專利名稱：表達(dá)乙肝病毒表面抗原中蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有編碼乙肝病毒表面抗原中蛋白(Pre-S2+S)的DNA的表達(dá)質(zhì)粒，用所說(shuō)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系以及培養(yǎng)所說(shuō)的轉(zhuǎn)化體高效表達(dá)乙肝表面抗原中蛋白。
乙型肝炎病毒(HBV)是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常見(jiàn)病因，我國(guó)是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，有50-70%的人群感染過(guò)HBV，8-10%的人群(約1億人)為帶毒者，目前還沒(méi)有治療乙肝的有效方法，接種乙肝疫苗是預(yù)防肝炎的有效措施。
血源疫苗國(guó)內(nèi)外已投入生產(chǎn)使用，但不能滿足普遍的預(yù)防接種，由于血源疫苗存在著一些問(wèn)題，如血源有限，帶有肯定的潛在性危險(xiǎn)(如丙肝，艾滋病毒等，)為此需要急切研制乙肝基因工程疫苗，國(guó)內(nèi)外對(duì)乙肝基因工程疫苗的研究得到較快的發(fā)展，美國(guó)的MSD公司應(yīng)用酵母系統(tǒng)生產(chǎn)乙肝基因工程疫苗已獲準(zhǔn)生產(chǎn)許可證，我國(guó)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的乙肝基因工程疫苗也獲準(zhǔn)生產(chǎn)，它們和血源疫苗一樣，是由乙肝表面抗原的主蛋白組成。
近來(lái)的研究表明，HBV的Pre-S2(前S2)區(qū)域中蛋白特異性決定簇比S區(qū)更為豐富，中蛋白免疫能激刺T細(xì)胞的功能，Pre-S2抗體出現(xiàn)早于S抗體，并具有保護(hù)野毒攻擊的作用，這進(jìn)一步表明中蛋白在免疫中有著重要作用。
1984年M.L.Michel報(bào)導(dǎo)[1]，用ay亞型的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)大蛋白構(gòu)建重組質(zhì)粒(PSVSdhfr9.1kb)。
其特點(diǎn)是乙肝表面抗原大蛋白受SV40早期啟動(dòng)子的調(diào)控，而dhfr(二氫葉酸還原酶)基因受MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)啟動(dòng)子的調(diào)控。
表達(dá)系統(tǒng)，他們采用二氫葉酸還原酶陰性的中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞(CHO-dhfr-)，作為其表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳顯出22 kD 26 kD的主蛋白及34kD的中蛋白條帶，未顯出大蛋白條帶。
用AUSRIA 11試劑盒測(cè)細(xì)胞培液中蛋白表達(dá)量＝1ug/106細(xì)胞/每天。
T.Lee等人[2]用HBV(adr亞型)2.8kb的Bg1 Ⅱ片段插到PSV2-dhfr載體質(zhì)粒的Bg1 Ⅱ-BamH1位點(diǎn)構(gòu)建質(zhì)粒，其中HBsAg基因的轉(zhuǎn)錄方向與SV40早期啟動(dòng)子方向相反，用構(gòu)建的重組質(zhì)轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物HBsAg表達(dá)量一平均為1μg/107Cell/每天。
蛋白印跡實(shí)驗(yàn)用pre-S1及PreS2單克隆抗體時(shí)分別測(cè)出40kD的Pre-s1及33kd，36kd的PreS2帶。
1989yasuakiItohandyukioFujisaua等人[3]質(zhì)粒構(gòu)建用adr型乙肝表面抗原中蛋白(此中蛋白是經(jīng)修飾即去掉第Ser44-Thr496個(gè)氨基酸，同時(shí)在氨基端增加了人工合成的三個(gè)氨基酸殘基)構(gòu)建成10.8kb的pGLDP31-RC重組質(zhì)粒。
該質(zhì)粒是由GLD啟動(dòng)子(甘油醛-3-磷酸-脫氫酶啟動(dòng)子)下游連接乙肝表面抗原修飾后的中蛋白，PBR322片段(含氨芐抗性基因及復(fù)制起點(diǎn))，酵母菌的arsl(自主復(fù)制系列)、LEU2(亮氨酸基因)及LR(反向重復(fù)序列)所構(gòu)成。
表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)
1)經(jīng)SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳顯示出34kd，37kd的中蛋白條帶。
2)鏡下觀察到20nm顆粒。
1986年P(guān).Dehouxetal等報(bào)導(dǎo)[4]質(zhì)粒構(gòu)建將ayw亞型HBV大蛋白1312bp的BglⅡ-BglⅡ片段插到含有PH05啟動(dòng)子的酵母載體質(zhì)粒PPV2的HindⅢ位點(diǎn)，其下游有URA3基因(轉(zhuǎn)錄終止信號(hào))構(gòu)成PPV2/S55重組質(zhì)粒。
該質(zhì)粒的特點(diǎn)是乙肝表面抗原大蛋白基因在PH05(強(qiáng)的酵母啟動(dòng)子)調(diào)控下。
表達(dá)系統(tǒng)酵母。
表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，免疫沉淀后，經(jīng)聚丙烯酰氨凝膠電泳電顯出39kD的帶條。蛋白分泌量為25ug/L(0.1-0.2ug/ml總蛋白)。
T.Yoneyamaetal等報(bào)導(dǎo)[5]1.質(zhì)粒構(gòu)建用HBV(adr亞型)表面抗原2.8kbBg1Ⅱ片段(含Pre-S1，S2+S基因)插到PdBpv-MMTneo的BamHⅠ的位點(diǎn)。
該質(zhì)粒含有BPVDNA(牛乳頭瘤病毒)載體，PML2DNA.SV40剪接位點(diǎn)及多聚腺苷位點(diǎn)，小鼠攝金蛋白啟動(dòng)子和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)。
2.表達(dá)系統(tǒng)小鼠C127細(xì)胞3.表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)1)電鏡下觀察到22-27nm顆粒。
2)SDS-PAGE電泳顯示22Kd26kd和35Kd的蛋白帶，無(wú)大蛋白帶。
3)細(xì)胞的免疫熒光用HBsAg的免血清及Pre-S2單克隆抗體分別測(cè)出HBsAg及Pre-S2抗原，用Pre-S1單抗未測(cè)出Pre-S1抗原。
L.Kutinova等人報(bào)導(dǎo)[6]的質(zhì)粒構(gòu)建包括用完整的前S2+S基因，插到含有痘苗TK的PGS20載體質(zhì)粒P1.4HEP，該質(zhì)粒特點(diǎn)是HBsAg抗原PreS2+S基因在痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子調(diào)控下。
蛋白分泌量的檢測(cè)HBsAgElisa滴度為HBsAg24-34;Pre-S2161。
M.W.Yuetal[7]報(bào)導(dǎo)用表面抗原Pre-S2+S基因插到大腸桿菌表達(dá)載體pTrpLE質(zhì)粒，構(gòu)成PLEPre-S2質(zhì)粒。
表達(dá)產(chǎn)物是融合蛋白蛋白。
上述所介紹的含乙肝病毒表面抗原前S基因的重組DNA質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性的研究中，或因表達(dá)載體的構(gòu)建不佳或因表達(dá)系統(tǒng)的選擇不利，因而都不能高效生產(chǎn)出免疫原性好的抗原，其中表達(dá)系統(tǒng)選擇的局限表現(xiàn)為用大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)其得到表達(dá)往往是融合蛋白，由于表達(dá)水平低，產(chǎn)物不穩(wěn)定，而未獲成功;以痘苗為載體表達(dá)乙肝表面抗原，最初是用此載體研制亞單位疫苗，雖然有成功的報(bào)導(dǎo)，但由于不適于大規(guī)模的生產(chǎn)，給廣泛使用前景帶來(lái)困難，現(xiàn)進(jìn)一步用此載體來(lái)研制含乙肝表面抗原的重組病毒活疫苗;酵母是一個(gè)較好的表達(dá)系，但有其不足之處。
1)酵母表達(dá)的乙肝表面抗原不能分泌，給分離純化帶帶來(lái)許多困難。
2)HBsAg中蛋白在酵母系統(tǒng)中過(guò)度糖基化而且穩(wěn)定性差，影響其免疫原性;用哺乳動(dòng)物細(xì)胞C127，小鼠LTK-及小鼠3T3細(xì)胞用為表達(dá)系統(tǒng)，雖有獲得乙肝表面抗原的表達(dá)的報(bào)導(dǎo)，但上述細(xì)胞不是世界衛(wèi)生組織認(rèn)可的用于基因工程疫苗生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
要想獲得更好的基因工程苗需從二方面考慮，一是高效表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，二是表達(dá)系統(tǒng)的選擇，為此我們構(gòu)建了含乙肝表面抗原Pre-S2+S中蛋白質(zhì)粒pSV2DHBWS2S，本質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)明顯地不同于現(xiàn)有報(bào)導(dǎo)的Pre-S的質(zhì)粒，并選用哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，目的是為進(jìn)一步研制免疫性好，表達(dá)量高的乙肝基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，我們采用的是乙肝表面抗原完整的中蛋白結(jié)構(gòu)(2.0kb的Saul-Bg1Ⅱ片段)，乙肝表面抗原中蛋白是具有豐富的抗原決定簇，免疫原性好，能與人多聚白蛋白結(jié)合，又能分泌的區(qū)域，采用的HBV亞型，這是我國(guó)南方流行的重要亞型，南方又是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，所采用的啟動(dòng)子也與上述文獻(xiàn)報(bào)道不同，即我們采用二個(gè)SV40早期啟動(dòng)子，SV40早期啟動(dòng)子是較強(qiáng)的啟動(dòng)子，SV40的DAN復(fù)制起點(diǎn)和早期啟動(dòng)子區(qū)域中含有72個(gè)核苷酸的重復(fù)序列能強(qiáng)化鄰近的基因的表達(dá)[8、9]。
質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中的dhfr基因在前，乙肝表面抗原基因在后，而且我們構(gòu)建的與Michel等所構(gòu)成的質(zhì)粒正好相反。
其優(yōu)點(diǎn)是dhfr基因是一個(gè)擴(kuò)增基因，由于它的擴(kuò)增而帶動(dòng)下游的HBsAg基因擴(kuò)增，從而增強(qiáng)基因HBsAg的表達(dá)。
此外用哺乳動(dòng)物細(xì)胞即缺失二氫葉酸還原酶基因的中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞(CHO-dhfr-)，為表達(dá)系統(tǒng)是較理想的細(xì)胞系，哺乳動(dòng)物胞表達(dá)的外源基因產(chǎn)物較原核及酵母系統(tǒng)更接近于天然，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系具有更適于大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)。


圖1說(shuō)明本發(fā)明的重組質(zhì)粒pSV2DHBWS2S的構(gòu)建方法。
下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
(一).含乙肝表面抗原中蛋白重組質(zhì)粒質(zhì)粒構(gòu)建PSVDHBW-1質(zhì)粒(adw亞型)經(jīng)HindⅢ及Saul酶切后回收大片段，Klenow酶補(bǔ)平，T4DNA酶連接構(gòu)成中間質(zhì)粒PSVHBWS2S再用Bg1Ⅱ及PVUⅡ酶切后制取小片段，載體質(zhì)粒PSV2dhfr(美國(guó)梁偉材教授贈(zèng))的Bg1Ⅱ位點(diǎn)處構(gòu)成PSV2DHBWS2S，該重組質(zhì)粒的特點(diǎn)是HBVPreS2+S基因及二氫葉酸還原酶(dhfr)酶基因分別置于二個(gè)SV40早期啟動(dòng)子調(diào)控下，圖1。
(二).轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系MX(X1-15)MX細(xì)胞系的篩選將重組質(zhì)粒DNA 15ug和等量的鮭魚(yú)精子DNA按常規(guī)沉淀技術(shù)[10，11]加到約80%成片的CHO-dhfr-細(xì)胞(該細(xì)胞是美國(guó)哥倫比亞大學(xué)Chasin教授惠贈(zèng))瓶中，8小時(shí)后第一次換生長(zhǎng)液(含次黃嘌呤和胸苷)，2天后消化稀釋(此時(shí)生長(zhǎng)液不再加次黃嘌呤和胸苷)，于CO2孵箱中培養(yǎng)約2周，待單個(gè)細(xì)胞集落出現(xiàn)時(shí)，挑單細(xì)胞集落于96孔板，增殖后依次逐漸轉(zhuǎn)到24孔板及方瓶，逐漸加MTX(氨甲喋呤)其濃度由1X10-7到5X10-6M以此篩出高效分泌HBsAg陽(yáng)性的克隆細(xì)胞系。
(三).表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)1.HBsAg的表達(dá)量反相血凝滴度為64-128;放射免疫(RIA)為2248-2558ng/ml。
Pre-S2表達(dá)量反相血凝為128-192酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(Elisa)為160-320。
2.初純品經(jīng)SDS-PAGE電泳，顯出24KD，27KD的主蛋白帶及33KD，36KD中蛋白帶，經(jīng)蛋白印跡試驗(yàn)證明，中蛋白是特異性條帶。
3.免疫電鏡觀察到22nm大小的顆粒。
4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)免疫小鼠及家兔后Elisa可測(cè)出1∶8Pre-S2抗體，Pre-S2抗體產(chǎn)生比S抗體產(chǎn)生早，而S抗體產(chǎn)生較高持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)(1∶10稀釋的血清其RIA的P/N值為104-190)。

表2M6細(xì)胞分泌乙肝疫苗免疫小鼠后前S2抗體的反應(yīng)Elisa檢測(cè)前S2抗體的P/N值鼠種血清稀釋1:11:21:8CBA5.16.22.4C575.95.02.2C3H5.47.02.06155.05.32.2NIH3.82.82.1Balb/c4.02.1未做ICR-未做DBA/C-未做
1.M.L.Micheletal.
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA817708-7712，1984)2.T.Lee，etalArchvirol106151-158，1989.
3.YasuakiItohandyukioFujisawaBiochemicalandBiophysicalResearchCommunications141(3)942-948，19864.P.DehouxetalGene48155-163，19865.T.YoneyamaetalJ.genVirol691931-1939.19886.L.Kutinovaetal.
ArchVirol.112181-193.1990.
7.M.W.YuetalJ.ofMedicalvirology307-13，19908.Fiers.W.R.etal.
Nature273113，1978.
9.BanerjiJ.etal.Cell27299.198110.WiglerM.etalProc.Natl.Acid.SeiUSA761373.197911.WiglerM.etal.Cell16777，1979.
權(quán)利要求
1.一種含有乙肝病毒表面抗原中蛋白Pre-S2+S基因的重組質(zhì)粒，其特征在于質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中包括二氫葉酸還原酶(dhfr)基因及乙肝病毒表面抗原Pre-S2+S基因，它們分別在二個(gè)SV40早期啟動(dòng)子的調(diào)控之下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組質(zhì)粒，其特征在于所說(shuō)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中dhfr基因在前，Pre-S2+S基因在后。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的重組質(zhì)粒，其特征在于所說(shuō)的PS2+S基因是乙肝病毒表面抗原的SauⅠ-Bg1 Ⅱ片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任何一個(gè)的重組質(zhì)粒，其特征在于所說(shuō)的乙肝病毒是adw亞型。
5.一種能分泌乙肝表面抗原中蛋白的細(xì)胞系MX(X1-15)，其特征在于它是用權(quán)利要求1-4中任何一個(gè)權(quán)利要求的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的細(xì)胞系，其特征在于所說(shuō)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO-dhfr-細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了含乙肝病毒表面抗原中蛋白(Pre-S2+S)基因的重組質(zhì)粒PSV2DHBWS2S和含有該質(zhì)粒并能高效分泌乙肝病毒表面抗原中蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系MX，在本發(fā)明的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中，二氫葉酸還原酶基因及乙肝病毒表面抗原Pre-S2+S基因分別受二個(gè)SV40早期啟動(dòng)子的調(diào)控，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的CHO-dhfr
文檔編號(hào)C12N15/85GK1078262SQ93102498
公開(kāi)日1993年11月10日 申請(qǐng)日期1993年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月11日
發(fā)明者田淑芳, 楊安道, 任貴方, 朱既明 申請(qǐng)人:中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所