專利名稱：：運輸系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種運輸系統(tǒng)。本發(fā)明尤其涉及向受體-如人運送疫苗的疫苗運輸系統(tǒng)。更為特別的是，本發(fā)明涉及通過有機體。如常帶有寄生蟲的食植物或食血性有機體運送寄生蟲抗原至受體的運輸系統(tǒng)。尤為特別的是，本發(fā)明涉及通過蚊子運送瘧疾疫苗至受體的運輸系統(tǒng)。關(guān)于動物和人疾病昆蟲載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的普通講義可發(fā)現(xiàn)于Crampton等(1989)。對熱帶地區(qū)人群進行有效免疫時遇到的問題中有疫苗運送的后勤學(xué)(logistics)問題，尤其是反復(fù)的疫苗運送及對合適受體的有效定向。前者的一個實施例為將要進行野外試驗的抗瘧疾傳播-阻滯疫苗(transmission-blocking)(TBV25H)。這里建議如果要在當(dāng)?shù)孬@得對寄生蟲的有效控制，有效免疫力將需要維持多達約12年之久。然而，被免疫的人將不會被保護而不受感染，且所得的寄生血癥將不會提高免疫力(Kaslow1992；Sinden，1994)。這帶來了如何有效維持免疫力的問題。在這方面，已進行過一些嘗試以克服這個問題-如設(shè)計持續(xù)釋放免疫原(Kaslow，1992)-但這些方法雖然似乎是有希望的，但他們達不到所需的理論目標(biāo)。此外，如果要對當(dāng)?shù)厝巳和瓿捎行У谋Ｗo，以可選擇的貯主宿主如T.cruzi，利什曼原蟲屬和獸類寄生蟲Theleria和梨漿蟲屬感染存在必須克服的特定困難。在這種情況需要對人/牛/馬的受體和貯主人群進行平行免疫，但目前是不可能的。此外，貯主常不容易免疫或確定。因此，總而言之，許多旨在對人和農(nóng)畜種群進行有效免疫的接種方案在持續(xù)疫苗運送的后勤學(xué)和對合適受體的有效定向中遇到較大的問題。定向是可選擇貯主宿主寄生蟲疾病情況中的特殊問題。本發(fā)明尋求克服與已知接種方案有關(guān)的問題。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種對于受體的運輸系統(tǒng)，該運輸系統(tǒng)包括含有受體疫苗的有機體，其中的疫苗能被有機體從它那里傳送至受體且其中的疫苗是在受體外部制備。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了一種從那里接種疫苗的包括能表達疫苗基因的轉(zhuǎn)基因有機體，其中的轉(zhuǎn)基因有機體本身適于用作向受體運送疫苗的手段而進行接種，且其中的疫苗在受體外部制備。根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供了一種對受體接種的方法，包括將受體暴露于根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有機體且允許疫苗從轉(zhuǎn)基因有機體那里并由它傳送至受體，其中的疫苗在受體外部制備。根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，提供了一種來自根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有機體。根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有機體生產(chǎn)對受體接種的疫苗的用途，其中的疫苗通過轉(zhuǎn)基因有機體運送至受體，且其中的疫苗在受體外部制備。根據(jù)本發(fā)明的第六個方面，提供了一種具有包含能表達所需抗原基因的唾液腺的轉(zhuǎn)基因昆蟲(如轉(zhuǎn)基因食血性或食植物性昆蟲)。根據(jù)本發(fā)明的第七個方面，提供了一種包括根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因有機體的唾液的受體，其中的唾液含有通過編碼相同抗原基因的表達而產(chǎn)生的抗原。根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有機體生產(chǎn)和運送疫苗而對受體進行接種的用途，其中的疫苗在受體外部制備且通過轉(zhuǎn)基因有機體傳送至受體。術(shù)語“受體”包括任何合適的對象，可通過用本發(fā)明的運輸系統(tǒng)向其運送合適的疫苗。例如，受體可以是人或家畜動物-如馬或牛。它甚至可以是植物。術(shù)語“受體”也包括對象的群體(即貯主)。術(shù)語“有機體”包括任何能向所需受體運送合適疫苗的有機體。有機體的例子包括帶有寄生蟲的食植物或食血性有機體-如蚊子、沙蠅類、廄蠅(stableflies)、蜱類、舌蠅類等。其它例子包括蚜蟲及其它植食性昆蟲。優(yōu)選地，有機體是一種在其自然狀態(tài)下通常以所需的受體為食的有機體。因此，一個優(yōu)選的實施方案為含有瘧疾疫苗的蚊子。有機體可以是在其自然狀態(tài)下通常會以所需受體為食且在這樣做的時候傳送感染原至受體而導(dǎo)致感染的有機體。同義語“疫苗”和“抗原”以它們的常規(guī)意義使用-即一種本體(如蛋白質(zhì))，其在給與一種有機體后能刺激產(chǎn)生適當(dāng)?shù)膽?yīng)答并因此獲得對相關(guān)感染的免疫力(部分或完全的)。疫苗的例子包括對瘧疾、利什曼原蟲病、昏睡病或血吸蟲病(bilharzia)等產(chǎn)生免疫力的那些疫苗。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因有機體”意思為含有對有機體典型非天然的一種額外基因或幾種額外基因的有機體。優(yōu)選地，額外基因為有機體非天然基因-如編碼瘧疾疫苗的基因。如果能表達疫苗的基因能穩(wěn)定插入轉(zhuǎn)基因有機體的基因組，那么該有機體的后代也將能表達該疫苗。這是特別有利的。優(yōu)選地，有機體為轉(zhuǎn)基因有機體且疫苗通過在轉(zhuǎn)基因有機體內(nèi)含有的基因而表達。基因可在轉(zhuǎn)基因有機體內(nèi)以，例如質(zhì)?；蚱渌问酱嬖?。然而優(yōu)選地，該基因被穩(wěn)定插入到轉(zhuǎn)基因有機體的基因組中。優(yōu)選地，受體為家畜動物、人或植物。優(yōu)選地，該有機體具有口且疫苗是通過有機體的口而被傳送。優(yōu)選地，有機體為食植物或食血性有機體。優(yōu)選有機體為昆蟲。優(yōu)選有機體為食血性昆蟲。優(yōu)選有機體為蚊子。優(yōu)選的蚊子為庫蚊(Culex)或伊蚊(Aedes)或按蚊(Anopheles)種類。優(yōu)選抗原為瘧疾疫苗。優(yōu)選有機體為通常帶有寄生蟲的有機體。優(yōu)選基因編碼影響(如停止或至少阻礙)導(dǎo)致需要治療疾病的寄生蟲生活周期的抗原。該基因可編碼傳播阻滯(transmission-blocking)免疫原，如TBV25H或Pfs28。本發(fā)明優(yōu)選的組合包括家畜動物、人或植物作為受體；和影響(如停止或至少阻礙)導(dǎo)致需要治療疾病寄生蟲的生活周期的抗原-如傳播阻滯免疫原作為抗原。另一個優(yōu)選的組合是當(dāng)受體為人時；轉(zhuǎn)基因有機體為轉(zhuǎn)基因的蚊子；且抗原為瘧疾疫苗。優(yōu)選的能表達所需抗原的基因置于運輸系統(tǒng)天然免疫原蛋白之一，如37kDa的蚊子唾液蛋白的強啟動子控制之下。本發(fā)明的一個主要優(yōu)點是它提供了被動的和持續(xù)的免疫方案(或方法)。另外一個主要優(yōu)點是本發(fā)明提供有效定向適當(dāng)受體的手段-如定向于人從而對他(她)們接種以防止瘧疾。另一個主要優(yōu)點是本發(fā)明的運輸系統(tǒng)可用于定向常規(guī)免疫方案一般難以得到的貯主種群?？傊景l(fā)明是基于這樣的認識許多帶有寄生蟲(如昆蟲)，包括許多正由于它而開發(fā)抗寄生蟲疫苗的疾病的載體的有機體生活周期中一個必不可少的需求是需要在受體身上反復(fù)取食(如食血(bloodmeals))。本發(fā)明也基于這樣的認識居住于充斥食植物或食血性昆蟲地區(qū)的個體對昆蟲唾液形成免疫/變態(tài)反應(yīng)(即食植物或食血性昆蟲能運送免疫原性量的蛋白至人)。在這一點，業(yè)已發(fā)現(xiàn)相當(dāng)數(shù)量的食血性昆蟲的唾液含有T細胞激活、嗜中性白細胞活性和巨噬細胞功能抑制劑以及血管舒張素和抗-炎癥分子(Riberio等1991；1994；Bissonnette等1994)。然而最終顯示長時間反復(fù)低水平暴露于食血性昆蟲唾液將導(dǎo)致人和動物受體對唾液蛋白的免疫力。對蚊子叮咬變態(tài)反應(yīng)的廣泛研究證明了昆蟲唾液中免疫原的免疫原潛力(Frazier，1987)。在伊蚊(Aedes)顯示自然暴露的成年人的血清識別多達4種唾液蛋白(Brummer-Korvenkontio等，1994)。占優(yōu)勢的反應(yīng)為IgG4，IgE和IgG1同種型抗原和定向抗‘36kDa’的蛋白。本發(fā)明也基于這樣的認識在昆蟲細胞中表達的重組寄生蟲抗原可具有高度和合適的免疫原性。本發(fā)明也基于這樣的認識構(gòu)建重組昆蟲的能力現(xiàn)在是可能的，因為在昆蟲如果蠅(Drosophila)中已獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因。這樣，在一高度優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明用食植物或食血性有機體(如通常帶有寄生蟲的昆蟲)作為載體以在食血時直接運送抗原至人和動物種群。在有些情況下，本發(fā)明的接種方案可用作傳統(tǒng)免疫方案的替代或輔助。具有本發(fā)明高度優(yōu)選的運輸系統(tǒng)，現(xiàn)在可以通過引起所患疾病傳播的食植物或食血性昆蟲或通過其它具有合適取食習(xí)慣的食血性昆蟲的每次叮咬來連續(xù)不斷地免疫和/或加強免疫人、家畜動物和其它動物貯主。此外，本發(fā)明提供能表達所需抗原于其唾液中的轉(zhuǎn)基因食植物或食血性昆蟲以使當(dāng)它們采血取食時少量抗原被運送，這將誘導(dǎo)、維持或加強被叮咬‘受體’的免疫應(yīng)答。在下面的評述中將更為詳細地討論本發(fā)明，其中描述了本發(fā)明的進一步優(yōu)選方面及其優(yōu)點。有機體的選擇理想地，選作本發(fā)明運輸系統(tǒng)和任何轉(zhuǎn)基因的有機體(如食植物或食血性昆蟲)應(yīng)具有以下特征的一個或幾個(優(yōu)選為所有全部)分布廣泛；廣泛的食血習(xí)慣；在叮咬時運送基本的唾液量；在實驗室容易飼養(yǎng)；其卵可長期保存；應(yīng)該是重要的分子生物學(xué)研究對象和對其應(yīng)該存在瞬時或永久的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。因此蚊子在目前顯然是優(yōu)選的有機體。認識到在瘧疾當(dāng)?shù)貐^(qū)域，在雨季，一個人每晚受到多達200次的蚊子叮咬，因此通過用本發(fā)明的運輸系統(tǒng)在唾液中運送蛋白的能力顯然是高度優(yōu)越的。在優(yōu)選實施方案中，任何合適的蚊子將會滿足需要。因此，目前制備本發(fā)明的運輸系統(tǒng)的優(yōu)選有機體為按蚊(Anopheline)或伊蚊(Aedine)種蚊子?；谔囟ǖ挠袡C體，如蚊子是一種寄生蟲來源的抗原的載化載體，故注意到其無須一定要被使用以制備本發(fā)明運輸系統(tǒng)是重要的。而有機體應(yīng)該是能以要被定向的‘受體’為食的有機體。這樣，通過實施例，不帶有引起瘧疾的寄生蟲的蚊子可運送瘧疾疫苗。蚊子也可用于運送針對于除瘧疾之外的疾病如-血吸蟲病的疫苗?？乖倪x擇瘧疾寄生蟲抗原(動合子)、天然蛋白和重組蛋白均可用于測定通過抗原性-叮咬(antigenic-bite)而誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答并且現(xiàn)在與關(guān)于小鼠對這些蛋白(重組和天然的)免疫應(yīng)答的廣泛數(shù)據(jù)庫一起進入一些實驗室的常規(guī)使用。用于檢測寄生蟲傳播(來自膜喂養(yǎng)和原封不動的小鼠(membranefeedsandintactmice)免疫效果的傳播阻滯分析也在一些實驗室中進入常規(guī)使用。一個實施例抗原為嚙齒類瘧疾寄生蟲伯氏瘧原蟲(Plasmodiumberghei)的傳播阻滯抗原Pbs21。Pbs21為位于質(zhì)膜的動合子抗原。它為高度保守基因家族的一個成員，該家族也編碼Pfs25和Pfs28，前者為即將進行野外試驗的人傳播-阻滯疫苗侯選產(chǎn)品(TBV25H)，并且后者為Pbs21的同源物。這些抗原都不是使自然免疫或通過感染而加強免疫，因此通過轉(zhuǎn)基因蚊子重復(fù)‘加強免疫’的可能性將在本領(lǐng)域內(nèi)至關(guān)重要。天然Pbs21是具有高度免疫原性的蛋白。據(jù)此觀點，只要有5μg的單次接種便會誘導(dǎo)顯著的傳播阻滯活性。整個蛋白在昆蟲細胞中表達(用桿狀病毒載體)且重組蛋白(rPbs21)在沒有佐劑的情況下與天然分子具有相同的免疫原性(Matsuoka等，1994；Margos等1994)。通常減少超過90％的傳播，且到目前為止還沒有報導(dǎo)重組抗原具有副作用-即增強了寄生蟲的傳播。rPbs21因此為一種理想的用于實驗室研究的重組寄生蟲蛋白，從而顯示出本發(fā)明的運輸系統(tǒng)能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。啟動子的選擇James等(1991)克隆了編碼‘37kDa’的一種重要的唾液蛋白的伊蚊(Aedes)基因，其可能的免疫應(yīng)答定向由Brummer-Korvenkontio等(1994)見到。該蛋白的信號序列和推斷的啟動子因此可得到。在一優(yōu)選的實施方案中，選擇的抗原置于來自天然免疫原性唾液蛋白之一，如37kDa蛋白的強啟動子控制之下。該優(yōu)選實施方案異致例如叮咬后被傳送至受體的高產(chǎn)量的抗原。構(gòu)建體的選擇能表達所有或選擇的T和B細胞分子表位的基因構(gòu)建體是可以得到的。其它優(yōu)選構(gòu)建體包括天然信號序列但其中的膜錨定基序被刪除。這些構(gòu)建體導(dǎo)致可溶性免疫原從昆蟲細胞的釋放(Matsuoka等，1994)。識別構(gòu)型依賴性和/或非依賴性表位的廣泛范圍的高滴度抗體是可以得到的，與ELISA、ELISPOT、IFAT和免疫金技術(shù)一起用于檢測和測量抗原表達。轉(zhuǎn)基因的定位選擇在埃及伊蚊中以唾液腺特異方式表達的許多基因被鑒定(James等，1989)。因此一個優(yōu)選的實施方案涉及這些基因的使用，如36/7kDa蛋白。在這里，這些基因的上游區(qū)域為已知且認為是含有適當(dāng)?shù)目刂菩蛄?。因此，結(jié)合唾液腺特異基因5′區(qū)大片段與Pbs21基因特異免疫原功能區(qū)是可能的。對于在有些情況要定向Pbs21至轉(zhuǎn)基因昆蟲的唾液導(dǎo)管，以來自分泌型唾液蛋白如36kDa蛋白的信號序列代替Pbs21的信號序列也許是特別必要的。這些組的盒(Cassettes)然后可被導(dǎo)入轉(zhuǎn)染載體。載體的選擇可用于產(chǎn)生本發(fā)明運輸系統(tǒng)的載體可以是已知的載體。例如，可用于在培養(yǎng)的蚊子細胞或蚊子胚胎中導(dǎo)入和表達DNA的典型DNA載體可分別見于Lycett和Crampton(1993)或Miller等(1987)，McGrane等(1988)和Morris等(1989)的文獻中。細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的選擇在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，細胞可用DNA瞬時或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染并且導(dǎo)入的DNA在適當(dāng)啟動子的控制下表達(Lycett等1992；Lycett和Crampton1993)。轉(zhuǎn)染方法的選擇現(xiàn)在通過瞬時轉(zhuǎn)染方法修飾蚊子唾液腺和中腸是可能的。向蚊子胚胎導(dǎo)入DNA的技術(shù)也已被開發(fā)且雖然整合不是以高頻率發(fā)生，但導(dǎo)入的DNA的確偶而整合進入受體基因組以使其傳遞到蚊子的后代中(Miller等1987；McGrane等，1988；Morris等，1989)。關(guān)于本發(fā)明，使用細胞轉(zhuǎn)染分析和分離的蚊子唾液腺的轉(zhuǎn)染是可能的。然而，在后者情況下切除的腺體相對地不能透過轉(zhuǎn)染DNA，因為基膜(basementmembrane)作為障礙起作用。但是如果腺體孵育于0.2％彈性蛋白酶，這將去除基膜從而可用陽離子脂，DOTAP將DNA瞬時轉(zhuǎn)染進入唾液腺。使用該技術(shù)，同源報告基因可在埃及伊蚊唾液腺中表達。這方面是優(yōu)選方法的特征。同源重組實驗顯示同源重組是以基因定向方式向蚊子種系(germline)導(dǎo)入基因構(gòu)建體的適當(dāng)方式(Comley等，1994)。因此，通過顯微注射向蚊子胚胎導(dǎo)入在適當(dāng)啟動子控制之下的實施例Pbs21基因而產(chǎn)生在其唾液中表達Pbs21的轉(zhuǎn)基因蚊子家系是可能的?；谕僖?斑點(spit-blot)系統(tǒng)(Billingsley等，1991)的簡單體外分析和體內(nèi)分析然后可在蚊子取食時用于測量抗原運送。因此，總言之本發(fā)明與過去所做努力的不同在于它旨在發(fā)展對昆蟲載體分子生物學(xué)的更深一步理解(Crampton，1994b)-如用轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生蚊子或其它不能傳送病原體，如瘧疾寄生蟲的載體(Crampton等，1993；Muller等，1993；Crampton，1994a)。與以前的方法相反，本發(fā)明沒有使有機體對感染不應(yīng)。而是本發(fā)明用有機體(如昆蟲)和它們的取食行為以新奇和創(chuàng)造性的方式去誘導(dǎo)或提高受體的免疫力-如打斷病原體生活周期。在這里，本發(fā)明運輸系統(tǒng)和其中使用的轉(zhuǎn)基因有機體的一個重要方面是這樣的事實有機體含有和/或在受體外部原位產(chǎn)生疫苗且然后由轉(zhuǎn)基因有機體本身將疫苗運送至受體。這樣，在其最廣泛的意義上，本發(fā)明涉及向受體的運輸系統(tǒng)，包括含有受體疫苗的有機體，其中的疫苗能從有機體那里由它傳送至受體，且其中的疫苗是已在受體外部制備的。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案包括轉(zhuǎn)基因食植物或食血性昆蟲，它們具有包括能表達所需抗原基因的唾液腺。本發(fā)明高度優(yōu)選的實施方案是向受體的運輸系統(tǒng)，運輸系統(tǒng)包括含有受體疫苗的有機體，其中的疫苗能從有機體那里由它傳送至受體，其中的疫苗由在有機體內(nèi)含有的基因所表達，疫苗在受體外部制備，且其中的有機體是通常以受體為‘食’的食植物或食血性有機體(可以不一定帶有寄生蟲)。本發(fā)明現(xiàn)在將僅通過實施例來加以描述。在下面的實施例中，列出實施例伯氏瘧原蟲瘧疾傳送-阻滯抗原Pbs21和埃及伊蚊及史蒂芬斯氏按蚊(Anophelesstephensi)作為參考。而且，下面的說明同樣適用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的其它運輸系統(tǒng)。為了證實本發(fā)明運輸系統(tǒng)的有效性，遵循下面程序中至少一些或全部階段是必要的程序1.將編碼傳播-阻滯抗原Pbs21的克隆基因?qū)氲脚囵B(yǎng)的蚊子細胞中并且在典型瞬時和穩(wěn)定的表達系統(tǒng)中表達該基因。2.反復(fù)運送在桿狀病毒或從蚊子細胞中產(chǎn)生的且適當(dāng)?shù)退降闹亟MPbs21至實驗室小鼠以評估產(chǎn)生的免疫力。這可以在幼年小鼠和以前以Pbs21免疫過(測試應(yīng)答的增強)的小鼠上進行。3.以含有在組成型和唾液腺特異的啟動子控制下的編碼Pbs21基因的DNA載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的蚊子唾液腺。4.以合適的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化蚊子胚胎以產(chǎn)生能以適當(dāng)數(shù)量表達蚊子唾液腺中具有高度免疫原性蛋白Pbs21基因的轉(zhuǎn)基因蚊子。5.在實驗室研究中，當(dāng)通過轉(zhuǎn)染蚊子叮咬而運送免疫原時，用小鼠測試作為免疫原的重組Pbs21的有效性。6.釋放適當(dāng)?shù)挠行мD(zhuǎn)基因蚊子到野外以影響，如，人的相關(guān)疾病，如瘧疾。Pbs21通過蚊子細胞的表達和分泌完整的Pbs21以及其信號或錨定序列已被刪除的突變體用桿狀病毒表達系統(tǒng)在斜紋夜蛾(Spodoptera)細胞和棉鈴蟲屬(Heliothis)幼蟲中表達(Matsuoka等1994；Margos等1994)。用同樣的方法，蚊子細胞表達和分泌可溶性、正確折疊和修飾過的具有高度免疫原性的Pbs21。作為檢驗，可以用整個Pbs21編碼區(qū)和‘少錨定區(qū)’(anchor-less)的構(gòu)建體(Pbs21c2)以現(xiàn)存的載體用果蠅熱休克(hsp70)及肌動蛋白5C啟動子(Lycett和Crampton，1993)在切除下的唾液腺的暫時表達系統(tǒng)中測試轉(zhuǎn)染的埃及伊蚊和史蒂芬斯按蚊(Anophelesstephensi)細胞系，同樣也可在轉(zhuǎn)染的伊蚊(Aedes)胚胎和轉(zhuǎn)基因昆蟲中用果蠅的熱休克和肌動蛋白啟動子。在一個方面，唾液蛋白置于特定啟動子和信號序列的控制之下從而在體內(nèi)提供適當(dāng)?shù)谋磉_和分泌極性。優(yōu)選的信號和啟動子序列從在唾液腺中表達的基因如從36kDa蛋白獲得(James等1991)。監(jiān)測Pbs21的表達典型的監(jiān)測Pbs21表達的技術(shù)為已知的。例如，Pbs21表達用原位雜交技術(shù)在mRNA水平(Thompson&Sinden，1994)和用ELISA及IFAT/共聚焦掃描顯微術(shù)在蛋白質(zhì)水平加以檢測-由此可提供mRNA和蛋白表達的定量和組織學(xué)定位。對整體或器官勻漿的ELISA捕獲分析使用兩種獨特的單克隆抗體12.1和13.1(Tirawanchai等，1991)；對于可制備整個蚊子和/或分離器官的IFAT分析由Simonetti等(1993)描述。如果唾液腺組織在體外或體內(nèi)表達Pbs21，那么唾液-斑點分析(Billingsley等，1991)用于檢測是否重組伊蚊(Aedes)的叮咬運送的唾液運送了可檢測或可定量水平的抗原。所表達的Pbs21的免疫原性a.重組Pbs21由靜脈注射按蚊(Anopheles)和皮下(SubCut)伊蚊(Aedes)途徑在獨立的實驗中被運送。在不同的實驗中施給的劑量反映每周蚊子叮咬頻率在5～1000次之間。結(jié)果顯示在三周期限內(nèi)僅50次的伊蚊(Aedes)叮咬誘導(dǎo)出小鼠唾液中可檢測的免疫應(yīng)答。認識到截止目前所描述的傳播-阻滯效應(yīng)劑機制均為抗體為基礎(chǔ)的(Ranawaka等，1994a-c)，在所有實驗中檢測免疫應(yīng)答的以下一個或幾個特征i)用rPbs21在捕獲分析中(Tirawanchai等1991)全部抗-Pbs21抗體的滴度；ii)傳播阻滯效率；這里的免疫小鼠給予激發(fā)感染且分析了它們向首次實驗的蚊子傳播瘧疾的能力(Tirawanchai等，1991)。b.重復(fù)實驗以檢測是否重復(fù)小劑量抗原的施用會有效地增強已用已知免疫有效量的rPbs21免疫的小鼠(見Matsuoka等1994；Margos等1994)的免疫應(yīng)答。初次免疫以后，直到檢測到總的抗體滴度下降時(通常在上次免疫后5～9周(Margos等，1994))免疫應(yīng)答才跟上。此時在延長的期限內(nèi)將免疫小鼠暴露于已知劑量的重組抗原-以模仿自然暴露于轉(zhuǎn)基因蚊子中。接著是激發(fā)的和增強的小鼠的免疫應(yīng)答以檢測是否且在什么頻率，該免疫作用能在與保護相關(guān)的水平(即100μg/ml或更高)維持或提高抗體滴度。如果它們被維持，該實驗使人們能夠檢測到持續(xù)免疫應(yīng)答的維持時間。在構(gòu)建了在其唾液中表達Pbs21的轉(zhuǎn)基因蚊子以后，用轉(zhuǎn)基因蚊子作為抗原來源重復(fù)所有在a.和b.(見上文)中的實驗。作為選擇，用蚊子唾液和來自棉鈴蟲屬幼蟲的rPbs21的混合物重復(fù)2a/b的挑選的方面是可行的。Pbs21-A在昆蟲細胞中的表達Pbs21在其羧基末端具有一個＜25氨基酸的疏水序列，它被認為是將該蛋白錨定于膜上。該序列已從分子中刪除且在培養(yǎng)的昆蟲細胞中檢測產(chǎn)物的分泌和免疫原性。在基因3′端缺少75個核苷酸的Pbs21編碼序列的產(chǎn)生Pbs21基因構(gòu)建體(PBS21-A)用整個Pbs21編碼區(qū)序列作為模板通過PCR技術(shù)獲得，且5′端寡核苷酸引物為5′TCACGGAATTCAATTTTAAATACAGTTTTAT3′EcoR1AsnPheLysTyrSerPhe且也使用反向引物3′TGACCATCGCTTTGCGGTATTCAGCTGGATGC5′終止Sall得到的PCR產(chǎn)物相應(yīng)于全部編碼序列減去最后75個核苷酸且被設(shè)計要被翻譯和表達蛋白羧基末端減去最后25個氨基酸的Pbs21。PCR產(chǎn)物克隆進入PCr載體(ProkaryoticT-AcloningOneShotKitINVITROGENInc)。PCr載體適于PCR產(chǎn)物的定向克隆。它利用了PCR擴增的DNA末端突出的A和T的優(yōu)點。在克隆重組載體經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌而被擴增后，插入子以EcoRI和Sall核酸內(nèi)切酸切割，這樣允許后來的定向克隆進入pSynXIVVI/2轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。當(dāng)克隆進入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒后，通過DNA的定向測序確證其取向和正確的序列。草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞以重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和親本vSynVIgal桿狀病毒DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染進行共轉(zhuǎn)染。經(jīng)幾輪篩選和分離重組桿狀病毒后，擴增重組的Pbs21-A桿狀病毒(通過斜紋夜蛾細胞的系列感染)。表達蛋白的免疫學(xué)結(jié)構(gòu)在桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)中表達的Pbs21-A蛋白由既結(jié)合共轉(zhuǎn)化依賴性又結(jié)合非依賴性傳播阻滯表位(Mab13.1共轉(zhuǎn)化非依賴性，Mab17.9共轉(zhuǎn)化依賴性)的抗體所識別。蛋白的細胞表達顯示蛋白產(chǎn)量的最大水平在感染后48小時，表明該時間是此系統(tǒng)的表達高峰，在還原或非還原條件下通過蛋白質(zhì)印跡分析，異源蛋白為21kD(類似于天然的寄生蟲蛋白)。重組蛋白的分泌通過活體或固定細胞的間接熒光抗體篩選發(fā)現(xiàn)蛋白位于細胞內(nèi)部的細胞質(zhì)中但沒有結(jié)合到細胞表面，并且也是以十分顯著(Significant)的數(shù)量(與細胞蛋白相比)分泌于感染細胞的上清中。感染后20小時，約65％的總蛋白位于上清而35％位于細胞中。48小時后，33％位于上清中而47％位于細胞中，72小時后，77％位于上清而23％位于細胞中且最終經(jīng)96小時后91％蛋白位于上清中而9％位于細胞中。相同制品的存活性分析顯示如下結(jié)果20小時-88％存活；45小時-84％存活；72小時-65％存活和96小時-34％存活。因為在這些時間未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞死亡或裂解，因此證明細胞在20小時和48小時分泌Pbs21-A。因此該構(gòu)建體可用作要在轉(zhuǎn)基因昆蟲中表達的抗原。因此本發(fā)明涉及向受體的運輸系統(tǒng)，該運輸系統(tǒng)包括含有受體疫苗的有機體，其中的疫苗能由有機體從它那里傳送至受體，且其中的疫苗在受體外部制備。優(yōu)選地，有機體與受體對象，如人是拮抗性的。這樣，本發(fā)明提供了包括含有和/或能產(chǎn)生受體疫苗的有機體的疫苗運輸系統(tǒng)，其中的疫苗能由有機體從它那里傳送至受體，且其中的疫苗在受體外部制備。本發(fā)明也提供了一種向受體的疫苗運輸系統(tǒng)，該運輸系統(tǒng)包括含有和能產(chǎn)生受體疫苗的有機體，其中的疫苗能由有機體從它那里傳送至受體，且其中的疫苗通過受體以外的合適基因的表達而產(chǎn)生。對本發(fā)明的其它修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。參考文獻Beard，C.B.等(1993)舌蠅(tsetse)細菌共生體的遺傳轉(zhuǎn)化和種系發(fā)生。昆蟲分子生物學(xué)1，123-131。Billingsley，P.F.，等(1991)?；铙w蚊子中成熟瘧疾感染的檢測。Trans.R.Soc.皇家熱帶醫(yī)藥與衛(wèi)生學(xué)匯刊85，450-453。Bissonnette，E.Y.，等(1993)。蚊子唾液腺提取物抑制肥大細胞(mastcells)腫瘤壞死因子α的釋放。寄生蟲免疫學(xué)15，27-33。Brummer-Korvenkontio，H.，等(1994)用免疫印跡對蚊子唾液特異的IgE和IgG4抗體的檢測。變態(tài)反應(yīng)和臨床免疫學(xué)雜志93，551-555。Collins，F(xiàn).H(1994)通過其載體的遺傳操作對瘧疾控制的前景。今日寄生蟲學(xué)(ParasitologyToday)10，37-371。Crampton，J.M.(1994a)。載體控制進展新的且可信的3。疾病昆蟲載體的遺傳操作前景?；始覠釒пt(yī)學(xué)與衛(wèi)生學(xué)匯刊88，141-143。Crampton，J.M.(1994b)。瘧疾昆蟲載體的分子學(xué)研究。寄生蟲學(xué)進展，34，1-31。Crampton，J.M.等(1990a)。轉(zhuǎn)基因蚊子未來載體控制戰(zhàn)略。今日寄生蟲學(xué)6，31-36。Curtis，C.F.(1994)。通過對其載體的遺傳操作而進行瘧疾控制的實例。今日寄生蟲學(xué)10，371-374。Gwadr，R.W.(1994)。瘧疾控制的遺傳途徑路有多長？美國熱帶醫(yī)藥衛(wèi)生雜志50，116-125。James，A.A.，等(1989)。載體蚊，埃及伊蚊唾液腺特異的麥芽糖酶樣基因。基因75，73-83。Kaslow，D.C.(1993)對瘧疾和其它載體介導(dǎo)疾病的傳播阻滯免疫性。免疫學(xué)當(dāng)前評論5，557-565。Kaslow，D.C.(1992)。對于伯氏瘧原蟲(Plasmodiumfalcipalum)的傳播阻滯疫苗。國際熱帶醫(yī)藥和瘧疾會議論文集，Patayya.TuS13pp177-178。Lycett，G.等(1992)。報告基因在培養(yǎng)埃及伊蚊細胞中的表達。在《昆蟲分子科學(xué)》(J.M.Crampton和P.Eggleston編)pp.247-48科學(xué)出版社，倫敦。Lycett，G.J.等(1993)。用hsp70新(neo)融合基因?qū)ξ米蛹毎捣€(wěn)定的轉(zhuǎn)化?；?365，129-136。McGrane，V.等(1988)。顯微注射DNA進入Aedestriseriarus卵且對整合的檢測。美國熱帶醫(yī)藥衛(wèi)生雜志。(Am.J.Trop.Med.Hyg.)39，502-510。Margos，G.等(1994)。在昆蟲桿狀病毒細胞系統(tǒng)中伯氏瘧原蟲(plasmodiumberghei)動合子抗原Pbs21的表達產(chǎn)生有效的傳播阻滯免疫原。待發(fā)表(Inpress)。Mastsuoka，H.等.(1994)。用桿狀病毒表達載體系統(tǒng)在蠶動蟲中產(chǎn)生的伯氏瘧原蟲重組動合子表面抗原誘導(dǎo)抗瘧疾的傳播阻滯免疫性。待發(fā)表(Inpress)。Miller，L.H.等(1987)。細菌基因在崗比亞按蚊中穩(wěn)定的整合和表達。科學(xué)237，779-781。Morris，A.C.等.(1989)。通過DNA的顯微注射對埃及伊蚊的遺傳轉(zhuǎn)化。醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)昆蟲學(xué)3，1-7。Muller，H.M等(1993)。崗比亞按蚊胰蛋白酶基因家族成員通過食血在腸中被誘導(dǎo)。EMBO雜志12，2891-2900。Ranawaka，G.，等(1993)。在第一次和第二次食血時攝入的傳播-阻滯抗體對蚊子載體中伯氏瘧原蟲發(fā)育的影響。寄生蟲學(xué)，107，225-231。Ranawaka，G，等(1994)。傳播-阻滯抗體在體外對伯氏瘧原蟲配子細胞分化成動合子效應(yīng)機制的特征描述。寄生蟲學(xué)，109，11-17。Ranawaka，G，等(1994)?？筆bs21瘧疾傳播-阻滯免疫性對卵囊(oocyst)在體內(nèi)分化的動合子作用模式的特征描述。寄生蟲學(xué)，(待發(fā)表)(Inpress)。Robertson，H.M.等(1993)。在自然界中mariner可轉(zhuǎn)移的成分廣泛分布。自然362，241-245。Ribeiro，J.M.C.等(1990)。Ixodesdemmini蜱唾液抑制噬中性細胞功能。實驗寄生蟲學(xué)，70，382-389。Ribeiro，J.M.C等(1994)。Aedestriseriatus和崗比亞按蚊(DipteraCulicidae)的唾液血管舒張素(Salivaryvasodilators)。醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)雜志31，747-753。Sinden，R.E.(1994)?？汞懠矀鞑?阻滯疫苗?？茖W(xué)進展(Scienceprogress)，77。Spielman，A.(1994)。為何昆蟲學(xué)的抗瘧疾研究不應(yīng)集中于轉(zhuǎn)基因蚊子。今日寄生蟲學(xué)10，374-376。Thompson和Sinden(1994)。伯氏瘧原蟲性發(fā)育階段RNA的原位檢測。分子和生化寄生蟲學(xué)(待發(fā)表)(Inpress)。Tirawamchai，N.等(1991)。由親和純化的21千道爾頓伯氏瘧原蟲(Plasmodiumberghei)合子-動合子(zygote-ookinete)表面抗原誘導(dǎo)的免疫性的分析。感染與免疫59，36-44。Warren，A.M等(1991)。埃及伊蚊基因組復(fù)雜性和組織。遺傳研究(Cambridge)58，225-232。Warren，A.M.等(1994)。Mariner它有望作為醫(yī)學(xué)上重要昆蟲的轉(zhuǎn)化載體。今日寄生蟲學(xué)11，58-63。權(quán)利要求1.一種向受體的運輸系統(tǒng)，該運輸系統(tǒng)包括含有受體疫苗的有機體，其中的疫苗能由有機體從它那里傳送至受體，且其中的疫苗在受體外部制備。2.根據(jù)權(quán)利要求1的運輸系統(tǒng)，其中的有機體為轉(zhuǎn)基因有機體且疫苗由包含在轉(zhuǎn)基因有機體中的基因所表達。3.根據(jù)權(quán)利要求2的運輸系統(tǒng)，其中該基因被穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)基因有機體的基因組中。4.根據(jù)以上任一權(quán)利要求的運輸系統(tǒng)，其中的受體為家畜動物，人或植物。5.根據(jù)以上任一權(quán)利要求的運輸系統(tǒng)，其中的有機體具有口且疫苗是通過有機體的口而被傳送。6.根據(jù)以上任一權(quán)利要求的運輸系統(tǒng)，其中的有機體為通常帶有寄生蟲的有機體。7.根據(jù)以上任一權(quán)利要求的運輸系統(tǒng)，其中的有機體為食植物或食血性有機體。8.根據(jù)以上任一權(quán)利要求的運輸系統(tǒng)，其中的有機體為昆蟲，優(yōu)選為食血性昆蟲。9.根據(jù)權(quán)利要求8的運輸系統(tǒng)，其中的食血性昆蟲為蚊子。10.根據(jù)以上任一權(quán)利要求的運輸系統(tǒng)，其中的有機體為在其自然狀下通常會以受體為食且在這樣做時轉(zhuǎn)移感染源(infectiousagent)至受體且因此導(dǎo)致感染的有機體。11.包含能表達疫苗基因的轉(zhuǎn)基因有機體，其中的轉(zhuǎn)基因有機體本身適于用作向受體運送疫苗而因此接種的手段，且其中的疫苗在受體外部制備。12.根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因有機體，其中的基因被穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)基因有機體的基因組中。13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的轉(zhuǎn)基因有機體，其中的轉(zhuǎn)基因有機體為權(quán)利要求5～10中任意一項所定義的有機體。14.根據(jù)權(quán)利要求11～13任意一項的轉(zhuǎn)基因有機體，其中的受體為家畜動物、人或植物。15.源自根據(jù)權(quán)利要求11或其任一項從屬權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因有機體的疫苗。16.根據(jù)權(quán)利要求11或其任一項從屬權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因有機體在生產(chǎn)用于通過轉(zhuǎn)基因有機體接種受體的疫苗中用途，其中的疫苗由轉(zhuǎn)基因有機體運送至受體，且其中的疫苗在受體外部制備。17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中的受體為家畜動物、人或植物。18.轉(zhuǎn)基因食植物或食血性昆蟲，其具有包含能表達所需抗原以產(chǎn)生免疫性的基因的唾液腺。19.根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因食植物或食血性昆蟲，其中的昆蟲為蚊子。20.根據(jù)權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因食植物或食血性昆蟲，其中的抗原為瘧疾疫苗。21.根據(jù)權(quán)利要求18-20任意一項的轉(zhuǎn)基因食植物或食血性昆蟲，其中的基因編碼影響導(dǎo)致要被治療疾病寄生蟲生活周期的抗原-如傳播阻滯免疫原(transmission-blockingimmunogen)。22.包括根據(jù)權(quán)利要求18或其任一項從屬權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因有機體唾液的受體，其中的唾液含有通過表達編碼相同基因而產(chǎn)生的抗原。23.根據(jù)權(quán)利要求22的受體，其中的受體為人，轉(zhuǎn)基因有機體為轉(zhuǎn)基因的蚊子且抗原為瘧疾疫苗，如傳播-阻滯免疫原。24.接種受體的方法，包括暴露受體于根據(jù)權(quán)利要求11或其任一項從屬權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因有機體且允許疫苗由轉(zhuǎn)基因有機體從它那里傳送至受體，其中的疫苗在受體外部制備。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的受體為家畜動物、人或植物。全文摘要本發(fā)明涉及一種向受體的運輸系統(tǒng),該系統(tǒng)包括含有受體疫苗的有機體且其中的疫苗在受體外部制備并能夠由該有機體從它那里傳送至受體。優(yōu)選的實施方案包括轉(zhuǎn)基因食植物或食血性昆蟲,其唾液腺含有能表達所需抗原的基因。文檔編號C12N15/85GK1171813SQ9519715公開日1998年1月28日申請日期1995年11月10日優(yōu)先權(quán)日1994年11月11日發(fā)明者R·E·辛登,J·M·克拉姆頓申請人:帝國科技及醫(yī)學(xué)學(xué)院,利物浦大學(xué)