專(zhuān)利名稱(chēng)：：功能性三聯(lián)吡啶-金屬配合物，其制備方法和帶有三聯(lián)吡啶-金屬配合物的寡核苷酸結(jié)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及環(huán)狀三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物，在其所成之大環(huán)上有8個(gè)氮原子和10個(gè)碳原子，在其三聯(lián)吡啶部分含一個(gè)功能基，一種通過(guò)三聯(lián)吡啶肼與吡啶-2，6-二醛或酮縮合的制備方法，這些配合物與寡核苷酸的締合以及這些締合物用于RNA序列專(zhuān)一性裂解的方法。RNA在金屬離子催化條件下水解久已為人熟知。這種裂解一般發(fā)生在RNA的未配對(duì)區(qū)域，在英語(yǔ)中稱(chēng)之為“環(huán)”“l(fā)oops”。對(duì)于t-RNAphe裂解的同一應(yīng)用目的，W.J.Krzyzosiak等人在‘生物化學(xué)’1988，27，5771-5777文中建議用二醋酸鉛，G.J.Murakawa等在‘核酸研究’1989，17，5361-5375文中述及嵌入1，10-菲咯啉的銅配合物，J.Ciesiolka等人在‘歐洲生化雜志’1989，182，445-450著文揭示了三氯化銪應(yīng)用于同一目的裂解tRNAphe。C.S.Chow等人在‘美國(guó)化學(xué)會(huì)志’1990，112，2839-2841文中應(yīng)用了釕和銠與菲咯啉配體的配合物。而在‘生物化學(xué)’29卷2515至2523頁(yè)L.S.Behlen等提及tRNAphe與二醋酸鉛的變體。此后，N.Hayashi等人在‘無(wú)機(jī)化學(xué)’1993年32卷5899至5900頁(yè)描述了鑭系配合物也適于tRNA裂解。后來(lái)D.Magda等人在美國(guó)化學(xué)會(huì)志1994年116卷7439-7440報(bào)告，由銪(III)-Texaphyrin和帶DNA-片段的寡核苷酸之結(jié)合物來(lái)裂解一靶RNA，其中在RNA/寡核苷酸配合物中的Texaphyrin配合物僅被裂解約30％。這種Texaphyrin配合物也有不利之處，在配體中須有另外的羥丙基結(jié)合，才能保證足夠的溶解度。配體的亞胺基不耐水解，所以在水性環(huán)境中其效力相當(dāng)快地減低，這就是說(shuō)作治療應(yīng)用時(shí)只有一個(gè)微不足道的存留時(shí)間。通過(guò)配體的水解金屬被激離出來(lái)，引起嚴(yán)重的毒性問(wèn)題和非選擇性RNA裂解。因?yàn)樗侨趼芬姿顾?，?dāng)銪離子電荷經(jīng)一個(gè)配體中和，一個(gè)二元配體配合物就形成了。上述的配合物都是通過(guò)昂貴的合成方法得到的。我們知道，細(xì)胞中生理上有害的多肽發(fā)生是通過(guò)基因調(diào)控下的mRNA合成而完成。為了抵抗或阻止疾病就希望有種方法阻止mRNA的作用。特別是能夠通過(guò)在確定位點(diǎn)不可逆裂解而破壞mNRA，因之失去其所含信息。因此還可以希望通過(guò)RNA鏈的序列特異性裂解提供一種碎片，以迅速在反義區(qū)構(gòu)成寡核苷酸為診斷目的之用(生物傳感器)或能用于疾病治療中以影響細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程。人們發(fā)現(xiàn)，一個(gè)對(duì)于靶RNA是序列互補(bǔ)并且結(jié)合一個(gè)三聯(lián)吡啶-鑭系配合物的寡核苷酸是高效的，并且能夠?qū)崿F(xiàn)靶RNA的序列專(zhuān)一裂解。本發(fā)明就是通式I的化合物其中R1為H或一個(gè)取代基和R5為一個(gè)一價(jià)功能基，或R1為一個(gè)一價(jià)功能基，R5為H或一取代基，這里功能基直接通過(guò)一個(gè)基團(tuán)Z連接到吡啶環(huán)上，基團(tuán)Z是在必要時(shí)以-O-，-S-，-NR12-，-C(O)O-或-C(O)NR12-隔開(kāi)的選自下列基團(tuán)的殘基C1-C20亞烷基，C2-C12亞烯基，C2-C12亞炔基，C5-C8亞環(huán)烷基，C6-C12亞芳基和C7-C12亞芳烷基，R2和R7彼此獨(dú)立地表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳烷基，C6-C16芳基或鹵素，R3和R6彼此獨(dú)立地表示H，C1-C4烷基，C7-C12芳烷基或C6-C16芳基，R4為H，C1-C20烷基，C5-C8環(huán)烷基，C6-C12芳基或C7-C12芳烷基，R12為H或C1-C6烷基，Me表示一個(gè)鑭系金屬或釔，Y表示一種酸的陰離子，n表示數(shù)字2或3，和m為數(shù)字1、2或3。在這里烷基、環(huán)烷基、芳基烷基、芳基和基團(tuán)Z殘基是未被取代的或以C1-C4烷氧基、F、Cl、Br、-CN、C1-C4烷基或-NO2取代。R1和R5作為取代基優(yōu)選選擇C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基或C6-C16芳基，帶有O，S，N作為雜原子的C4-C16芳基，C6-C12雜芳基，C1-C4烷基硫基，雙(C1-C4烷基)氨基，鹵素基、磺酰胺基或羧酰胺。R1和R5優(yōu)選是連接在吡啶環(huán)氮原子的對(duì)位。R2、R3、R6和R7代表烷基時(shí)優(yōu)選是甲基和乙基，作烷氧基時(shí)優(yōu)選是甲氧基和乙氧基，作芳烷基優(yōu)選是亞芐基或亞苯乙基，而作芳基則優(yōu)選是萘基和特別是芐基。在一種實(shí)施方案中R2和R7為H和R3、R6為烷基，尤其是R2和R7為H及R3和R6為C1-C4烷基，并且特別是都為甲基。R2、R3、R6和R7也可以是以O(shè)、S、N作雜原子的C4-C12雜環(huán)芳基，例如吡啶基、噻唑基、咪唑基、噁唑基、呋喃基、吡啶基、苯硫基。此外還能是C1-C4烷基硫基，鹵素基、雙(C1-C4烷基)氨基、磺酰胺和羧酰胺。R4作為烷基含有1-12C、優(yōu)選1-8C，特別是1-4C原子。烷基的若干例子如甲基、乙基和丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基的各異構(gòu)體。R4作為環(huán)烷基優(yōu)選含有5或6環(huán)碳原子。作為環(huán)烷基的若干例子如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)戊基和環(huán)辛基。R4表示芳基則優(yōu)選是萘基特別是苯基。當(dāng)R4為芳基烷基時(shí)，它優(yōu)選是芐基或苯乙基。對(duì)R4而言一組優(yōu)選的基團(tuán)是H，C1-C4烷基，特別是甲基及苯基或芐基。R1以及R5作為烷基優(yōu)選是甲基或乙基，作為烷氧基優(yōu)選是甲氧基或乙氧基，作為芳基優(yōu)選是萘基或苯基，作為芳烷基優(yōu)選是芐基或苯乙基，優(yōu)選是R1及R5是為H、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基。在本項(xiàng)發(fā)明范圍內(nèi)其一價(jià)功能基主要由下列基團(tuán)中選取-OR10，-SR10，-NCO，-NCS，-NHR11，-C(O)OR11，-C(O)SH，-C(O)NHR11，－C(O)Cl，-C(S)SR11，-C(S)NHR11，-C(S)OR11，-SO3R11，-SO2NHR11-SO2Cl，-P(O)(OH)2，-P(O)(OH)-NHR11，-P(S)(SH)2，-P(S)(SH)-NHR11，-P(S)(OH)2，-P(S)(OH)-NHR11，-P(O)(SH)2，-P(O)(SH)-NHR11，-P(O)(OH)H，-P(O)(NHR11)H，-P(S)(SH)H，-P(S)(NHR11)H，-P(S)(OH)H，-P(O)(SH)H，其中R10為H，-C(O)NH2，-C(S)NH2，-C1-C6-烷基，-CxH2x-NH2，-CxH2x-SH或-(CxH2xO)y-H和R11為H，-C1-C6-烷基，-CxH2x-NH2，-CxH2x-SH或-(CxH2xO)y-H，x等于一個(gè)2到6的數(shù)字，y等于一個(gè)1到20的數(shù)。尤其優(yōu)選的功能基選自這些-OR10，-SR10，-NCO，-NCS，-NHR11，-C(O)OR11和-P(O)(OH)2，特別是選自-NCS，-C(O)OR11和-P(O)(OH)2這些基團(tuán)。通式I的化合物可優(yōu)選自其中R2和R7表示H，R3和R6代表C1-C4烷基，R4是H，C1-C4烷基、苯基或芐基，R1是一個(gè)通過(guò)C1-C3亞烷基、C3-亞炔基、亞苯基或C7-亞芳烷基，特別是C2-C3亞烷基或亞苯連接的一價(jià)功能基，R5是H、甲基或甲氧基，或者R5是一個(gè)經(jīng)C1-C3亞烷基、C3-亞炔基、亞苯基或C7-亞芳烷基，尤其是C2-C3亞烷基或亞苯基連接的一價(jià)功能基，以及R1是H、甲基或甲氧基。在本發(fā)明范圍內(nèi)鑭系金屬是全部的鑭系，即認(rèn)為是鑭(La)，鈰(Ce)，鐠(Pr)，釹(Nd)，钷(Pm)，釤(Sm)，銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)，鏑(Dy)，鈥(Ho)、鉺(Er)，銩(Tm)，鐿(Yb)和镥(Lu)，優(yōu)選是鑭、鈰、釹、銪和釓，特別是鑭和銪，尤其是優(yōu)選銪。絡(luò)合鹽的適當(dāng)陰離子可由下列一類(lèi)中選出鹵素離子(如Cl-，Br-和I-)，含氧酸的陰離子，BF4-，PF6-，SiF6-和AsF6-。含氧酸的陰離子可舉出的例子如硫酸根、磷酸根、高氯酸根、高溴酸根、高碘酸根、銻酸根、硝酸根、碳酸根、C1-C8羧酸的陰離子例如甲酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、苯甲酸根、苯乙酸根、一取代、二取代或三取代氯或氟乙酸根，磺酸根類(lèi)如甲磺酸根、乙磺酸根、丙磺酸根、丁磺酸根、三氟甲磺酸根(Triflat)，必要時(shí)帶C1-C4烷氧基、C1-C4烷氧基或鹵素取代基，特別是氟、氯或溴取代基的苯磺酸或芐基磺酸，例如甲苯磺酸、甲磺酸、對(duì)溴苯磺酸、對(duì)甲氧或?qū)σ已趸交撬?、五氟苯磺酸?，4，6-三異丙基苯磺酸，和膦酸例如甲基膦酸、乙基膦酸、丙基膦酸、丁基膦酸、苯基膦酸、對(duì)甲基苯基膦酸和芐基膦酸根。適當(dāng)?shù)年庪x子還有酒石酸根、檸檬酸根和乳酸根。在本發(fā)明的范圍優(yōu)選的陰離子是F-，Cl-，Br-，I-，PF6-，SbF6-，BF4-，B(Ph)4-，醋酸根，NO3-，硫酸根和磷酸根，特別優(yōu)選的陰離子是Cl-，醋酸根和NO3-。上述的那些優(yōu)選和注釋?zhuān)貏e是那些取代基，適于所述的通式I化合物也適于下述通式V的化合物。本項(xiàng)發(fā)明的另一方面是通式V的化合物。其中R2和R7彼此獨(dú)立地表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基或鹵素，R3和R6彼此獨(dú)立地表示H，C1-C4烷基，C7-C12芳基烷基或C6-C16芳基，R4是H，C1-C20烷基，C5-C8環(huán)烷基，C6-C12芳基或C7-C12芳基烷基，這里的烷基、環(huán)烷基、芳基烷基和芳基或不被取代或以C1-C4烷氧基、F、Cl、Br、-CN、C1-C4烷基或-NO2取代；Me表示一個(gè)鑭系金屬或釔，Y表示一個(gè)酸的陰離子，n是一個(gè)2或3的數(shù)，m是一個(gè)1、2或3的數(shù)，R9表述為式VI的一個(gè)殘基-Xp-A-X′q-A′r-Oligo(VI)R8是H或一個(gè)取代基或者R9表示H或一個(gè)取代基和R8為式VI的一個(gè)殘基，p、q和r彼此獨(dú)立地為0或1，X和X′相互獨(dú)立地表示一個(gè)未被取代基團(tuán)或者以C1-C4烷氧基、F，Cl，Br，-CN，C1-C4烷基或-NO2取代的選自C1-C20亞烷基，C2-C12亞烯基，C2-C12亞炔基，-(CxH2xO)y-，其中x等于一個(gè)2到6的數(shù)，y是一個(gè)1到20的數(shù)，C5-C8亞環(huán)烷基，C6-C12亞芳基和C7-C12亞芳烷基的基團(tuán)。A和A′相互獨(dú)立地代表-O-，-S，-S-S，-NR12-CO-NR12-，-NR12-CS-NR12-，-NR12-，-NR12-C(O)-O-，-C(O)O-，-C(O)S-，-C(O)NR12-，-C(S)S-，-C(S)O-，-C(S)NR12-，-SO2NR12-，-SO2-，-P(O)(OH)O-，-P(S)(SH)S-，-P(S)(SH)O-，-P(S)(OH)O-，-P(O)(SH)S-，-P(O)(OH)S-，-P(O)(SH)O-，-P(O)(OH)-NR12-，-P(S)(SH)-NR12-，-P(S)(OH)-NR12-，-P(O)(SH)-NR12-，-HP(O)O-，-HP(S)S-，-HP(O)NR12-或HP(S)NR12-，其中R12表示H或C1-C6烷基，以及Oligo表述為一個(gè)由天然的、修飾的或合成的脫氧核苷或肽核酸片段衍生而來(lái)的天然、修飾或合成的序列，它經(jīng)過(guò)一個(gè)核酸堿基、一個(gè)核苷酸間的橋或一個(gè)糖基來(lái)連接，并且在其區(qū)域內(nèi)部互補(bǔ)，特別是對(duì)于靶RNA是完全互補(bǔ)的。因此q優(yōu)選1。作為取代基的R8和R9適用上述對(duì)R5和R1的已有規(guī)定及相應(yīng)的優(yōu)選。在本發(fā)明的范圍內(nèi)靶RNA意味著必須存在一個(gè)RNA序列靶物。因此能存在多聚核糖核酸(RNA)，優(yōu)選地涉及m-RNA(信使RNA)，pre-m-RNA(前體信使RNA)，t-RNA(轉(zhuǎn)移RNA)，sn-RNA(小核RNA)，r-RNA(核糖體RNA)和病毒RNA。它也能存在由RNA和脫氧核糖核酸(DNA)的混合序列，例如嵌合的RNA-DNA(Okazaki片段)。RNA提供同樣多的片段(Bausteine)，一個(gè)與寡核苷酸的復(fù)合物(雙鏈)就得以構(gòu)成。在本發(fā)明范圍內(nèi)一個(gè)序列是被理解為在其區(qū)域內(nèi)，例如序列的外部核苷酸片段可有多至5個(gè)，優(yōu)選是3個(gè)，優(yōu)選是1到2個(gè)不必與靶RNA互補(bǔ)。這樣就有其優(yōu)點(diǎn)，聯(lián)接上三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物的序列的末端能夠運(yùn)動(dòng)并從而起作用。寡核苷酸可以部分地或完全由與靶RNA互補(bǔ)天然DNA片段，或者同樣由互補(bǔ)于靶RNA的非天然的合成核苷酸來(lái)構(gòu)成，在此部分意味著，在寡核苷酸序列中靶RNA天然DNA片段通過(guò)同樣的互補(bǔ)非天然合成核苷酸替代。合成的片段包含著對(duì)天然片段在核酸堿基、呋喃糖環(huán)和/寡核苷酸的橋基團(tuán)的修飾。合成的結(jié)構(gòu)一般著眼于以增強(qiáng)雙鏈結(jié)構(gòu)的配合物的形成和/或寡核苷酸穩(wěn)定性，來(lái)提高其抗核苷酶分解能力。修飾的核苷在‘反義技術(shù)’領(lǐng)域作為合成或修飾互補(bǔ)的寡核苷酸已有大量已知結(jié)果，這里不再贅述(例見(jiàn)于E.Uhlmann等，化學(xué)評(píng)論，1990年，90卷，4期，543-584頁(yè))。作為修飾，可以考慮基團(tuán)的改變，這些改變發(fā)生在核素堿基部分(如取代、取代基的刪除)，在核苷酸橋聯(lián)基團(tuán)(如磷酸酯基團(tuán)改變或?yàn)榱硪粯蚵?lián)基團(tuán)替代)，在呋喃糖環(huán)(如在2′-羥基上取代，呋喃糖的O原子被替代，呋喃糖環(huán)被單或雙碳環(huán)替代，呋喃糖環(huán)為開(kāi)鏈結(jié)構(gòu)所替代)。在寡核苷酸序列中片段的選擇和順序依靶RNA必要的雙螺旋結(jié)構(gòu)選定，并且與三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物聯(lián)結(jié)的種類(lèi)和位置也影響到片段的選擇和次序。在寡核苷酸中片段和數(shù)目是按與靶RNA雜合的完成而確定。這種寡核苷酸可具有5到100個(gè)，優(yōu)選是5到50個(gè)，更好地是8到30個(gè)，優(yōu)選是10到25個(gè)片段。與靶RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)配對(duì)(核苷酸堿基配對(duì))優(yōu)選是排在寡核苷酸的中間序列部分，例如在后四個(gè)之間，或后三個(gè)，后兩個(gè)或該序列的最后一個(gè)片段。例如一個(gè)有20個(gè)片段的寡核苷酸其配對(duì)的片段優(yōu)選是在其4到7片段。寡核苷酸優(yōu)選是由嘌呤類(lèi)和嘧啶型核苷構(gòu)成，特別是2′-脫氧-2-氨基腺苷，2′-脫氧-5-甲基胞苷，2′-脫氧腺苷，2′-脫氧胞苷，2′-脫氧尿苷，2′-脫氧鳥(niǎo)苷和2′-胸苷。特別優(yōu)選的是2′-脫氧腺苷(A)，2′-脫氧胞苷(C)，2′-脫氧鳥(niǎo)苷(G)和2′-胸苷(T)。修飾的結(jié)構(gòu)單元按嘌呤型和嘧啶型天然核苷來(lái)進(jìn)行，特別優(yōu)選是腺苷，胞苷，鳥(niǎo)苷，2-氨基腺苷，5-甲基胞苷，胸苷和其脫氧衍生物。這些核苷也可采用2′-修飾的核糖核酸。在本發(fā)明中一個(gè)很優(yōu)選的實(shí)施方案是向一個(gè)靶RNA互補(bǔ)由天然的脫氧核苷來(lái)的寡核苷酸，特別是由2′-脫氧腺苷(A)，2′-脫氧胞苷(C)，2′-脫氧鳥(niǎo)苷(G)和2′-胸苷(T)或者由互補(bǔ)的非天然合成的片段所構(gòu)成。在本發(fā)明范圍內(nèi)所有這些修飾的寡核苷酸，抗核苷酶的穩(wěn)定性提高的核苷均是優(yōu)選的。寡核苷酸也可由肽核酸(PNA)的序列組成，這樣三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物就優(yōu)選是在核酸堿基上連接氨基或羧基端。對(duì)于DNA序列的構(gòu)成，關(guān)于寡核苷酸的優(yōu)先選擇的同樣適用。例證可見(jiàn)于‘科學(xué)雜志’254卷，14970-1500頁(yè)。三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物主要通過(guò)一個(gè)橋聯(lián)基團(tuán)連接到寡核苷酸序列中的3′-或5′-端基的N-或O-原子上，但也可連接到核酸堿基的C、N-或O-原子上或在序列末端中呋喃糖環(huán)的2′-位置，或連接于序列中核苷酸橋基的O-，S-或N-原子上。結(jié)合的方式有賴(lài)于三聯(lián)吡啶-鑭系配合物及其功能基團(tuán)的種類(lèi)。一個(gè)橋聯(lián)基團(tuán)可以是改造了的功能基，它能直接地或通過(guò)一化合物基團(tuán)連接到三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物或寡核苷酸上。在寡核苷酸上結(jié)合的可以是離子鍵，優(yōu)選是共價(jià)鍵。三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物也能連接到一個(gè)碳環(huán)核苷酸類(lèi)似物的6′-碳原子上。作為三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物和寡核苷酸之間的橋組成部分，X和X′有直接結(jié)合的形式X0或X0′，或以X1或X1′形式，這是些二價(jià)的具有1-22個(gè)碳原子的開(kāi)鏈或環(huán)狀碳?xì)浠鶊F(tuán)，這些基團(tuán)不斷開(kāi)或以-S-，-NR12-，-C(O)O-或-C(O)NR12-斷開(kāi)，或具有1-12個(gè)亞噁烷基單元的聚亞噁烷基，且在亞烷基中含2-3個(gè)碳原子。碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)可如一線性或分枝的C1-C20亞烷基，優(yōu)選是C1-C18亞烷基，特別優(yōu)選是C1-C12亞烷基，最優(yōu)選是C1-C8亞烷基，還有C3-C8亞環(huán)烷基，優(yōu)選的是C5-或C6-亞環(huán)烷基，C12-亞芳基或C7-C12亞芳烷基。二價(jià)烴類(lèi)基的一些例子是亞甲基，亞乙基，1，2-或1，3-亞丙基，1，2-，1，3-或1，4-亞丁基，1，2-，1，3-，1，4-或1，5-亞戊基，1，2-，1，3-，1，4-，1，5-或1，6-亞己基，1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-或1，7-亞庚基，1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-或1，8-亞辛基，以及亞壬基，亞癸基、亞十一烷基，亞十二烷基、亞十三烷基，亞十四烷基，亞十五烷基，亞十六烷基，亞十七烷基，亞十八烷基，亞十九烷基，亞二十烷基，亞環(huán)戊基、亞環(huán)己基，亞環(huán)萘基和尤其是亞苯基，亞芐基和亞苯乙基的異構(gòu)體。亞聚噁烷基的一些例子是亞乙氧基，雙亞乙氧基，三亞乙氧基，四亞乙氧基和1，2-丙氧基。尤為優(yōu)選的是橋聯(lián)基團(tuán)，在其中X為C1-C3亞烷基，C3-亞炔基、亞苯基或C7-亞芳基，特別優(yōu)選是C2-C3亞烷基或亞苯基。還有一些優(yōu)選的橋聯(lián)基團(tuán)，其中X′為C1-C20亞烷基，特別優(yōu)選是C1-C10亞烷基。二價(jià)的基團(tuán)A可以是-NR12-CS-NR12-或-C(O)NR12，特別優(yōu)選是-NH-CS-NH-或-C(O)NH-。通式V的優(yōu)選化合物是這樣一些，其中A′不是現(xiàn)有的基團(tuán)或是-P(O)(OH)O-。通式V的優(yōu)選化合物是這樣一些，其中R2和R7相互獨(dú)立地表示H或C1-C4烷基。R3和R6各自獨(dú)立地表示H或C1-C4烷基是有利的。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方式中R4表示H或C1-C20烷基。關(guān)于適當(dāng)?shù)蔫|系金屬及陰離子的優(yōu)化是選內(nèi)容是已經(jīng)列舉過(guò)的，這也適用于通式V的化合物。本發(fā)明的另一方面是為通式I化合物合成的中間產(chǎn)物。這就是通式II的化合物。其中R1表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳烷基或C6-C16芳基，或一個(gè)一價(jià)功能基，這個(gè)功能基直接或經(jīng)過(guò)一個(gè)基團(tuán)Z連接到吡啶環(huán)上，基團(tuán)Z必要時(shí)可由-O-，-S-，-NR12-，-C(O)-或-C(O)NR12-斷開(kāi)，可選自C1-C20亞烷基，C2-C12亞烯基，C2-C12亞炔基，C5-C8亞環(huán)烷基，C6-C12亞芳基和C7-C12亞芳烷基，R2和R7各自獨(dú)立地表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳烷基，C6-C16芳基或鹵素，和R3和R6分別獨(dú)立地是H，C1-C4烷基，C7-C12芳烷基或C6-C16芳基，R12是H或C1-C6烷基，這里殘基是烷基，環(huán)烷基，芳烷基，芳基，基團(tuán)Z不被取代或以C1-C4烷氧基，F(xiàn)，Cl，Br，-CN，C1-C4烷基或-NO2取代。制備通式I化合物過(guò)程中的另一中間產(chǎn)物，及本發(fā)明的另一目的是通式III的化合物。其中R5表示一個(gè)經(jīng)過(guò)C2-C20亞烷基連接在吡啶環(huán)上的一價(jià)功能基，這里的功能基選自-C(O)-OR12，-C(O)-NHR12，-SO2-R12和-SO2NHR12，R12是H或C1-C6烷基，和R4為H或C1-C20烷基。對(duì)這些中間產(chǎn)物，那些對(duì)最終產(chǎn)物所作描述的優(yōu)選方案也相應(yīng)地適用。本發(fā)明的又一目的是制造通式I化合物的方法，其中通式II的三聯(lián)吡啶與通式III的吡啶二醛或吡啶二酮在式IV的一種鹽類(lèi)存在下縮合Men+(Ym-)n/m(IV)其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，Me，Y，n和m在此前已描述其定義，特別是對(duì)于通式I化合物的定義，優(yōu)選和注釋。作為實(shí)例的方法實(shí)施，是將通式II、III和IV的化合物以優(yōu)選的當(dāng)量數(shù)溶于一種溶劑，然在升高的溫度一同轉(zhuǎn)化。同時(shí)使用縮合催化劑，例如濃無(wú)機(jī)酸，特別是鹽酸或酸性離子交換樹(shù)脂。加入吸水劑或從反應(yīng)混合物中移去反應(yīng)水可能是符合目的的。反應(yīng)溫度可在例如40到220℃，優(yōu)選在50到150℃。使用有機(jī)極性質(zhì)子惰性溶劑為溶劑是有益的。適當(dāng)?shù)娜軇┤缢蜆O性質(zhì)子惰性溶劑，可與水混溶的為佳。這樣一些溶劑的例子有醇類(lèi)(甲醇、乙醇、n-或i-丙醇，丁醇，1，2-亞乙基二醇，丙二醇，乙二醇單甲醚，二乙二醇，二乙二醇單甲醚)，醚類(lèi)(乙醚，二丁醚，四氫呋喃，二噁烷，乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚，二乙二醇二乙醚，三乙二醇二甲醚)，鹵代烴(二氯甲烷，氯仿，1，2-二氯乙烷，1，1，1-三氯乙烷，1，1，2，2-四氯乙烷，氯苯)，羧酸酯及內(nèi)酯類(lèi)(乙酸乙酯，丙酸甲酯，苯甲酸乙酯，2-甲氧基乙酸乙酯，γ-丁內(nèi)酯，δ-戊內(nèi)酯，新戊內(nèi)酯)，N-烷基化羧酰胺和內(nèi)酰胺(N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二乙基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，四甲基脲，六甲基磷酸三酯，N-甲基-γ-丁內(nèi)酰胺，N-甲基-ε-己內(nèi)酰胺，N-甲基吡咯烷酮)，亞砜類(lèi)(二甲亞砜，四亞甲亞砜)，砜類(lèi)(二甲基砜，二乙基砜，三亞甲砜，四亞甲砜)，季胺(三甲胺，三乙胺，N-甲基哌啶，N-甲基嗎啉，吡啶)，取代苯類(lèi)(氯苯，O-二氯苯，1，2，4-三氯苯，硝基苯，甲苯，二甲苯)和腈類(lèi)(乙腈，丙腈，苯腈，苯乙腈)。通式IV的金屬鹽類(lèi)是一般所知的并且大部分可購(gòu)得。通式II所包含化合物的新功能基制備可類(lèi)似地依E.C.Constable在‘多面體’雜志1988年7卷24期2531-2536頁(yè)所述方法實(shí)現(xiàn)，這些功能基在必要時(shí)可帶保護(hù)基。帶有或沒(méi)有功能基的式II和式III化合物一般都是已知的或者能按照已知或類(lèi)似的方法制備。通式III的化合物中，R4為H，R5表示C2-C18亞烷基-X5，而X5表示-C(O)-OR，-C(O)-NHR，-SO2-R或-SO2-NHR，以及R是H或C1-C6烷基，這些都是新的化合物并可由下述方法得到在鈀催化下將一個(gè)相應(yīng)的3-鹵代吡啶-1，5-二羧酸酯以一個(gè)通式為CH2＝CH-C1-C15-亞烷基羧酸酯的烯使之烯化，催化氫化烯基，還原成相應(yīng)的1，5-二羥基甲基吡啶烷基羧酸酯，氧化羥基甲基成為醛基并且在必要時(shí)水解酯基成為羧酸基或?qū)Ⅴセ０坊婶人狨０贰Ｍㄊ絀II的化合物，其中R4表示C1-C12烷基，R5為C2-C18亞烷基-X5，X5表示-C(O)-OR，-C(O)-NHR，-SO2-R或者-SO2-NHR，R是H或C1-C6烷基，這些化合物是新的并可由下述方法得到在鈀催化下將一相應(yīng)的化合物如乙酰保護(hù)的3-鹵代-1，5-二羥基甲基吡啶(得自相應(yīng)的3，5-二羧酸甲酯還原)以一個(gè)式為CH2＝CH-C1-C6亞烷基羧酸酯的烯使之烯基化，氫化烯基例如催化氫化，羥基脫保護(hù)并在必要時(shí)氧化成相應(yīng)的3，5-吡啶醛，這些醛基能以例如格氏試劑作C1-C12烷基化，在必要時(shí)再將酯水解成為羧酸或?qū)Ⅴセ０坊蔀轷０?，并將仲醇基氧化成為酮基。本發(fā)明的另一個(gè)方面是式V化合物的制備方法，其中一個(gè)式I的化合物a)與式VIa的化合物反應(yīng)A″-X′-A′0或1-Oligo(VIa)其中A″是一個(gè)選自下述基團(tuán)中的適當(dāng)一價(jià)功能基-OR10，-SR10，-NCO，-NCS，-NHR11，-C(O)OR11，-C(O)SH，-C(O)NHR11，-C(O)Cl，-C(S)SR11，-C(S)NHR11，-C(S)OR11，-SO3R11，-SO2NHR11，-SO2Cl，-P(O)(OH)2，-P(O)(OH)-NHR11，-P(S)(SH)2，-P(S)(SH)-NHR11，-P(S)(OH)2，-P(S)(OH)-NHR11，-P(O)(SH)2，-P(O)(SH)-NHR11，-P(O)(OH)H，-P(O)(NHR11)H，-P(S)(SH)H，-P(S)(NHR11)H，-P(S)(OH)H，-P(O)(SH)H，其中R10是H，-C(O)NH2，-C(S)NH2，-C1-C6-烷基，-CxH2x-NH2，-CxH2x-SH或-(CxH2xO)y-H，R11表示H，-C1-C6-烷基，-CxH2x-NH2，-CxH2x-SH或-(CxH2xO)y-H，x是一個(gè)2到6的數(shù)，y是一個(gè)1到20的數(shù)，X′是一個(gè)不被取代或以C1-C4烷氧基，F(xiàn)，Cl，Br，-CN，C1-C4烷基或-NO2取代的下述基團(tuán)C1-C20亞烷基，C2-C12亞烯基，C2-C12亞炔基，-(CxH2xO)y-，其中x是2到6的數(shù)，y是1到20的數(shù)，C5-C8亞環(huán)烷基，C6-C12亞芳基，C7-C12亞芳烷基，A′表示-O-，-S-，-S-S-，-NR12-CO-NR12-，-NR12-CS-NR12-，-NR12-，-NR12-C(O)-O-，-C(O)O-，-C(O)S-，-C(O)NR12-，-C(S)S-，-C(S)O-，-C(S)NR12-，-SO2NR12-，-SO2-，-P(O)(OH)O-，-P(S)(SH)S-，-P(S)(SH)O-，-P(S)(OH)O-，-P(O)(SH)S-，-P(O)(OH)S-，-P(O)(SH)O-，-P(O)(OH)-NR12-，-P(S)(SH)-NR12-，-P(S)(OH)-NR12-，-P(O)(SH)-NR12-，-HP(O)O-，-HP(S)S-，-HP(O)NR12-或-HP(S)NR12-，其中R12為H或C1-C6烷基，和Oligo可描述為一個(gè)由天然的、修飾的或合成的脫氧核苷或肽核酸片段而來(lái)的天然、修飾或合成的序列，它們通過(guò)一個(gè)核堿基、一個(gè)核苷酸內(nèi)的橋或一個(gè)糖基相連接并且其內(nèi)部區(qū)域與靶RNA互補(bǔ)，或者(b)與一個(gè)式VIb的化合物反應(yīng)A″-Oligo(VIb)其中A″和Oligo的意義已如(a)項(xiàng)中所述。本發(fā)明的制造寡核苷酸結(jié)合物方法可以如下進(jìn)行，將一種在必要時(shí)功能化的寡核苷酸溶解在一種溶劑或混合溶劑中，然后加入帶適當(dāng)功能基的三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物，必要時(shí)在攪拌下進(jìn)行反應(yīng)。所得的結(jié)合產(chǎn)物再以很熟知的方法提純并在必要時(shí)進(jìn)行分離。反應(yīng)溫度可在0°到120℃之間，優(yōu)選是20到80℃，優(yōu)選使反應(yīng)在室溫進(jìn)行。酯化、酯交換(Umesterungs)或酰胺化是互相聯(lián)系的，有關(guān)的羧酸基可用熟知的方式活化，例如經(jīng)由與碳化二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)。反應(yīng)物按克分子關(guān)系加入是合乎目的的，但可使用過(guò)量的催化劑或寡核苷酸。為了純化可用些通常的方法，例如滲析，電泳和色譜法，像高效液相色譜(HPLC)，反相HPLC，親合色譜，離子交換色譜和凝膠色譜都是有利的。所使用的功能化寡核苷酸能以已知方法用自動(dòng)合成儀制造，這些都可購(gòu)得。用于此合成的核苷是已知的，部分可買(mǎi)到或按類(lèi)似方法制造。本發(fā)明的三聯(lián)吡啶-寡核苷酸結(jié)合物特別適于RNA序列的序列專(zhuān)一性裂解，只須微不足道量的加進(jìn)去就有催化作用。本項(xiàng)發(fā)明的另一目的是在生理?xiàng)l件下和在一種合成的三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物影響下裂解核糖核酸的磷酸核苷酸橋的方法，其特征在于，a)靶RNA與一個(gè)寡核苷酸復(fù)合，其內(nèi)部序列與靶RNA互補(bǔ)，再在它上面結(jié)合一個(gè)三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物；b)然后再起反應(yīng)并裂解。本發(fā)明的方法能經(jīng)體內(nèi)施用寡核苷酸或在體外配合靶RNA和本發(fā)明相關(guān)的，所使用的寡核苷酸來(lái)實(shí)行。方法的施行可在專(zhuān)家們熟悉的生理?xiàng)l件下進(jìn)行，如在水性介質(zhì)中pH5到9范圍內(nèi)，優(yōu)選是pH5到8優(yōu)選是pH5到范圍內(nèi)，該水介質(zhì)亦可含惰性組分，例如堿金屬或堿土金屬的鹽，以及在一個(gè)緩沖體系中。此方法可在0°到100℃的溫度下施行，優(yōu)選是在20°到50℃，優(yōu)選是在30°到40℃。以本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了以形成帶有2′，3′-環(huán)磷酸酯基和5′-羥基端基片段，將磷酸酯橋連化合物經(jīng)酯交換反應(yīng)裂解。這種環(huán)磷酸酯可以接著進(jìn)行進(jìn)一步水解。本發(fā)明的三聯(lián)吡啶-寡核苷酸結(jié)合物被發(fā)現(xiàn)可作為藥物使用。它對(duì)于核苷酶降解具有很高的穩(wěn)定性。特別意外的是它們與RNA-Typ的互補(bǔ)核苷酸鏈的極好的配對(duì)。此外還表現(xiàn)出意外的高度細(xì)胞吸收性。這種發(fā)明的寡核苷酸特別適用于反義技術(shù)，這就是說(shuō)通過(guò)結(jié)合到mRNA上一個(gè)適當(dāng)?shù)幕パa(bǔ)核苷酸序列以阻止不希望的蛋白產(chǎn)物表達(dá)(EP266099，WO87/07300和WO89/08146)。它們能通過(guò)在核酸水平上阻斷生物活性蛋白的表達(dá)來(lái)治療感染或疾病。本發(fā)明的另一目的也是關(guān)于所發(fā)明的寡核苷酸在治療方法中的應(yīng)用，這是通過(guò)在體內(nèi)失活核苷酸序列而治療溫血?jiǎng)游锇ㄈ祟?lèi)疾病的治療方法。體重約70kg的溫血?jiǎng)游锩咳沼盟幜繛?.01到1000mg。給藥尤以胃腸外制劑形式給藥，例如靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。為了胃腸外給藥首先一種水溶性生物活性物質(zhì)的水溶液是適用的，例如一種水溶性生理上無(wú)須多慮的鹽，或這一生物活性物質(zhì)的水性懸浮液，其中含有增粘度物質(zhì)如羧甲基纖維鈉、山梨醇和/或葡聚糖和特別的穩(wěn)定劑，這樣生物活性物質(zhì)必要時(shí)與助劑一起以一種凍干形式存在，給藥前補(bǔ)加適當(dāng)溶劑配成溶液使用。本發(fā)明的結(jié)合物也能以一種吸入或以一種脂質(zhì)體形式的給藥方式應(yīng)用。本發(fā)明的結(jié)合物也能作診斷目的之用，或作為序列特異性內(nèi)核糖核酸酶的分子生物學(xué)助劑。本發(fā)明的又一目的是關(guān)于一種含水組合物尤其是基于一種含水溶液或懸浮液的藥物制劑，其中僅含有效量的式V化合物或與另一種生物活性一起，水作為藥物賦形劑，優(yōu)選以大量存在，必要時(shí)，含有助劑。藥理學(xué)有效的化合物可以胃腸外給藥的制劑或輸注溶液(Infusionsloungen)的形式應(yīng)用。這樣的溶液主要是等滲水溶液或懸浮液，例如用親水性制劑，其中只含有有效物質(zhì)或同時(shí)含一種載體物質(zhì)如甘露糖制備而應(yīng)用。藥物制劑可以被滅菌，并/或含有助劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、浸潤(rùn)劑和/或乳化劑、溶解促進(jìn)劑，鹽類(lèi)以調(diào)節(jié)滲透壓和/或作緩沖劑。這種藥物制劑，根據(jù)需要還可含有其它的治療上有效的物質(zhì)如抗生素類(lèi)，用已知熟知的方法來(lái)制造，例如用方便的溶解法或親水化處理方法，其中所含有的活性物質(zhì)約0.1到90％，優(yōu)選是0.5到30％，如1％到5％之間。圖中是由一個(gè)反義寡核苷酸和一個(gè)底物RNA分子得到的雜種分子結(jié)構(gòu)實(shí)例。圖1所示為一個(gè)由底物RNA(標(biāo)有5′的線)和一個(gè)反義寡核苷酸(標(biāo)有3′的線)結(jié)合到發(fā)明的配合物(以Ln表示)所成的雜種分子(所謂結(jié)合物)。底物RNA的核苷酸片段所給的編號(hào)如此定義，編號(hào)如此進(jìn)行底物RNA的核苷酸互補(bǔ)于反義寡核苷酸的核苷酸，在其結(jié)合于配合物之處，編號(hào)為“0”。然后其它的編號(hào)為凡在底物RNA3′-方向的依次升高為+1，+2等，在5′方向則為-1，-2等。圖2表示一個(gè)由具體的底物RNA(CG-1352，見(jiàn)實(shí)例)和一個(gè)本發(fā)明的反義寡核苷酸結(jié)合物(以3′注明)雜種分子的表示線。底物RNA的粗體印刷核苷酸(此處為G)互補(bǔ)于反義寡核苷酸結(jié)合物的核苷酸，配合物在此處結(jié)合。下述實(shí)施例用以說(shuō)明本發(fā)明。A.制備三吡啶-鑭系金屬配合物的初始化合物實(shí)施例A1三聯(lián)吡啶雙肼類(lèi)化合物制備a)向6-乙?；?2-溴吡啶(100mMol)在200ml甲醇中的溶液冰浴冷卻下加入40ml2N氫氧化鉀水溶液。再加入相應(yīng)取代的苯甲醛(400mMol)后移去冰浴，反應(yīng)混合物在室溫下繼續(xù)4小時(shí)。產(chǎn)物被過(guò)濾，水洗3次并用冷甲醇洗兩次，于高真空下干燥。按這種方法制得的化合物a.1(R1，苯基-4-OCH3。MS317.7)，a.2(R1，苯基-4-NO2，MS333.6)，a.3(R1，苯基-3-NO2，MS334)，a.4(R1，苯基-2-NO2，MS334)和a.5(R1苯基)。(b)由(a)所得的α，β-不飽和羰基化合物(30mMol)，1-(2-溴代吡啶羰基甲基)吡啶碘化物(12.1.克，30mMol)和醋酸銨(13.9克，180mMol)置燒瓶中并加100ml醋酸。該混合物被加熱回流，2小時(shí)后冷卻室溫，過(guò)濾所得產(chǎn)物于高真空下烘干。按此方法制得的化合物.b.1(R1，苯基-4-OCH3，MS497.1)，b.2(R1，苯基-4-NO2，MS512)，b.3(R1，苯基-3-NO2，MS513)，b.4(R1，苯基-2-NO2，MS512)和b.5(R1，苯基)。向四氯化鈦(30mMol)在75ml無(wú)水四氫呋喃溶液于室溫并在氬氣氛下分次加入氫化鋁鋰(22mMol)。該懸浮液于室溫?cái)嚢?0分鐘，接著冷卻到0℃。加入化合物b.2(10mMol)，此懸浮液于室溫?cái)嚢?0分鐘。于0℃小心滴加50ml水后再加入25ml25％氨水溶液。該混合物中加150ml氯仿經(jīng)硅藻土過(guò)濾。分離出水相并用氯仿提取三次。將有機(jī)相合并，水洗一次后在硫酸鈉上干燥并濃縮。按這個(gè)程序制備化合物b.6(R1，苯基-4-NH2，MS482.5)，同類(lèi)化合物b.7(R1苯基-3-NH2，MS482)和b.8(R1，苯基-2-NO2，MS482)也被制得。(c)由(b)所得的相應(yīng)二溴代三聯(lián)吡啶化合物(10mMol)溶于30ml甲肼中，加熱回流17小時(shí)。冷卻到室溫后濃縮，殘?jiān)苡?0ml甲醇。產(chǎn)物被過(guò)濾并于高真空下烘干。按這個(gè)方法制得化合物c.1(R1，苯基-4-OCH3，M要427)，c.2(R1，苯基-4-NH2，MS412.5)，c.3(R1，苯基-3-NH2，MS412)，c.4(R1，苯基-2-NH2，MS412)和c.5(R1，苯基)?；衔颿.1(10mMol)懸浮于100ml氯仿中，用冰浴冷卻20分鐘再加入1當(dāng)量濃度的三溴化硼在二氯甲烷中的溶液(50ml)。此懸浮液被加熱回流5天，冷卻到室溫后倒入300ml冰水中，以200ml2N鹽酸水溶液酸化。乙醚提取(兩次)后水相用10％硫酸鈉水溶液調(diào)pH9.0并且攪拌30分鐘。沉淀的化合物c.6(R1，苯基-4-OH，MS413.5)被過(guò)濾并在高真空下烘干。實(shí)施例A23-[4′-(2′，6′-二甲?；拎?]丙酸制備(a)3.5克4-溴吡啶-2，6-羧酸二甲酯，390毫克三甲苯基膦，9.3ml丙烯酸特丁酯，7.1ml三乙胺，30ml二甲基甲酰胺和287mg醋酸鈀混合并加熱到110℃。90分鐘后反應(yīng)混合物被冷卻到室溫，用乙醚/二氯甲烷(1∶1)稀釋并用NH4Cl/H2O震搖提取。有機(jī)相用Na2SO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮并在高真空下烘干。CHN計(jì)算值59.815.964.36測(cè)定值59.86.04.1250mg鈀活性碳(5％)和2.5克上述化合物溶在250ml甲醇中于室溫下氫氣氛中氫化過(guò)夜。產(chǎn)物用Hyflo過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并在室溫下高真空烘干。CHN計(jì)算值59436.554.33測(cè)定值59.36.64.35.0克上述化合物溶于50ml甲醇和50ml四氫呋喃中，冷卻到0℃后加入1.1克NaBH4。50分鐘后再加1.1克NaBH4，并在130分鐘后加0.5克NaBH4。溫?zé)岬绞覝毓?65分鐘后再冷卻到0℃。3.5小時(shí)后再次加入1.1克NaBH4。6小時(shí)后濃縮到60ml體積。然后滴加飽和氯化銨溶液，用二氯甲烷提取4次，有機(jī)相用氯化銨溶液洗一次，用Na2SO4干燥，過(guò)濾并濃縮。CHN計(jì)算值62.907.925.24測(cè)定值63.07.95.219.8克上述化合物溶于330ml二噁烷，然后加入16.2克二氧化硒。反應(yīng)混合物被加熱到100℃并攪拌，45分鐘后冷卻到室溫。再攪拌兩小時(shí)反應(yīng)混合物被過(guò)濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。CHN計(jì)算值63.876.515.32測(cè)定值64.146.535.434.7克上述化合物加入17.2ml冰冷卻的三氟乙酸，轉(zhuǎn)化成酸后該混合物于0℃濃縮。CHN計(jì)算值57.974.386.76測(cè)定值57.554.216.61(b)5克4-溴吡啶-2，6-二羧酸二甲酯于室溫溶于175ml氫呋喃，然后加入75ml甲醇。冷卻到0℃，于45分鐘內(nèi)分次加入3.44克硼氫化鈉并溫?zé)嶂潦覝亍?小時(shí)后在10分鐘內(nèi)滴入30ml丙酮。加熱反應(yīng)混合物使回流1小時(shí)，然后將反應(yīng)混合物以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至干，殘?jiān)谑覝叵禄烊?0ml吡啶。然后加入0.1克4-二甲胺基吡啶，冷卻至0℃。于30分鐘內(nèi)滴加34.4ml醋酸酐，將此懸浮液溫?zé)嶂潦覝兀偌尤?0ml四氫呋喃。在室溫下攪拌過(guò)夜后反應(yīng)混合物被過(guò)濾并以約50ml四氫呋喃洗滌兩次，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，產(chǎn)物經(jīng)重結(jié)晶得4-溴-2，6-二(乙酰氧甲基)吡啶(熔點(diǎn)66-69℃)。0.982克4-溴-2，6-二(乙酰氧甲基)吡啶，1.5克3-(三丁基錫基)丙烯酸乙酯和176毫克四(三苯基膦)鈀溶于25ml二噁烷并加熱到90℃。90分鐘后反應(yīng)混合物被冷卻，分離固體產(chǎn)物并從正己烷/乙酸乙酯中重結(jié)晶。MS321(M+)2.74克上述得到的化合物和70毫克Wilkinson催化劑溶于150ml苯中，加入12.2ml三乙基硅烷，此溶液被加熱回流，再于1小時(shí)內(nèi)分次加入270mg催化劑三乙基硅烷。產(chǎn)物經(jīng)色譜法純化。MS323。267mg鈉溶于50ml己醇中，7.2ml此溶液加于1.845克上述所得化合物于35ml乙醇的溶液中。于室溫下攪拌2.5小時(shí)后此反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)硅膠過(guò)濾，濾液濃縮至干，產(chǎn)物在高真空下干燥過(guò)夜。NMR(CDCl3)δ7.0(2H，s)，4.7(4H，s)，4.1(2H，q)，2.9(2H，t)，1.2(3H，t)。1.27克上述產(chǎn)物溶于30ml二噁烷，向其中加入714mg二氧化硒。反應(yīng)混合物被加熱并在2小時(shí)后經(jīng)棉花過(guò)濾，濾液濃縮至干。殘?jiān)苡谝宜嵋阴?二氯甲烷(5％)再經(jīng)硅膠過(guò)濾。1H-NMR(CDCl3)δ10.1(2H，s)，8.0(2H，s)，4.1(2H，q)，3.1(2H，t)，2.7(2H，t)，1.2(3H，t)。向45ml乙醚和350mg上述產(chǎn)物的溶液于0℃加13ml一制備好的溶液(0.949克溴化銅，二甲亞砜在10ml乙醚中；冷卻到0℃后加入5.9ml甲基鋰)。室溫?cái)嚢?.5小時(shí)后冷卻到0℃，加入2ml冰醋酸在8ml乙醚中的溶液。于室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后加入的60ml水，用二氯甲烷萃取四次。有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，產(chǎn)物經(jīng)色譜純化。MS266(M+H)+。向4.5ml二氯甲烷和草酰氯的溶液于-78℃加入0.5mlDMSO(二甲亞砜)。15分鐘后此溶液加于193mg上述產(chǎn)物于4ml二氯甲烷的溶液中。于-78℃兩小時(shí)后再加1.5ml三乙胺。于0℃攪拌30分鐘后加入15ml水，用乙醚提取四次。有機(jī)相以Na2SO4干燥，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，經(jīng)色譜純化。CHN計(jì)算值63.876.515.32測(cè)定值63.966.555.450.464克上述產(chǎn)物和5ml4NHCl-起被加熱到50℃。90分鐘后反應(yīng)被冷卻到室溫并用冰水稀釋?zhuān)镁w產(chǎn)物。CHN計(jì)算值61.275.575.95測(cè)定值61.25.56.2實(shí)施例A3.其它三聯(lián)吡啶-雙肼化合物和2，6-二羰基吡啶類(lèi)化合物的制備1.2，6-二羰基化合物(f)的制備(a)化合物(d)的制備0.3克(1.4mMol)2，6-雙(羥甲基)4-溴吡啶，0.25克(2.8mMol)N-甲基氨基乙酸和0.11克(2.8mMol)NaOH加于15ml甲醇和15ml水的溶液部，用氮?dú)饧訅旱?50巴，再于100℃加熱到無(wú)固形的2，6-雙(羥甲基)-4-溴吡啶時(shí)止。兩天后反應(yīng)結(jié)束。棕色的反應(yīng)物被濃縮，產(chǎn)物被色譜純化(流動(dòng)相，20-80％MeOH/CH2Cl2)，得一種黃色油狀物。1H-NMR(MeOH)δ6.6(2H，s)，4.5(4H，s)，3.8(2H，s)，3.1(2H，s)，3.0(2H，s)。(b)化合物(e)的制備將5.4g上述的產(chǎn)物(d)懸浮于450ml甲醇中并加熱至沸，向其中加入6ml濃硫酸，這樣得一清亮溶液。此溶液加熱回流3小時(shí)后冷卻，向溶液中加5克碳酸鉀并攪拌10分鐘。固體物被過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。粗產(chǎn)物在硅膠柱上純化(硅膠44克，流動(dòng)相1/9/50，乙酸/甲醇/二氯甲烷)，得黃色晶體。1H-NMR(MeOD)δ6.8(2H，s)，4.6(4H，s)，3.7(2H，s)，3.7(3H，s)，3.2(3H，s)。(c)化合物(f)的制備上述產(chǎn)物(e)(0.557g，2.31mmol)在8ml吡啶/二惡烷(1∶1)中的溶液被加熱至沸，向所得的黃色溶液中加入1.54g二氧化硒(13.7mmol)，并加熱回流4小時(shí)(直至不再有離析物)。冷卻到室溫后用約100ml丙酮/二氯甲烷(1∶9)處理，經(jīng)一個(gè)小硅膠柱過(guò)濾再用少量溶劑洗脫。得到的清亮黃色溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，粗產(chǎn)物用柱色譜純化(流動(dòng)相丙酮/二氯甲烷1∶40)，得白色固體。1H-NMR(CDCl3)δ10.1(2H，s)，7.3(2H，s)，4.2(2H，s)，3.8(3H，s)，3.2(3H，s)。2.2，6-二羰基吡啶類(lèi)化合物(k)的制備(a)化合物(g)的制備580mg叔丁醇鉀(5.17mmol)及20ml二甲亞砜置于氬氣保護(hù)的100ml三口瓶中，1克4-羥基-2，6-吡啶二羧酸二甲酯(4.7mmol)分次加入(微入熱反應(yīng))。10分鐘后緩慢滴加1.04ml溴乙酸叔丁醇酯(7.05mmol)在2ml二甲亞砜中的溶液并繼續(xù)攪拌3小時(shí)。然后加入冰水停止反應(yīng)，反應(yīng)物用乙醚提取3次，乙醚相用30ml水洗一次后用硫酸鈉干燥。溶液在放置蒸發(fā)器上濃縮并在高真空烘干。得到白色微黃晶體，再于硅膠柱上(70g硅膠60F，Merck9385，流動(dòng)相甲醇/二氯甲烷1∶100)純化，得到白色晶體。1H-NMR(CDCl3)δ7.8(2H，s)，4.7(2H，s)，4.0(6H，s)，1.5(9H，s)。(b)化合物(h)的制備1.17克(3.6mmol)上述制得的化合物(g)溶于65ml二甲氧基乙烷并冷卻至0℃。680mgNaBH4分小份加入，于0℃攪拌15分鐘后，反應(yīng)物被熱到室溫。在室溫下反應(yīng)3小時(shí)后該反應(yīng)物再冷至0℃。加入12ml丙酮并攪拌15分鐘。反應(yīng)物溫?zé)岬绞覝剡^(guò)夜。濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并隨之于高真空下烘干。由第一個(gè)反應(yīng)的粗產(chǎn)物溶于55ml吡啶并冷卻至0℃，加入6.8ml(72mmol)醋酸酐和44mg(0.36mmol)二甲基胺基吡啶。此混合物被加熱到室溫，用水稀釋后乙醚提取3次。有機(jī)相用Na2SO4干燥并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，然后在高真空下烘干，殘留一種棕色油狀物。此產(chǎn)物用柱色譜純化(100g硅膠，流動(dòng)相1％甲醇的CH2Cl2)，得純化產(chǎn)物。1H-NMR(CDCl3)δ6.8(2H，s)，5.2(4H，s)，4.6(2H，s)；(c)化合物(i)的制備170mg(0.46mmol)上述得到的化合物(h)溶于6.5ml甲醇并冷卻到0℃。加入1.7ml32％氨水，繼續(xù)攪拌1.5小時(shí)。反應(yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并在高真空下烘干。得一種黃色膠狀物，此物經(jīng)柱色譜(20g硅膠60F，Merck編號(hào)9385，流動(dòng)相甲醇/二氯甲烷，1∶15)純化，最終產(chǎn)物為白色固體。1H-NMR(CD3OD)δ7.0(2H，s)，4.8(2H，s)，4.5(4H，s)，1.5(9H，s)；(d)化合物(j)的制備在25ml錐形瓶中于氬氣保護(hù)下溶解260微升(μl)草酰氯(3.0mmol)在6ml二氯甲烷中，冷卻到-78℃，接著加入370μl二甲亞砜(5.25mmol)。反應(yīng)物于-78℃攪拌混合15分鐘。再加入上述所得化合物(i)(200mg，0.75mmol)在2ml二氯甲烷/200μl二甲亞砜中的溶液加入(控制溫度！)。然后繼續(xù)在-78℃攪拌2小時(shí)，用1.04ml三乙胺(2.5mmol)在2ml二氯甲烷中的溶液萃滅反應(yīng)。于0℃繼續(xù)攪拌15分鐘后，反應(yīng)物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并在高真空烘干。得棕色晶體，再經(jīng)硅膠60F過(guò)濾(流動(dòng)相正己烷∶乙酸乙酯，2∶1)。1H-NMR(CDCl3)δ10.1(2H，s)，7.6(2H，s)，4.7(2H，s)，1.5(9H，s)；(e)化合物(k)的制備65mg上述制得的化合物(j)在14ml4N鹽酸溶液中室溫下攪拌1.5小時(shí)，此反應(yīng)物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至干并在高真空下干燥。得微黃色晶體粗產(chǎn)物。1H-NMR(CD3OD)δ7.4(2H，s)，5.1(2H，s)；3.三聯(lián)吡啶-雙肼基化合物(o)的制備(a)化合物(m)的制備11.49g(205mmol)KOH磨細(xì)，再與20g(164mmol)4-羥基苯甲醛和1.66g(4.09mmol)Aliguat336(三辛基甲基氯化銨)一起用單錨式攪拌混合，在冰浴冷卻下小心滴加l2.24ml(164mmol)3-溴丙醇。反應(yīng)混合物被加熱到100℃。暗棕色懸浮液在氬氣保護(hù)下于100℃加熱過(guò)夜。向反應(yīng)混合物中加入250mlCH2Cl2繼續(xù)攪拌。所得的懸浮液經(jīng)Hyflo過(guò)濾、濃縮并在高真空下烘干。粗產(chǎn)物分兩部分以快速柱色譜純化(流動(dòng)相2％THF/CH2Cl2)，得最終產(chǎn)物。1H-NMR(CDCl3)δ9.9(1H，s)，7.8(2H，d)，7.0(4H，d)，4.2(2H，t)，3.9(2H，m)，1.9(1H，s)。(b)化合物(n)的制備13g上述制得的化合物(m)(0.072mol)，28.86g2-乙酰基-6-溴吡啶(0.144mol)，63.72g乙酰胺(1.08mol)和41.58g乙酸銨(0.54mol)置于一燒瓶中，并于180℃攪拌2小時(shí)。此棕色懸浮液冷卻到120℃并滴加140克氫氧化鈉在300ml水中的溶液。反應(yīng)混合物再加熱2小時(shí)。反應(yīng)物結(jié)成暗棕色膠狀物，然后傾去溶劑，再用水洗一次。黑色膠狀物溶于盡可能少的醋酸中，在熱溶液中加入等當(dāng)量的溴化氫水溶液(48％水溶液)并放置過(guò)夜。吸濾出亮黃色晶體，用水溶解并用4當(dāng)量氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值7-8。此黃色懸浮液用二氯甲烷萃取3次，有機(jī)相經(jīng)棉花過(guò)濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并于高真空下烘干。粗產(chǎn)物用乙醇重結(jié)晶，得黃色晶體。MS計(jì)算峰值543m/z(M+H+)測(cè)定峰值542m/z(M+H+)(c)化合物(o)的制備6.38g上述得到的化合物(n)置于88ml甲基肼中，加熱到85℃并攪拌2小時(shí)。冷卻后加入150mlMeOH，產(chǎn)物沉淀出來(lái)。該懸浮液被過(guò)濾，所得晶體烘干。1H-NMR(DMSO)δ8.5(2H，s)，7.8(4H，m)，7.7(2H，t)，7.2(2H，d)，7.1(2H，d)，4.6(2H，t)，4.1(2h，t)，3.5(2H，m)，3.3(2H，s)，1.9(2H，m)。4.三聯(lián)吡啶-雙肼基化合物(q)的制備(a)化合物(p)的制備2.6g9-醛基蒽(12.5mmol)，5g2-乙?；?6-溴吡啶(25mmol)，11.2g乙酰胺(187.5mmol)和7.1g醋酸銨(93.7mmol)置于一燒瓶中，所得棕色液體被加熱回流2小時(shí)(浴溫180℃)，然后冷卻到110℃，滴加33g氫氧化鈉溶于71ml水中的溶液。反應(yīng)物再回流2小時(shí)，再冷卻到90℃。所得溶液被傾析，固體物用水洗兩次。此黑色物質(zhì)溶解在25ml醋酸中。加入1.75ml48％溴化氫水溶液并放置5天。此懸浮物被過(guò)濾，所得綠色沉淀用乙醚洗滌。該晶體懸浮于水中，用2當(dāng)量氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值到8。用二氯甲烷提取，有機(jī)相用硫酸鈉干燥后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并在高真空下干燥，得綠色物質(zhì)。此物用約400ml乙醇重結(jié)晶。所得晶體溶解于乙醇/二氯甲烷混合溶劑中，以飽和碳酸銨溶液提取兩次。有機(jī)相再在硫酸鈉上干燥，復(fù)原并在高真空干燥。粗產(chǎn)物在一柱上純化(流動(dòng)相乙酸乙酯/正己烷，1∶9)，得綠棕色晶體。MS計(jì)算峰值568m/z(M+H+)測(cè)定峰值569m/z(M+H+)(b)化合物(q)的制備1.43g(2.5mmol)如上所得的化合物(p)加到50ml甲基肼中并加熱回流過(guò)夜，得一暗棕色溶液，反應(yīng)物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。產(chǎn)物懸浮于熱甲醇中然后過(guò)濾，得400mg綠色晶體。由CH3CN中重結(jié)晶，先是清亮濾液，冷卻后過(guò)濾。在高真空下干燥后得綠色晶體。這些晶體由CH3CN再重結(jié)晶一次以得純化，仍得一綠色結(jié)晶物。母液也同樣被濃縮，可得1g棕色晶體。由CH3CN同樣經(jīng)重結(jié)晶再高真空干燥后，得一淡棕色晶體。元素分析計(jì)算值74.83％C5.47％H19.70％N測(cè)定值74.76％C5.55％H19.42％N5.2，6-二羰基化合物(r)的制備118μl(1.38mmol)草酰氯在氬氣保護(hù)下加入2mlCH2Cl2中并冷卻到-78℃，然后小心滴加195μl(2.75mmol)DMSO。此反應(yīng)物于-78℃攪拌15分鐘。另將100mg(0.458mmol)2，6-二(羥甲基)-4-吡啶溶于100μlDMSO中并以1mlCH2Cl2稀釋。將此溶液加到上述反應(yīng)物中，并在-78℃攪拌1小時(shí)。再加381μl(2.75mmol)Et3N后在0℃攪拌15分鐘。濃縮后殘?jiān)苡贖2O和CH2Cl2。兩相分離，水相用CH2Cl2洗兩次。有機(jī)相經(jīng)棉花過(guò)濾。濃縮后在高真空下干燥，得淡棕色晶體。1H-NMR(CDCl3)δ10.1(2H，s)，8.7(2H，s)；6.三聯(lián)吡啶-雙肼基化合物(s)的制備72mg實(shí)施例A1(b)中所得化合物b.5(0.16mmol)加到480mg丁基肼(5.44mmol)中，并在氬氣保護(hù)下加熱到110℃。此懸浮物繼續(xù)加熱過(guò)夜。然后反應(yīng)混合物被冷卻，用乙醚和甲醇稀釋?zhuān)瑸V去固體物。濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，再加入甲醇使沉淀溶解。由冷卻的溶液中濾出結(jié)晶并用少量甲醇清洗。產(chǎn)物在低真空干燥，得本色晶體。MS計(jì)算峰值482m/z(M+H+)測(cè)定峰值481m/z(M+H+)B.三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物的制備實(shí)施例B11.)1mMol由實(shí)施例A1(c)所述三聯(lián)吡啶-雙-肼基化合物在氬氣保護(hù)下溶于60ml絕對(duì)甲醇中，加入鑭系金屬(III)醋酸鹽(1mMol)，并加熱回流10分鐘。向此溶液依次加入1.2mMol前述2，6-二羰基化合物和5mMol濃鹽酸水溶液，煮沸兩天。冷卻到室溫后過(guò)濾產(chǎn)物并在高真空下干燥。按此程序可制備表1中化合物1.1到1.28。2.)由實(shí)施例A1(c)所述的三聯(lián)吡啶-雙肼基化合物1mMol在氬氣保護(hù)下溶于60ml無(wú)水甲醇中，加入鑭系金屬(III)氯化物(1mMol)并加熱回流10分鐘。向此溶液依次加1.2mMol實(shí)施例A2(a)中得到的化合物，再煮沸過(guò)夜。冷卻到室溫后除去溶劑，產(chǎn)物由二甲亞砜和甲苯中重結(jié)晶。按此程序制備表1中的化合物1.29到1.32及同類(lèi)物1.33到1.44。3.)帶取代基R5的三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物的制備(a)化合物1.45的制備168mg實(shí)施例A1(c)所得產(chǎn)物c.5(0.423mmol)溶在20ml干燥甲醇中并加熱至沸。然后向其中加入155mg三氯化銪六水合物(0.423mmol)，此黃色懸浮物繼續(xù)攪拌15分鐘。再加入100mg實(shí)施例Al(c)所得產(chǎn)物(f)(0.423mmol)在15ml干燥甲醇中的溶液后，此懸浮液在氬氣保護(hù)下加熱回流過(guò)夜。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，使其過(guò)濾，并取出獲得的黃色溶液的2/3溶劑加入乙醚從溶液中沉淀出桔黃色晶體并經(jīng)微孔過(guò)濾器過(guò)濾。固體物在高真空下干燥，得桔黃色晶體。MS計(jì)算峰值821m/z(M-Cl-)實(shí)測(cè)峰值821m/z(M-Cl-)表1中的同類(lèi)化合物1.46到1.58也可同樣得到。(b)化合物1.59的制備10mg(0.0116mmol)上述得到的化合物1.45加入5ml水中并加熱回流，得一黃色溶液。三天后反應(yīng)物被過(guò)濾，濃縮并在高真空下干燥，得一黃色固體。4.)帶其它取代基R5的三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物制備(a)化合物1.60的制備48mg實(shí)施例A1(c)所得物質(zhì)c.5(0.12mmol)于7.5ml甲醇中在氬氣中加熱回流，向其中加入44mg三氯化銪六水合物(0.12mmol)并繼續(xù)加熱回流15分鐘。然后加入實(shí)施例A3.2(e)所得化合物(k)在2.5ml甲醇中溶液，使此溶液保持回流45分鐘。冷卻的懸浮物經(jīng)濾過(guò)后，清亮的黃色濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至約2ml。加入乙醚以沉淀出黃色沉淀，然后以乙醚/甲醇1∶1溶劑洗一次和用乙醚洗兩次。殘?jiān)诟哒婵障赂稍?，得黃色晶體。MS計(jì)算峰值807m/z(M-Cl-)實(shí)測(cè)峰值809m/z(M-Cl-)(b)化合物1.61的制備化合物1.61由化合物1.60制得，方法類(lèi)似于從化合物(1.45)制備化合物(1.59)。MS計(jì)算峰值1056m/z[M-3Cl-+2(C8H7O4)-]實(shí)測(cè)峰值1055m/z[M-3Cl-+2(C8H7O4)-]5.帶有另一些取代基R1的三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物的制備(a)化合物1.62的制備136mg實(shí)施例A3.3(c)所得化合物(o)(9.54mmol)溶于干燥甲醇并在氬氣保護(hù)下加熱回流。然后加入1.53g三氯化銪六水合物(5.94mmol)，反應(yīng)物加熱回流0.5小時(shí)。再將溶于100ml干燥甲醇中的1g2，6-二乙?；拎?5.94mmol)和兩滴濃鹽酸加入所得之清亮黃色溶液。將此反應(yīng)混合物加熱回流8天，冷卻至室溫過(guò)濾此懸浮液。所得之清亮黃色溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，加入乙醚得到沉淀物。用乙醚/甲醇1∶1混合溶液洗滌沉淀一次，再以乙醚洗滌兩次，沉淀物在高真空下干燥，得桔黃色固體。MS計(jì)算峰值822m/z(M-Cl-)實(shí)測(cè)峰值822m/z(M-Cl-)6.帶其它取代基R5的三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物的制備(a)化合物1.63的制備96mg實(shí)施例A1(c)所得化合物c.2(0.234mmol)溶于20ml干燥甲醇中并于氬氣保護(hù)下加熱回流，然后加入60mg三氯化銪六水合物(0.234mmol)，此反應(yīng)混合物加熱回流0.5小時(shí)。再將溶于15ml干燥甲醇中的實(shí)施例A3.5所得化合物(r)(0.234mmol)和2滴濃鹽酸加入所得之清亮黃色溶液。將此反應(yīng)物加熱回流過(guò)夜，冷至室溫后將此暗紅色懸浮液經(jīng)Hydrofilter過(guò)濾。所得之清亮紅色濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并加入乙醚使之沉淀。沉淀物用乙醚/甲醇1∶1混合溶劑洗一次再用乙醚洗兩次。產(chǎn)物在高真空下干燥，得暗紅色固體。MS計(jì)算峰值813m/z(M-Cl-)實(shí)測(cè)峰值812m/z(M-Cl-)7.帶有取代基R1或R5的三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物的制備(a)化合物1.64到1.74的制備按上述的類(lèi)似的反應(yīng)如化合物1.62和1.63制備，由所述的取代2，6-二羰基吡啶類(lèi)化合物和所述之取代三聯(lián)吡啶-雙肼基化合物制得表1中的化合物1.64到1.74。表1化合物編號(hào)Ln3+R1R4R5分子量[M-Cl]計(jì)算值/實(shí)測(cè)值1.1LaPhHH706/7051.2LaPh-4-OHHH722.4/722.31.3LaPh-4-OCH3HH736.4/735.61.4LaPh-4-NH2HH1.5LaPhCH3H734.4/734.41.6LaPh-4-OHCH3H750.4/750.91.7LaPh-4-OCH3CH3H764.5/765.01.8LaPh-4-NH2CH3H749.5/749.51.9EuPhHH719.4/718.91.10EuPh-4-OHHH735.4/735.81.11EuPh-4-OCH3HH749.5/749.31.12EuPh-4-NH2HH734.5/734.51.13EuPhCH3H747.5/7471.14EuPh-4-CHCH3H763.5/763.71.15EuPh-4-OCH3CH3H777.5/777.31.16EuPh-4-NH2CH3H762.5/762.51.17CePh-4-NH2CH3H750.7/749.31.18PrPh-4-NH2CH3H751.4/750.91.19NdPh-4-NH2CH3H754.8/752.71.20GdPh-4-NH2CH3H767.8/766.31.21TbPh-4-NH2CH3H769.5/768.71.22DyPh-4-NH2CH3H773.1/773.21.23HoPh-4-NH2CH3H775.5/774.41.24ErPh-4-NH2CH3H777.8/776.81.25TmPh-4-NH2CH3H779.5/778.81.26YbPh-4-NH2CH3H783.6/783.01.27LuPh-4-NH2CH3H785.5/784.71.28YPh-4-NH2CH3H699.4/698.11.29LaHHCH2CH2COOH1.30EuHHCH2CH2COOH1.31LaPhHCH2CH2COOH*1.32EuPhHCH2CH2COOH**1.33CePhHCH2CH2COOH911/9121.34PrPhHCH2CH2COOH782/7811.35NdPhHCH2CH2COOH915/9151.36GdPhHCH2CH2COOH1060/10591.37TbPhHCH2CH2COOH1062/10621.38DyPhHCH2CH2COOH1066/10651.39HoPhHCH2CH2COOH1068/10681.40ErPhHCH2CH2COOH1070/10701.41TmPhHCH2CH2COOH905/9031.42YbPhHCH2CH2COOH1076/10761.43LuPhHCH2CH2COOH911/9081.44YPhHCH2CH2COOH922/9221.46CePhHN(CH3)CH2C(O)OCH31071/10711.47PrPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31072/10711.48NdPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31075/10731.49GdPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31089/10911.50TbPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31091/10921.51DyPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31094/10941.52HoPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31097/10971.53ErPhHN(CH3)CH2C(O)CCH31099/10991.54TmPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31101/11021.55YbPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31104/11021.56LuPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31107/11041.57YPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31020/10201.58LaPhHN(CH3)CH2C(O)OCH31071/10701.64EuPh-4-NH2BuH888/8881.65EuPh-4-NH2PhH847/8491.66EuPh-4-NH2Ph-4-OCH3H947/9481.67EuPh-4-NCSBuH889/8921.68EuPh-4-NCSPhH1.69EuPh-4-NCSPh-4-OCH3H1085/1086***1.70Eu9-AnthracenylHCH2CH2C(O)CCH3906/9081.71EuPh-2-NH2CH3H763/7621.72EuPh-2-NH2CH3H805/8041.73EuPh-3-NH2CH3H727/7291.74EuPh-3-NH2CH3H805/804Ph苯基Bu丁基*CHNCl計(jì)算值(+2DMSO)45.814.1611.5510.96測(cè)定值45.54.311.810.6**CHNCl計(jì)算值(+2DMSO+4H2O)42.114.5810.6210.07測(cè)定值42.24.610.69.5***反離子是THA-(C8H7O4-)實(shí)施例B2異硫氰酸酯衍生物的制備向4.4mMol碳酸氫鈉和3.5mMol硫光氣在4ml氯中的懸浮液加入一種表1所列配合物的溶液。該混合物于室溫下劇烈攪拌2.5小時(shí)。氯仿相被分離并以水洗一次。所有的水相合并并被弄干，所得的表2中產(chǎn)物2.1到2.15無(wú)需進(jìn)一步純化。類(lèi)似地由表1中其它一些含有伯胺基作取代基的化合物制得相應(yīng)的異硫氰基化合物。表2化合物L(fēng)n3+R1R4R5-分子質(zhì)量數(shù)[M-Cl]編號(hào)計(jì)算值/實(shí)測(cè)值2.1CePh-NCSCH3H792.7/792.72.2PrPh-NCSCH3H793.5/791.22.3GdPh-NCSCH3H809.9/807.42.4TbPh-NCSCH3H811.5/811.72.5DyPh-NCSCH3H815.1/815.92.6HoPh-NCSCH3H817.5/816.22.7ErPh-NCSCH3H819.9/819.02.8TmPh-NCSCH3H821.5/820.12.9YbPh-NCSCH3H825.6/826.42.10LuPh-NCSCH3H827.6/825.52.11YPh-NCSCH3H741.5/740.22.12LaPh-NCSCH3H791.5/792.12.13EuPh-NCSCH3H804.6/804.72.14LaPh-NCSHH2.15EuPh-NCSHHC.氨基寡核苷酸的制備約30mg可控微孔玻璃(CPG)固相裝入一個(gè)作1.5μMol合成用的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用生物合成反應(yīng)器中。此CPG-固相(1)帶有為合成氨基寡核苷酸的連接3′-片段(例如dc)。為了寡聚，加入氨基亞磷酸脂(6)，(7)，(8)，(9)。為了后面經(jīng)氨基打開(kāi)金屬配合物，特定的氨基亞磷酸酯(10)，(11)，(12)，(13)，(14)，(15)和(16)被插入。(14)n＝3，R＝P(N(i-Propyl)2)OCH2CH2CN(15)n＝4，R＝P(N(i-Propyl)2)OCH2CH2CN(16)n＝5，R＝P(N(i-Propyl)2)OCH2CH2CN氨基亞磷酸酯(14)，(15)和(16)制備實(shí)施例-初始化合物(14a)(n＝3，R＝H)的制備4.0g3-氨基-1-丙醇，3.28g4-甲氧基三苯基氯甲烷和35ml吡啶置于一無(wú)水燒瓶中，于室溫和氬氣氛中攪拌4.5小時(shí)左右。溶劑被蒸去，殘?jiān)眉妆较匆淮?，乙腈處理兩次并不時(shí)攪動(dòng)。所得殘?jiān)苡诙燃淄椴⒂蔑柡吞妓釟溻c溶液洗兩次。水相用二氯甲烷提取三次，有機(jī)相合并，在硫酸鈉上干燥并濃縮。然后粗產(chǎn)物經(jīng)快速色譜法(硅膠)純化(流動(dòng)相乙酸乙酯/正己烷＝1∶2)，得到一黃色的油。1H-NMRδ值于CDCl3中，OCH3＝3.65初始化合物(15a)(n＝4，R＝H)和(16a)(n＝5，R＝H)類(lèi)似地由4-氨基-1-丁醇及5-氨基-1-戊醇制得。1H-NMRδ值于CDCl3中，OCH3＝3.65(15a)和3.65(16a)。-氨基亞磷酸酯(14)的制備于氬氣氛中將1.99gN，N-二異丙胺四唑復(fù)鹽和3.5g2-氰乙基-N，N，N′，N′-四異丙胺基亞磷酸酯置于150ml二氯甲烷中，在20分鐘內(nèi)滴加上述所得化合物(14a)在120ml二氯甲烷中的溶液。此黃色的細(xì)懸浮物攪拌4.5小時(shí)，然后以250ml二氯甲烷稀釋并用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌二次。水相用二氯甲烷提取三次，有機(jī)相合并后于硫酸鈉上干燥，濃縮，然后粗產(chǎn)物以快速柱色譜(硅膠)純化(流動(dòng)相乙酸乙酯/正己烷＝1∶4+0.5％N-甲基嗎啉)，得一黃色油。13P-NMRδ值在CDCl3中，146.9。氨基亞磷酸酯(15)和(16)類(lèi)似地由上述所得化合物(15a)和(16a)制得。13P-NMRδ值于CDCl3中，146.9(15)和147.0(16)。按AppliedBiosystem公司的標(biāo)準(zhǔn)記錄，使用該公司的394型合成器合成周期是有變化的〔脫氧序列(6)，(7)，(8)和(9)的氨基亞磷酸酯偶合時(shí)間共2分鐘，(10)和(11)為10分鐘，(12)為5分鐘，(13)共40分鐘；(13)使用了100倍于剩下那些的時(shí)間〕。為了所得的寡核苷酸與金屬配合物偶合，相應(yīng)的保護(hù)基要在標(biāo)準(zhǔn)條件下裂解?？梢再?gòu)得的試劑有0.1M氨基亞磷酸四唑/乙腈4％，96％叔丁基苯氧乙酸酐/吡啶/四氫呋喃10％，10％，80％N-甲基咪唑/四氫呋喃16％，84％，三氯乙酸/二氯甲烷2％，98％碘/水/吡啶/四氫呋喃3％，2％，20％，75％下列的氨基寡核苷酸被合成(821)5′-GACTGGCGAGAT*CGGCAGTCGGCTAG-3′，其中T*代表這里T表示胸腺嘧啶(823)5′-GACTGGCGAGAT*CGGCAGTCGGCTAG-3′，其中T*代表這里T為胸腺嘧啶(940)5′-GACTGGCGAGATCGGCAGT*CGGCTAG-3′，其中T*代表(1759)5′-H2N(CH2)3OP(O)2-CGAGATCGGGAGTCGGCTAG-3′，(1760)5′-H2N(CH2)4OP(O)2-CGAGATCGGCAGTCGGCTAG-3′，(1761)5′-H2N(CH2)5OP(O)2-CGAGATCGGCAGTCGGCTAG-3′，und(1757)5′-H2N(CH2)6OP(O)2-GGAGATCGGCAGTCGGCTAG-3′.D.三聯(lián)吡啶-鑭系金屬-寡核苷酸結(jié)合物的制備實(shí)施例D1寡核苷酸結(jié)合到鑭系配合物的三聯(lián)吡啶部分的結(jié)合物的制備(a)0.2mg所述之氨基寡核苷酸溶于15μl吡啶/水/三乙胺(90∶15∶1)中，加入1mg表2中所述之異硫氰基配合物后，該混合物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。此反應(yīng)混合物在0.1克分子氯化鉀溶液中滲析一次，水中滲析三次。所得產(chǎn)物經(jīng)反相HPLC(90分鐘溶劑梯度0.05M醋酸三乙胺中乙腈由0％到30％)從Nucleosil-C18柱精制，或經(jīng)離子排阻-HPLC于60℃由PVDI.400DA-柱，5μm精制(梯度10分鐘20％1M氯化鉀溶液和80％20mMpH6磷酸鉀溶液，其中含20％乙腈，然后用80％氯化鉀溶液60分鐘)，得到表3的結(jié)合物3.1到3.13和3.18，3.21。(b)3mg所述之氨基寡核苷酸懸浮于200μlDMSO/100μlN-甲基嗎啉中，加入1mg所述之異硫氰酸酯配合物后(見(jiàn)表2及表1制得的異硫氰酸酯配合物的所述化合物)，此混合物于室溫放置2-3小時(shí)。產(chǎn)物以32％氨水處理以使固相裂解和完全脫保護(hù)(室溫3小時(shí))。經(jīng)反相-HPLC純化制得表3的化合物3.26到3.44。實(shí)施例D2寡核苷酸連接到鑭系金屬配合物的吡啶部分上的結(jié)合物制備(a)3μMol前述羧酸衍生物1.29到1.32(表1)在200μl二甲亞砜中的溶液，加入3.3μMol二環(huán)己基羰二亞胺和3.3μMolN-羥基丁二酰亞胺，室溫放置16小時(shí)。加入100μMolN，N-二異丙基乙胺后再加0.2mg所述之氨基寡核苷酸。室溫下四天后在50mM三乙胺酸或碳酸鹽溶液中滲析兩次，并在水中滲析兩次。再經(jīng)反相-HOLC[(見(jiàn)D1(a)]純化得表3中3.14到3.17，3.19，3.20和3.22到3.25這些化合物。(b)3μMol所述的羧酸衍生物(見(jiàn)表1)于200μl二甲亞砜中的溶液，加入3.3μmol二環(huán)己基羰二亞胺和3.3μmolN-羥基丁二酰亞胺，室溫放置16小時(shí)。加入3mg氨基寡核苷酸后再加100μlN-甲基嗎啉。室溫3天之后以DMSO洗兩次，水洗一次。產(chǎn)物以32％氨水處理以使固相裂解并完全脫保護(hù)(室溫下3小時(shí))。經(jīng)反相-HPLC純化得表3的化合物3.45到3.49。表3化合物L(fēng)nR4R9R8MM(MS)RZ編號(hào)3.1LaCH3Ph-4-691H7082/70933.2EuCH3Ph-4-691H7095/70903.3CeCH3Ph-4-691H27,43.4PrCH3Ph-4-691H42,5*3.5GdCH3Ph-4-691H27,03.6TbCH3Ph-4-691H27,73.7DyCH3Ph-4-691H27,63.8HoCH3Ph-4-691H26,73.9ErCH3Ph-4-691H27,23.10TmCH3Ph-4-691H27,53.11YbCH3Ph-4-691H28,83.12LuCH3Ph-4-691H27,93.13YCH3Ph-4-691H27,43.14EuH-苯基A-6917060/70653.15LaH-苯基A-6917048/70723.16EuHHA-6913.17LaHHA-6913.18EuCH3Ph-4-821H9843/98533.19LaH-苯基A-8219800/98003.20EuH-苯基A-8219813/98393.21EuCH3Ph-4-823H9842/98613.22LaH-苯基A-82335,6*3.23EuH-苯基A-8239811/98263.24LaH-苯基A-9409757/98293.25EuH-苯基A-9409770/97943.26EuCH3Ph-3-691H7092/71173.27EuCH3Ph-4-1759H7050/70433.28EuCH3Ph-4-1760H7064/70713.29EuCH3Ph-4-1761H7078/70783.30EuHPh-4-691H7067/70663.31LaHPh-4-691H7078/70603.32EuCH3Ph-3-1759H7053/70583.33EuCH3Ph-3-1760H7067/70643.34EuCH3Ph-3-1761H7081/70853.35EuCH3Ph-2-691H7096/70983.36EuCH3Ph-2-1759H7053/70553.37EuCH3Ph-2-1760H7067/70653.38EuCH3Ph-2-1761H7081/70833.39EuHPh-4-1759H7025/70303.40DyHPh-4-1759H7036/70433.41GdHPh-4-1759H7031/70343.42DyHPh-3-1759H7036/70383.43GdHPh-3-1759H7031/70293.44EuHPh-3-1759H7025/70263.45EuH-苯基A-17597018/70213.46EuH-苯基A-17577100/71233.47GdH-苯基A-6917065/72173.48TbH-苯基A-6917078/70673.49EuH-苯基B-6917075/7097MM分子質(zhì)量數(shù)計(jì)算值/實(shí)測(cè)值RZ離子排阻高效液相色譜保留時(shí)間(分)Ph-4-691-苯基-4-N(H)C(S)-oligo691Ph-4-821-苯基-4-N(H)C(S)-oligo821Ph-4-823-苯基-4-N(H)C(S)-oligo823Ph-3-NH-691-苯基-3-N(H)C(S)-oligo691Ph-2-NH-691-苯基-2-N(H)C(S)-oligo691Ph-4-1759-苯基-4-N(H)C(S)-oligo1759Ph-4-1760-苯基-4-N(H)C(S)-oligo1760Ph-4-1761-苯基-4-N(H)C(S)-oligo1761Ph-3-1759-苯基-3-N(H)C(S)-oligo1759Ph-3-1760-苯基-3-N(H)C(S)-oligo1760Ph-3-1761-苯基-3-N(H)C(S)-oligo1761Ph-2-1759-苯基-2-N(H)C(S)-oligo1759Ph-2-1760-苯基-2-N(H)C(S)-oligo1760Ph-2-1761-苯基-2-N(H)C(S)-oligo1761A-691-4-CH2CH2C(O)-oligo691A-821-4-CH2CH2C(O)-oligo821A-823-4-CH2CH2C(O)-oligo823A-940-4-CH2CH2C(O)-oligo940A-1759-4-CH2GH2C(O)-oligo1759A-1757-4-CH2CH2C(O)-oligo1757B-691-4-N(CH3)CH2C(O)-oiigo691*反相-HPLC保留時(shí)間(分)E底物RNA(鈀RNA)的制備實(shí)施例E1底物RNA合成約30mg‘可控微孔玻璃’(CPG)固相放在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用生物系統(tǒng)反應(yīng)器以作1.5μmol量合成。此CPG-固相(1)含有作合成RNA的保護(hù)的3′-片段(實(shí)施例中rC)。為了寡聚加入氨基亞磷酸酯(2)，(3)，(4)和(5)。按AppliedBiosystem公司的標(biāo)準(zhǔn)方案，用394型該公司的自動(dòng)合成儀時(shí)進(jìn)行合成循環(huán)(脫氧核糖序列的氨基亞磷酸酯的偶合時(shí)間共10分鐘)，(使用手冊(cè)，第二部(1992)，1.0μmol，附錄1-41)。其它可購(gòu)買(mǎi)的試劑0.1M氨基亞磷酸酯四唑/乙腈4％，96％叔丁基苯氧乙酸酐/吡啶/四氫呋喃10％，10％，80％N-甲基咪唑/四氫呋喃16％，84％三氯乙酸/二氯甲烷2％，98％碘/水/吡啶/四氫呋喃3％，2％，20％，75％下列的底物-RNA被合成CG-6905′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCCACUCUAC)CG-13525′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCUGACUGAC)實(shí)施例E2固相(CPG)裂解和堿基的脫保護(hù)固相物(1.5μMol合成量)以800μl氨飽和乙醇處理并在室溫培育過(guò)夜。氨飽和的乙醇由一份乙醇和三份33％氨液制得。溫育后將氨飽和的乙醇溶液傾析，CPG有氨化乙醇清洗，純化了的溶液凍干。實(shí)施例E3叔丁基二甲硅烷基(TBDMS)保護(hù)基的脫保護(hù)。凍干的樣品以800μl1M氟化四丁銨-四氫呋喃溶液處理，樣品被劇烈混合30分鐘，再避光于室溫培育24小時(shí)。此RNA和50mM三乙胺碳酸氫鹽(TAHC)溶液pH7.0(1+1)混合并直接在4℃滲析(水要有毫微級(jí)10-9純度)。實(shí)施例E4滲析滲析在7.5mMTAHC溶液中pH7.0進(jìn)行3次(此溶液用毫微級(jí)10-9純水配制，以CO2調(diào)整pH7.0并冷卻到4℃)。樣品被凍干并以焦碳酸二乙酯處理〔參見(jiàn)Sambrook，F(xiàn)ritsch，Mamatis，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，ColdSpringHabor實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)〕，再于壓熱器中吸收水(DEPC-H2O)。取一份在260nm作濃度測(cè)定。其余帶RNA部分與RNA酶作用并去雜離子。實(shí)施例E5用33[P]-γATP5′-標(biāo)記底物RNA由上述合成記錄的100μMolRNA為進(jìn)行激酶反應(yīng)在20μl體積中于37℃溫育20分鐘，反應(yīng)溶液中含0.5μlT4聚核苷酸激酶(Promega產(chǎn)，10單位/微升)，2μl激酶緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，5mM1，4-二硫DL-蘇糖醇，0.1mM亞精胺)和0.5μl33[P]γ-ATP(Amersham，＞1000Ci/mMol，10μCi/μl)。接著加入138μlTris-HCl/EDTA(10mM/1mM，pH7.5)，2μl糖原(35mg/ml)和40μlNH4CH3COO(10M)。加600μl乙醇之后樣品被冷卻至-20℃，然后于4℃離心20分鐘。所得沉淀經(jīng)凍干，再以15μl染色液(0.025％溴酚蘭，0.025％二甲苯蘭(酸性蘭)于80％甲酰胺中1∶1混合，和7M尿素，20mM檸檬酸，1mMEDTA)處理，在95℃變性處理1分鐘，立即放在冰上并上樣于1.0cm×1mm袋中作凝膠電泳分離。凝膠電泳在55瓦進(jìn)行40分鐘后再在55瓦進(jìn)行2.5小時(shí)。實(shí)施例E6.經(jīng)激酶處理的底物RNA純化和分離為作酶反應(yīng)物的電泳分離先制備12％聚丙烯酰胺凝膠(1mm×30cm×40cm)。聚合反應(yīng)在170ml體積中，將51ml丙烯酰胺溶液(40％丙烯酰胺/雙丙烯酰胺，10∶1)，17mlTBE-緩沖液(0.89M三個(gè)(羥甲基)氨基甲烷，0.89M硼酸，0.02M乙二胺四乙酸)和71.4g尿素與所述量的水混合。聚合作用以170μl過(guò)氧二硫酸銨溶液(25％w/v)和170μlTEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)引起。1小時(shí)后該凝膠即可使用。作為工作緩中液(Laufpuff)可用10倍稀釋的TBE緩沖液。分離的RNA在360μl洗脫液中用40μlNaCH3COO(3MpH5.2)和1ml乙醇處理，樣品在-20℃冷凍20分鐘然后在4℃離心20分鐘。所得沉淀以30μlH2O滲析，溶液按Czerenkow記錄在閃爍計(jì)數(shù)器上測(cè)定并調(diào)整到12000cpm/μl。F以三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物-寡核苷酸結(jié)合物進(jìn)行裂解的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例F1用寡核苷酸鑭系金屬配合物結(jié)合物進(jìn)行底物RNA裂解為了作裂解反應(yīng)后RNA產(chǎn)物的凝膠電泳分離和鑒定，要制備一種LongRanger凝膠(ATBiochem，改性聚丙烯酰凝膠)(0.4mm×30cm×40cm)。聚合反應(yīng)在90ml體積中進(jìn)行。21mlLongRanger溶液(50％)，11mlTBE緩沖液(0.89M三個(gè)(羥甲基)氨基甲烷，0.89M硼酸，0.02M乙二胺四乙酸)和37g尿素與所述數(shù)量的H2O混合，用450μl過(guò)氧二硫酸銨溶液(10％w/v)和45μlTEMED引發(fā)聚合作用，1小時(shí)后凝膠即可使用。作工作緩沖液的可用稀釋16.66倍的TBE-緩沖液。分離在60瓦進(jìn)行75分鐘。凝膠電泳分離之后，標(biāo)記的裂解產(chǎn)物(RNA-寡聚物)放在一張X光膠片上或借助于磷光檢測(cè)器來(lái)分別計(jì)數(shù)。裂解反應(yīng)在10μl體積進(jìn)行。向1μl底物-RNA(12000cpm)用吸管加入1μl寡核苷酸結(jié)合物(10μM)，4μlTris-HCl緩沖液(50mM，37℃pH7.4)和所述數(shù)量的H2O。此混合物于85℃加熱1分鐘，再在37℃培育16小時(shí)。加入5μl染色緩中液(0.025％溴酚蘭，0.025％二甲苯蘭(酸性蘭)在80％甲酰胺中1∶1混合，并帶7M尿素，20mM檸檬酸和1mMEDTA)使反應(yīng)結(jié)束。為了作凝膠電泳分離將7.5μl樣品于95℃失活1分鐘，立即放在冰上并上樣在凝膠板上。此底物RNA濃度是下述估算的25倍按所述的原始記錄以100pMolRNA粗產(chǎn)物和凝膠純化10％收率，發(fā)現(xiàn)底物RNA最終濃度0.04mM，在反應(yīng)混合物中是1mM寡核苷酸結(jié)合物。只有三聯(lián)吡啶-鑭系金屬配合物用來(lái)比較，所以需要400mM配合物才能達(dá)到大致相同的裂解。對(duì)于底物-RNA則以10000倍過(guò)量配合物處理。實(shí)施例F2底物RNACG-690以寡核苷酸-銪配合物第3.2號(hào)化合物溫育裂解反應(yīng)依實(shí)施例F1所述之基本原則進(jìn)行。(80％未裂解的起始物)CG-6905′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCCACUCUAC)主要裂解產(chǎn)物(∑15％)5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCCACUCUAcp5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCCACUCUcp5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCCcp5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGcp其它裂解產(chǎn)物(∑5％)5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCcp5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCcp實(shí)施例F3底物RNACG-690和寡核苷酸-鑭配合物結(jié)合物第3.15號(hào)化合物溫孵裂解反應(yīng)按實(shí)施例F1所述之基本原則進(jìn)行。(80％未裂解的起始物)CG-6905′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCCACUCUAC)主要產(chǎn)物(∑20％)5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCCACUCUcp5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCCcp(CP＝2′，3′-環(huán)磷酸酯)實(shí)施例F4底物RNACG-1352用寡核苷酸-銪配合物結(jié)合物第3.14號(hào)化合物溫孵裂解反應(yīng)按實(shí)施例F1所述之基本原則進(jìn)行。(＜5％未裂解之起始物)CG-13525′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCUGACUGAC)主要產(chǎn)物(＞70％)5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCUGcp)殘余裂解產(chǎn)物(∑25％)5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCUcp)5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCUGAcp)5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCUGACcp)5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCUGACUcp)5′r(CUAGCCGACUGCCGAUCUCGCUGACUGcp)實(shí)施例F5底物RNACG-1352以寡核苷酸-三聯(lián)吡啶-金屬配合物結(jié)合物進(jìn)一步裂解進(jìn)一步裂解反應(yīng)依實(shí)施例F1所述之基本原則進(jìn)行。表4列出底物RNACG-1352用表3中各種三聯(lián)吡啶-金屬配合物-寡核苷酸結(jié)合物裂解的結(jié)果。符號(hào)+3表示主要裂解發(fā)生在底物RNA的核苷酸+3和+4之間(見(jiàn)表1和表2及注釋)。人們知道，在制造中裂解最好是發(fā)生在+3位置。表4低物RNACG-1352的主要裂解產(chǎn)物(黑體位置)。指明的是所用的結(jié)合物(亦見(jiàn)表3)。</tables>權(quán)利要求1.通式I的化合物其中R1表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基，以O(shè)，S或N作雜原子的C4-C12雜芳基，C1-C4烷硫基，二(C1-C4烷基)氨基，鹵素，磺酰胺或羧酰胺和一個(gè)一價(jià)功能基R5；或者R1是一個(gè)一價(jià)功能基，R5是H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基，以O(shè)、S或N作雜原子的C4-C12雜芳基，C1-C4烷硫基，二(C1-C4烷基)氨基，鹵素、磺酰胺或羧酰胺；這里功能基直接或通過(guò)一個(gè)基團(tuán)X連接到吡啶環(huán)上，基團(tuán)Z是必要時(shí)可通過(guò)-O-，-S-，-NR12-，-C(O)O-或-C(O)NR12-斷開(kāi)的選自下述這些基團(tuán)的殘基C1-C4亞烷基，C2-C12亞烯基。C2-C12亞炔基，C5-C8亞環(huán)烷基，C6-C12亞芳基和C7-C12亞芳烷基；R2和R7相互獨(dú)立地表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基，鹵素，O，S或N作雜原子的C4-C12雜芳基，C1-C4烷硫基，二(C1-C4烷基)氨基，磺酰胺或羧酰胺；R3和R6相互獨(dú)立地為H，C1-C4烷基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基，鹵素，以O(shè)，S或N作雜原子的C4-C12雜芳基，C1-C4烷硫基，二(C1-C4烷基)氨基，磺酰胺或羧酰胺，R4代表H，C1-C20烷基，C5-C8環(huán)烷基，C6-C12芳基或C7-C12芳基烷基，R12代表H或C1-C6烷基，Me代表一種鑭系金屬或釔，Y表示一個(gè)酸陰離子，n是一個(gè)2或3的數(shù)，和m是一個(gè)1、2或3的數(shù)。這里的基團(tuán)為烷基、環(huán)烷基、芳烷基和芳基和基團(tuán)Z為不被取代或以C1-C4烷氧基、F、Cl、Br、-CN、C1-C4烷基或-NO2取代。2.權(quán)利要求1之化合物，其特征在于，R1代表H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基，和R5為一價(jià)功能基；或R1為一價(jià)功能基和R5為H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基。3.權(quán)利要求1或2的化合物，其特征在于，基團(tuán)Z代表C1-C3亞烷基，C3-亞炔基，亞苯基或C7-亞芳烷基。4.權(quán)利要求1至3的化合物，其特征在于基團(tuán)Z是C2-C3亞烷基或亞苯基。5.權(quán)利要求1至4的化合物，其特征在于R2和R7各自獨(dú)立地為H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基或鹵素。6.權(quán)利要求1至5之化合物，其特征在于R2和R7各自獨(dú)立地為H或C1-C4烷基。7.權(quán)利要求1至6之化合物，其特征在于R3和R8各自獨(dú)立地為H，C1-C4烷基，C7-C12芳基烷基或C6-C16芳基。8.權(quán)利要求1至7之化合物，其特征在于R3和R8各自獨(dú)立地為H或C1-C4烷基。9.權(quán)利要求1至8之化合物，其特征在于R4代表H或C1-C20烷基。10.權(quán)利要求1至9之化合物，其特征在于一價(jià)功能基選自下述基團(tuán)-OR10，-SR10，-NCO，-NCS，-NHR11，-C(O)OR11，-C(O)SH，-C(O)NHR11，-C(O)Cl，-C(S)SR11，-C(S)NHR11，-C(S)OR11，-SO3R11，-SO2NHR11，-SO2Cl，-P(O)(OH)2，-P(O)(OH)-NHR11，-P(S)(SH)2，-P(S)(SH)-NHR11，-P(S)(OH)2，-P(S)(OH)-NHR11，-P(O)(SH)2，-P(O)(SH)-NHR11，-P(O)(OH)H，-P(O)(NHR11)H，-P(S)(SH)H，-P(S)(NHR11)H，-P(S)(OH)H，-P(O)(SH)H，其中R10為H，-C(O)NH2，-C(S)NH2，-C1-C6-烷基，-CxH2x-NH2，-CxH2x-SH或-(CxH2xO)y-H，R11為H，-C1-C6-烷基，-CxH2x-NH2，-CxH2x-SH或-(CxH2xO)y-H，x等于一個(gè)2到6的數(shù)，y等于一個(gè)1到20的數(shù)。11.權(quán)利要求10之化合物，其特征在于R10表示H。12.權(quán)利要求1至11之化合物，其中之功能基選自如下基團(tuán)-OH，-SH，-NCO，-NCS，-NHR11，-C(O)-OR11和-P(O)(OH)2。13.權(quán)利要求1至12之化合物，其中之功能基選自如下基團(tuán)-NCS，-NHR11，-C(O)-OR11和-P(O)(OH)2。14.權(quán)利要求1至13之化合物，其中之鑭系金屬是鑭、鈰、釹、銪和釓。15.權(quán)利要求1至14之化合物，其中之鑭系金屬是鑭和銪。16.權(quán)利要求1至15之化合物，其中之鑭系金屬是銪。17.權(quán)利要求1至16之化合物，其中之陰離子是F-，Cl-，Br-，J-，PF6-，SbF6-，BF4-，B(Ph)4-，醋酸根，NO3-，硫酸根或磷酸根。18.權(quán)利要求1至17之化合物，其中之陰離子是Cl-，醋酸根或NO3-。19.通式V的化合物其中R2和R7各自獨(dú)立地表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基，鹵素，以O(shè)，S或N作雜原子的C4-C12雜芳基，C1-C4烷硫基，二(C1-C4烷基)氨基，磺酰胺或羧酰胺；R3和R6各自獨(dú)立地為H，C1-C4烷基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基，鹵素，以O(shè)，S或N作雜原子的C4-C12雜芳基，C1-C4烷硫基，二(C1-C4烷基)氨基，磺酰胺或羧酰胺；R4代表H，C1-C20烷基，C5-C8環(huán)烷基，C6-C12芳基或C7-C12芳基烷基；這里的烷基、環(huán)烷基、芳基烷基和芳基或未被取代，或以C1-C4烷氧基、F、Cl、Br、-CN、C1-C4烷基或-NO2取代；Me代表鑭系金屬或釔，Y表示一個(gè)酸的陰離子，n是一個(gè)2或3的數(shù)，m是一個(gè)1、2或3的數(shù)，R9表示一個(gè)式VI的殘基-Xp-A-X′q-A′r-Oligo(VI)R8表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基，以O(shè)，S或N作雜原子的C4-C12雜芳基，C1-C4烷硫基，二(C1-C4烷基)氨基，鹵素，磺酰胺或羧酰胺，或者R9表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基，以O(shè)，S或N作雜原子的C4-C12雜環(huán)芳基，C1-C4烷硫基，二(C1-C4烷基)氨基，鹵素，磺酰胺或羧酰胺和R8代表一個(gè)式VI的殘基，p、q和r各自獨(dú)立地表示0或1，X和X′分別獨(dú)立地表示一個(gè)未取代的或是以C1-C4烷氧基，F(xiàn)，Cl，Br，-CN，C1-C4烷基或-NO2取代的下述基團(tuán)C1-C20亞烷基，C2-C12亞烯基，C2-C12亞炔基，-(CxH2xO)y-，其中x等于一個(gè)2到6的數(shù)，y是一個(gè)1到20的數(shù)，C5-C8亞環(huán)烷基，C6-C12亞芳基和C7-C12亞芳烷基；A和A′分別表示-O-，-S-，-S-S-，-NR12-CO-NR12-，-NR12-CS-NR12-，-NR12-，-NR12-C(O)-O-，-C(O)O-，-C(O)S-，-C(O)NR12-，-C(S)S－，-C(S)O-，-C(S)NR12-，-SO2NR12-，-SO2-，-P(O)(OH)O-，-P(S)(SH)S-，-P(S)(SH)O-，-P(S)(OH)O-，-P(O)(SH)S-，-P(O)(OH)S-，-P(O)(SH)O-，-P(O)(OH)-NR12-，-P(S)(SH)-NR12-，-P(S)(OH)-NR12-，-P(O)(SH)-NR12-，-HP(O)O-，-HP(S)S-，-HP(O)NR12-或-HP(S)NR12-，其中R12表示H或C1-C6烷基，和Oligo代表一個(gè)由天然的，修飾或合成的脫氧核苷或肽核酸片段(Bausteinen)衍生來(lái)的天然、修飾或合成的序列，它經(jīng)一個(gè)核酸堿基、一個(gè)寡核苷酸間的橋或一個(gè)糖基聯(lián)接，并且其內(nèi)部區(qū)域互補(bǔ)于一個(gè)靶RNA。20.權(quán)利要求19的化合物，其特征在于，R9是一個(gè)式VI的殘基-Xp-A-X′q-A′r-O1igo(VI)R8表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基或C6-C16芳基，或R9是H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基或C6-C16芳基和R8代表一個(gè)式VI的殘基，和p、q和r分別獨(dú)立地表示0或1。21.權(quán)利要求10或20之化合物，其特征在于，q代表1。22.權(quán)利要求19至21的化合物，其特征在于，R2和R7各自獨(dú)立地表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基或鹵素。23.權(quán)利要求19至22之化合物，其特征在于，R2和R7各自獨(dú)立地表示H或C1-C4烷基。24.權(quán)利要求19至23之化合物，其特征在于，R3和R6各自獨(dú)立地表示H，C1-C4烷基，C7-C12芳基烷基或C6-C16芳基。25.權(quán)利要求19至24之化合物，其特征在于R3和R6各自獨(dú)立地表示H或C1-C4烷基。26.權(quán)利要求19至25之化合物，其特征在于R4代表H或C1-C20烷基。27.權(quán)利要求19至26之化合物，其中之鑭系金屬是鑭、鈰、釹、銪和釓。28.權(quán)利要求19至27之化合物，其中之鑭系金屬是鑭或銪。29.權(quán)利要求19至28之化合物，其中之鑭系金屬是銪。30.權(quán)利要求19至29之化合物，其中之陰離子是F-，Cl-，Br-，J-，PF6-，SbF6-，BF4-，B(Ph)4-，醋酸根，NO3-，硫酸根或磷酸根。31.權(quán)利要求19至30之化合物，其中之陰離子是Cl-，醋酸根或NO3-。32.權(quán)利要求19至31之化合物，其中之陰離子是Cl-。33.權(quán)利要求19至32之化合物，其特征在于x表示C1-C3亞烷基，C3-亞炔基，亞苯基或C7-亞芳烷基。34.權(quán)利要求19至33之化合物，其特征在于x是C2-C3亞烷基或亞苯基。35.權(quán)利要求19至34之化合物，其特征在于A代表-NR12-CS-NR12-或-C(O)NR12-。36.權(quán)利要求19至35之化合物，其特征在于A代表-NH-CS-NH-或-C(O)NH-。37.權(quán)利要求19至36之化合物，其特征在于X′表示C1-C20亞烷基。38.權(quán)利要求19至37之化合物，其特征在于X′表示C1-C10亞烷基。39.權(quán)利要求19至38之化合物，其特征在于A′表示非已有的或-P(O)(OH)O-基。40.通式II的化合物其中，R1表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基或C6-C16芳基或一個(gè)一價(jià)功能基，這里功能基直接或通過(guò)一個(gè)基團(tuán)Z連接到吡啶環(huán)上，基團(tuán)Z是必要時(shí)通過(guò)-O-，-S-，-NR12-，-C(O)O-或-C(O)NR12-斷開(kāi)的選自下述基團(tuán)的殘基C1-C20亞烷基，C2-C12亞烯基，C2-C12亞炔基，C5-C8亞環(huán)烷基，C6-C12亞芳基和C7-C12亞芳烷基，R2和R7各自獨(dú)立地表示H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C7-C12芳基烷基，C6-C16芳基或鹵素，R3和R6分別獨(dú)立地為H，C1-C4烷基，C7-C12芳基烷基或C6-C16芳基，R12表示H或C1-C6烷基，這里的烷基，環(huán)烷基，芳烷基，芳基殘基，基團(tuán)Z不被取代或以C1-C4烷氧基，F(xiàn)，Cl，Br，-CN，C1-C4烷基或-NO2取代。41.通式III的化合物R5表示一個(gè)經(jīng)C2-C20亞烷基連接在吡啶環(huán)上的一價(jià)功能基，這個(gè)功能基選自下述基團(tuán)-C(O)-OR12，-C(O)NHR12，-SO2-R12和-SO2NHR12，其中R12是H或C1-C6烷基，和R4是H或C1-C20烷基。42.通式I的化合物制備方法，其特征在于通式II的三聯(lián)吡啶與通式III的吡啶二醛或吡啶二酮在式IV的鹽類(lèi)存在下縮合Men+(Ym-)n/m(IV)其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，Me，Y，n和m有著前面指定的意義。43.權(quán)利要求19至39之通式(V)的化合物制備方法，其特征在于將權(quán)利要求1-18之任一的通式(I)的化合物(a)與一個(gè)式VIa的化合物相反應(yīng)A″-X′-A′0或1-Oligo(VIa)其中A″表示一個(gè)選自下述基團(tuán)的適當(dāng)一價(jià)功能基-OR10，-SR10，-NCO，-NCS，-NHR11，-C(O)OR11，-C(O)SH，-C(O)NHR11，-C(O)Cl，-C(S)SR11，-C(S)NHR11，-C(S)OR11，-SO3R11，-SO2NHR11，-SO2Cl，-P(O)(OH)2，-P(O)(OH)-NHR11，-P(S)(SH)2，-P(S)(SH)-NHR11，-P(S)(OH)2，-P(S)(OH)-NHR11，-P(O)(SH)2，-P(O)(SH)-NHR11，-P(O)(OH)H，-P(O)(NHR11)H，-P(S)(SH)H，-P(S)(NHR11)H，-P(S)(OH)H，-P(O)(SH)H，其中R10為H，-C(O)NH2，-C(S)NH2，-C1-C6-烷基，-CxH2x-NH2，-CxH2x-SH或-(CxH2xO)y-H，R11為H，-C1-C6-烷基，-CxH2x-NH2，-CxH2x-SH或-(CxH2xO)y-H，x等于一個(gè)2到6的數(shù)，y是一個(gè)1到20的數(shù)，X′是一個(gè)不被取代或以C1-C4烷氧基，F(xiàn)，Cl，Br，-CN，C1-C4烷基或-NO2取代的選自下述基團(tuán)的殘基C1-C20亞烷基，C2-C12亞烯基，C2-C12亞炔基，-(CxH2xO)y-，其中x等于一個(gè)2到6的數(shù)，y是一個(gè)1到20的數(shù)，C5-C8亞環(huán)烷基，C6-C12亞芳基和C7-C12亞芳烷基，A′表示-O-，-S-，-S-S-，-NR12-CO-NR12-，-NR12-CS-NR12-，-NR12-，-NR12-C(O)-O-，-C(O)O-，-C(O)S-，-C(O)NR12-，-C(S)S-，-C(S)O-，-C(S)NR12-，-SO2NR12-，-SO2-，-P(O)(OH)O-，-P(S)(SH)S-，-P(S)(SH)O-，-P(S)(OH)O-，-P(O)(SH)S-，-P(O)(OH)S-，-P(O)(SH)O-，-P(O)(OH)-NR12-，-P(S)(SH)-NR12-，-P(S)(OH)-NR12-，-P(O)(SH)-NR12-，-HP(O)O-，-HP(S)S-，-HP(O)NR12-或-HP(S)NR12-，其中R12表示H或C1-C6烷基，和Oligo代表一個(gè)由天然的，修飾的或合成的脫氧核苷或肽核酸片段而來(lái)的天然、修飾或合成的序列，它通過(guò)一個(gè)核酸堿基、一個(gè)核苷酸內(nèi)的橋或一個(gè)糖基連接，并在內(nèi)部區(qū)域與靶RNA互補(bǔ)，或者(b)與一個(gè)式VIb的化合物相反應(yīng)A″-Oligo(Vib)其中A″和Oligo具有(a)項(xiàng)中所述的意義。44.權(quán)利要求43的方法，其特征在于R10是H。45.一種在生理?xiàng)l件下，和一種由金屬配合物和寡核苷酸結(jié)合物的作用下，裂解核糖核酸的磷酸核苷酸橋的方法，其特征在于(a)靶RNA與一個(gè)如權(quán)利要求19至39的化合物配合，(b)再經(jīng)反應(yīng)并裂解。46.權(quán)利要求19至39的式(V)化合物在治療溫血?jiǎng)游锇ㄈ祟?lèi)疾病的一種療法中的應(yīng)用，它通過(guò)使體內(nèi)核苷酸序列失活而起作用。47.一種基于一種水溶液或懸浮液的藥物制劑，其中含有單獨(dú)的或與另一種生物活性物質(zhì)一起的有效量的權(quán)利要求19至39項(xiàng)之式(V)化合物，作為藥物載體的水及必要的助劑。48.權(quán)利要求19至39之式(V)化合物在治療溫血?jiǎng)游锇ㄈ祟?lèi)疾病中的應(yīng)用。它通過(guò)使體內(nèi)核苷酸序列失活而起作用。全文摘要通式V的化合物，其中R文檔編號(hào)C12Q1/68GK1162317SQ95195985公開(kāi)日1997年10月15日申請(qǐng)日期1995年8月30日優(yōu)先權(quán)日1995年8月30日發(fā)明者R·漢納,J·豪爾,D·赫斯金,U·皮爾利斯,H·穆沙申請(qǐng)人:諾瓦蒂斯有限公司