專利名稱：：鑒別對(duì)治療自身免疫疾病有效的化合物的方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明與自身免疫疾病有關(guān)。主要組織相容性(MHC)II類分子表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞表面。通過結(jié)合抗原并遞呈抗原給T細(xì)胞，MHCII類分子參與了免疫應(yīng)答的啟動(dòng)。于是，MHCII類分子表達(dá)的水平影響免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。編碼MHCII類抗原α-和β-多肽的基因定位于染色體的HLA-D(組織相容性白細(xì)胞抗原-D)區(qū)域。II類基因的同型抗原包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP。這些基因中，存在基本的等位基因多態(tài)性；例如，HLA-DR的等位基因包括DR1、DR2、DR3和DR4。此外，存在這些等位基因的亞型；例如，DR4的亞型包括DW4、DW10、DW13、DW14和DW15。幾種自身免疫疾病與MHCII類基因特殊等位基因的表達(dá)相關(guān)。大約93％感染類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人表達(dá)HLA-DR1、HLA-DR4或二者均有表達(dá)(McDermott等，風(fēng)濕疾病通報(bào)(BulletinontheReumaticDiseases)，381-10；見表1)。</tables>續(xù)表一其它自身免疫疾病也與特殊等位基因的表達(dá)相關(guān)。例如，F(xiàn)elty氏綜合癥、Sjogren氏綜合癥，系統(tǒng)紅斑狼瘡以及對(duì)金和青霉胺毒性的發(fā)作都與各種HLA-DR等位基因有關(guān)(McDermott等，風(fēng)濕疾病通報(bào)(BulletinontheReumaticDiseases)，381-10；見表2作為另外一個(gè)例子，特殊的青少年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與HLA-DPB2.1相關(guān)(Begovich等，1989，PNAS869489-9493)。大約70％患有胰島素依賴糖尿病的病人表達(dá)HLA-DQ3.2B、DQA1或DQB1，而且自身免疫皮膚病尋常天庖瘡與HLA-DQB1.3的表達(dá)相關(guān)(Scharf等，1989，PNAS866215-6219)。MHCII類基因的激活依賴于激活子CIITA(Steimle等，1993，細(xì)胞75135-146)。發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺乏蛋白的其余部分并且有其它完整的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)存在時(shí)，CIITA的一部分足以用來激活轉(zhuǎn)錄。這一結(jié)構(gòu)域被稱為CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，而且我們已經(jīng)揭示出它對(duì)抑制CIITA依賴轉(zhuǎn)錄的化合物的鑒別能提供有用的信息。這些化合物因其抑制MHCII類基因轉(zhuǎn)錄的能力而成為潛在的自身免疫疾病治療藥物。我們還發(fā)現(xiàn)缺乏蛋白的其余部分并且有其它完整的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)存在時(shí)，CIITA的第二部分足以用來介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄器中CIITA和其靶蛋白的相互作用而且激活所有的MHCII類啟動(dòng)子。我們稱這一結(jié)構(gòu)域?yàn)镃IITA相互作用結(jié)構(gòu)域，而且抑制這一結(jié)構(gòu)域與其靶蛋白結(jié)合的化合物能夠抑制CIITA依賴的轉(zhuǎn)錄從而是潛在的自身免疫疾病治療藥物。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CIITA的一種突變子(在此稱為克隆13CIITA)激活MHCII類基因一種亞類的轉(zhuǎn)錄。稱該突變子為同型特異突變子；同型特異CIITA蛋白的轉(zhuǎn)錄激活和相互作用結(jié)構(gòu)域在鑒別轉(zhuǎn)錄的同型特異抑制劑的化合物中也是有用的。因此，本發(fā)明的特色在于其方法用CIITA激活結(jié)構(gòu)域或相互作用結(jié)構(gòu)域確定化合物是否是潛在自身免疫治療藥物。用以下說明的轉(zhuǎn)錄測(cè)定技術(shù)可形成有功能的CIITA激活結(jié)構(gòu)域或有功能CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域的存在或缺失。某一方法中，測(cè)定化合物抑制報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的能力，轉(zhuǎn)錄的抑制指示該化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。用另一種方法測(cè)定化合物抑制CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域與靶蛋白結(jié)合的能力，抑制結(jié)合指示該化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。在又一種方法中，CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域缺失而另外一種蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域存在時(shí)測(cè)定了CIITA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的能力。抑制相互作用功能的化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。在待試化合物存在時(shí)通過測(cè)定野生型CIITA相互作用構(gòu)域介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的能力和監(jiān)測(cè)每一同型抗原的表達(dá)，這種方法可用于鑒別同型特異性轉(zhuǎn)錄抑制劑的化合物。存在同型特異性轉(zhuǎn)錄抑制劑時(shí)，野生型CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域只介導(dǎo)MHCII類基因一種亞類的轉(zhuǎn)錄。此外本發(fā)明的特色方法即用同型特異性CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域鑒別同型特異性轉(zhuǎn)錄抑制劑的化合物。這些方法中，測(cè)定了化合物對(duì)野生型和同型特異CIITA相互作用和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)哉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的不同影響能力，這樣的同型特異抑制劑對(duì)選擇性影響免疫系統(tǒng)有效。轉(zhuǎn)錄抑制可在體內(nèi)、體外或細(xì)胞基礎(chǔ)上分析。現(xiàn)有技術(shù)中有很多技術(shù)用以測(cè)定轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的活力(例如，見Keegan等，1986，科學(xué)23699；Ma等，1987，細(xì)胞48847Lin等，1988，細(xì)胞54659；Sadowski等，1988，自然335563；Robert等，1993，自然363741和Ma等，1988，細(xì)胞55443)。這些以及其它轉(zhuǎn)錄分析可以鑒別抑制CIITA轉(zhuǎn)錄激活的化合物為目的進(jìn)行改進(jìn)這可通過用新鑒別出的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域代替以前描述過的分析中所用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域來完成。給轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入化合物并確定化合物是否抑制轉(zhuǎn)錄，從而鑒別抑制CIITA轉(zhuǎn)錄激活的化合物。這些化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，潛在的自身免疫疾病治療藥物通過如下方法鑒別a)提供一種融合蛋白，該蛋白包含與DNA結(jié)合蛋白(如，LexA的DNA結(jié)合/二聚化結(jié)構(gòu)域或GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)融合的CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(不含有功能的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域)；b)在一種轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(例如，體外或原核和真核細(xì)胞內(nèi)如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中提供融合蛋白，此轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)具有與融合蛋白結(jié)合的調(diào)節(jié)序列(如，在質(zhì)?；蛉旧w上)而且調(diào)節(jié)序列與報(bào)告基因(例如，編碼β-半乳糖苷酶、CAT、GUS、蟲熒光素酶、人生長(zhǎng)激素或堿性磷酸酶)可操作地相連；c)測(cè)定報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的水平(例如，通過標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定報(bào)告基因RNA和蛋白產(chǎn)物的活力。舉例如下，在含X-gal的培養(yǎng)基里或上培養(yǎng)細(xì)胞并且測(cè)定產(chǎn)生的藍(lán)色發(fā)色團(tuán)的數(shù)量可測(cè)定lacZ基因的轉(zhuǎn)錄，)；以及d)在待試化合物存在時(shí)完成上述步驟a-c，轉(zhuǎn)錄水平的降低(相對(duì)于缺乏化合物時(shí)的水平)表明化合物抑制轉(zhuǎn)錄的CIITA激活從而是一種潛在的自身免疫疾病治療藥物。其它優(yōu)選的方案中，CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域用以鑒別潛在的自身免疫疾病治療藥物。這些方法包括a)提供一種融合蛋白，該蛋白包括與一個(gè)非CIITA激活結(jié)構(gòu)域融合的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域(如，單純皰疹病毒α-誘導(dǎo)因子(α-TDF)的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)；b)提供一種CIITA相互作用的靶蛋白(如，人B細(xì)胞的CIITA相互作用靶蛋白)；c)在一種轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中提供融合蛋白和靶蛋白(如，體外或原核和真核細(xì)胞內(nèi)如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞比如人B細(xì)胞(例如，克隆13、Raji或RM3細(xì)胞))，轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中具有含MHCII類啟動(dòng)子序列的調(diào)節(jié)序列(如，在質(zhì)?；蛉旧w上)而且調(diào)節(jié)序列與報(bào)告基因(例如，MHCII類基因、編碼β-半乳糖苷酶、CAT、GUS、蟲熒光素酶、人生長(zhǎng)激素或堿性磷酸酶)可操作地地相連的DNA；以及d)測(cè)定報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的水平(例如，通過標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定報(bào)告基因RNA和蛋白產(chǎn)物的活力。舉例如下，在人B細(xì)胞中用FACS分析細(xì)胞表面MHCII類分子表達(dá)的增加可測(cè)定MHCII類基因的轉(zhuǎn)錄)；以及e)完成步驟a-d，在被測(cè)試化合物存在時(shí)轉(zhuǎn)錄水平的降低(相對(duì)于缺乏化合物時(shí)的水平)表明化合物抑制CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的能力從而是一種潛在的自身免疫疾病治療藥物。同型特異轉(zhuǎn)錄抑制劑化合物可通過其差異抑制MHCII類基因表達(dá)能力的特征得以鑒別。例如，野生型CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域克隆13細(xì)胞的表達(dá)恢復(fù)了HLA-DR、-DQ和-DP同型抗原的轉(zhuǎn)錄。不以同型特異方式抑制轉(zhuǎn)錄的化合物會(huì)阻滯三個(gè)基因表達(dá)的恢復(fù)。相反，同型轉(zhuǎn)錄抑制劑只會(huì)干擾這些基因的亞類的表達(dá)恢復(fù)。另外的優(yōu)選方案中，作為潛在自身免疫疾病治療藥物的化合物的鑒別如下a)提供的第一個(gè)融合蛋白包括與一個(gè)DNA結(jié)合蛋白(如，LexA的DNA結(jié)合/二聚化結(jié)構(gòu)域或GAL4的DNA激活結(jié)構(gòu)域)融合的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域(不含有功能的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域)；b)在一種轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(例如，體外或原核和真核細(xì)胞內(nèi)如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中提供融合蛋白，轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)具有與第一個(gè)融合蛋白結(jié)合的調(diào)節(jié)序列(如，在質(zhì)粒或染色體上)而且調(diào)節(jié)序列與報(bào)告基因(例如，編碼β-半乳糖苷酶、CAT、GUS、熒光素酶、人生長(zhǎng)激素或堿性磷酸酶)可操作地相連的DNA；c)提供第二個(gè)融合蛋白，其特征在于它包含了一種與在此定義過的CIITA相互作用靶蛋白融合的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如，B42的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)；d)測(cè)定報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的水平(例如，通過標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定報(bào)告基因RNA和蛋白產(chǎn)物的水平和活力。舉例如下，在含X-gal的培養(yǎng)基里培養(yǎng)細(xì)胞并且測(cè)定產(chǎn)生的藍(lán)色發(fā)色團(tuán)的數(shù)量可測(cè)定lacZ基因的轉(zhuǎn)錄，)；以及e)在待試化合物存在時(shí)完成步驟a-d，轉(zhuǎn)錄水平的降低(相對(duì)于缺乏化合物時(shí)的水平)表明化合物能抑制CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域與靶蛋白結(jié)合力從而是一種潛在的自身免疫疾病治療藥物。抑制結(jié)合的化合物可通過很多方法發(fā)生作用，其中包括空間干擾結(jié)合或改變CIITA或靶蛋白的結(jié)構(gòu)。盡管該化合物完全破壞轉(zhuǎn)錄的精確機(jī)理尚未明了。然而該化合物卻是一種有價(jià)值的藥物。另外一些測(cè)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法也可用來鑒別抑制CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域與靶蛋白結(jié)合的化合物。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，本領(lǐng)結(jié)構(gòu)域的技術(shù)人員可使用ELISA、Southwestern雜交、濾紙或膜結(jié)合的蛋白或固定化蛋白來鑒別抑制CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域與其靶蛋白結(jié)合的化合物。本發(fā)明還包括一種基本純化的多肽，后者包括一個(gè)不具功能性CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域的CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，該多肽包括一種與圖1中所示序列26-352的一個(gè)多于50個(gè)氨基酸序列基本相同的多于50個(gè)氨基酸的序列。相關(guān)的工作中，本發(fā)明記述了基本純化的編碼CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域而不編碼有功能的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域的DNA(如，基因組DNA，cDNA或合成DNA)。本發(fā)明進(jìn)一步記述了一種基本純化的多肽，它包括一種CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域而不包括一種有功能的CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，該多肽包括與圖1所示序列301-1130氨基酸的多于50個(gè)氨基酸的序列基本相同的一個(gè)多于50個(gè)氨基酸的序列。相關(guān)的工作中，本發(fā)明記述了基本純化的編碼CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域而不編碼有功能的CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的DNA(如，基因組DNA，cDNA或合成DNA)。此外，本發(fā)明記述了一種基本純化的多肽，它包括克隆13細(xì)胞系(細(xì)胞系的描述，參看Ono等，1991，J.Exp.Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)173629-637)CIITA多肽的相互作用結(jié)構(gòu)域?？寺?3CIITA激活MHCII類DQ基因的轉(zhuǎn)錄而不激活MHCII類DR和DP基因的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，該多肽包括與圖1所示序列301-1077氨基酸的多于50個(gè)氨基酸序列基本相同的一種多于50個(gè)氨基酸的序列，但是缺失了圖1所示序列1-300和1078-1130的氨基酸。相關(guān)的工作中，本發(fā)明包括一種基本純化的編碼克隆13CIITA的DNA(如，基因組DNA，cDNA或合成DNA)。本發(fā)明還包括其它同型特異CIITA突變子，而且進(jìn)一步描述的方法中使用CIITA同型特異突變子的激活和相互作用結(jié)構(gòu)域來確定化合物是否為轉(zhuǎn)錄的同型特異抑制劑。同型特異抑制劑的化合物也是潛在的自身免疫疾病治療藥物。當(dāng)這種化合物能夠抑制與自身免疫疾病有關(guān)的特殊基因而不影響其它MHCII類基因的表達(dá)時(shí)將會(huì)特別有用。于是，同型特異化合物作為自身免疫疾病治療藥物使用時(shí)，就可能避免引起普遍的免疫抑制。一種化合物它能通過這兒描述的一個(gè)采用同型特異性CIITA的抑制測(cè)試并與那些同野生型CIITA和CIITA突變子不同同型特異性相比較而得到的結(jié)果鑒定的，例如，抑制依賴于野生型而非克隆13CIITA轉(zhuǎn)錄的化合物在對(duì)抑制MHCII類DR和DP基因中是有效的。因?yàn)镈R1和/或DR4的表達(dá)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎93％的病例有關(guān)，所以特異性抑制DR基因轉(zhuǎn)錄的化合物是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療法中一個(gè)有力的候選藥物。類似的，兩種CIITA的同型特異抑制劑能夠用來確定一個(gè)化合物是否是轉(zhuǎn)錄的同型特異抑制劑。例如，一種可比較的方法可用于第一個(gè)激活DR和DP轉(zhuǎn)錄的突變子，而第二個(gè)突變子只激活DP的轉(zhuǎn)錄。抑制第一個(gè)突變子活力而不抑制第二個(gè)突變子的化合物可用于選擇性抑制DR基因的表達(dá)?！癐I類轉(zhuǎn)錄激活基因(CIITA基因)”是指編碼轉(zhuǎn)錄激活子的基因，該基因80％或更多序列與圖1所示的CIITA序列相同(SEQIDNO1)。“CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域”指一種80％或更多序列與圖1所示CIITA多肽序列26-352氨基酸相同的多肽，不具有一個(gè)功能性CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域。“CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域”是指一種80％或更多序列與圖1所示CIITA多肽序列301-1130氨基酸相同的多肽，不具有功能性CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域一種突變子的例子是克隆13CIITA的相互作用結(jié)構(gòu)域，該DNA序列至少部分特征在于圖1所示野生型CIITA序列3211-3214核苷酸的缺失(這與以前描述過的(Steimle等，)cDNA序列3326-3329核苷酸相對(duì)應(yīng))從而產(chǎn)生一種相對(duì)于野生型為53個(gè)氨基酸截短的蛋白質(zhì)。應(yīng)該明白的是在此定義的CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和相互作用結(jié)構(gòu)域有51個(gè)氨基酸的重疊。然而重疊區(qū)域不足于形成一個(gè)有功能的轉(zhuǎn)錄激活或相互作用結(jié)構(gòu)域。于是，含有圖1所示26-352氨基酸而缺失353-1130氨基酸序列的多肽具有有功能的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域而缺失有功能的相互作用結(jié)構(gòu)域。類似的，含有圖1所示301-1130氨基酸而缺失1-300氨基酸序列的多肽具有功能的相互作用結(jié)構(gòu)域而缺失有功能的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域?！岸嚯摹笔侵溉魏伟被徭?，不用考慮長(zhǎng)度或轉(zhuǎn)錄后修飾(例如，糖基化或磷酸化)?！翱汕懈畹叵噙B”是指一種基因與調(diào)節(jié)序列如此相連以致在合適的分子(如，轉(zhuǎn)錄的激活子蛋白)與調(diào)節(jié)序列連接時(shí)可允許基因表達(dá)。“報(bào)告基因”指一種其表達(dá)可測(cè)試的基因；沒有限制，這類基因包括lacZ、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶(CAT)、β-葡糖苷酸酶(GUS)和蟲熒光素酶基因。“基本相同”是指一種多肽或核酸表現(xiàn)出至少50％，優(yōu)選為85％，更優(yōu)選為90％而最優(yōu)選為95％與參照氨基酸或核酸的同源性。對(duì)于多肽，對(duì)比序列的長(zhǎng)度一般至少為16個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少為20個(gè)氨基酸。更優(yōu)選地至少為25個(gè)氨基酸而最優(yōu)選至少為35個(gè)氨基酸。對(duì)核酸，對(duì)比序列的長(zhǎng)度一般至少為50核苷酸，優(yōu)選為至少60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為至少75個(gè)核苷酸而最優(yōu)選為110個(gè)核苷酸。序列相同性典型地是用序列分析軟件測(cè)定(例如，WI53705，麥迪遜1770大學(xué)街道，威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心，遺傳計(jì)算研究組的序列分析軟件包)。該軟件通過各種替換、缺失、替換和其它修飾形成同源性的程度來匹配相似的序列。保守替換典型地包括在以下各組內(nèi)替換甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬氨酰，谷氨酰；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸?！盎炯兓亩嚯摹敝笍奶烊话殡S成分中分離的多肽。典型地，多肽重量的60％不含與其天然相連的蛋白或天然存在的有機(jī)分子時(shí)該多肽基本純化。優(yōu)選的制劑至少為按重量計(jì)75％、更優(yōu)選為90％而最優(yōu)選為99％所需的蛋白質(zhì)。例如，從天然原料(如，人的細(xì)胞)中提?。槐磉_(dá)編碼CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域的重組核酸；或化學(xué)合成多肽可獲得基本純化的CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域。純度可用合適的方法(例，柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳和HPLC分析)測(cè)定。蛋白從其天然伴隨的污染物中分離出來時(shí)基本不含天然伴隨的成分。于是，化學(xué)合成、體外合成或在不同于其天然產(chǎn)生細(xì)胞的細(xì)胞體系中產(chǎn)生的蛋白基本上不含其天然伴隨的成分。因此，基本純凈的多肽包括那些源于真核細(xì)胞但在大腸桿菌或其它原核細(xì)胞中表達(dá)的多肽?！盎炯兓腄NA”指不含在本發(fā)明DNA來源的有機(jī)體天然存在基因組中處于該基因側(cè)翼的基因。所以該術(shù)語(yǔ)包括比如，連接入載體的重組DNA、或連接入一種自我復(fù)制的質(zhì)?；虿《?、或進(jìn)入一種原核或真核細(xì)胞基因組DNA(如，酵母細(xì)胞)；或作為一個(gè)單獨(dú)的分子(cDNA或一個(gè)基因組或PCR或限制性酶切片段產(chǎn)生的cDNA片段)獨(dú)立于其它序列存在。該術(shù)語(yǔ)還包括作為編碼額外多肽序列雜交基因部分的重組DNA。詳述首先說明附圖。圖1為全長(zhǎng)CIITA(見SEQIDNO1)的核酸和推測(cè)氨基酸序列。圖2是CIITA缺失突變子和用于鑒別CIITA轉(zhuǎn)錄激活或相互作用結(jié)構(gòu)域的體內(nèi)分析的圖解說明。轉(zhuǎn)錄分析的結(jié)果也總結(jié)于本圖。圖3是轉(zhuǎn)錄分析中用于鑒別CIITA轉(zhuǎn)錄激活或相互作用結(jié)構(gòu)域的酵母細(xì)胞的照片。圖4組方圖中的數(shù)據(jù)來自比色分析，用于測(cè)定lazC基因的轉(zhuǎn)錄從而鑒別CIITA的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和相互作用結(jié)構(gòu)域。圖5是質(zhì)粒pCMV.ciita的圖解。圖6A-E是一系列FACS圖譜，表明α-TDF/CIITA任何蛋白在克隆13細(xì)胞和RM3中的表達(dá)恢復(fù)MHCII類基因的表達(dá)。圖7是一系列FACS圖譜，表明野生型CIITA在克隆13細(xì)胞中的表達(dá)修正了DR和DP同型表達(dá)的缺陷而且增加了DQ的表達(dá)。圖8A-F是本文描述過的質(zhì)粒的圖解說明。CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域我們首次鑒別了CIITA的一個(gè)片段，該片段在CIITA蛋白區(qū)域部分缺失而存在另一種完整的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)時(shí)足以激活轉(zhuǎn)錄。我們稱該片段為CIITA的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。為了鑒別CIITA的這一結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建一系列質(zhì)粒(從載體pEG202)以產(chǎn)生融合蛋白，這些蛋白包含附著于大腸桿菌阻遏蛋白LexAN末端202氨基酸二聚化和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CIITA部分。構(gòu)建這些質(zhì)?；虮疚拿枋鲞^的其它質(zhì)粒的方法見以下的“質(zhì)粒的構(gòu)建”。每一個(gè)lexA-CIITA獨(dú)立地與一種lacZ報(bào)告質(zhì)粒(pSH18-34)共轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞EGY48株(his3-和ura3-)。這些質(zhì)粒在酵母中是由LexA-CIITA質(zhì)粒中HIS3質(zhì)粒的表達(dá)和pSH18-34中URA3的表達(dá)維持的。LexZ報(bào)告基因的調(diào)節(jié)序列在GAL1上游激活序列包括8個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。該實(shí)驗(yàn)分析中，LexA多肽作為一種DNA結(jié)合蛋白，使CIITA多肽接近轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)。缺乏LexA融合蛋白時(shí)，攜帶pSH18-34報(bào)告基因的酵母沒有從lacZ基因中產(chǎn)生可檢測(cè)的β-半乳糖苷酶而且在含X-gal培養(yǎng)基中呈現(xiàn)白色(圖3；pHRFM1，一個(gè)陰性對(duì)照)。此外，攜帶只表達(dá)LexAN末端202個(gè)氨基酸或一種已知沒有轉(zhuǎn)錄活性(pSH17-4)的融合蛋白的轉(zhuǎn)錄的酵母沒有產(chǎn)生可檢測(cè)的β-半乳糖苷酶。相反，含與CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(大約N末端29％)融合的LexA多肽的酵母株誘導(dǎo)合成足量的β-半乳糖苷酶，宿主酵母細(xì)胞在含X-gal培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍(lán)色。此外，測(cè)定含融合蛋白和鄰硝基苯基-β-半乳糖苷酶培養(yǎng)基的光密度進(jìn)行定量的比色分析(見圖4)(Ausubel等，In分子生物學(xué)動(dòng)態(tài)(CurrentProtocolinMolecularBiology)，J.Wiley&amp;Sons，1994)。我們的數(shù)據(jù)還表明包括CIITAN末端區(qū)域大約8％的多肽足以激活轉(zhuǎn)錄。CIITA的這一部分包含轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的酸性部分；如果需要，用N末端29％所做的實(shí)驗(yàn)可與用N末端8％所做的實(shí)驗(yàn)對(duì)比。包括CIITAN末端區(qū)域大約29％的多肽至少與全長(zhǎng)的CIITA一樣有效的激活轉(zhuǎn)錄。于是，CIITA全長(zhǎng)的氨基酸26-352和核苷酸78-1,056表示轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(這些數(shù)字涉及CIITA編碼序列，CIITAcDNA序列在核苷酸116處的起始(以下Steinle.等，))。用CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域鑒別自身免疫疾病治療藥物CIITA激活結(jié)構(gòu)域可用以鑒別抑制CIITA依賴轉(zhuǎn)錄的化合物。因?yàn)镃IITA為MHCII類基因激活所需，所以特異抑制CIITA依賴轉(zhuǎn)錄的化合物是有效的自身免疫疾病候選藥物。我們發(fā)現(xiàn)CIITA的一個(gè)片段(稱CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)在CIITA蛋白其余部分缺失而其它完整的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)存在時(shí)能夠激活轉(zhuǎn)錄，由此有利于鑒別抑制為CIITA激活的轉(zhuǎn)錄的化合物。有效的化合物因其抑制CIITA依賴轉(zhuǎn)錄的能力而可鑒別。因此，在任何使用CIITA激活結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄分析系統(tǒng)中可測(cè)試化合物對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制。下面的例子可用以鑒別抑制CIITA依賴的轉(zhuǎn)錄；該實(shí)驗(yàn)中鑒別出的化合物可作為自身免疫疾病候選藥物。其它的實(shí)驗(yàn)分析(如，Keegan等1986科學(xué)23699；Ma等，1987細(xì)胞48847；Lin等，1988，細(xì)胞54659；Sadowski等，1988，自然335563；Robert等，1993自然363741；Maetal.，以及1998，細(xì)胞55443等所記述過的)可改進(jìn)為用我們發(fā)現(xiàn)的CIITA轉(zhuǎn)錄激活域。CIITA轉(zhuǎn)錄激活域可簡(jiǎn)單地克隆入合適的載體，這樣其它的轉(zhuǎn)錄分析也包含于本發(fā)明中，其適用和范圍由以下的權(quán)利要求確定。實(shí)施例1鑒別抑制CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的化合物為了鑒別有效的化合物，宿主酵母株EGY48(his3-，ura3-和Leu-)用兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。第一個(gè)質(zhì)粒，pSH18-34攜帶GAL1TATA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和與lacZ基因可切割相連的GAL1編碼序列的一個(gè)片段(Zervos等，1993，細(xì)胞72223-232和Gyuris等，1993，細(xì)胞75；791-803)。該質(zhì)粒也為L(zhǎng)exA在GAL1上游激活序列處攜帶8個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而且它攜帶一個(gè)URA3選擇標(biāo)記。第二個(gè)質(zhì)粒，pEG.ciita.N29，源于質(zhì)粒pEG202而且攜帶編碼CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的序列。該質(zhì)粒也攜帶選擇標(biāo)記(HIS3)基因和LexA(氨基酸1-202)的DNA結(jié)合和二聚化結(jié)構(gòu)域。對(duì)照酵母株中，第二質(zhì)粒可以為pSH17-4(Gyuris等，1993，細(xì)胞75791-803)，它編碼與一個(gè)質(zhì)粒激活結(jié)構(gòu)域如pHRFM1或CDK2(Zervos等.，1993，細(xì)胞72223-232Gyuris等，1993，細(xì)胞75791-803)融合的LexA。雙重轉(zhuǎn)化酵母株的少量培養(yǎng)物與化合物混合用以在適宜的條件(如，30℃搖動(dòng)過夜)下于合適的培養(yǎng)基(如，SGR、-his，-ura，+X-gal(80mg/L))中篩選和培養(yǎng)。然后測(cè)定產(chǎn)生的藍(lán)色發(fā)色團(tuán)(例如，測(cè)定光密度或人工檢查培養(yǎng)基)。抑制測(cè)試質(zhì)粒(pEG.ciita，N29)而不抑制對(duì)照質(zhì)粒(pSH17-4)轉(zhuǎn)錄的激活的化合物可抑制MHCII類分子的表達(dá)，從而是自身免疫疾病有效的候選藥物。CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域以上的缺失分析也表明包括全長(zhǎng)CIITA氨基酸1-26和301-1130(核苷酸1-78和903-3390)的多肽單獨(dú)不能激活轉(zhuǎn)錄(圖1、2、3)。由于該結(jié)構(gòu)域在缺失轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(源于CIITA或其它轉(zhuǎn)錄激活子)時(shí)不能激活轉(zhuǎn)錄，可作出結(jié)論該結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合細(xì)胞轉(zhuǎn)錄器(如，一種聚合酶或一種DNA結(jié)合蛋白)的其它成分介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。因此，CIITA氨基酸301-1130(C末端74％)稱為CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域。盡管CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域單獨(dú)不能激活轉(zhuǎn)錄，但是抑制相互作用結(jié)構(gòu)域與其正常的細(xì)胞靶蛋白結(jié)合的化合物可有效的抑制CIITA的轉(zhuǎn)錄，因此也是潛在的自身免疫疾病治療藥物。CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域用于恢復(fù)MHCII類基因表達(dá)為了證實(shí)氨基酸301-1130包括了CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域，我們實(shí)驗(yàn)分析了在不能表達(dá)這些基因的突變細(xì)胞系中CIITA的這一區(qū)域恢復(fù)MHCII類基因表達(dá)的能力。這些研究中，我們用質(zhì)粒pCMV.ciita(圖5)構(gòu)建了一個(gè)質(zhì)粒pCMV.αTDF-CIITA.C70，它在CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域和單純皰疹病毒株F的α-誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生一個(gè)融合蛋白。作為陰性對(duì)照，產(chǎn)生一個(gè)缺失CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒pCMV.CIITA.C74。第二個(gè)陰性對(duì)照使用在缺失相互作用結(jié)構(gòu)域時(shí)編碼CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的pCMV.ciitaHindIII。作為轉(zhuǎn)染效率的對(duì)照，用pCMV/Kb轉(zhuǎn)染細(xì)胞。作為陽(yáng)性對(duì)照，用編碼全長(zhǎng)CIITA的pCMV.ciita轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些細(xì)胞獨(dú)立地轉(zhuǎn)染入人B細(xì)胞。一個(gè)B細(xì)胞系RM3缺乏DR、DP和DQ的表達(dá)。第二個(gè)B細(xì)胞系克隆B、DR和DP的表達(dá)缺陷，但不包括DQ。第三個(gè)細(xì)胞系Raji表達(dá)三個(gè)MHCII類基因的野生型水平。以DR(LB3.1)、DQ(SPV.L3，相當(dāng)于Genox.53)、DP(B7/21)、I類分子(W6/32)或Kb(Y-3)的抗體用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)每個(gè)細(xì)胞系中細(xì)胞染色，然后用熒光激活細(xì)胞分選(圖6FACS)進(jìn)行分析。這些數(shù)據(jù)表示哺乳類B細(xì)胞中α-TDF/CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)恢復(fù)突變細(xì)胞系表面MHCII類基因的表達(dá)。于是，CIITA的氨基酸(301-1130)可發(fā)揮相互作用結(jié)構(gòu)域的作用。實(shí)施例2相互作用抑制劑化合物的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以上描述過的方法改進(jìn)后可提供一個(gè)測(cè)定化合物是否抑制CIITA依賴的轉(zhuǎn)錄的方法。該方法中，待試化合物只是簡(jiǎn)單地加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基中。抑制α-TDF/CIITA融合蛋白恢復(fù)細(xì)胞表面MHCII類分子表達(dá)的化合物是潛在自身免疫疾病治療藥物。該方法也可鑒別轉(zhuǎn)錄的同型特異抑制劑。例如，導(dǎo)致α-TDF/CIITA融合蛋白只恢復(fù)MHCII類基因的一種亞類的化合物是同型特異抑制劑。因?yàn)檫@樣的化合物可選擇性地抑制MHCII類基因轉(zhuǎn)錄，所以是特別有價(jià)值的自身免疫疾病藥物。以上描述的細(xì)胞為基礎(chǔ)的測(cè)試可單獨(dú)使用或與以下描述的用兩種融合蛋白所做的測(cè)試聯(lián)合使用。CIITA相互作用靶蛋白其它的測(cè)定中，抑制CIITA依賴的轉(zhuǎn)錄的化合物也可因其在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)器中抑制CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶蛋白的能力而得以鑒別?，F(xiàn)在我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CIITA氨基酸301-1130的功能是通過其在細(xì)胞中結(jié)合其它的蛋白(在此指靶蛋白)來介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，用廣泛使用的相互作用捕獲克隆可方便快捷地克隆出CIITA靶蛋白。如以下所要說明的，相互作用捕獲克隆改進(jìn)后可用以鑒別抑制CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域結(jié)合其靶蛋白的化合物；這種化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。簡(jiǎn)單地說，相互作用捕獲克隆是用一個(gè)蛋白的相互作用結(jié)構(gòu)域和第二個(gè)蛋白激活結(jié)構(gòu)域方便快捷地鑒別相互作用結(jié)構(gòu)域所聯(lián)的一個(gè)靶蛋白。靶蛋白使相互作用結(jié)構(gòu)域能夠介導(dǎo)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄可用以下的方法鑒定。用該系統(tǒng)以及我們發(fā)現(xiàn)的相互作用結(jié)構(gòu)域可快捷地克隆出CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域的靶蛋白。下面是關(guān)于CIITA靶蛋白克隆和用CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域鑒別潛在自身免疫疾病治療藥物的說明。實(shí)施例3克隆CIITA相互作用靶蛋白為了克隆CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域的靶蛋白，用編碼第一個(gè)融合蛋白的第一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如，EGY48株酵母細(xì)胞)。第一個(gè)融合蛋白包括與一種沒有CIITA激活結(jié)構(gòu)域的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域融合的DNA結(jié)合蛋白(如，LexAN末端202個(gè)氨基酸)。酵母細(xì)胞還攜帶一個(gè)報(bào)告基因(lacZ、CAT、GUS、人生長(zhǎng)激素、堿性磷酸酶或蟲熒光素酶基因)，后者與第一個(gè)融合蛋白結(jié)合的調(diào)節(jié)序列可操作地相連。報(bào)告基因可能在一個(gè)質(zhì)粒或染色體上。此外，用編碼第二個(gè)融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。第二個(gè)融合蛋白包括與待試多肽融合的一個(gè)蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如，B42酸性激活結(jié)構(gòu)域(Ma等，1988，細(xì)胞55443-446))，該多肽按下述方法測(cè)試其介導(dǎo)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的能力。允許報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的多肽為CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域的靶蛋白。編碼潛在靶蛋白的DNA分子可從文庫(kù)(例如從人Burkitt氏B淋巴細(xì)胞，Raji所獲的poly-A+RNA制備的cDNA文庫(kù))中獲得。對(duì)照測(cè)試中，CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域可由其它蛋白(例如，pHRFM1或CDK2(以下的Zervos和Gyuris))的相互作用結(jié)構(gòu)域代替。實(shí)施例4用CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域鑒別自身免疫疾病治療藥物通過干擾CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域而抑制轉(zhuǎn)錄的化合物可通過測(cè)試其抑制CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域與靶蛋白結(jié)合的能力得以鑒別。任何測(cè)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的方法可用于鑒別加入后抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的化合物。例如，基于ELISA、Southwestern雜交，濾紙和膜結(jié)合蛋白以及固定化蛋白的鑒定均可用于測(cè)定對(duì)CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域和其靶蛋白結(jié)合的抑制。以下一種方法的詳例用于識(shí)別抑制CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域功能，從而是潛在自身免疫疾病治療藥物的化合物。一種優(yōu)選的方法中，編碼第一個(gè)融合蛋白的第一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如，EGY48株的酵母細(xì)胞)。第一個(gè)融合蛋白包括與一個(gè)沒有CIITA激活結(jié)構(gòu)域的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域融合的DNA結(jié)合蛋白(如，LexAN末端202個(gè)氨基酸)。酵母細(xì)胞還攜帶一種報(bào)告基因(lacZ、CAT、GUS、人生長(zhǎng)激素、堿性磷酸酶或蟲熒光素酶基因)，后者與第一個(gè)融合蛋白結(jié)合的調(diào)節(jié)序列可操作地相連。報(bào)告基因可能在質(zhì)?；蛉旧w上。此外，用編碼第二個(gè)融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。第二個(gè)融合蛋白包括與CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域的靶蛋白融合的一種蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如，B42)。有效的化合物可由其抑制報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的能力而鑒別。轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)物與待試化合物混合并在適宜的條件(如，30℃搖動(dòng)過夜)下于維持質(zhì)粒表達(dá)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。然后測(cè)定基因表達(dá)的水平。例如，如果LacZ用作報(bào)告基因可測(cè)定X-gal存在時(shí)藍(lán)色發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生的數(shù)量(例如測(cè)定光密度或人工檢查細(xì)胞培養(yǎng)基的顏色)。測(cè)試中用CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域而非對(duì)照相互作用結(jié)構(gòu)域抑制轉(zhuǎn)錄激活的化合物能夠抑制MHCII類分子的表達(dá)，所以是自身免疫疾病有力的候選藥物。這種鑒定可獨(dú)立或與實(shí)施例2中基于細(xì)胞的測(cè)定聯(lián)合使用。CIITA克隆13突變子鑒別在改變蛋白激活某一MHCII類同型抗原轉(zhuǎn)錄能力的CIITA中我們鑒別了一種突變子。該突變子稱為克隆13CIITA，存在于人B細(xì)胞Jijoye(由麻省哈佛大學(xué)L.Glimcher惠贈(zèng))來源的克隆13細(xì)胞系中。克隆13CIITA在MHCII基因DR和DP同型抗原的轉(zhuǎn)錄中活力低下但在DQ中卻并非如此。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)野生型CIITA基因在克隆13中的表達(dá)能夠使細(xì)胞轉(zhuǎn)錄DR和DP同型抗原。這些研究中，CIITA基因克隆入載體pCMV，產(chǎn)生載體pCMV.ciita(圖5)，然后通過電穿孔轉(zhuǎn)染克隆13細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用FACS分析DR和DP同型的表達(dá)(圖7)。作為對(duì)照，以同樣的方法檢測(cè)Raji細(xì)胞(它表達(dá)DR、DP和DQ)和未轉(zhuǎn)化的克隆13細(xì)胞。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以抗體給細(xì)胞染色。除了用抗DR(LB3.1；自Becton-Dickinson的L243抗體亦可用)、抗DQ(Genox.53；ATCC#HB103)或抗DP(B7/21；Becton-Dickinson)抗體之外，也用抗I類抗體(W6/32；陽(yáng)性對(duì)照，ATCC#HB95)和抗Kb抗體(Y-3；陰性對(duì)照。ATCC#HB95)給細(xì)胞染色。參看圖7，用抗DP、抗DR或抗DQ的抗體染色時(shí)CIITA在克隆13細(xì)胞中的表達(dá)增加了這些細(xì)胞的相對(duì)熒光。于是，野生型CIITA在克隆13細(xì)胞中的表達(dá)糾正了克隆13突變CIITA的缺陷。實(shí)施例5同型特異化合物的鑒別克隆13突變CIITA的相互作用結(jié)構(gòu)域可用在實(shí)施例4描述的方法以鑒別為CIITA依賴性轉(zhuǎn)錄同型特異抑制劑的化合物。如果需要，克隆13CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或全長(zhǎng)多肽可用于其它方法中以鑒別有效的化合物。抑制野生型CIITA而非克隆13突變CIITA的CIITA依賴轉(zhuǎn)錄的化合物對(duì)抑制DR和DPMHCII類同型抗原的表達(dá)有效，但不抑制DQ的表達(dá)。這種化合物為同型特異性而且可用于參與抑制某一免疫應(yīng)答的特殊基因的表達(dá)而不引起普遍的免疫抑制。因?yàn)楹芏嘧陨砻庖呒膊∪珙愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(參考表1和表2)與特定的同型相關(guān)，可抑制MHCII類基因的亞類表達(dá)的化合物對(duì)選擇性影響免疫系統(tǒng)特別有價(jià)值。其它的實(shí)施方案其它的實(shí)施方案在以下的權(quán)利要求中。例如，克隆13CIITA以外的同型特異性CIITA突變子激活和相互作用結(jié)構(gòu)域也包含在本發(fā)明中。同型特異性CIITA突變子可用上面克隆13CIITA所描述過的方法鑒別。MHCII類基因的一種亞類表達(dá)缺陷的細(xì)胞系是同型特異CIITA蛋白的潛在來源。含同型特異CIITA的細(xì)胞系可由潛在細(xì)胞系中野生型CIITA的表達(dá)和CIITA的表達(dá)是否糾正MHCII類基因表達(dá)的缺陷來鑒別。突變CIITA基因可用克隆13中所用的技術(shù)克隆。于是，實(shí)施例5中提示的方法對(duì)分離其它同型特異CIITA突變子仍然有效，該突變子可用于確定化合物是否是轉(zhuǎn)錄的同型特異抑制劑。另外的測(cè)試CIITA依賴的轉(zhuǎn)錄的方法也包含在本發(fā)明中。例如，以前描述過的轉(zhuǎn)錄測(cè)試(例如，參看Keegan等，1986，科學(xué)23699；Ma等，1987細(xì)胞48847；Lin等，1988，細(xì)胞54659；Sadowski等，1988，自然335563；Roberts等，1993，自然363741；和Ma等，1988，細(xì)胞55443)用合適的CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域替代物，簡(jiǎn)單地將化合物加入測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，可鑒定有效的化合物。此外，以上描述的測(cè)定的改進(jìn)可用于本發(fā)明中。例如，其它的DNA結(jié)合蛋白如GAL4可代替LexA。報(bào)告基因，如氯霉素?；D(zhuǎn)移酶(CAT)、熒光素酶β-葡糖苷酸酶(GUS)、人生長(zhǎng)激素、堿性磷酸酶或任何其表達(dá)可鑒定的基因均可代替lacZ基因。非酵母的宿主細(xì)胞也可使用。例如可用原核或其它真核細(xì)胞(如細(xì)菌，哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞)測(cè)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法如基于ELISA、Southerstern雜交、濾紙和膜結(jié)合的蛋白和固定化蛋白的測(cè)試均可用于鑒別抑制CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域和其靶蛋白結(jié)合的化合物。顯而易見，標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)使人們能夠?qū)IITA相互作用結(jié)構(gòu)域用于其它蛋白質(zhì)相互作用的測(cè)定。質(zhì)粒構(gòu)建原始的CIITA模板是由HLAII類陽(yáng)性B細(xì)胞系Raji提取的polyA+RNA通過RT-PCR獲得。然后將PCR產(chǎn)物直接克隆入PCRII(Invitrogen)。所獲的克隆中，三個(gè)(pCRII.ciita.b，pCRII.ciita.h和pCRII.ciita.p)用于產(chǎn)生一個(gè)完整的cDNA真核表達(dá)構(gòu)建物(參看圖5和8)。pCRII.ciita.b用于該構(gòu)建物的CIITA特異性PCR引物5’末端為5’-GGAAGCTGAGGGCACGAGGA-3’而3’末端為3’-CAGAAGAGACAGGGGACGGTAAC-5’。pCRII.ciita.h用于該構(gòu)建物的CIITA特異性PCR引物5’末端為5’-CTCCAACAAGCTTCCAAAATG-3’而3’末端為3’-GTACAAGAGACTCCTGTGATTG-5’。pCRII.ciita.p用于該構(gòu)建物的CIITA特異性PCR引物5’末端的為5’-GTCCCTGAAGGATGTGGAAGAC-3’而3’末端為3’-GTCTGACCTTCGTGTCGAAG-5’。pCMV.ciita該構(gòu)建物以pLB-1為載體以pCRII.ciita.b、pCRII.ciita.和pCRII.ciita.p為插入片段通過多步亞克隆而得。首先，由HindII酶切pLB-1和T4聚合酶處理制備載體DNA，然后NotI活化消化；5’CIITADNA插入片段由pCRII構(gòu)建物中PCR插入片段側(cè)翼的EcoRI位點(diǎn)酶切pCRII.ciita.b，凝膠純化較小的片段，T4聚合酶處理后NotI活化消化(NotI在CIIT序列的核苷酸1340處)。這兩個(gè)片段由T4連接酶連接，所產(chǎn)生的pCMV.ciita亞構(gòu)建物稱為pCMV.ciita.b。BamHI消化pCMV.ciita.b，凝膠純化較小的片段，T4聚合酶鈍化，然后為NotI消化活化；類似的，pCRII.ciita.p為EcoRI酶切、T4聚合酶鈍化、然后NotI活化消化。較小的片段凝膠純化后使用。載體和插入片段以T4連接酶連接，由此產(chǎn)生的pCMV.ciita的第二個(gè)亞構(gòu)建物稱pCMV.ciita.bp。pCMV.ciita.bp進(jìn)一步用BamHI和NotI消化；pCRII.citta.h也用BamHI和NotI消化，凝膠純化較小的片段。T4連接酶連接兩個(gè)較小的片段，所得的含CIITAcDNA序列(核苷酸48-4471)的構(gòu)建物稱為pCMV.ciita.bp。pCMV.CIITApCMV.ciita構(gòu)建后并確證其恢復(fù)HLAII類一般表達(dá)(通過轉(zhuǎn)染HLAII類陰性細(xì)胞系(RM3和克隆13)和FACS分析)的生物學(xué)功能之后制備了該構(gòu)建物。CIITAcDNA構(gòu)建物pKS/CIITA(+)(自瑞士日內(nèi)瓦，日內(nèi)瓦大學(xué)B.Mach博士)也在這些實(shí)驗(yàn)中使用。該質(zhì)粒中，載體為pBluescriptKS(+)(Stratagene)，cDNA插入多克隆位點(diǎn)的SalI位點(diǎn)。為了構(gòu)建pCMV.CIITA，pCMV用XhoI和NheI消化，用酶切位點(diǎn)在cDNA插入片段側(cè)翼的XhoI和SpeI酶切pKS/CIITA獲得CIITAcDNA酶切片段。兩個(gè)片段用T4連接酶連接，所得的構(gòu)建物稱為pCMV.CIITA(大寫字母表示DNA來源為原始cDNA文庫(kù))。pEG.CIITA用pED.CIITA.SalI和pTrc.CIITA制備該質(zhì)粒。BamHI消化pED.CIITA.SalI而且凝膠純化大片段；BamHI消化pTrc.CIITA獲得CIITA序列，載體和插入片段應(yīng)T4連接酶連接。pED.CIITA.SalIpEG202首先用SalI線性化并用CIP脫磷酸化；SalI消化pCMV.CIITA獲得CIITAcDNA；載體和插入片段連接，所得的帶CIITAcDNA插入片段的中間pEG構(gòu)建物稱為pED.CIITA.SalI.pTrc.ciita該構(gòu)建物最初產(chǎn)生于重組CIITA蛋白的過表達(dá)。首先將5’CIITA序列克隆(用PCR，如以下pEG.ciita.N29構(gòu)建的途徑)入pTrcHisC(Invitrogen)的BamHI的位點(diǎn)和XhoI位點(diǎn)。所得的質(zhì)粒pTrc5或pTrc/ciita5用XhoI線性化、T4聚合酶鈍化并且用DraIII活化；CIITA下游3790bp由ScaI和DraIII消化pCMV.ciita、并且連接兩個(gè)片段而得。pEG.ciita.N29設(shè)計(jì)一對(duì)引物用以在LexAN末端第202個(gè)密碼子處將CIITAN末端29％按閱讀框融合入pEG202。5’反向引物的序列為AATGGATCcgttgcctggctcca(大寫字母表示標(biāo)記的序列包括一個(gè)以閱讀框克隆的BamHI位點(diǎn))3’正向引物為CCGCTCGAGcggcaccatacgtgt(標(biāo)記的序列包括一個(gè)XhoI位點(diǎn))。這些引物在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中以全長(zhǎng)的CIITAcDNA模板產(chǎn)生一個(gè)1060bp片段。PCR反應(yīng)為95℃5分鐘、55℃5分鐘72℃3分鐘循環(huán)三次，隨后95℃1分鐘、60℃2分鐘、72℃1分鐘循環(huán)30次。產(chǎn)生的DNA片段用BamHI和XhoI循環(huán)后，克隆入pEG202載體相應(yīng)的BamHI和XhoI的位點(diǎn)。終止密碼子由pEG202XhoI位點(diǎn)后的載體序列提供。pCMV和pLB-1pCMV是由pREP7(InVitrogen)產(chǎn)生的一個(gè)EBV過表達(dá)載體；過程為用SalI部分消化Klenow酶鈍化后將以后BglII連接子插入第二個(gè)SalI位點(diǎn)(nt.1091)；HindIII和BglII雙酶切消化；最后與pCDM8(Invitrogen)SpeI消化Klenow酶鈍化；BglII連接子插入；以及HinlIII和BglI消化并凝膠純化而。制備的CMV啟動(dòng)子片段連接。用于制備第一個(gè)ciita(小寫字母表示構(gòu)建物為PCR衍生產(chǎn)物)亞構(gòu)建物的載體為pLB-1，它是通過在HindIII和NotI位點(diǎn)之間插入約1kb填充DNA以助于HindIII/NotI的雙重消化而從pCMV中衍生而來。pEG.CIITA.C74用BamIII使pEG202線性化，T4聚合酶鈍化、SalI活化；插入片段通過SphI消化pCMV.CIITA，T4聚合酶鈍化，SalI活化制備；然后連接兩個(gè)片段。pEG.CIITA.C50用EcoRI使pEG202線性化，T4聚合酶鈍化、SalI活化；插入片段通過NcoI消化pCMV.CIITA，T4聚合酶鈍化，SalI活化制備；然后連接兩個(gè)片段.pEG.CIITa.C30用BamHI使pEG202線性化，T4聚合酶鈍化、SalI活化；插入片段通過kpnI消化pCMV.CIITA，T4聚合酶鈍化，SalI活化制備；然后連接兩個(gè)片段.pEG.CIITA.C14用BamHI完全酶切、稀釋和連接pEG.ciita。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離含ORFN-14％的重環(huán)化缺失構(gòu)建物。pEG.ciita.N70用XhoI使pEG202線性化，T4聚合酶鈍化、BamHI活化；插入片段通過KpnI消化pET.ciiTA，T4聚合酶鈍化，BamHII活化制備；然后連接兩個(gè)片段。CIITA的過表達(dá)構(gòu)建物pET.ciiTA如pEG.ciiTA(以上)的構(gòu)建一樣，將CIITA的開放閱讀框克隆入pET28c(Novagen)。pEG.ciita.N56用XhoI使pEG202線性化，T4聚合酶鈍化、BamHI活化；插入片段通過SfiI消化pET.ciiTATA，T4聚合酶鈍化，BamHI活化制備；然后連接兩個(gè)片段。pEG.ciita.N22用BanI消化pTrc5的含ciita的NheI/XhoI片段、T4聚合酶鈍化、用BamHI酶切獲得插入片段。用XhoI線性化pEG202、T4聚合酶鈍化、最后用BamHI酶切獲得載體。然后連接制備的插入片段和載體。pEG.ciita.N17用EaeI消化pTrc5的小NheI/XhoI片段、T4聚合酶鈍化、用BamHI酶切獲得插入片段。用XhoI線性化pEG202、T4聚合酶鈍化、最后用BamHI酶切獲得載體。然后連接制備的插入片段和載體。pEG.ciita.N12用MspI消化pTrc5的小NheI/XhoI片段、T4聚合酶鈍化、用BamHI酶切而獲得插入片段。用SalI線性化pEG202、T4聚合酶鈍化、最后用BamHI酶切獲得載體。然后按閱讀框連接制備的插入片段和載體。pEG.ciita.N7.6用EcoNI消化pTrc5的小NheI/XhoI片段、T4聚合酶鈍化、用BamHI酶切獲得插入片段。用XhoI線性化pEG202、T4聚合酶鈍化、最后用BamHI酶切獲得載體。然后連接制備的插入片段和載體。pEG.C-αTDF插入HSV-1F株α-轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(transducingfactor)C未端16％Pelltt等，1985，PNAS825870-5874；登記號(hào)k033501到pEG202。pEG.C’-αTDF插入HSV-1F株α誘導(dǎo)因子C末端16％(除了最C末端的3個(gè)密碼子)。這一構(gòu)建物的插入片段后來用于構(gòu)建pCMV.αTDF-CIITA.C70。pCMV.ciita＾HindIII該構(gòu)建物包括CIITAN末端的29％的ORF，由HindIII消化pCMV.ciita、純化主要譜帶和重環(huán)化制得。pCMV.CIITA.C74該構(gòu)建物包括N末端25個(gè)密碼子和CIITA大約74％的C末端ORF，由多步亞克隆產(chǎn)生。首先，NcoI酶切pKS/CIITA(+)、T4聚合酶鈍化、然后XhoI酶切作為載體。類似的，它為SphI酶切，T4聚合酶鈍化然后用XhoI酶切作為插入片段。兩個(gè)片段以T4聚合酶連接，產(chǎn)生所構(gòu)建物稱為pKS.CIITA＾N/S。為了產(chǎn)生pCMV.CIITA.C74，pKS.CIITA＾N/S用SpeI和XhoI酶切，然后將含CIITA片段插入NheI/XhoI酶切的pCMV載體中。pCMV.αTDF-CIITA.C70這是由多步亞克隆產(chǎn)生的。首先，pKS/CIITA(+)用Tth111I酶切、T4聚合酶鈍化、然后用T4連接酶連接。該中間構(gòu)建物稱pKS/CIITA.＾Tth。然后以NcoI和AatII酶切之、T4聚合酶鈍化、與編碼HSV1(F株)α誘導(dǎo)因子C末端(除了最C端3個(gè)密碼子)按閱讀框連接。第二個(gè)中間載體稱pKS/αTDF-CIITA.＾Tth。含NotI片段的5’αTDF-CIITA用于置換pKS/CIITA(+)相應(yīng)的5’NotI片段。該第三中間構(gòu)建物稱為pKS/αTDF-CIITA.70。為了產(chǎn)生pCMV.αTDF-CIITA，pKS/αTDF-CIITA用SpeI和XhoI酶切。然后將含αTDF-CIITA片段插入NheI/XhoI酶切的pCMV片段。序列表(1)概況(i)申請(qǐng)人Glimcher，LaurieH.Zhou，HongDouhanIII，John(ii)發(fā)明標(biāo)題鑒別對(duì)治療自身免疫疾病有效的化合物的方法(iii)序列數(shù)1(iv)聯(lián)系地址(A)地址Fish&amp;Richardson(B)街道225FranklinStreet(C)城市波士頓(D)州馬薩諸塞(E)國(guó)家美國(guó)(F)區(qū)號(hào)02110-2804(v)計(jì)算機(jī)可讀方式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，版本#1.30B(vi)當(dāng)前申請(qǐng)材料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日期(C)分類(viii)委托/代理人信息(A)姓名Freeman，JohnW.(B)注冊(cè)號(hào)29,066(C)參考/存檔號(hào)00264/188001(2)SEQIDNo1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3393堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)定位1..3393(xi)序列描述SEQIDNo1ATGCGTTGCCTGGCTCCACGCCCTGCTGGGTCCTACCTGTCAGAGCCC48MetArgCysLeuAlaProArgProAlaGlySerTyrLeuSerGluPro151015CAAGGCAGCTCACAGTGTGCCACCATGGAGTTGGGGCCCCTAGAAGGT96GlnGlySerSerGlnCysAlaThrMetGluLeuGlyProLeuGluGly202530GGCTACCTGGAGCTTCTTAACAGCGATGCTGACCCCCTGTGCCTCTAC144GlyTyrLeuGluLeuLeuAsnSerAspAlaAspProLeuCysLeuTyr354045CACTTCTATGACCAGATGGACCTGGCTGGAGAAGAAGAGATTGAGCTC192HisPheTyrAspGlnMetAspLeuAlaGlyGluGluGluIleGluLeu505560TACTCAGAACCCGACACAGACACCATCAACTGCGACCAGTTCAGCAGG240TyrSerGluProAspThrAspThrIleAsnCysAspGlnPheSerArg65707580CTGTTGTGTGACATGGAAGGTGATGAAGAGACCAGGGAGGCTTATGCC288LeuLeuCysAspMetGluGlyAspGluGluThrArgGluAlaTyrAla859095AATATCGCGGAACTGGACCAGTATGTCTTCCAGGACTCCCAGCTGGAG336AsnIleAlaGluLeuAspGlnTyrValPheGlnAspSerGlnLeuGlu100105110GGCCTGAGCAAGGACATTTTCAAGCACATAGGACCAGATGAAGTGATC384GlyLeuSerLysAspIlePheLysHisIleGlyProAspGluValIle115120125GGTGAGAGTATGGAGATGCCAGCAGAAGTTGGGCAGAAAAGTCAGAAA432GlyGluSerMetGluMetProAlaGluValGlyGlnLysSerGlnLys130135140AGACCCTTCCCAGAGGAGCTTCCGGCAGACCTGAAGCACTGGAAGCCA480ArgProPheProGluGluLeuProAlaAspLeuLysHisTrpLysPro145150155160GCTGAGCCCCCCACTGTGGTGACTGGCAGTCTCCTAGTGGGACCAGTG528AlaGluProProThrValValThrGlySerLeuLeuValGlyProVal165170175AGCGACTGCTCCACCCTGCCCTGCCTGCCACTGCCTGCGCTGTTCAAC576SerAspCysSerThrLeuProCysLeuProLeuProAlaLeuPheAsn180185190CAGGAGCCAGCCTCCGGCCAGATGCGCCTGGAGAAAACCGACCAGATT624GlnGluProAlaSerGlyGlnMetArgLeuGluLysThrAspGlnIle195200205CCCATGCCTTTCTCCAGTTCCTCGTTGAGCTGCCTGAATCTCCCTGAG672ProMetProPheSerSerSerSerLeuSerCysLeuAsnLeuProGlu210215220GGACCCATCCAGTTTGTCCCCACCATCTCCACTCTGCCCCATGGGCTC720GlyProIleGlnPheValProThrIleSerThrLeuProHisGlyLeu225230235240TGGCAAATCTCTGAGGCTGGAACAGGGGTCTCCAGTATATTCATCTAC768TrpGlnIleSerGluAlaGlyThrGlyValSerSerIlePheIleTyr245250255CATGGTGAGGTGCCCCAGGCCAGCCAAGTACCCCCTCCCAGTGGATTC816HisGlyGluValProGlnAlaSerGlnValProProProSerGlyPhe260265270ACTGTCCACGGCCTCCCAACATCTCCAGACCGGCCAGGCTCCACCAGC864ThrValHisGlyLeuProThrSerProAspArgProGlySerThrSer275280285CCCTTCGCTCCATCAGCCACTGACCTGCCCAGCATGCCTGAACCTGCC912ProPheAlaProSerAlaThrAspLeuProSerMetProGluProAla290295300CTGACCTCCCGAGCAAACATGACAGAGCACAAGACGTCCCCCACCCAA960LeuThrSerArgAlaAsnMetThrGluHisLysThrSerProThrGln305310315320TGCCCGGCAGCTGGAGAGGTCTCCAACAAGCTTCCAAAATGGCCTGAG1008CysProAlaAlaGlyGluValSerAsnLysLeuProLysTrpProGlu325330335CCGGTGGAGCAGTTCTACCGCTCACTGCAGGACACGTATGGTGCCGAG1056ProValGluGlnPheTyrArgSerLeuGlnAspThrTyrGlyAlaGlu340345350CCCGCAGGCCCGGATGGCATCCTAGTGGAGGTGGATCTGGTGCAGGCC1104ProAlaGlyProAspGlyIleLeuValGluValAspLeuValGlnAla355360365AGGCTGGAGAGGAGCAGCAGCAAGAGCCTGGAGCGGGAACTGGCCACC1152ArgLeuGluArgSerSerSerLysSerLeuGluArgGluLeuAlaThr370375380CCGGACTGGGCAGAACGGCAGCTGGCCCAAGGAGGCCTGGCTGAGGTG1200ProAspTrpAlaGluArgGlnLeuAlaGlnGlyGlyLeuAlaGluVal385390395400CTGTTGGCTGCCAAGGAGCACCGGCGGCCGCGTGAGACACGAGTGATT1248LeuLeuAlaAlaLysGluHisArgArgProArgGluThrArgValIle405410415GCTGTGCTGGGCAAAGCTGGTCAGGGCAAGAGCTATTGGGCTGGGGCA1296AlaValLeuGlyLysAlaGlyGlnGlyLysSerTyrTrpAlaGlyAla420425430GTGAGCCGGGCCTGGGCTTGTGGCCGGCTTCCCCAGTACGACTTTGTC1344ValSerArgAlaTrpAlaCysGlyArgLeuProGlnTyrAspPheVal435440445TTCTCTGTCCCCTGCCATTGCTTGAACCGTCCGGGGGATGCCTATGGC1392PheSerValProCysHisCysLeuAsnArgProGlyAspAlaTyrGly450455460CTGCAGGATCTGCTCTTCTCCCTGGGCCCACAGCCACTCGTGGCGGCC1440LeuGlnAspLeuLeuPheSerLeuGlyProGlnProLeuValAlaAla465470475480GATGAGGTTTTCAGCCACATCTTGAAGAGACCTGACCGCGTTCTGCTC1488AspGluValPheSerHisIleLeuLysArgProAspArgValLeuLeu485490495ATCCTAGACGCCTTCGAGGAGCTGGAAGCGCAAGATGGCTTCCTGCAC1536IleLeuAspAlaPheGluGluLeuGluAlaGlnAspGlyPheLeuHis500505510AGCACGTGCGGACCGGCACCGGCGGAGCCCTGCTCCCTCCGGGGGCTG1584SerThrCysGlyProAlaProAlaGluProCysSerLeuArgGlyLeu515520525CTGGCCGGCCTTTTCCAGAAGAAGCTGCTCCGAGGTTGCACCCTCCTC1632LeuAlaGlyLeuPheGlnLysLysLeuLeuArgGlyCysThrLeuLeu530535540CTCACAGCCCGGCCCCGGGGCCGCCTGGTCCAGAGCCTGAGCAAGGCC1680LeuThrAlaArgProArgGlyArgLeuValGlnSerLeuSerLysAla545550555560GACGCCCTATTTGAGCTGTCCGGCTTCTCCATGGAGCAGGCCCAGGCA1728AspAlaLeuPheGluLeuSerGlyPheSerMetGluGlnAlaGlnAla565570575TACGTGATGCGCTACTTTGAGAGCTCAGGGATGACAGAGCACCAAGAC1776TyrValMetArgTyrPheGluSerSerGlyMetThrGluHisGlnAsp580585590AGAGCCCTGACGCTCCTCCGGGACCGGCCACTTCTTCTCAGTCACAGC1824ArgAlaLeuThrLeuLeuArgAspArgProLeuLeuLeuSerHisSer595600605CACAGCCCTACTTTGTGCCGGGCAGTGTGCCAGCTCTCAGAGGCCCTG1872HisSerProThrLeuCysArgAlaValCysGlnLeuSerGluAlaLeu610615620CTGGAGCTTGGGGAGGACGCCAAGCTGCCCTCCACGCTCACGGGACTC1920LeuGluLeuGlyGluAspAlaLysLeuProSerThrLeuThrGlyLeu625630635640TATGTCGGCCTGCTGGGCCGTGCAGCCCTCGACAGCCCCCCCGGGGCC1968TyrValGlyLeuLeuGlyArgAlaAlaLeuAspSerProProGlyAla645650655CTGGCAGAGCTGGCCAAGCTGGCCTGGGAGCTGGGCCGCAGACATCAA2016LeuAlaGluLeuAlaLysLeuAlaTrpGluLeuGlyArgArgHisGln660665670AGTACCCTACAGGAGGACCAGTTCCCATCCGCAGACGTGAGGACCTGG2064SerThrLeuGlnGluAspGlnPheProSerAlaAspValArgThrTrp675680685GCGATGGCCAAAGGCTTAGTCCAACACCCACCGCGGGCCGCAGAGTCC2112AlaMetAlaLysGlyLeuValGlnHisProProArgAlaAlaGluSer690695700GAGCTGGCCTTCCCCAGCTTCCTCCTGCAATGCTTCCTGGGGGCCCTG2160GluLeuAlaPheProSerPheLeuLeuGlnCysPheLeuGlyAlaLeu705710715720TGGCTGGCTCTGAGTGGCGAAATCAAGGACAAGGAGCTCCCGCAGTAC2208TrpLeuAlaLeuSerGlyGluIleLysAspLysGluLeuProGlnTyr725730735CTAGCATTGACCCCAAGGAAGAAGAGGCCCTATGACAACTGGCTGGAG2256LeuAlaLeuThrProArgLysLysArgProTyrAspAsnTrpLeuGlu740745750GGCGTGCCACGCTTTCTGGCTGGGCTGATCTTCCAGCCTCCCGCCCGC2304GlyValProArgPheLeuAlaGlyLeuIlePheGlnProProAlaArg755760765TGCCTGGGAGCCCTACTCGGGCCATCGGCGGCTGCCTCGGTGGACAGG2352CysLeuGlyAlaLeuLeuGlyProSerAlaAlaAlaSerValAspArg770775780AAGCAGAAGGTGCTTGCGAGGTACCTGAAGCGGCTGCAGCCGGGGACA2400LysGlnLysValLeuAlaArgTyrLeuLysArgLeuGlnProGlyThr785790795800CTGCGGGCGCGGCAGCTGCTTGAGCTGCTGCACTGCGCCCACGAGGCC2448LeuArgAlaArgGlnLeuLeuGluLeuLeuHisCysAlaHisGluAla805810815GAGGAGGCTGGAATTTGGCAGCACGTGGTACAGGAGCTCCCCGGCCGC2496GluGluAlaGlyIleTrpGlnHisValValGlnGluLeuProGlyArg820825830CTCTCTTTTCTGGGCACCCGCCTCACGCCTCCTGATGCACATGTACTG2544LeuSerPheLeuGlyThrArgLeuThrProProAspAlaHisValLeu835840845GGCAAGGCCTTGGAGGCGGCGGGCCAAGACTTCTCCCTGGACCTCCGC2592GlyLysAlaLeuGluAlaAlaGlyGlnAspPheSerLeuAspLeuArg850855860AGCACTGGCATTTGCCCCTCTGGATTGGGGAGCCTCGTGGGACTCAGC2640SerThrGlyIleCysProSerGlyLeuGlySerLeuValGlyLeuSer865870875880TGTGTCACCCGTTTCAGGGCTGCCTTGAGCGACACGGTGGCGCTGTGG2688CysValThrArgPheArgAlaAlaLeuSerAspThrValAlaLeuTrp885890895GAGTCCCTGCGGCAGCATGGGGAGACCAAGCTACTTCAGGCAGCAGAG2736GluSerLeuArgGlnHisGlyGluThrLysLeuLeuGlnAlaAlaGlu900905910GAGAAGTTCACCATCGAGCCTTTCAAAGCCAAGTCCCTGAAGGATGTG2784GluLysPheThrIleGluProPheLysAlaLysSerLeuLysAspVal915920925GAAGACCTGGGAAAGCTTGTGCAGACTCAGAGGACGAGAAGTTCCTCG2832GluAspLeuGlyLysLeuValGlnThrGlnArgThrArgSerSerSer930935940GAAGACACAGCTGGGGAGCTCCCTGCTGTTCGGGACCTAAAGAAACTG2880GluAspThrAlaGlyGluLeuProAlaValArgAspLeuLysLysLeu945950955960GAGTTTGCGCTGGGCCCTGTCTCAGGCCCCCAGGCTTTCCCCAAACTG2928GluPheAlaLeuGlyProValSerGlyProGlnAlaPheProLysLeu965970975GTGCGGATCCTCACGGCCTTTTCCTCCCTGCAGCATCTGGACCTGGAT2976ValArgIleLeuThrAlaPheSerSerLeuGlnHisLeuAspLeuAsp980985990GCGCTGAGTGAGAACAAGATCGGGGACGAGGGTGTCTCGCAGCTCTCA3024AlaLeuSerGluAsnLysIleGlyAspGluGlyValSerGlnLeuSer99510001005GCCACCTTCCCCCAGCTGAAGTCCTTGGAAACCCTCAATCTGTCCCAG3072AlaThrPheProGlnLeuLysSerLeuGluThrLeuAsnLeuSerGln101010151020AACAACATCACTGACCTGGGTGCCTACAAACTCGCCGAGGCCCTGCCT3120AsnAsnIleThrAspLeuGlyAlaTyrLysLeuAlaGluAlaLeuPro1025103010351040TCGCTCGCTGCATCCCTGCTCAGGCTAAGCTTGTACAATAACTGCATC3168SerLeuAlaAlaSerLeuLeuArgLeuSerLeuTyrAsnAsnCysIle104510501055TGCGACGTGGGAGCCGAGAGCTTGGCTCGTGTGCTTCCGGACATGGTG3216CysAspValGlyAlaGluSerLeuAlaArgValLeuProAspMetVal106010651070TCCCTCCGGGTGATGGACGTCCAGTACAACAAGTTCACGGCTGCCGGG3264SerLeuArgValMetAspValGlnTyrAsnLysPheThrAlaAlaGly107510801085GCCCAGCAGCTCGCTGCCAGCCTTCGGAGGTGTCCTCATGTGGAGACG3312AlaGlnGlnLeuAlaAlaSerLeuArgArgCysProHisValGluThr109010951100CTGGCGATGTGGACGCCCACCATCCCATTCAGTGTCCAGGAACACCTG3360LeuAlaMetTrpThrProThrIleProPheSerValGlnGluHisLeu1105111011151120CAACAACAGGATTCACGGATCAGCCTGAGATGA3393GlnGlnGlnAspSerArgIleSerLeuArg*11251130權(quán)利要求1.一種測(cè)定化合物是否抑制多肽激活轉(zhuǎn)錄能力的方法，該多肽其特征在于它包括一個(gè)CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域而缺失一個(gè)有功能的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域，其中轉(zhuǎn)錄的抑制表示該化合物是一種潛在的自身免疫疾病治療藥物。2.權(quán)利要求1中的方法，其中轉(zhuǎn)錄激活的抑制如下測(cè)定a)提供一種所述多肽與一種DNA結(jié)合蛋白的融合蛋白。b)提供一種在系統(tǒng)中與報(bào)告基因可操作地連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)DNA序列，該系統(tǒng)在融合蛋白與調(diào)節(jié)序列連接時(shí)適于轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因。c)在所述系統(tǒng)中提供所述融合蛋白和所述化合物；以及d)測(cè)定所述化合物抑制報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的能力。3.權(quán)利要求1中的方法，它進(jìn)一步包括測(cè)定化合物抑制第二個(gè)多肽激活轉(zhuǎn)錄的能力，第二個(gè)多肽其特征在于包括一個(gè)同型特異CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域而缺失一個(gè)有功能的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域，其中所述的方法鑒別了同型特異化合物。4.一種基本純化的DNA，它編碼CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域而不編碼有功能的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域。5.權(quán)利要求4中的DNA，其中DNA有圖1核苷酸192-1142的核苷酸序列，或其簡(jiǎn)并的變異序列。6.權(quán)利要求4中的DNA，其中DNA80％或更多的序列與圖1DNA序列的核苷酸192-1149相同。7.權(quán)利要求4中的DNA，其中CIITA是同型特異的。8.一種基本純化的包括一個(gè)CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域而缺失一個(gè)有功能的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域的多肽。9.權(quán)利要求8中的多肽，它包括與圖1氨基酸序列氨基酸26-352基本相同的氨基酸序列。10.權(quán)利要求8中的多肽，其中CIITA是同型特異的。11.一種測(cè)定化合物是否抑制多肽與其靶蛋白結(jié)合能力的方法，該多肽其特征在于它包括一個(gè)CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域而缺失一個(gè)有功能的CIITA激活結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)合的抑制表示化合物是潛在的自身免疫疾病治療藥物。12.權(quán)利要求11中的方法，該方法包括測(cè)定所述化合物是否抑制上述多肽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄能力，轉(zhuǎn)錄的抑制表示化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。13.權(quán)利要求12的方法，其中所說的抑制如下測(cè)定a)提供第一個(gè)包括所述多肽與一種DNA結(jié)合蛋白的融合蛋白；b)為DNA序列提供一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，它在適于轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因的系統(tǒng)中可操作地與報(bào)告基因連接；c)提供第二個(gè)融合蛋白，所述第二個(gè)融合蛋白其特征在于它包含與CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域的靶蛋白融合的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域；d)在系統(tǒng)中提供所述第一個(gè)和所述第二個(gè)融合蛋白以及所述化合物；以及e)測(cè)定所述化合物抑制報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的能力。14.權(quán)利要求11中的方法，進(jìn)一步包括測(cè)定所述化合物抑制第二個(gè)多肽結(jié)合其靶蛋白的能力，上述第二個(gè)多肽特征在于它包含一個(gè)同型特異CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域而缺失一個(gè)有功能的CIITA激活結(jié)構(gòu)域，其中所說的方法鑒別同型特異化合物。15.權(quán)利要求14中的方法，其中所述第二多肽包含克隆13CIITA的相互作用結(jié)構(gòu)域。16.一種基本純化的DNA，它編碼CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域而不編碼有功能的CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。17.權(quán)利要求16中的方法，其中所DNA具有圖1核苷酸1016-3509的核苷酸序列或其簡(jiǎn)并的變異序列。18.權(quán)利要求16中的方法，其中所述DNA有80％或更多的序列與圖1DNA序列的核苷酸1016-3509的序列相同。19.權(quán)利要求16中的方法，其中CIITA是同型特異的。20.權(quán)利要求19中的方法，其中CIITA為克隆13CIITA。21.一種基本純凈的多肽，它包括CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域而缺失有功能的CIITA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。22.權(quán)利要求21中的多肽，它包含與圖1氨基酸序列中氨基酸301-1130基本相同的氨基酸序列。23.權(quán)利要求21中的多肽，其中所述CIITA是同型特異的。24.權(quán)利要求23中的多肽，CIITA為克隆13CIITA。25.測(cè)定一個(gè)化合物是否抑制多肽介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄能力的方法，該多肽其特征在于它包含一個(gè)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域而缺失有功能的CIITA相互作用結(jié)構(gòu)域，其中轉(zhuǎn)錄的抑制表示所述化合物是潛在的自身免疫疾病治療藥物。26.權(quán)利要求25中的方法，它進(jìn)一步包含在B淋巴細(xì)胞中提供上述多肽而且測(cè)定MHCII類基因的表達(dá)。27.權(quán)利要求26中的方法，其中所述細(xì)胞是選自克隆13細(xì)胞和RM3細(xì)胞的人B淋巴細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明公開了鑒別化合物的方法，該化合物抑制CIITA的轉(zhuǎn)錄激活從而抑制MHCII類基因的表達(dá)。這樣的化合物能夠影響免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。這些方法分別應(yīng)用CIITA的激活和相互作用結(jié)構(gòu)域。方法中也同時(shí)應(yīng)用同型特異性CIITA蛋白激活和相互作用結(jié)構(gòu)域，以用于鑒別這類化合物它們是轉(zhuǎn)錄的同型特異抑制劑和選擇性影響免疫系統(tǒng)中有效的化合物。文檔編號(hào)C12N15/12GK1164236SQ95195840公開日1997年11月5日申請(qǐng)日期1995年8月22日優(yōu)先權(quán)日1995年8月22日發(fā)明者L·H·格利姆徹,周虹,J·杜漢三世申請(qǐng)人:哈佛大學(xué)校長(zhǎng)及研究員協(xié)會(huì)