑曲霉株TGR40-13，包含一個編碼dhaB1、dhaB2以及dhaB3以及dhaT的DNA片斷，其ATCC登記號為＿＿。
31.一種表達脫水酶的重組真核微生物。
32.選自酵母和絲狀真菌的權(quán)利要求31的重組真核微生物。
33.權(quán)利要求1的方法，并進一步包括回收1，3-丙二醇。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用單一微生物將一種碳底物生物轉(zhuǎn)化為1,3－丙二醇的方法,所使用的微生物含有編碼一種活性甘油脫水酶或二醇脫水酶的基因,本方法通過將這類微生物與一種碳底物在合適的發(fā)酵條件下接觸來進行。
文檔編號C12N15/09GK1189854SQ96195288
公開日1998年8月5日 申請日期1996年5月10日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月12日
發(fā)明者L·A·拉芬德, V·納加拉杰安, C·E·納卡穆拉 申請人:納幕爾杜邦公司, 詹倫卡國際有限公司