專利名稱：用稀有氣體調節(jié)酶活性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用稀有氣體調節(jié)酶活性的方法。
稀有氣體氦(He)、氖(Ne)、氬(Ar)、氪(Kr)、氙(Xe)和氡(Ra)進入化學物質中與其他原子結合的能力是極其有限的?？偟卣f來，只有氪、氙和氡已被誘導與其他原子如氟和氧反應，且如此生成的化合物極不穩(wěn)定(參見AdvancedIInorganicChemistry，F(xiàn).A。CottonandG。Wilkinson(Wiley，ThirdEdition))。雖然稀有氣一般在化學上是無反應性的，但已知氙表現(xiàn)有某些生理學效應，如麻醉作用。也已觀察到了其他惰性氣體如氮的其他生理效應，例如，已經(jīng)知道在深海潛水的強大壓力下使用氮時其可引起麻醉效應。
Schreiner的美國專利US3，183，171中已報導了氬和其他惰性氣體可影響真菌的生長速度，并且已知氬可改善魚或其他海產(chǎn)品的防腐保鮮(Schvester的美國專利4，946，326以及日本專利JP52105232、JP80002271和JP77027699)。然而，由于對所觀察的現(xiàn)象缺乏根本的了解，所以很難清楚地解釋這些結果。另外，由于在這些研究中使用了包括氧在內(nèi)的許多氣體的混合物，所述使得這些觀察結果的含意更加模糊。再者，其中某些研究工作是在高氣壓和冷凍溫度下進行的。在這樣高壓力下，所觀察到的結果很可能是由于壓力對細胞成分或酶本身的損傷引起的。
例如，從1964到1966年，Schreiner在有關適當抑制深海潛水、潛水艇及宇宙飛船的大氣壓力的研究中，提出了惰性氣體之生理學效應特別與麻醉作用有關的報告。這一研究結果總結成了三篇報告，為OfficeofNavalResearch，DepartmentoftheNavy準備的報告的題目是“TechnicalReport.ThePhysiologiceclEffectsofArgon，HeliumandtheRareGases”(ContractNonr4115(00)，NR∶102-597)。后來出版了這項研究的三篇綜述和摘要。
一篇摘要(“InertGasZnteractionsandEffectsonEnzymaticallyActiveProteins”，F(xiàn)ed，Proc.26650(1967))重申了有關稀有和其他惰性氣體在升高的分壓下對整體動物(麻醉)和微生物及哺乳動物細胞系統(tǒng)(生長抑制)產(chǎn)生生理學作用的觀察結果。
第二篇摘要(“APossibleMolecularMechanismfortheBiologicalActivifyofChcemicallyInertGases”，Intern。Congr.Physiol。Sci.，23rd，Tokyo)再次提出了惰性氣體在高壓下對各種水平之細胞組織表現(xiàn)的生理學活性的觀察結果。
另外，Schreiner發(fā)表了稀有氣體之一般性生理學效應的綜述，其中再次闡述了他的早期研究的主要結果(“GeneralBiologicalEffectsoftheHelium-XenonSerierofElements”，F(xiàn)ed，Proc.27∶872-878(1968))。
然而，在1969年，Behnke等人提出反對Schreiner的主要結論。Behnke等人得出的結論是，Schreiner的早期報導的結果是不能再現(xiàn)的，而且只是因高氣壓造成的，即不能證明稀有氣體對酶的影響(“Enzyme-CatalyzedReactionsasInfluecedbyInertGasesatHighPressures”J。FoodSci，34∶370-375)。
實質上，Schreiner的研究工作是基于這種的假設，即化學上惰性氣體與氧分子競爭細胞位點，并且氧置換取決于氧對惰性氣體濃度的比例。這一假設從未作為用一氧化二氮觀察到最大效應(只觀察了抑制效應)得以證實，而且發(fā)現(xiàn)這種效應是不依賴于氧分壓的。此外，所觀察到的抑制作用為每大氣壓所加一氧化二氮只產(chǎn)生1.9%抑制。
為了反駁Schreiner的早期工作，Behnke等人單獨試驗了高氣壓對酶的影響，并試圖再現(xiàn)Schreiner所得到的結果。Behnke等人發(fā)現(xiàn)，與Scgreiner的完全相反，過高增加氮和氬的氣體壓力肯定可觀察到胰凝乳蛋白酶、轉化酶和酪氨酸酶的輕度抑制，但不會引起抑制作用的進一步增加。
Behnke等人的發(fā)現(xiàn)可用簡單的初始水靜壓抑制作用來解釋，在壓力穩(wěn)定后這一抑制作用即解除。很清楚，Schreiner提出的化學O2/惰性氣體相互依賴性來解釋。Behnke等人的結論是，高壓惰性氣體通過降低氧利用率抑制了非流體(如凝膠體)中的酪氨酸酶，而不是在物理上改變酶。這一結論正與Schreiner的發(fā)現(xiàn)相反。
除了Behnke等人的反對意見外，Schreiner報導的結果也難以對其他一些事實作出解釋。
首先，所有分析都是在很高壓力下進行的，并且針對水靜壓效應控制分析條件。
第二，在許多例子中，沒有觀察到各種稀有氣體和氮氣之間有明顯差異。
第三，在進行這些研究時，對酶作用及抑制的方式了解很少，所用酶的純度也不夠。不可能肯定不存在混淆的酶活性，而且不能肯定所作檢測的分辨程度是以區(qū)分開不同氣體的效力。再者，任何特異作用方式都只能是作為一種不可檢驗的推測提出的。
第四，沒有控制各種氣體間溶解度的差異，沒有考慮到這一差異對結果的影響。
第五，所有試驗均使用高于1個大氣壓的高惰性氣體壓力進行，故不能充分地控制氧氣壓。
第六，報導的所有效應只是抑制作用。
第七，文章中沒有充分描述所有方法，并且可能也沒有作實驗對照，另外，在酶反應開始后長時間脫延而妨礙了繼后的整個反應過程，以致沒有記錄到可讀的最高改變速率。
第八，基于小數(shù)目的觀察，而使報告的數(shù)據(jù)范圍變化很大，從而影響了結果的統(tǒng)計學意義。
第九，即使在高壓力所觀察到的抑制水平也是很小的。
第十，有關依賴于酶濃度的研究并沒有得出有意義的可用數(shù)據(jù)。
第十一，惰性氣體在低氣壓下之抑制潛能的所有報告都是基于從高氣壓測定值作曲線外延后推斷的，而不是真實數(shù)據(jù)。
最后，值得再次指出的是，Behnke等人的結果在幾個關鍵方面明確地反駁了Schreiner的結論，其中主要是高壓力影響很小，而且Schreiner沒有控制的靜水壓效應是這些研究中得出錯誤結論的主要原因。
因此，雖然Sandhoff等人(FEBSLetters，Vol.62，No，3(March，1976))報導了氙、一氧化二氮和氟烷可提高顆粒唾液酸酶的活性，但由于研究中所用的酶純度很差，而且可能在顆粒中存在抑制性氧化酶，所以結果是有問題的。
為了總結上述專利和出版物，進一步列出下面一些相關的現(xiàn)有技術。
Behnke等人公開了高壓力惰性氣體對酶催化的反應的影響(J.FoodSci.34∶370-375)。
Scireiner等人(1967)描述了惰性氣體相互作用以及對酶促活性蛋白質的影響(AbstactNo。2209.Fed.Proc.26∶650)。
Schreiner，H，R，1964年在TechnicalReport中描述了氬、氦及其他稀有氣體的生理學效應(ContractNonr4115(00)，NR∶102-597。OfficeofNavalResearch，Washington，D.C。)。
Schreiner，H。R。1965年在TechnicalReport中描述了氬、氦等希有氣體的生理學效應(ContractNoNr4115(00)，NR102-597。OfficeofNavalResearch，Washington，D.C。)。
關鍵的是，上述研究均沒有作出所研究的氣體與酶活性部位相互反應的明確結論。
不過最近已經(jīng)知道可以幾種方式抑制酶活性。例如，許多酶可被在結構上與其正常底物相關的特定毒物抑制。另外，已知許多不同的試劑是靶酶的特異性失活劑。這些試劑一般可在酶的活性部位造成化學修飾以誘導催化活性喪失，即造成活性部位特異性不可逆失活或親合標記(參見EnzymaticReactionMechanisms，C.Walsh(W。H。Frecman&Co。，1979))，另外，某些多酶系列受到所謂調節(jié)或變構酶等特殊酶的調節(jié)(參見Bioenergetics，A。L。Leninger(Benjamin/CummingsPublishingCo。，1973)。
然而，如果能夠得到一種可預言和可控制的方式調節(jié)酶活性的更簡單的手段，將是極其有利的。此外，如果能找到一種以可預言和可控制的方式選擇性地抑制或提高酶活性的方法也將是極為有利的。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種以簡單和直接的方式調節(jié)酶活性的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種不使用按結構設計的失活靶酶的試劑即可調節(jié)酶活性的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種不使用結構上與正常酶底物相關的酶毒物即可調節(jié)酶活性的方法。
再者，本發(fā)明還提供了轉移最適相關酶-底物濃度以及修飾與物理參數(shù)相關之最適反應條件的方法。
基于下面的詳細描述，對有關通過使一種或多種酶與包括一種或多種稀有氣體的氣體相接觸而完成的調節(jié)酶活性的方法，及由之提供的上述及其他發(fā)明目的將會更顯而易見。


圖1顯示酪氨酸酶的吸收光譜。
圖2顯示L-酪氨酸的吸收光譜。
圖3顯示用L′-酪氨酸封閉的酪氨酸酶與L-酪氨酸的吸收光譜。
圖4顯示用各種不同濃度酪氨酸酶進行的反應之結合的迭加，顯示了直接線性一級酪氨酸酶濃度依賴性。
圖5證明相等W/W氙氣對酪氨酸酶的抑制作用。
圖6證明于26℃時氙氣對酪氨酸酶的很大抑制作用。
圖7顯示在15℃時，氬輕度抑制酪氨酸酶-L-酪氨酸反應的平衡關系;氙具有較小但明顯的抑制作用，氖和氪則表現(xiàn)出很大的抑制作用。
圖8顯示氙、氪、氖和氬在20℃時對酪氨酸酶-L-酪氨酸反應的抑制作用。
圖9顯示氧在20℃下沒有提高對酪氨酸酶-L-酪氨酸反應的影響。
圖10顯示氖、氬、氪和氙在25℃時對酪氨酸酶-L-酪氨酸反應的影響。
圖11顯示在25℃下氧沒有提高對酪氨酸酶-L-酪氨酸反應的影響。
圖12顯示30℃下氖、氬、氪和氙對酪氨酸酶-L酪氨酸反應的影響。
圖13顯示30℃下氧沒有提高對酪氨酸酶-L酪氨酸反應的影響。
圖14顯示在不同溫度下在空氣中的標準曲線，并證明速率改變與氧溶解度差異直接相關。
圖15顯示氖對酪氨酸酶-L酪氨酸反應的抑制作用是正溫度依賴性的。
圖16顯示氪抑制酪氨酸酶的能力與溫度間的直接反(付)相關性。
圖17顯示氙對酪氨酸酶-L酪氨酸平衡的抑制作用與溫度間有反相關性。
圖18顯示在20℃時，氧并不加速酪氨酸酶-L酪氨酸反應，而氬、氙和氖均可顯著抑制該反應。
圖19顯示25℃時，氬和氮對酪氨酸酶-L酪氨酸反應的抑制程度小于稀有氣體，且氧可加速該反應。
圖20顯示于30℃時，氧因減小了溶解度而不再加速酪氨酸酶-L酪氨酸反應。
圖21顯示氖在不同溫度時對酪氨酸酶-L酪氨酸反應的抑制，且顯示在20℃和25℃之間有一個躍遷。
圖22顯示氬在不同溫度時對酪氨酸酶-L酪氨酸反應的抑制作用。
圖23顯示氪在不同溫度時對酪氨酸酶-L酪氨酸反應的抑制作用。
圖24顯示氙在不同溫度時對酪氨酸酶-L酪氨酸反應的抑制作用。
圖25顯示單純由參予從溶液中置換氧之溶解度機制對酪氨酸酶-L酪氨酸反應的抑制作用。
圖26顯示氮對酪氨酸酶活性的抑制作用。
圖27顯示在20℃和25℃間氙活的明顯不同。
圖28顯示氪、氙、氬、氮和氖對葡萄糖氧化酶的抑制作用。
圖29顯示氪、氙、氬和氪與氙的混合物對α-容氨酰轉肽酶的抑制作用。
圖30顯示氪、氙、氬和氪與氙的混合物對天冬氨酸基轉移酶的抑制作用。
圖31顯示氮、氖、和氧增強α-D-葡糖苷酶活性。
圖32顯示氖、氧和氮增強苯丙氨酸解氨酶活性。
圖33顯示氙和氪增強檸檬酸合酶活性，而氬則對其有抑制作用。
圖34顯示氙、氪、氬和氪與氙的混合物在10℃下增強磷酸葡萄糖異構酶活性。
圖35顯示25℃時氖和氮增強磷酸葡萄糖異構酶活性，氧則對其有抑制作用。
圖36顯示在25℃時氪和氪與氙的混合物增強S-乙酰CoA合成酶活性。
圖37顯示在100個大氣壓和25℃下，空氣和氮對β-葡糖苷酶的抑制作用。
圖38顯示在30個大氣壓下空氣和氮對β-葡糖苷酶的抑制作用。
圖39顯示在30個大氣壓下空氣、氙和氮對酪氨酸酶的抑制作用。
圖40顯示在100個大氣壓下空氣、氙和氮對酪氨酸酶的抑制作用。
圖41顯示酶-底物濃度影響稀有氣體增強/抑制作用的結果。
圖42顯示氙和氖例如在10℃下在分別增強，然后抑制乳酸脫氫酶中的不同作用。
圖43顯示即使在60℃下，稀有氣體仍表現(xiàn)出對酶的增強或抑制作用。
圖44顯示氙在增強固相化β-葡糖苷酶活性上的作用。
圖45顯示在五個不同底物濃度下，β-葡糖苷酶在空氣下的紫外/可見光(UV/Vis)吸收率曲線。
圖46顯示在五個不同底物濃度下，β-葡糖苷酶在氙氣下的UV/Vis吸收率曲線。
圖47顯示β-葡糖苷酶-空氣充氣反應的一級反應動力曲線回歸速率線性變換。
圖48顯示β-葡糖苷酶-氙氣充氣反應的一級反應動力曲線回歸速率線性變換。
圖49和50顯示本實驗中研究的所有氣體的同樣一級反應速率近似回歸線性化關系。
圖51和52顯示單一酪氨酸酶實驗的前160秒所得數(shù)據(jù)，表示為空氣、再充氙氣后的反應動力曲線。
根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可通過使一種或多種酶與含一種或多種稀有氣體的氣體接觸，以一種受控制和可預言的方式調節(jié)酶活性。特別是發(fā)現(xiàn)即使在低氣壓下和寬的溫度范圍內(nèi)，稀有氣體可表現(xiàn)出對酶有顯著影響。
基于下列幾個原因可知本發(fā)明確實是令人驚異的。首先，根據(jù)本發(fā)明，可在低氣壓下調節(jié)酶活性。但也可使用高氣壓。第二，用稀有氣體，包括其他氣體如氮、氧、二氧化碳、一氧化碳和一氧化二碳的混合物也可得到極好的結果。一般說來，除提到的稀有氣體外，其他任何氣體均可用于氣體混合物中。但這些其他氣體中最典型的包括氧、氮和二氧化碳。
本文所用的術語“稀有氣體”是指選自氦、氖、氬、氪、氙和氡的任何一種氣體。但因為氦的溶解度低而且反應速率對于實用系統(tǒng)來說顯得過高，另外氡有危險的放射活性，所以一般最好是使用氖、氬、氪或氙。
根據(jù)本發(fā)明，可使用單一的、純的稀有氣體，或可使用稀有氣體的混合物。例如，可使用含有大約90%Kr和10%Ne(基于總氣體體積)的廉價生產(chǎn)的工廠側餾氣體。但也可使用一種或多種稀有氣體與其他氣體如氮、六氟化硫、二氧化碳或氧的混合物。
根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)可在水或無機溶液、分散劑、懸浮劑或其他型式基質如凝膠中觀察到一種或多種希有氣體對酶活性的作用。此外，被調節(jié)的酶可結合或不結合到載體上。稀有氣體本身可以是溶液、大氣或結合形式的。
本發(fā)明是基于這樣的基本發(fā)現(xiàn)而預言的，即按照國際生化聯(lián)合會和國際純化學與應用化學聯(lián)合會的生化命名委員會的統(tǒng)一分類，所有六大類中的酶均可通過在低氣壓下與純惰性氣體或它們的混合物，甚至與其他氣體的混合物接觸，可重復地提高或抑制它們的活性。
根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的氣體或氣體混合物可在動力學和熱力學控制兩方向影響酶促活性。即是說，現(xiàn)在有可能控制酶促反應的速率和產(chǎn)率。
雖然反應混合物中存在的氣體和氣體混合物的溶解度影響氣體和氣體混合物的測得的效應。但溶解度并不能完全決定這一效應。效應主要是歸因于極化性、電離性、范德華力及原子半徑等分子效應，一般說來，根據(jù)本發(fā)明增加溫度將限制氣體可利用性，這是由于降低了溶解度進而降低了這些效應。然而，這種效應的降低可隨著增加溫度進而提高極化性而得到補償。因此，在大約30℃或更高溫度下，增加氣體和氣體混合物的極化性對于氣體和氣體混合物的效應要比溶解度特性有更為顯著的影響。
一般說來，在高于標準溫度和壓力(STP)的條件下增加惰性氣體和其混合物的摩爾濃度，可觀察到對酶效應的增加。此外，這些效應可能是基于氣體分子與酶的相互作用，這種相互作用是獨立的，但可因其他氣體之混合物的存在而得以改善或增強。值得注意的是，惰性氣體混合物的行為與單純惰性氣體相同，而且發(fā)現(xiàn)幾種氣體的混合物可擬似、倒轉或改善用單一希有氣體觀察到的效應。
另外，根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)特定希有氣體或其混合物可抑制或提高作為溫度的函數(shù)的酶促活性。
再者，根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)一般在適當?shù)腜H、溫度、壓力、〔E〕和〔S〕條件下，所有的酶都可受到本發(fā)明各惰性氣體的特異性抑制。
可在任何使用酶的實際應用中，利用本發(fā)明來調節(jié)酶活性。例如，本發(fā)明可有利地用于抗生素如青霉素生產(chǎn)中、用于乙醇和乙酸生產(chǎn)中、用于制造診斷藥盒、用于制造發(fā)酵產(chǎn)品如啤酒、白酒和干酪，以及用于大規(guī)模酶促轉化中。
如上面提到的，本發(fā)明可有利地應用于調節(jié)已鑒定的六大類酶中的任何一種酶的活性。這些酶的例子可以是但不只限于下列一些酶。
本發(fā)明特別可用于調節(jié)氧化還原酶類，如包括脫氫酶、氧化酶、過氧化酶、羥化酶及加氧酶。氧化還原酶的特定例子是酪氨酸酶、葡萄糖氧化酶、3-羥基丁酮脫氫酶、牛磺酸脫氫酶、章魚堿脫氫酶、偶氮苯還原酶、乙酰吲哚氧基氧化酶、亞?；撬崦摎涿?、假單胞菌細胞色素氧化酶、3-羥基鄰氨基苯甲酸氧化酶、氯過氧化物酶、細胞色素C3加氫酶、鄰羥苯丙酸3-單加氧酶、CDP-4-酮-6-脫氧-二葡萄糖還原酶及紅氧還蛋白NaD+還原酶和氯酸鹽還原酶。但可使用任何一種氧化還原酶。
可按照本發(fā)明進行調節(jié)的第二類酶是轉移酶。轉移酶特定例子是肌肽N-甲基轉移酶、3-氧?；；d體蛋白合酶、海帶糖磷酸轉移酶、半乳糖6-硫酸化酶、二碘酪氨酸氨基轉移酶、景天庚酮糖基激酶和鞘氨醇半乳糖苷硫酸轉移酶、8-谷氨酰轉肽酶和天冬氨酸氨基轉移酶。但任何轉移酶均可使用。
可按照本發(fā)明調節(jié)的第三類酶是水解酶，如包括酯酶、磷酸酶、葡糖苷酶和肽酶。
水解酶的特定例子是二氫香豆素水解酶、β-D-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、核糖同型半胱氨酸酶、?；邗１彼狒然拿?、脲基琥珀酸酶、根皮素水解酶及2-鹵酸脫鹵酶。但可以使用任何一種水解酶。
可按照本發(fā)明調節(jié)的第四類酶是裂解酶，如包括脫羧酶、醛縮酶和脫水酶。裂解酶的特定例子是苯丙氨酸解氨酶、檸檬酸合成酶、甲基乙醛酰合酶、脲基甘醇酸酯裂解酶、蒜氨酸裂解酶、分支酸合酶及烷基汞裂解酶。但任何裂解酶均可使用。
可按照本發(fā)明調節(jié)的第五類酶是異構酶，如包括消旋酶、表異構酶、順-反異構酶、分子內(nèi)氧化還原酶和分子內(nèi)轉移酶。其特定例子可以是磷酸葡萄糖異構酶、UDP阿拉伯糖4-表異構酶、馬來酰乙酰乙酸異構酶、分支酸變位酶和己二烯二酸環(huán)異構酶。但任何異構酶均可使用。
可按照本發(fā)明調節(jié)的第六類酶是連接酶，如包括氨基酸-RNA連接酶、酸-硫醇連接酶、酰胺合成酶、肽合成酶和環(huán)化連接酶。可特別提到的連接酶例如有乙酰膽堿合酶、絲氨酰-2-RNA合成酶、肌肽合成酶和甲基豆酰CoA羧基酶。但任何一種連接酶均可使用。
雖然總的說來本發(fā)明提供了一種調節(jié)酶活性的方法，但也提供了其他幾種特定方法。
第一，本發(fā)明還提供了使一種或多種酶與包括一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以提高酶活性的方法。
第二，本發(fā)明還提供了使一種或多種酶與包括一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以抑制酶活性的方法。
第三，本發(fā)明提供了通過使一種或多種酶與包含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以轉移其最適PH和/或溫度的方法。
第四，本發(fā)明提供了通過使一種或多種氧化還原酶與包含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以調節(jié)氧化還原酶活性的特定方法。
第五，本發(fā)明還提供了通過使一種或多種水解酶與包括一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以調節(jié)水解酶酶促活性的特定方法。
第六，本發(fā)明還提供了通過使一種或多種裂解酶與包括一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體與接觸以特異性調節(jié)裂解酶酶促活性的方法。
第七，本發(fā)明還提供了通過使一種或多種異構酶與包括一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以特異性調節(jié)異構酶酶促活性的方法。
第八，本發(fā)明還提供了通過使一種或多種連接酶與包括一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以特異性調節(jié)連接酶酶促活性的方法。
第九，本發(fā)明還提供了通過使一種或多種轉移酶與包括一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以特異性調節(jié)轉移酶酶促活性的方法。
第十，本發(fā)明還提供了通過使一種或多種酶與包括一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以改變最適相對酶-底物濃度的方法。
第十一，本發(fā)明還提供了選擇性調節(jié)兩種或多種酶混合物中之一種酶的方法。
應強調指出的是，上面列出的六大類酶中個別酶的例子只是作為舉例說明而不是只限于這些酶。根據(jù)本發(fā)明，任何酶都可使用本發(fā)明的氣體或氣體混合物進行調節(jié)。例如，可按照本發(fā)明調節(jié)EnzymesbyMDixonandE。C.Webb，ThirdEdition(AdademicPress)中所述的酶。
一般說來，如上所述的含有一種或多種惰性氣體的氣體可以是單一的、純的惰性氣體或惰性氣體的混合物。所說的氣體也可以是一種或多種氣體與上述其他氣體的混合物。
酶可以是任何形式的。例如，被調節(jié)的酶可以是含水、水基或無機溶液。酶也可以是在其他基質如凝膠中。另外，酶可以是結合或未結合形式的，甚至是在細胞或活細胞或植物或其他組織中呈結合形式的。
例如，在使用本發(fā)明調節(jié)結合的酶時，可以許多應用形式使用本發(fā)明。例如，可在分批反應器、連續(xù)流動的攪拌罐式反應器、柱狀反應器，如充填床反應器或流化床反應器中使用。
此外，當酶提供的成本太多或不能純化時，或者當酶從其天然環(huán)境中除去后不穩(wěn)定時，使在細胞中的結合酶是有利的。例如，可使用假單胞菌(Pseudomonasputida)的固相化細胞制備L-瓜氨酸，并可使用(Achromobacterliguidium)的固相化細胞制備尿刊酸。
此外，本發(fā)明還可用于調節(jié)與酶電極結合之酶的活性，如用于使用葡萄糖氧化酶檢測葡萄糖的電極。
本發(fā)明可有利地用于以可控制和可預見的方式調節(jié)酶活性。
為了進一步描述本發(fā)明，下面將對六大酶類中的每一類逐一進行更詳細地討論。
Ⅰ.氧化還原酶一般說來，氧化還原酶可受到惰性氣體的強烈抑制。但對于不同的惰性氣體或不同的惰性氣體混合物來說，抑制程度可有所不同。
氙對氧化還原酶反應的速率表現(xiàn)有最大抑制作用，并可抑制反應的終平衡。其他稀有氣體也都抑制此反應速率并壓低反應平衡到一較低程度，這一程度則取決于它們的溶解度和分子特性。氪比氙的作用稍小，且氬在低溫度下很活潑。因此，根據(jù)本發(fā)明，可依據(jù)使用的是室溫還是冷凍溫度，用不同的氣體混合物將氧化還原酶活性調節(jié)到最佳程度。
使用一種或多種希有氣體或其混合物時，可依據(jù)所使用的確切氣體或混合物、底物、溫度及氣體壓力獲得可變程度的氧化還原酶抑制作用。
Ⅱ.轉移酶一般說來，轉移都可被抑制。例如，氨基轉移酶和轉肽酶可被稀有氣體或其混合物抑制。
一般氪表現(xiàn)有最大抑制作用，或者依據(jù)被調節(jié)之轉移酶的亞類不同而存在某些變異。相反，氖則根據(jù)轉移酶的不同亞類表現(xiàn)有較低的抑制作用或提高作用。
Ⅲ。水解酶稀有氣體或其混合物可強烈提高所有水解酶的活性。
特別是氙表現(xiàn)有最大增強效應，而氪則表現(xiàn)有很小的效應。
但必要時也可抑制水解酶。
Ⅳ。裂解酶一般說來，稀有氣體或其混合物可強烈或中度提高裂解酶活性。但有些氣體則在亞最適條件下抑制裂酶酶促活性。
氙表現(xiàn)有最大增強效應，而氬則表現(xiàn)最小增強效應。
Ⅴ.異構酶一般說來，希有氣體或其混合物可強烈或中度提高異構酶活性。
然而，氬和含有氬的混合物可被誘導以在較高溫度下抑制酶活性。
Ⅵ.連接酶(合成酶)一般說來，稀有氣體或其混合物可強烈提高連接酶活性。
為了更清楚地了解用于檢測本發(fā)明一種或多種稀有氣體對酶促活性之效應的方法，現(xiàn)對一種典型的和舉例說明的實驗方法作如下描述一般方法溶液制備在適當緩沖液(對于酶有最適PH和摩爾濃度)中稀釋酶(單位/ml)和底物(μg/ml)以制備最佳化W/V溶液。溶液在氣體實驗中只用一次，以避免活性喪失。可利用各種不同的酶和底物濃度及抑制劑。必要時可改變物理參數(shù)。
分光光度裝置使用溫度控制的、接有IBMPS/230個人計算機的Perkin-ElmerLambda6UV/ViS分光光度計進行實驗分析。IBM裝有兩個軟盤(PECSS或UVDM用于記錄和評閱光譜，改良的ENZFITTER和Grafit用于作動力學研究)。
全量程光譜取得酶和底物以及完成之反應混合物的全量程光譜，以便確定在確切時間追蹤酶促反應的適當波長(相當于主吸收峰的波長)。測定吸收的波長并制成空白對照?？墒褂蔑@色底物，在某些情況下，可將顯色反應與正在研究的酶反應偶聯(lián)起來。
稀釋系列在氣體實驗前進行系列稀釋以找出最適酶/底物比例。在最適條件下進行反應，然后用超最適和亞最適底物范圍，繼之再用各種抑制劑進行反應。
硅封口小池的制備用硅橡膠密封層封閉1Cm光程丙烯酸或石英小池。硅須固化48小時以得到密封的小池。用空氣吹除任何可用GC/MS檢測到的化學氣體污染物，并進行漏氣試驗。
樣品的制備借助氣密注射器在小池內(nèi)充入2ml底物溶液。在密封的血清小瓶中充入酶和溶劑。在小池和血清小瓶中連續(xù)吹入足夠氣體，且在注射至氣體達到最大平衡間間隔/小時。在充入適當氣體之前，所有注射器和死空間都要吹除氣體污染物。檢測所用氣體的量以足夠飽和所需溶液。
對照組所有可能的干擾參數(shù)均須嚴加控制，包括T、P、其他氣體、空氣漏失、材料、氣體和試劑質量變化、pH。重復進行以達到有效位數(shù)。
分光光度定時推進、反應速率及動力學分析分析前各小池和血清管用氣體飽和40分鐘。用充氣注射器回收0.5ml酶溶液以避免空氣接觸。同時用注射器注射0.5ml酶，以使各樣品均在同一時間開始分析。在不同溫度(0℃至60℃)分析各7種氣體(空氣、O2、N2、Ne、Ar、Kr、Xe)。記錄反應速率或終反應平衡對環(huán)境空氣的改變。同時對加氧和脫氧合條件進行比較。還在加壓下制備某些樣品。
完整實驗方案在完整實驗中，使有最適pH和緩沖鹽濃度的酶與5種濃度的底物在有1個大氣壓下稀有氣體的溶液(飽和溶液)中，以10%和50%飽和度，并在1.5和2個大氣壓下及至少一個更高壓力下，同時添加相當于在1和2個大氣壓總壓力下之占總氣體10%、20%和50%氧的條件下進行反應，其中各溫度由0-65℃以5℃之差遞增，使用N2、O2、Ar、Ne、Kr、Xe、空氣，有時使用其他氣體，以及使用上述氣體的十分位數(shù)混合物，同時使酶在控制靜水壓條件下接觸到很高的壓力。在真空抽空溶液后還進行對照實驗。在快速掃描分光光度儀中以比色法監(jiān)測反應，并對信號進行術學處理以得到速率和產(chǎn)率差值。樣品數(shù)是恒定的并足以保證結果的顯著性。所有參數(shù)都獨立控制并測定，有時還進行更為復雜的實驗。
數(shù)據(jù)以真實時間產(chǎn)物生成曲線圖(標準速率曲線)的形式得到，每個樣品小池有一個數(shù)據(jù)，其在標準程序下重迭，以便對每6-12個小池實驗產(chǎn)生一個重復占位。這樣一個占位數(shù)據(jù)被附加上去。也產(chǎn)生出構成這些曲線外加所有機械參數(shù)的X-Y數(shù)據(jù)點表格。這些數(shù)據(jù)可進一步轉化為曲線間的計算差值，產(chǎn)率間差值、速率間差值或其他邏輯比較值。使用n個單獨的軟件程序計算這些數(shù)據(jù)，所說的程序利用了簡單或復雜的普通數(shù)學表達法、線性和非線性回歸曲線擬合、對數(shù)正常轉化、酶促速率計算(Michaelis-Menten，Eadie-Hofstee，Lineweaver-Burk)以及時間依賴性多變量分析。
為了更完整地描述本發(fā)明，現(xiàn)提供下列一些實施例以進一步舉例說明，這些實施例并不限制本發(fā)明的范圍。
第Ⅰ類。氧化還原酶(ECl)實施例1酪氨酸酶;25℃和最適反應條件，用體簡單飽和溶液稀有氣體或混合物效應Xe-73%(抑制)Kr-73%Ar-60%Ne-46。7%90∶10Xe∶Krmix-50%Ar∶Xe99∶1-70%
實施例2葡萄糖氧化酶稀有氣體或混合物效應Xe-91。6%(抑制)Kr-92。7%Ar-85。8%Ne-61。7%類的畸峰Xe-95%(抑制)Kr-91%Ar-91%Ne-85%應注意的是，上述結果是依賴于溫度和底物濃度的。
第Ⅱ類。轉移酶(EC2)實施例3r-谷氨酰轉肽酶稀有氣體或混合物效應Xe-7%(抑制)Kr-8%Ar-5%Ne-3%
實施例4天冬氨酸氨基轉移酶稀有氣體或混合物效應Xe-17%(抑制)Kr-82%Ar-17%Ne-12%第Ⅲ類。水解酶實施例5β-D-葡糖苷酶稀有氣體或混合物效應Xe+40%(增強)Kr+14%Ar+16%90∶10Xe∶Kr+18%混合物上述結果取決于溫度、底物濃度及底物類型。在加入不同的竟爭底物后，使用氙得到高達200%的增強作用。
第四類.裂解酶(EC4)實施例6結果隨溫度和〔E/S〕的不同而變化。對于檸檬酸合成酶復合反應35℃25℃10℃Xe+320+18Kr+32+6+3790:100+16-32Ar-15-10+25Ne-14+9+11N2-17 -25 -6實施例7對于具有最適酶濃度的苯丙氨酸解氨酶:
Xe+18+3+5Kr+7+4+490:10+5+2+1Ar+6+1+3Ne-2+6-6N2+19 0 +6實施例8對亞最適酶濃度的苯丙氨酸解氨酶:
Xe+14+8+11Kr+3+18+1490:10+5+8+6
Ar-1+1+6.5Ne+150+6N20 0 +12第Ⅴ類。異構酶(EC5)實施例9磷酸丙糖異構酶，10℃稀有氣體或混合物效應Xe+24%(增強)Kr+12Ar+8%(但在25℃時產(chǎn)生-37%抑制)90∶10Xe∶Kr+6。3%實施例10磷酸葡萄糖異構酶稀有氣體或混合物效應Xe+186%(下延-61%)Kr+206.4%Ar+232。5%Ne+107%(下延-45%)下延值是指在正最適底物濃度或溫度條件下出現(xiàn)的。
第Ⅵ類。連接酶(合成酶)(EC6)這些酶的活性均提高，但變異很大;有極活躍的位點特點性。
觀察到的最大增強作用對觀察到最大抑制作用(依賴于溫度)實施例11乙酰S-CoA合成酶在包括水解酶反應的偶聯(lián)的復合反應系列中Xe+18.3%/-25。0%Kr+16。1%/-34。6%Ar+67。7%/+34。6%Ne+2。3%/-21.9%90/10+16.1%/-38.5%N2+31.2%/-39。5%實施例12作為孤立的反應Xe+15。4%/-39。5%Kr+5。0%/-52。6%Ar+75。4%/-27.6%90/10+5。0%/-57.9%N2+35.7%/-118.7%一般在較高溫度下發(fā)生抑制作用，在低溫度發(fā)生增強作用。通常氮在超最適溫度時比稀有氣體有更小的效應。我們注意到在對于該反應來說為超最適的條件下，增進這一反應的稀有氣體趨向于使反應有最佳產(chǎn)率和速率。同時在最造條件下得到的混合結果取決于所用的氣體。
下面將參照其他實施例進一步描述本發(fā)明，這些實施例只是為了舉例說明之目的，而無意限制本發(fā)明。
酪氨酸酶催化的反應酪氨酸酶(一元酚，二羥苯丙氨酸氧，氧化還原酶;EC1.14。18。1)是一種一元酚單加氧酶，它催化鄰-二酚生成鄰一苯醌的反應。
酪氨酸酶在果實褐變和食品腐敗中起重要作用。
1.實驗方案1).溶液制備在磷酸鈉緩沖液(pH6。85，酶的最適pH)中稀釋酶(單位/ml)和底物(μg/ml)以制備10%(W/V)溶液。在水箱(0-5℃)中保存該溶液，并在2或3天內(nèi)使用以避免活性喪失。
2)。分光光度裝置用接有IBMPS/230個人電腦的Perkin-ElmerLambda6UV/ViS分光光度儀進行實驗檢測。IBM裝有兩個軟件組合(PECSS用于記錄和評閱光譜，ENZFIJTER用于動力學研究)。
3)，全量程光譜取得E、S及E+S的全量程光譜以確定追蹤酶促反應的適當波長(相當于主吸收峰的波長)。
4).系列稀釋對E/S、S/E進行系列稀釋、以在氣體實驗前找出最佳〔E〕/〔S〕比例。根據(jù)吸光率讀數(shù)，選擇最好的兩個空白(緩沖液+E或緩沖液+S)。
5).硅密封之小池的制備用清徹的硅橡膠密封劑封閉1Cm光程聚乙烯一次性小池。為了得到氣密小池，硅應固化48小時。
6).分析樣品的制備借助氣密注射器在聚乙烯小池內(nèi)裝入2ml底物溶液。氣密血清瓶內(nèi)裝入酶。在小池和血清瓶內(nèi)連續(xù)吹入3×10cc氣體，兩次注射間間隔1小時。將死體積重復置換10次。以使氣體達到最大平衡。在充入適當氣體之前，應吹洗所有注射器和死空間。第3次注射10cc后，將小池和血清瓶在0-5℃水箱中在兩個裝有適當氣體的cc注射器下放置過夜。
7)。對照組所有可能的干擾參數(shù)，包括T、P、其他氣體、空氣漏失、材料、氣體和試劑質量變異、pH等均須控制。重復進行到有效位數(shù)。
8)。分光光度分析分析前40分鐘在小池和血清瓶中充入10cc氣體。用充氣的注射器回收0。5ml酶溶液以避免空氣接觸。對各樣品均同時用注射器注射0.5ml酶，以使反應都在to時間開始。各在5個不同溫度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)分析七種氣體(空氣、O2、N2、Ne、Ar、Kr、Xe)。記錄反應速率和反應終平衡對環(huán)境空氣的改變。
2.試劑酪氨酸酶(SigmaChemicalCo.，St。Louis，Mo)商品目錄編號.T-7755(批號48F-9610)·一元酚單加氧酶;多酚氧化酶;兒萘酚氧化酶;一元酚二羥苯丙氨酸氧氧化還原酶;EC1、14、18、1)·得自蘑菇
。25，000單位12mg固體2，200單位/mg固體(酪氨酸酶活性)·酪氨酸酶單位定義使用L酪氨酸作底物時，在pH6.5、25℃條件下1單位酶每分鐘將使A280增加0.001。反應體積3ml(1Cm光程)·在0℃下干燥保存L-酪氨酸(SigmaChemicalCo.，StLouis，Mo)·產(chǎn)品目錄編號No、T-3754(批號48F-0833)·L-3-〔4-羥苯基〕丙氨酸·游離堿(pfs)結晶·無水分子量181。2·在室溫下保存(25℃)磷酸二氫鉀(EKIndusties，Addison，IL)·商品目錄編號No。8680·NaH2Po4·H2O·結晶試劑·FW137。99磷酸氫二鈉(EKIndusties，Addison，IL)·商品目錄編號No。8720·Na2HPo4·無水的·FW141。96去離子水H2O(Barnstead NANopure Ⅱ)
3。溶液制備磷酸鈉緩沖液pH6。85(25℃)·138gNaH2PO4·H2O·142gNa2HPO4·在20L D。I H2O中·儲存于室溫(25℃)下塑料桶內(nèi)酪氨酸酶溶液(100μg/ml;208單位/ml，2。08單位/μg)·10%(W/V)，在磷酸鈉緩沖液中·反復顛倒混合幾次以溶解內(nèi)容物·放在放有鋁箔的125mlHDPE瓶中于冰箱(0-5℃)內(nèi)保存(以避免光降解)L-酪氨酸溶液(100μg/ml)·10%(W/V)，在磷酸鈉緩沖液中·磁力攪拌(25℃，30分鐘)·在250ml琥珀色玻璃瓶中于冰箱(0-5℃)中保存4。氣體空氣(環(huán)境)氬(Alphagaz，分析純)氪(Alphagaz，分析純，最低純度99。995%〔ppm〕)氖(Alphagaz，分析純，最低純度99。999%〔ppm〕)氮(Alphagaz，分析純，最低純度99。9995%〔ppm〕)氧(Alphagaz，分析純，最低純度99。997%〔ppm〕)氙(Alphagaz，分析純，最低純度99.995%〔ppm〕)
5。儀器和材料5。1儀器裝有自動傳輸熱電的5小池夾持器(5×5樣品和參考池儲存罐，參考小池夾持器，C005-0515型)的Perkin-ElmerLambda6UV/VIS分光光度儀(窄波帶寬度分光光度儀)Perkin-ElmerLambda附件連接裝置(691-0000型)Perkin-Elmer數(shù)字控制器(C570-0701型)Perkin-Elmer溫度程序器(C570-0710型)IBMPS/230個人計算機EpsonEX800打印機軟件·IBMDOS(光盤操作系統(tǒng)變型3。30，BocaRatonFL)·PECSS(Perkin-Elmer計算機化光譜學軟件，Norwalk，CT)·ENZFITTER(非線性回歸數(shù)據(jù)分析程序，Elsevier-BIOSOFT，Cambridge，UV)·PIZAZZPLUS(打印增強軟件，APTEC，Repperell，MA)MettlerAE100天平·稱重范圍0…109g·可讀性0.1mgBarnsteadNANopureⅡ柱體去離子化系統(tǒng)，TokyRikakikaiCo。MicroTubingPumpMp-3(用于Perkin-Elmer水冷卻測定池)5。2材料100、200ml量瓶FISHERbrand丙烯酸塑小池(標準型/異丁烯酸酯/UV級/一次性)1Cm光程，能夠裝3ml溶液的正方形小池100%硅橡膠粘封劑(透明的)3ml加橡膠蓋的血清瓶1ml一次性血清學移液管(1/100ml)1cc一次性結核菌素注射器(1/100ml)10cc一次性注射器20G11/2一次性針頭6。技術設計6。1最初觀察對酪氨酸酶、L-酪氨酸和酶促反應的終產(chǎn)物進行全量程掃描(900-190nm)6。1。1實驗構成PARAM吸收率縫隙1nm掃描速度1，500nm/分鐘反應時間1秒自動儲存(Asave)(+)AZERO本底校正(900-190nm)SCAN數(shù)據(jù)間隔1.0nm溫度室溫(26℃)，溫度程序控制
6。1。2全量程掃描〔900-190nm〕掃描酪蛋白酶(圖1)樣品＝2.5ml酪蛋白酶(100μg/ml)空白＝2。5ml磷酸鈉緩沖液，存儲信息名稱T775501。SP〔900-190nm〕掃描L-酪氨酸(圖2)樣品＝2。5mlL-酪氨酸(100μg/ml)空白＝2。5ml磷酸鈉緩沖液存儲信息名稱T375401。SP〔900-190nm〕掃描終產(chǎn)物(圖3)樣品＝2mlL-酪氨酸(100μg/ml)+0.5ml酪氨酸酶(100μg/ml)20分鐘反應后空白＝2mlL-酪氨酸(100μg/ml)+0.5ml磷酸鈉緩沖液存儲信息名稱TCEB0081.SP6.1。3主吸收峰的確定為此目的，使用自動記錄游標酪氨酸酶吸收峰在275nm(蛋白質)L-酪氨酸吸收峰在275nm反應終產(chǎn)物吸收峰在480nm和305nm6.1.4.確定適當波長以進行反應重迭三個全程光譜(圖5)提示在480和305nm處可得到L-酪氨酸之酶促氧化還原作用的最適觀察結果。
6.1。5。確定適當?shù)摹睧〕/〔S〕比例T-3754T-7755磷酸鈉最終(100μg/ml)(100μg/ml)緩沖液[E](ml)(ml)(ml)(100μg/ml)樣品520.10.420樣品420.20.340樣品320.30.260樣品220.40.180樣品120.50.0100使用測定池程度器(CPRG)指令進行定時驅動，其可同時記錄多達5個小池的定時驅動(Time-Drive)數(shù)據(jù)。
波長480nm重迭(圖6)45個點，60秒間隔 ( )/() 進行45分鐘TCEB0091.SP[enz.]=100μg/ml小室1:
TCEB0092.SP[enz.]=80μg/ml小室2:
TCEB0093.SP[enz.]=60μg/ml小室3:
TCEB0094.SP[enz.]=40μg/ml小室4:
波長305nm重迭(圖7)60個點，60秒間隔 ( )/() 進行1小時
TCEB010I.SP[enz.]=100μg/ml小室1:
TCEB0102.SP[enz.]=80μg/ml小室2:
TCED0103.SP[enz.]=60μg/ml小室3:
TCEB0104.SP[enz.]=40μg/ml小室4:
TCEB0105.SP[enz.]=20μg/ml小室5:
結論最適條件是〔E〕/〔S〕(100μg/ml)/(100μg/ml)，在305nm觀察吸光率改變。
6。2預備實驗6.2.1。樣品和參比池的制備氙飽和的樣品(參見加樣步驟)空氣樣本用1ml吸管在丙烯酸小池內(nèi)加入2ml底物T-3754，并加蓋塑料蓋。
其后該步驟由使用塑料蓋改為使用硅密封的小池。未見有明顯差異。
參比樣品(空白)丙烯酸小池加蓋塑料蓋。
·B12mlT-3754(100μg/ml)+0.5ml磷酸鈉緩沖液·B22ml磷酸鈉緩沖液+0。5mlT-7755(100μg/ml)。
6.2。2。于305nm定時驅動空白B1·空氣樣品歸檔名稱TCEBO114。SP·氙樣品歸檔名稱＝TCEBO115.SP
空白B2·空氣樣品歸檔名稱＝TCEBO116。SP氙樣品歸檔名稱＝TCEBO117。SP發(fā)現(xiàn)L-酪氨酸空白(B1)降低吸光率讀數(shù)，所以優(yōu)先使用酪氨酸酶作空白的實驗(B2)。
這4個定時驅動(time-drie)實驗顯示氙的最適抑制曲線。在繼后檢測(6.3.7。和7。2。)L-酪氨酸溶液不斷消耗，從而導致吸光率讀數(shù)衰減。
6。3。技術設計6。3。1。步驟1硅密封小池的制備用干凈的硅橡膠密封器密閉一次性丙烯酸小池。使硅干燥24小時。24小時后，得到氣密的丙烯酸小池，用在水下充氣試驗。
6。3。2.步驟2底物加樣程序借助1cc注射器(1/100cc)在硅密封的丙烯酸小池內(nèi)充入2ml底物為了得以準確加樣，放出注射器內(nèi)液體并排空空氣(其可干擾底物溶液體積)。
將充滿的小池保存在冰箱(0-5℃)中。
在加塑料蓋的小池內(nèi)制備空白B1(2mlT-3754+0.5ml磷酸鈉緩沖液)。其后改為使用硅密封的小池。
6.3。3.步驟3酶加樣程序借助1ml吸管(1/100ml)在血清瓶內(nèi)加入2ml酶，用橡膠隔膜蓋住并用鋁蓋卷曲密封。血清小瓶是不透氣的。
充滿的血清瓶保存在冰箱(0-5℃)中。
6。3。4。步驟4氣體飽和步驟(氬、氪、氖、氧、氙)將3×10cc氣體連續(xù)鼓泡注入硅密封的小池和血清瓶(T-3754，T-7755)中，注射間等候1小時。此代表了10次置換氣體積，同時達到氣體的最大平衡。
在充入適當氣體之前弄空所有注射器和死空間。第三次注射10cc后，在0-5℃冰箱中于兩個充有適當氣體的10cc注射器下，將硅密封的小池和血清瓶放置過夜。
6。3。5。附注空氣樣品(酶和底物)不能遭受任何吹泡處理。用普通乙烯蓋(非氣密的)封蓋丙烯酸小池。再后改為使用硅密封的小池。與密封的吹入空氣的處理多次比較明顯兩種方法間沒有差異。
6。3。6。步驟5分光光度檢測a。從冰箱中取出硅密封的小池、血清瓶和塑料蓋小池。這一步后來作了改變(見7。1。5。)b。在硅密封小池和血清瓶內(nèi)充入10cc氣體并在兩個10cc注射器下室溫(26°)放置。
c。將小池放在小室儲氣罐中并使其溫度與小室儲氣罐平衡10分鐘。
d。1cc注射器充入適當氣體并用以從血清瓶中抽回0。5ml酶溶液，以避免在加樣(酶)時在小池內(nèi)引入空氣。
e。檢測從小室5至小室1盡可能快地用0。5ml注射器連續(xù)向小池內(nèi)注入酶(延遲X＝2秒)。該步驟其后改為同時注射。
6。3。7。分光光度檢測在305nm處定時驅動60個點，60秒間隔 ( )/() 檢測1小時檢測1T1＝15℃(TS＝TR＝15.1℃)存儲資料名稱氣體小室1號B1TIG2.SP氖小室2B1T1G3.SP氬小室3B1T1G4.SP氪小室4B1T1G5.SP氙小室5檢測2: T1=15℃(TS=TR=15.1℃)存儲資料名稱氣體小室1號B1T1G6.SP空氣小室1B1T1G7.SP氧小室2檢測3: T2=20℃(TS=TR=20℃)存儲資料名稱氣體小室1號B1T2G1.SP空氣小室1B1T2G2.SP氖小室2B1T2G3.SP氬小室3B1T2G4.SP氪小室4B1T2G5.SP氙小室5
檢測4: T2=20℃(TS=TR=20℃)存儲資料名稱氣體小室1號B2T2G6.SP氧小室1檢測5: T3=25℃(TS=TR=24.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B1T3G1.SP空氣小室1BIT3G2.SP氖小室2B1T3G3.SP氬小室3B1T3G4.SP氪小室4B1T3G5.SP氙小室5檢測6: T3=25℃(TS=TR24.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B1T3G6.SP氧小室1檢測7: T4=30℃(TS=TR=29.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號BIT4G1.SP空氣小室1B1T4G2.SP氖小室2B1T4G3.SP氬小室3B1T4G4.SP氪小室4B1T4G5.SP氙小室5
檢測8: T4=30℃(TS=TR=29.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B1T4G6.SP氧小室1檢測9: T5=35℃(TS=TR=34.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B1T5G1.SP空氣小室1B1T5G2.SP氖小室2B1T5G3.SP氬小室3B1T5G4.SP氪小室4B1T5G5.SP氙小室5檢測10: T5=35℃(TS=TR=34.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B1T5G6.SP氧小室17.3.圖解結果定時驅動重迭/溫度-附頁時間驅動重迭/氣體-附頁
7.最后程序7.1.最后實驗方案7。1。1。步驟1硅密封小池的制備同6.3.1.，但使硅固化48小時，以除去乙酸蒸氣，后者可干擾對酶的抑制作用。這一點已經(jīng)過試驗證實。
7.1.2.步驟2底物加樣步驟圖6.3.2。
按同樣方法(在硅密封的小池中)制備空白B2(2ml磷酸鈉緩沖液+0.5mlT-7755)，但不經(jīng)過氣體飽和步驟(7.1.4。)。
對照檢查顯示在工作吸收率范圍內(nèi)任何氣體都沒有吸收。
7.1.3。步驟3酶加樣步驟同6.3.3。
7.1.4。步驟4氣體飽和步驟(空氣、氬、氪、氮、氧、氙)在硅密封的小池和血清瓶(T-3754，T-7755)中注射吹入3×10cc氣體，每次氣體注射間隔20分鐘。
第三次10cc注射后，在0-5℃冰箱中于裝有適當氣體的兩個10cc注射器下放置過夜。
7.1.5。步驟5分光光度檢測a.實驗檢測前40分鐘從冰箱內(nèi)取出硅密封的小池，充入10cc氣體并在兩個10cc注射器下室溫(26℃)放置。
b.實驗檢測前25分鐘從冰箱內(nèi)取出血清瓶，充入10cc氣體并在兩個10cc注射器下放回冰箱內(nèi)。
c.檢測前15分鐘，從硅密封的小室內(nèi)取出10cc注射器(及針頭)。將小池放入小室夾持器內(nèi)并使之與小室夾持器溫度平衡10分鐘。
d.檢測前5分鐘，在1cc注射器內(nèi)充入氣體并用于回收血清瓶中的0.5ml酶溶液，以避免加酶樣品時在瓶內(nèi)引入空氣。
e。檢測從小室氣中取出硅密封的小池并開口以排出可能形成的氣泡，同時將小池加溫(特別定在30和35℃)，并重新放在小室夾持器中。
同時用注射器注射0.5ml酶，以使各樣同在to時間開始反應。
7.2.分光光度檢測于305nm處定時驅動200個點，18秒間隔 ( )/() 測1小時7.2.1.檢測1T1＝15℃(TS＝TR＝15.1℃)存儲資料名稱氣體小室1號B2T1G1.SP空氣小室1B2T1G2.SP氖小室2B2T1G3.SP氬小室3B2T1G4.SP氪小室4B2T1G5.SP氙小室57.2.2. 檢測2: T1=15℃(TS=TR=15.1℃)存儲資料名稱氣體小室1號
B2T1G6.SP空氣小室1B2T1G7.SP氧小室2B2T1G8.SP氮小室37.2.3. 檢測3: T2=20℃(TS=TR=19.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B2T2G1.SP空氣小室1B2T2G2.SP氖小室2B2T2G3.SP氬小室3B2T2G4.SP氪小室4B2T2G5.SP氙小室57.2.4. 檢測4: T2=20℃(TS=TR=19.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B2T2G6.SP空氣小室1B2T2G7.SP氧小室2B2T2G8.SP氮小室3
7.2.5. 檢測5: T3=25℃(TS=TR=24.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B2T3G1.SP空氣小室1B2T3G2.SP氖小室2B2T3G3.SP氬小室3B2T3G4.SP氪小室4B2T3G5.SP氙小室57.2.6. 檢測6: T3=25℃(TS=TR=24.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B2T3G6.SP空氣小室1B2T3G7.SP氧小室2B2T3G8.SP氮小室37.2.7. 檢測7: T4=30℃(TS=TR=29.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B2T4G1.SP空氣小室1B2T4G2.SP氖小室2B2T4G3.SP氬小室3B2T4G4.SP氪小室4B2T4G5.SP氙小室5
7.2.8. 檢測8: T4=30℃(TS=TR=29.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B2T4G7.SP空氣小室2B2T4G8.SP氧小室3B2T4G9.SP氮小室47.2.9. 檢測9: T5=35℃(TS=TR=34.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B2T5G1.SP空氣小室1B2T5G2.SP氖小室2B2T5G3.SP氬小室3B2T5G4.SP氪小室4B2T5G5.SP氙小室57.2.1.0. 檢測10: T5=35℃(TS=TR=34.9℃)存儲資料名稱氣體小室1號B2T5G6.SP空氣小室1B2T5G7.SP氧小室2B2T5G8.SP氮小室3
7.3.圖解結果時間驅動重迭/溫度-附頁時間驅動重迭/氣體-附頁7.4.酶動力學ENZFITTER根據(jù)上述由酪氨酸酶-L-酪氨酸反應得到的結果，可獲得下列結論。
氙可顯著抑制酪氨酸酶-L-酪氨酸反應的速率并抑制反應終平衡。此外，其他稀有氣體則依據(jù)它們的溶解度和分子特性以較小程度抑制反應速率和阻抑終平衡。一般氪的效力與氙相似，但較小，而氬在低溫度下表現(xiàn)有令人驚奇的活性。
另外，可通過使用氮控制氧消耗的效應。當與氬相比較時，發(fā)現(xiàn)氮缺乏與活性部位相互作用的能力。相對氮，氬似乎更活躍。這一點對于其酶類似乎也是同樣的。
因此溶解度差異只能解釋這種抑制作用的一部分原因，所以肯定發(fā)生了活性位點相互作用或誘導了蛋白質構象的改變。
動力學實驗包括下述內(nèi)容。
高壓實驗在實際時間中于2個大氣壓或3個大氣壓下使溶液飽合后，或在30.6個大氣壓及100個大氣壓在1升氣缸中加壓1小時或-24小時后，在用附加試驗氣體加壓的壓力小室中進行實驗。
使用下列實驗設計。
內(nèi)容高壓對酶的影響理論我們將向高壓環(huán)境引入酶并確定它們的活性。高壓應抑制酶的活性。
酶酪氨酸酶(Sigma№.T-7755)(一元酚單加氧酶;多酚氧化酶;兒茶酚氧化酶;一元酚二羥苯丙氨酸氧氧化還原酶;EC1.14.18.1);得自蘑菇中。
酪氨酸酶單位定義在3ml含L-酪氨酸的反應混合物中，于PH6.5和25℃條件下，1單位酶每分鐘將使A280增加0.001。
酪氨酸酶活性3870U/mg固體;
7.1mg固體 ( )/() 27.440單位干燥儲存于0℃以下。
底物L-酪氨酸(SIGMA№.T-3754)L-3-〔4-羥苯基〕丙氨酸游離堿(pfs)結晶無水分子量181.2儲存于室溫下(25℃)酶β-D-葡糖苷酶(SIGMA№.G-4511)(苦杏仁酶;β-D-葡糖苷葡糖水解酶EC3.2.1.21)提取自苦杏仁單位定義在PH50和37℃條件下，1單位酶每分鐘將從水楊苷中釋放出1.0μmole葡萄糖。
活性22U/mg固體12mg固體 ( )/() 264單位干燥儲存于0-5℃批號49F-4021
底物對-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(SIGMA№.N-7006)結晶含有2.4%溶劑無水分子量301.3干燥儲存于0℃以下批號129F-5057試驗11/10/91-4/11/91氣體1.空氣;2。N2壓力1.30.6大氣壓(450psi);2.100.0大氣壓(1470psi)對照對照A酶未經(jīng)加壓并不放在氣缸內(nèi)。
對照B酶未經(jīng)加壓但放在氣缸1中。
用氣體1(空氣)的對照組。
對照C酶未經(jīng)加壓但放在氣缸2中。
用于氣體2(N2)的對照組。
溶液制備4/10/91溶液A磷酸鈉緩沖液(PH6.6，25℃)，1L去離子水141.96×0.2×187.5×1/1000＝5.3 g Na2HPO4119.96×0.2×312.5×1/1000＝7.5 g NaH2PO4測得的PH6.502
溶液B酪氨酸酶溶液，在磷酸鈉緩沖液中(228U/ml)14.2mgT-7755稀釋到240mL磷酸緩沖液(PH6.6，25℃)中溶液C50μg/mlL-酪氨酸溶液，在磷酸鈉緩沖液中10mgT-3754稀釋到200ml磷酸鈉緩沖液(PH6.6，25℃)中溶液D磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25°);
2L去離子水2×141.96×0.2×245×1/1000＝13.91g Na2HPO42×119。96×0.2×255×1/1000＝12.20g NaH2PO4測得的PH6.719溶液E100μg/mlβ-D-吡喃葡糖苷溶液，在磷酸鈉緩沖液中25mgN-7006稀釋到250ml磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)液體Fβ-D-葡糖苷溶液，在磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中，(2.18U/ml)24mgG-4511稀釋到242ml磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中。
方法酪氨酸酶4/11/91
將100ml等份的酶溶液放入各2個氣缸中。在氣缸內(nèi)將氣體搖動數(shù)分鐘，然后取5ml用于對照B和對照C的樣品。將氣缸移向裝料臺，用適當氣體充氣;使壓力慢慢達到30.6大氣壓。使其在所需壓力下放置60分鐘。使壓力緩慢降至2psi，然后送到實驗室。
從各氣缸轉移約10ml酶，同時放入量杯中使其保持在氣體中并立即在酶/底物混合物上進行TDrive/CPRG分析。
酶1，氣體1，壓力1，重復1酶1，氣體2，壓力1，重復1將氣缸送回裝料臺并用適當氣體再加壓到200大氣壓。使其在所需壓力下放置60分鐘。緩慢降低壓力至2psi，然后送入實驗室。
從各氣缸中轉移大約10ml酶，同時將其保持在進入不同燒瓶的氣體下并立刻在酶/底物混合物上進行TDrive/CPRG分析。
酶1，氣體1，壓力2，重復1酶1，氣體2，壓力2，重復1β-葡糖苷酶用去離子水沖洗氣缸。然后用第二酶溶液(葡糖苷酶)沖洗氣缸。在每兩個一次性氣體氣缸中放入25ml等分的酶溶液。將各氣缸中酶搖動數(shù)分鐘，然后取5ml樣品用于對照B和對照C。將氣缸移向裝料臺，用適當氣體充氣;使壓力慢慢升高到30.6大氣壓，在所需壓力下擱置60分鐘。再緩慢降低壓力至2psi，然后送入實驗室。
從各氣缸轉移約10ml酶，同時放入燒杯中保留在氣體下和立即對酶/底物進行TDrive/CPRG分析。
酶2，氣體1，壓力1，重復1酶2，氣體2，壓力1，重復1將氣缸放回裝料臺并用適當氣體加壓至100大氣壓。
使之在所需壓力下擱置60分鐘。緩慢降低壓力至2psi，然后送入實驗室。
由各氣缸轉移約10ml酶，同時放入燒杯中繼續(xù)保留在氣體下，并立即就酶/底物混合物進行TDrive/CPRG分析。
酶2，氣體2，壓力2，重復1酶2，氣體2，壓力2，重復1分光光度研究25℃小池最少34個RARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintNCPRG酪氨酸酶305nm80pts ( )/() 測20分鐘間隔16秒Ymin＝0.0Ymax＝2。0
β-葡糖苷酶400nm40pts ( )/() 測10分鐘16移間隔Ymin＝0.0Ymax＝1。5空白酪氨酸酶2ml溶液A+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液D樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液F小室傳送裝置小室1對照A小室2對照B小室3對照C小室4氣體1(空氣)小室5氣體2(N2)存儲資料酪氨酸酶X1P1G1C1…5.SP ( )/() X1P1G1C1…5.SP也定名為X1P1E1C1…5.SP至DOSX1P2E1C1…5.SP ( )/() …5.SP以較高壓力開始，所以我們放出氣泡并對所有5個小室進行全量程掃描全量程掃描900-190nm存儲資料X1SCAN1…5。SP
10個存儲數(shù)據(jù)β-葡糖苷酶X2P1E2C1…5.SPX2P2E2C1…5.SP10個存儲數(shù)據(jù)試驗24/15/91本試驗中我們只作酪氨酸酶的壓力試驗。
氣體1.空氣;2.N2壓力1.30。6大氣壓(450psi);
2.100.0大氣壓(1470psi)對照對照A酶未加壓力且沒有放入氣缸中對照B酶未加壓力但放入氣缸1中。
用于氣體1(空氣)。
對照C酶未加壓力但放入氣缸2中。
用于氣體2(N2)。
溶液制備1/10/91溶液A磷酸鈉緩沖液，在25℃時PH6.6，1L去離子水141.96×0.2×187.5×1/1000＝5.3g Na2HPO4119.96×0.2×312.5×1/1000＝7.5g NaH2PO4測得pH6.502溶液B在磷酸鈉緩沖液中的酪氨酸酶溶液(228U/ml)14。2mgT-7755稀釋到PH6.6(25℃)的磷酸鈉緩沖液中溶液C在磷酸鈉緩沖液中的50μg/mLL-酪氨酸溶液10mgT-3754稀釋到200mlPH66(25℃)的磷酸鈉緩沖液中。
方法酪氨酸酶將25ml等分的酶溶液分別放入2個一次性氣缸中。將各氣缸中的酶搖動幾分鐘，然后除去5ml樣品用于對照B和對照C。
將氣缸移到裝料臺上，用適當氣體充氣。將氣缸加壓并降壓幾次以除去液面上氣體/殘留氣體。使壓力慢慢升高到30.6大氣壓，在所需壓力下擱置60分鐘。緩慢降低壓力至40psi，然后送入實驗室。
從各氣缸轉移約5ml酶，同時在進入不同燒瓶之氣體下保持之，并立即對酶/底物混合物進行TDrive/CPRG分析。
酶1，氣體1，壓力1，重復1酶1，氣體2，壓力1，重復1酶1，氣體2，壓力2，重復2分光光度研究25℃小池最少10個PARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintN
CPRG酪氨酸酶305nm80pts ( )/() 測20分鐘16秒間隔Ymin＝0.0Ymax＝2.0空白酪氨酸酶2ml溶液A+0.5ml溶液B樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0。5ml溶液B試驗觀察溶液C是否仍然可以使用TDrive305nm，80pts，16移間隔S＝2.0mlC+0.5mlBR＝2.0mlA+0.5mlD外存儲資料TYTRL1，SP小室傳輸裝置檢測1100大氣壓小室1對照A小室2對照B小室3對照C小室4氣體1(空氣)小室5氣體2(N2)檢測230大氣壓小室1對照A小室2對照B小室3對照C
小室4氣體1(空氣)小室5氣體2(N2)存儲資料酪氨酸酶X7P2E1C1…5.SPX7P1E1C1…5。SP10個存儲數(shù)據(jù)試驗34/24/91(溶液制備和最始加壓)，4/25/91，4/26/91本試驗中我們作酪氨酸酶的壓力試驗。
氣體1.空氣2.N23.Xe1大氣壓/N2至壓力壓力1.30。6大氣壓(450psi)2.100.0大氣壓(1470psi)對照組對照A酶未受高壓且不放在氣缸中。
溶液制備H/24/91溶液A磷酸鈉緩沖液，在25℃下PH6.82L去離子水2×141.96×0.2×245×1/1000＝13.91g Na2HPO42×119.96×0.2×255×1/1000＝12.20g NaH2PO4測得PH6。740溶液B酪氨酸酶溶液，在磷酸鈉緩沖液中(228U/ml)
14。2mgT-7755稀釋到240ml磷酸鈉緩沖液(25℃下PH6.8)中溶液C50μg/mlL-酪氨酸溶液，在磷酸鈉緩沖液中10mgT-3754稀釋到200ml磷酸鈉緩沖液(在25℃PH6.8)中。
方法酪氨酸酶4/24/91氣缸制備當注射50cc去離子水時將氣缸(3)放在真空下，并在放在達60psi的壓力下氣缸1充空氣，氣缸2充N2，氣缸3充N2，搖動、上下顛倒并使釋放的壓力吹出氣缸內(nèi)的液體。用50cc磷酸鈉緩沖液重復此過程。按上面所述方法對氣缸加壓3次以除去其中的所有液體。
注入酶再次將氣缸放在真空下并利用真空注射60cc酪氨酸酶，以將酶吸入氣缸中。氣缸按上述方法加壓。釋放氣缸壓力并再反復加壓10次以除去其中的O2。
最后加壓用相應氣體對氣缸1(空氣)和2(N2)加壓到30。6大氣壓。氣缸3用Xe加壓到1個大氣壓，然后用N2加壓到30.6個大氣壓以保存Xe。
時間表到91年4月14日下午1時氣缸加壓到30大氣壓。因事實上在91年4月25日決定于5℃使用分光光度計對樣品進行不同的實驗，所以這一天結束。所以當分光光度計得以利用時氣缸是在25℃下。加壓后，加樣進行28小時。直接對這樣樣品進行光譜/氣體分析。
4/25/91重新加壓于91年4月25日下午6時再次對氣缸加壓力到100大氣壓。這些氣缸將于91年4月26日2時加樣(再次加壓力后20小時)。
分光光度研究4/25/91，25℃小池最少10個PARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintNCPRG酪氨酸酶305nm80pts ( )/() 測20分鐘16秒間隔Ymin＝0.0Ymax＝2.0空白酪氨酸酶2mL溶液A+0.5mL溶液B樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液B小室傳輸裝置檢測130大氣壓小室1對照A小室2氣體1(空氣)小室3氣體2(N2)小室4氣體3(Xe1大氣壓/N229大氣壓)存儲信息酪氨酸酶Y30G1…4.SP
4個存儲信息分光光度研究4/26/9125℃小池最少10個PARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintNCPRM酪氨酸酶305nm80pts ( )/() 進行20分鐘16秒間隙Ymin＝0.0Ymax＝2。0空白酪氨酸酶2mL溶液A+0.5ml溶液B樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液B小室傳輸裝置檢測1100大氣壓小室1對照A小室2氣體1(空氣)小室3氣體2(N2)小室4氣體3(Xe∶1大氣壓/N2∶29大氣壓)存儲信息酪氨酸酶Y100G1…4.SP
4存儲信息方案壓力對酶的影響酶酪氨酸酶(SIGMA№。T-7755)(一元酚單加氧酶;多酚氧化酶;兒茶酚氧化酶;一元酚，二羥苯丙氨酸氧氧化還原酶;EC1。14。18。1)自蘑菇中得到酪氨酸酶單位定義在3ml含L-酪氨酸的反應混合物中，于25℃，PH6.5條件下，每分鐘一單位將引起A280增加0.001。
酪氨酸酶活性3870U/mg固體7.1mg固體 ( )/() 27。440單位干燥儲存于0℃以下底物L-酪氨酸(SIGMA№.T-3754)L-3-〔4-羥苯基〕丙氨酸游離堿(pfs)結晶無水分子量181.2于室溫(25℃)儲存酶β-D-葡糖苷酶(SIGMA№。G-4511)(苦杏仁酶;β-D-葡糖苷葡糖水解酶EC3。2。1.21)得自苦杏仁單位定義于PH5.0，37℃下，1單位酶每分鐘從水楊苷中釋放1.0μmole葡萄糖。
活性22U/mg固體
12mg固體 ( )/() 264單位干燥儲存于0-5℃底物N-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(SIGMA№.N-7006)結晶含2。4%溶劑無水分子量301。3干燥儲存于0℃以下試驗1氣體1?？諝?。N23.空氣4。O2壓力1。2個大氣壓(30psi)溶液制備4/29/91制備4/26/91，溶液A磷酸鈉緩沖液，PH6.8，25℃2L去離子水2×141.96×0.2×245×1/1000＝13.91g Na2HPO42×119.96×0.2×255×1/1000＝12.20g NaH2PO4測得PH溶液B溶于磷酸鈉緩沖液的酪氨酸酶溶液(228U/ml)14。2mgT-7755稀釋到240mL磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中溶液C溶于磷酸鈉緩沖液的50μg/mLL-酪氨酸溶液10mgT-3754稀釋到200ml磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中。
溶液E溶于磷酸鈉緩沖液的100μg/mLβ-D-吡喃葡糖苷溶液25mgN-7006稀釋到250ml磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中溶液F溶在PH6.8(25℃)磷酸鈉緩沖液中的β-D-葡糖苷溶液(2.18單位/ml)24mgG-4511稀釋到242ml磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中方法從分光光度儀中取出小室傳輸器并裝配混合的小室。
制備丙烯酸小池，首先固定蘭色硅塞蕊、針頭，然后用通常使用的硅氧烷硅化小池的頂部和側面。使用前放置固化48小時。當硅固化時對小池垂直開孔，然后用捆扎膠帶環(huán)繞塞蕊。
樣品制備4/29/91小池內(nèi)注入兩種酶以進行2大氣壓實驗。各小池用適當氣體充氣10×10cc并在冰箱中冷卻15分鐘，然后進行實驗。血清瓶內(nèi)注入5cc相應的酶并在實驗前用適當氣體充氣10×10cc。裝配分光光度儀以便在所有時間內(nèi)使各氣體的連續(xù)流發(fā)出光譜。安裝100psimax壓力量計以讀出小池壓力，并安裝開/關閥以便能在第二次重復期間對參考小室加壓。在氣缸/室管和壓力量計之間安裝球閥，以便在分光光度計上直接控制氣球。在各管路中放入止回閥以確保造成反向壓力污染小室管或氣缸。在實驗期間小池保留2個針頭。一個針頭接到氣體管路上，而第二個則用于引入酶，然后加塞。由于組裝起來太大，所以不可能使用安裝好的分光光度儀的門，而須將它們?nèi)サ?。對每次光譜分析均制備一4層厚的黑色氈罩以盡可能減少進入系統(tǒng)的光量。
雖然小池平衡到分光光度計內(nèi)的溫度，但保留在小池中的兩針頭仍與10cc注射器相接。在引入酶之前，除去一個注射器同時將氣體管路接到針頭上。小氣流流過管路時如此安裝以確保沒有氣體污染。針頭保留在液體水平上方。除去第二個注射器以便恒流通過小池。使用1cc注射器通過第二個針頭注射酶。然后塞住針頭，對小池加壓并開始實驗。
4/29/912大氣壓參考小室不加壓酪氨酸酶1。未經(jīng)空氣加壓的參考小室或樣品。
2.重復1(參考小室未加壓)4種氣體葡糖苷酶1.非經(jīng)空氣加壓的參考小室或樣品2.重復1(參考小室未加壓)4種氣體分光光度研究室溫小池10個
PARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintNTDrive酪氨酸酶新分光光度儀(B)305nm60pts ( )/() 測15分鐘16秒間隔Ymin＝0。0Ymax＝1.6β-葡糖苷酶舊分光光度儀(A)400nm60pts ( )/() 測15分鐘16秒間隔Ymin＝0.0Ymax＝2.0空白酪氨酸酶2mL溶液A+0.5mL溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液A樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液F外存儲信息4/29/91酪氨酸酶空氣參考(非經(jīng)加壓的)429TYTRL.SP2大氣壓(未加壓的參考小室)Y4E1P1G1…7.SP
葡糖苷酶空氣參考(非經(jīng)加壓的)429GLUTR。SP2大氣壓(未加壓的參考小室)Y4E2P1G1…7.SP附注固定之樣品小室內(nèi)的溫度沒有保持恒定，而直接影響到我們的實驗結果。我們將除去兩個分光光度儀上的固定的小室夾持器并換成小室傳輸裝置。
試驗24/30/91氣體1.空氣;2.N2;
3.空氣;4.O2;
壓力1.2大氣壓(30psi)樣品制備重新使用于4/29/91制備的溶液。
方法按試驗1所述組裝用于連續(xù)氣流的分光光度儀。將固定的小室夾持器換成小室傳輸裝置以便使用Fisher循環(huán)器和數(shù)字控制器保持溫度恒定。我繼續(xù)使用黑色氈罩以提供適當?shù)墓饩€保護。對每種酶均使用四種氣體進行非加壓氣體分析。用10×10cc相應氣體對小池充氣并在冰箱中冷卻15分鐘。當小池放入分光光度儀中時除去用于充氣的2個針頭。使用帶有20G11/2針頭的1cc注射器將酶引入小池。通過硅氧烷塞將針頭置入小池但不浸入液體中。以此確保如加壓氣體實驗那樣將酶引入小池。
血清瓶內(nèi)加入5cc相應的酶并在實驗分析前充入10×10cc適當氣體。
小池酪氨酸酶對于這種酶使用常用的蘭色硅氧烷和捆扎帶封閉小池。
葡糖苷酶對于這種酶只使用帶蘭色硅氧烷的小池。
使用前所有小池均試驗加壓到32psi。
分光光度研究小池26PARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintNTDrive酪氨酸酶新分光光度儀(B)25℃305nm60Pts ( )/() 進行13分鐘16移間隔Ymin＝0.0Ymax＝1.6β-葡糖苷酶舊分光光度儀(A)35℃400nm60pts ( )/() 進行15分鐘16秒間隔Ymin＝0.0Ymax＝2.0空白酪氨酸酶2ml溶液A+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0。5ml溶液A樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液F
存儲信息1/30/91酪氨酸酶氣體分析(未加壓的)Y6E1RSG1…4.SP2大氣壓(參考，未加壓的)Y6E1P1G1…4.SP2大氣壓(參考，加壓的)Y7E1P1G1…4。SP葡糖苷酶氣體分析(未加壓的)Y6E2RSG1…4.SP2大氣壓(參考，未加壓的)Y6E2P1G1…4.SP2大氣壓(參考加壓的)Y7E2P1G1…4。SP附注我們決定使用帶蘭色硅氧烷塞的小池進行其他壓力試驗。附加常規(guī)使用的硅氧烷和捆扎帶似乎可降低有蘭色硅氧烷之小池的氣密封口牢固性。
試驗35/1/91氣體1。空氣;2。N2;
3?？諝?4。O2;
壓力1。3大氣壓(45psi)樣品制備重新使用于4/29/91制備的溶液。
方法本試驗中使用于4/30/91進行之試驗2的同樣方法。
分光光度研究小池31個PARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintN
TDrive酪氨酸酶新分光光度儀(B)25℃305nm60pts ( )/() 測15分鐘16秒間隔Ymin＝0.0Ymax＝1.6β-葡糖苷酶舊分光光度儀(A)35℃400nm60pts ( )/() 測15分鐘16秒間隙Ymin＝0.0Ymax＝2。0空白酪氨酸酶2ml溶液A+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液A樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0。5ml溶液F存儲信息5/1/91酪氨酸酶氣體分析(未加壓的)Y6E1SRG1…4.SP氣體分析(未加壓的)Y7E1SRG1…4。SP3大氣壓(參考，未加壓的)Y6E1P2G1…4.SP3大氣壓(參考，加壓的)Y7E1P2G1…4。SP葡糖苷酶氣體分析(未加壓的)Y6E2SRG1…4。SP
3大氣壓(參考，未加壓的)Y6E2P2G1…4。SP(使用了新的空白)3大氣壓(參考，加壓的)Y7E2P2G1…4.SP試驗45/3/91氣體5.空氣;6。Ne;
7。Kr;8.Xe;
壓力1.2大氣壓(30psi)溶液制備5/2/91制劑4/26/91溶液APH6.8(25℃)磷酸鈉緩沖液2L去離子水2×141.96×0.2×245×1/1000＝13.91g Na2HPO42×119.96×0.2×255×1/1000＝12.20g NaH2PO4測得的PH溶液B溶在磷酸鈉緩沖液中的酪氨酸酶溶液(228U/ml)7.1mgT-7755稀釋到120ml磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中溶液C溶在磷酸鈉緩沖液中的50Pg/mlL-酪氨酸10mgT-3754稀釋到200ml磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中溶液E溶在磷酸鈉緩沖液的100μg/mlβ-D-吡喃葡糖苷溶液12。5mgN-7006稀釋到125ml磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中溶液F溶在磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中的β-D-葡糖苷溶液(2.18U/ml)12mgG-4511稀釋到121mL磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中方法與試驗2和3中使用的方法基本相同，但有兩處另外。在將注入小池內(nèi)之后將針頭浸入小池中的液體內(nèi)，并將一般常規(guī)使用的硅氧烷加在針頭周圍以防氣體從小池內(nèi)漏出。
分光光度研究小池20個PARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintNTDrive酪氨酸酶新分光光度儀(B)25℃305nm40pts ( )/() 測10分鐘16秒間隔Ymin＝0.0Ymax＝1.6β-葡糖苷酶舊分光光度計(A)35℃400nm40Pts ( )/() 測10分鐘16秒間隔
Ymin＝0.0Ymax＝2.0空白酪氨酸酶2ml溶液A+0。5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液A樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液F存儲信息5/1/91定時驅動(TDrive)以核對浸沒的針頭并沒有造成影響吸光率的問題。
Drive40pts，16秒間隔，305nmTYRONEE1.SPDrive40pts，16秒間隔，400nmGLUCNEE1，SP酪氨酸酶氣體分析(未加壓力的)Y6E1SRG5…8.SP2大氣壓(參考，未加壓的)Y6E1P1G5…8。SP葡糖苷酶氣體分析(非加壓的)Y6E2SRG5…8.SP2大氣壓(參考，未加壓的)Y6E2P1G5…8。SP附注如果針頭進入光程，須將它們移到液面以上。這可通過關閉室內(nèi)燈光并將氈罩放在分光光度儀中工作的位置中達到。
結果結果以相對于1個大氣壓之氣體的%抑制率/相對加壓后1個大氣體的抑制率來表示。
對于酪氨酸酶2大氣壓3大氣壓30.6大氣壓100大氣壓(24小時)(1小時)(-24小時)(1小時)空氣-7.0&-15.4-11.6-37.0-4.9-65.8-11.1Xe-76.0/-86.2-87.0-85.7Kr-84.5/-93.1Ar-76.9/-90.4-55.8/-72.1Ne-69.0/-84.5N2-71.2/-88.5 -72.1/-82.6 -78.8 -15.4 -84.7 -20.0相對效應的變化是很大的。例如，Xe為75%。此明顯地說明單靠壓力即可顯著抑制酪氨酸酶。
對于β-葡糖苷酶在3個大氣壓時，所觀察到的增強之程度的改變是空氣0(增強)>-12.5(抑制)Xe+3.1>-15.7Kr+2.0>-6.2Ar+1.0>-13.2Ne+1.0>-12.5N20 > -5.0
從上述結果清楚表明，現(xiàn)有技術報導的稀有氣體對水解酶及其他酶的抑制作用是由于水靜壓效應。
加氧實驗向酪氨酸酶中加入氧減小了整個氮的效應。加入氧明顯地降低稀有氣體的效應，這顯然是因為稀有氣體通過上述分子特性影響酶并單純地置換溶液中的氧。這一證據(jù)可將稀有氣體的效應同氮的效應區(qū)分開。另外，加入小量氧可稍微提高酪氨酸酶的活性(如需氧反應所期望的)，但進一步加入氧不會產(chǎn)生更大效應。因此，氧分壓和酶活性間嚴格線性關系的報導是有缺陷的，因為它們只說明氧之限制作用的條件。
向空氣中加入氧使酪氨酸酶的活性最大增加6%。
向氙飽和的溶液中加入多達飽和量的氧可使氙的效應從85%抑制改變?yōu)?0%抑制。
如上所述向氬飽和的溶液中加入氧，可使氬的效應從82%抑制改變?yōu)?2%抑制。
如上所述向氮飽和的溶液中加入氧，可使氮的抑制作用完全消除，即從84%降到0。
如對于不依賴氧的反應所預略的，向葡糖苷酶反應中加入氧未見有何影響。加氧沒有影響任何一種稀有氣體對酶的作用，再次表明稀有氣體對酶的效應取決于它們的分子特性。
氣體混合物實驗除試驗稀有氣體與氮和氧的混合物后，還試驗了Kr和Xe的混合物、Ar與Ar和Xe或Kr的混合物。
對酪氨酸酶所作實驗的結果用抑制率對空氣對照的比例表示。
混合物=空氣中的%Xe%抑制=空氣中的%Kr%抑制0-750-750.1-721.0-735.0-8310.0-8110.0-8050.0-7850.0-78100.0-86100.0-77用β-葡糖苷酶得到了相似的結果，其中所有混合物均測得增強作用，而且這些混合物與Xe、Kr或Ar的結果相同，后者取決于混合物與純氣體的接近程度。
實驗設計氣體混合物理論氣體混合物將改變酶活性氣體混合物1.Ar/Xe2.Ar/Kr1.0。1%2。1.0%3。5.0%4.10.0%5。50。0%酶酪氨酸酶(SIGMA№.T-7755)(一元酶單加氧酶;多酚氧化酶;兒茶酚氧化酶;一元酚二羥苯丙氨酸氧氧化還原酶;EC1。14.18.1)
得自蘑菇酪氨酸酶定義在3ml含L-酪氨酸的反應混合物中，于PH6.5和25℃條件下1單位酶每分鐘使A280提高0-001。
酪氨酸酶活性3870U/ml固體7.1mg固體27.440單位干燥后儲存于0℃以下批號80H9615底物L-酪氨酸(SIGMA№.T-3754)L-3-〔一羥苯基〕丙氨酸游離堿(pfs)結晶無水分子量181.2于室溫(25°)下保存批號59F-0478酶β-D-葡糖苷酶(SIGMA№.G-4511)(苦杏仁酶;β-D-葡糖苷葡糖水解酶，EC3。2.1.21)得自苦杏仁單位定義在PH5。0，37℃條件下1單位酶從水楊苷中每分鐘釋放1.0μmole葡萄糖。
活性22U/mg固體12mg固體264單位干燥儲存于0-5℃下批號49F-402
底物對-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(SIGMA№.N-7006)結晶體含有2。4%溶劑無水分子量301.3干燥儲存于0℃以下批號129F-5057溶液制備制備4/15/91溶液A磷酸鈉緩沖液(PH6.6，25℃)1L去離子水141.96×0.2×187.5×1/1000＝5.3g Na2HPO4119.96×0.2×312.5×1/1000＝7.5g NaH2PO4制備4/17/91溶液B溶于磷酸鈉緩沖液的酪氨酸酶溶液(228U/ml)14.2mgT-7755稀釋到240ml磷酸鈉緩沖液(PH6.6，25℃)中制備4/17/91溶液C溶于磷酸鈉緩沖液中的50μg/mlL-酪氨酸10mgT-3754稀釋到200ml磷酸鈉緩沖液(PH6.6，25℃)中制備4/10/91溶液D磷酸鈉緩沖液，25℃下PH6.62L去離子水
2×141.96×0.2×245×1/1000＝13.91g Na2HPO42×119.96×0.2×255×1/1000＝12.20g NaH2PO4制備4/15/91溶液E溶于磷酸鈉緩沖液的100μg/mlβ-D-吡喃葡糖苷溶液25mgN-7006稀釋到250ml磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中制備4/17/91溶液F溶于磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)的β-D-葡糖苷酶溶液(2.18U/ml)24mgG-4511稀釋到242ml磷酸鈉緩沖液(PH6.8，25℃)中方法4/17/91制備溶液，確認小池不透氣后用空氣吹凈、充填小池并置入冰箱保存，制備加酶血清瓶并制備充氣瓶。
4/18/91氣體混合物制備在120cc血清瓶內(nèi)混合充入的氣體。以真空吹洗這些小瓶，此時瓶中保留1大氣壓的氬。以此方法將小瓶吹洗20秒鐘。小瓶在稍高壓力下以通過針頭釋放壓力。這樣被認為有120cc氬。然后使用30cc注射器和針頭將必需體積的氬和待與之混合的氣體(Xe或Kr)引入瓶內(nèi)。
%氬Xe/Kr0.1%120cc0.2cc1.0%118cc2.4cc5.0%108cc12cc10%96cc24cc50%0cc120cc試驗1我們通過排出8×10cc小瓶氣體使用1瓶氣體混合物對酶進行充氣。我們通過排出8×10cc小瓶氣體使用第二瓶氣體混合物對小池/底物充氣。
我們以下列氣體充填酶加樣注射器酶氣體ArArXeXe0.1%Ar/XeAr1.0%Ar/XeAr5.0%Ar/XeAr
小室傳輸裝置氣體混合物Ar/Xe，1次重復檢測1小室1Ar小室2Xe小室3Ar/Xe0.1%小室4Ar/Xe1.0%小室5Ar/Xe5.0%(重復1R1)PARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintNCPRG酪氨酸酶25℃305nm80Pts ( )/() 測20分鐘16秒間隔Ymin＝0.0Ymax＝2.0β-葡糖苷酶35℃400nm60Pts ( )/() 測15分鐘16sintYmin＝0.0Ymax＝1.5
空白酪氨酸酶2ml溶液A+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液D樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液F存儲信息酪氨酸酶X9R1G1M1…5.SP葡糖苷酶X0R1G1M1…5。SP試驗1的結果我們發(fā)現(xiàn)在我們酪氨酸酶試驗中有空氣污染并推測葡糖苷酶也這樣的。我們確定將不能從1個瓶中回收8×10cc氣體混合物。因此我們決定每小池制備2瓶用于充氣的氣體混合物，并且每種酶用2瓶氣體混合物，這樣我們就能夠對每小池/瓶提供10×10cc氣體混合物。
試驗2對人體每小池使用2瓶氣體混合物進行第二次充氣，且對每種酶充2瓶混合氣體。然后繼續(xù)使用后兩種氣體混合物(10%和50%)進行充氣。
氣體混合物Ar/Xe，1次重復小室傳輸裝置檢測2小室1空氣小室2Xe小室3Ar/Xe10.0%小室4Ar/Xe50.0%小室5空氣(重復1R1)
PARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintNCPRG酪氨酸酶25℃305nm80Pts ( )/() 20分鐘16sintYmin＝0.0Ymax＝2.0β-葡糖苷酶35℃400nm60Pts ( )/() 15分鐘16sintYmin＝0.0Ymax＝1.5空白酪氨酸酶2ml溶液A+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液D樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液Bβ-葡糖苷酶2ml溶液E+0.5ml溶液F試驗2的結果酪氨酸酶試驗給出了一個我們預期的離散的結果，因此推斷我們的新充氣方法是恰當?shù)?，并且將繼續(xù)這種方式充氣。葡糖苷酶并沒有出現(xiàn)大的分離，因此因時間緊迫而將重點放在特定使用10%和50%氣體混合物的酪氨酸酶實驗分析上。
檢測3小室1空氣小室2Xe小室3Ar/Xe10.0%小室4Ar/Xe50.0%小室5空氣(重復2，R2)存儲資料酪氨酸酶X9R2G1M6…0.SP我們制備了如上所述的Ar/Kr混合物并2次重復試驗10%和50%混合物。
檢測4/5小室1空氣小室2Kr小室3Ar/Kr10.0%小室4Ar/Kr50.0%小室5空氣(重復1，2R1，R2)存儲資料酪氨酸酶X9R1G2M6…0.SPX9R2G2M6…0.SP結果用Ar/Xe所得結果看上去要比用Ar/Kr所得結果好。我們將繼續(xù)使用10%和50%混合物進行兩種混合物的重復試驗。時間允許我們只對酪氨酸酶進行兩種氣體之0.1%、1%和5%混合物的重復試驗。
4/19/91對酪氨酸酶在一個分光光度儀上進行2次Ar/Xe重復試驗，并在另一個分光光度儀上進行Ar/Kr試驗。
新分光光度儀檢測1小室1空氣小室2Xe小室3Ar/Xe10.0%小室4Ar/Xe50.0%小室5空氣(重復3R3)檢測2小室1空氣小室2Xe小室3Ar/Xe10.0%小室4Ar/Xe50.0%小室5空氣(重復4R4)舊分光光度儀檢測1小室1空氣小室2Kr小室3Ar/Kr10.0%小室4Ar/Kr50.0%小室5空氣(重復3R3)檢測2小室1空氣小室2Kr小室3Ar/Kr10.0%小室4Ar/Kr50.0%
小室5空氣(重復4R4)PARAM縫隙1速度1500AsareYAprintNCPRM酪氨酸酶25℃305nm80Pts ( )/() 進行20分鐘16sintYmin＝0.0Ymax＝2.0空白酪氨酸酶2ml溶液A+0.5ml溶液B樣品酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液B存儲資料Ar/XeX9R3G1M6…0.SPX9R4G1M6…0.SP10份存儲資料Ar/KrX9R3G2M6…0.SPX9R4G2M6…0.SP10份存儲資料時間允許我們只能進行下列檢測新分光光度儀檢測3小室1空氣小室2Xe小室3Ar/Xe0.1%小室4Ar/Xe1.0%小室5Ar/Xe5.0%(重復3R3)存儲資料Ar/XeX9R2G1M1…5.SPX9R3G1M1…5.SP10份存儲資料因此可見，本發(fā)明總地提供了通過使一種或多種酶與含有一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以調節(jié)酶活性的方法。
根據(jù)本發(fā)明，被調節(jié)的酶可以是單一的、分離的酶，或者是包括混合物的一種或多種酶。例如，根據(jù)本發(fā)明，可通過選擇性地抑制一種或多種酶的活性及選擇性地提高一種或多種酶的活性來調節(jié)酶的混合物。
再者，可根據(jù)本發(fā)明在從液氮沸點(約-200℃)到大約120℃的溫度范圍內(nèi)調節(jié)酶促活性。
根據(jù)本發(fā)明，任何酶可使用本發(fā)明的稀有氣體進行調節(jié)。然而，通過選擇適當?shù)腜H、溫度、壓力、〔E〕和〔S〕等條件，可用本發(fā)明的任何一種希有氣體調節(jié)所有的酶。另外，本領域的技術人員可利用上文公開的技術內(nèi)容及原則來確定適合于任何所研究之特定酶體系或混合酶體系的最適PH、溫度、壓力、〔E〕及〔S〕。
以下更詳細地討論本說明書的附圖。
圖1顯示2.5ml酪氨酸酶(100μg/ml)對2.5ml磷酸鈉緩沖液(PH6.85)的吸收光譜。
圖2顯示2.5mlL-酪氨酸(100μg/ml)對2.5ml磷酸鈉緩沖液(PH6.85)的吸收光譜。
圖3顯示在所指定的濃度和PH下，用L-酪氨酸作空白的酪氨酸酶和L-酪氨酸的吸收光譜。
圖4顯示隨著酪氨酸酶濃度的變化(40、60、80和100μg/ml)，反應進行結果的交迭，表明直接線性一級酪氨酸酶濃度依賴性。
圖5顯示使用所指出的濃度和PH，等量(W/W)氙對酪氨酸酶的抑制。
圖6顯示在26℃時氙對酪氨酸酶的很大抑制作用，并給出約略的估計(空氣面積變動曲線＝11217μ，氙＝3037μ，總計＝14254μ，%總空氣面積＝78.69%，氙＝21.31，氙總面積＝空氣面積的27.08%，氙對空氣速度的抑制＝72.92%)。相對于其他常規(guī)酶抑制劑這一抑制率是很大的。
圖7顯示在15℃時，氙輕度抑制酪氨酸酶-L-酪氨酸反應的平衡;氙具有較小但明顯的抑制作用，氖和氪則表現(xiàn)出很大的抑制作用。氧和空氣差不多有同樣效應。
圖8顯示在20℃時，氙強烈抑制酪氨酸酶-L-酪氨酸反應，而其他氣體氖、氪和氬都是有效的抑制劑。
圖9顯示氧對酪氨酸酶-L-酪氨酸反應只有中度抑制作用。
圖10顯示在20℃時氬對酪氨酸酶-L-酪氨酸反應的強抑制作用，同時氬也有幾乎相等的效應。但所指出的其他氣體也是有效的抑制物。
圖11顯示氧對25℃時的酪氨酸酶-L-酪氨酸反應只有輕度抑制作用。
圖12顯示在30℃時氖、氬、氪和氙對酪氨酸酶活性的抑制作用。
圖13顯示30℃時氧對酪氨酸酶-L-酪氨酸反應的抑制效應。
圖14顯示在空氣中進行的標準酪氨酸酶-L-酪氨酸反應，表明速率反應直接歸因于氧溶解度差異。用氧代替空氣所得曲線完全相同。
圖15說明氖的抑制效應是溫度依賴性的。
圖16顯示氪抑制酪氨酸酶的能力與溫度之間是直接反(付)相關的。
圖17顯示氙比其他氣體能更強地抑制酪氨酸酶-L-酪氨酸反應的平衡，但只與氪和氬一樣抑制該反應的速率。另外，曲線形狀的變異性高，此提示直接活性位點與酪氨酸酶的相互作用。氙與溫度有相反的相互作用，且在20℃和25℃間共有效應的動態(tài)轉換。
圖18顯示在20℃時氬、氙和氖均顯著地抑制酪氨酸酶活性，而氪具有較小效應。氮也可很有力地抑制該反應，但氧的抑制作用很小。
圖19顯示在25℃時氬以比其他稀有氣體較小的水平發(fā)揮抑制作用，而氧則提高反應速率。由于范德華排斥力和氧稀釋的可能的相對影響，而使氪-氙和氖-氬曲線對間的小的曲線差異有很高顯著性。
圖20顯示在30℃時，氧因為減小了溶解度而不再提高酪氨酸酶活性。氙比其他氣體更好地抑制反應，但所有這些氣體都是有效的。
圖21顯示氙對酪氨酸酶活性的抑制作用，同時在20℃和25℃間有活性轉換。
圖22顯示氬對酪氨酸酶活性的抑制，表明在20℃時氬比氖有更大抑制作用，但在25℃時則比氖的抑制作用小。這些差異被認為直接歸因于溶解度/氧擴散能力。
圖23顯示氪對酪氨酸酶活性的抑制作用，同時可見在20℃和25℃間有活性轉換。這一點為氣體和酶活性位點間的直接相互作用提供了強有力的證據(jù)。
圖24顯示氙在對酪氨酸酶活性的抑制中至少存在兩次活性轉換。第一次活性轉換是在25℃和30℃之間，第二次是在30℃和35℃間。在20℃和25℃間可能存在第三次活性轉換。這些轉換為氣體與酶活性位點間的直接相互作用提供了強有力的證據(jù)。
圖25顯示單純由參予從溶液中置換氧之溶解度機制對酪氨酸酶的抑制?？諝怙@示出期望的解離-驅動速度圖形，而氧在30℃即飽和。
圖26顯示氮對酪氨酸酶活性的抑制。氮只能通過參予從溶液中置換氧的溶解度機制抑制酶，但在抑制酪氨酸酶活性中是有效的。在20℃后出現(xiàn)轉換最大值。氮曲線和稀有氣體曲線間的差異代表了潛在的活性位點抑制作用。在大多數(shù)情況下，這些差異對每種氣體至少在一個溫度下是有意義的。
圖27顯示氙在20℃和25℃間的活性有很大差異。這些差異與酶活性位點之最適溫度相對應。
圖28顯示氪、氙、氬和氪與氙的混合物對α-谷氨酰轉肽酶的抑制作用。
圖30顯示氪、氙、氬和氪與氙的混合物對天冬氨酸氨基轉移酶的抑制作用。
圖31顯示SF6、氬、氮、氖和氧對α-D-葡糖苷酶活性的增強作用。
圖32顯示氖、氧和氮對苯丙氨酸解氨酶的增強作用。
圖33顯示氙和氪對檸檬酸合酶活性的增強作用以及氬對該酶的抑制作用。
圖34顯示氙、氪、氬和氪與氙的混合物在10℃下對磷酸葡萄糖異構酶活性的增強作用。
圖35顯示氖和氮在25℃下對磷酸葡萄糖異構酶活性的增強作用，以及氧對該酶的抑制作用。
圖36顯示在25℃下氪和氪與氙的混合物對S-乙酰CoA合成酶活性的增強作用。
圖37顯示在100大氣壓下空氣和氮對β-葡糖苷酶的抑制作用。這種作用主要是因于高壓力對酶的損傷。
圖38顯示在30大氣壓下空氣和氮對β-葡糖苷酶的抑制作用。這種效應同樣是因高壓力對酶的損傷。
圖39顯示在30大氣壓下空氣、氙和氮對β-葡糖苷酶活性的抑制作用。這種效應是由于高壓力對酶的損傷。
圖40顯示在100大氣壓下空氣、氙和氮對酪氨酸酶的抑制作用。這種效應是由于高壓力對酶的損傷。
圖41顯示酶-底物濃度影響稀有氣體之增強和抑制作用的結果，如以β-D-葡糖苷酶活性為例所證實的。S1、S2和S3代表三個不同的和遞增的底物濃度。這一結果是有利的，因為它意味著可改變已有的生物工藝方法以降低酶和/或底物的成本，甚或可有利于發(fā)生目前不可能的反應。
圖42顯示在10℃下氙和氖分別在增強然后抑制乳酸脫氫酶中的不同效應。這一結果是有利的，因為它意味著可根據(jù)所選用的氣體增強或抑制已知酶的活性。
圖43顯示即使在高溫度下仍可觀察到本發(fā)明方法的效力。特別是在60℃下，氬、氮和氙可增強而氪則抑制α-葡糖苷酶活性。很顯然，在60℃下氬是這種酶的強有力增強劑。
圖44顯示氙在25℃下在增強固相化β-葡糖苷酶之酶促活性中的作用。
如上面提到的，可根據(jù)本發(fā)明在從液氮之低溫度(約-200℃)到大約120℃的寬溫度范圍內(nèi)調節(jié)酶促活性。另外，所使用的氣體或氣體混合物的壓力可從大約10-8大氣壓的超真空低壓高至大約100大氣壓。但也可望能使甚至更低或更高的壓力。一般多使用從大約10-3和3大氣壓的氣體壓力。且最常用的從大約10-2至2大氣壓的氣體壓力。
如上所述，不管所選擇的酶和酶的形式怎樣，本發(fā)明在調節(jié)酶促活性中都是有效的。提供下列實施例以舉例說明本發(fā)明在調節(jié)固相化酶之酶促活性中的效能。
設計固相化酶理論同樣氣體可作用于游離的或固相化的酶。
氣體1?？諝?2.氙酶β-D-葡糖苷酶(SIGMA№。G-0898)(β-D-葡糖苷葡糖水解酶E(3.2.1.21)得自Caldocellumsacharolyticum在大腸桿菌中表達的重組體(pfs)凍干粉末熱穩(wěn)定性酶，70℃下半壽期為38小時單位定義在PH50，37℃下1單位酶每分鐘從水楊苷釋放1.0μmole葡萄糖活性46U/g固體10.87g固體 ( )/() 500單位干燥儲存于0-5℃下批號50H0251底物對位硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷酶(SIGMA№。N-7006)結晶體含有2.4%溶劑無水分子量301.3干燥儲存于0℃以下批號129F-5057
溶液制備制備5/21/91，溶液A磷酸鈉緩沖液(PH6.6，25℃)1L去離子水141.96×0.2×187.5×1/1000＝5.3g Na2HPO4119.96×0.2×312.5×1/1000＝7.5g NaH2PO4制備5/21/91;溶液B溶于磷酸鈉緩沖液的100μg/mlβ-D-吡喃葡糖苷溶液25mgN-7006稀釋到250ml磷酸鈉緩沖液(PH6.6，25℃)中制備5/21/91，溶液C1溶于PH6.6(25℃)磷酸鈉緩沖液中的β-D-葡糖苷酶溶液(2.18U/ml)1gG-0898溶解在21ml磷酸鈉緩沖液(PH6.6，25℃)中(對于不溶性酶凍干粉末，按SIGMA推薦的方法以所需量懸浮于水中(5-10mg固體/ml水)，以使之簡單水合)。
我們得以進行簡單水合作用(直到溶液顯現(xiàn))400nm80Pts ( )/()160sintYmin＝0.0Ymax＝3。0
空白2ml溶液A+0.5ml溶液C1樣品2ml溶液B+0。5ml溶液C1存儲資料G0898G1…4。SP＊試驗25/22/91小室傳輸裝置2次重復檢測操作小室1空氣小室2空氣(重復)小室3Xe小室4Xe(重復)PARAM縫隙1速度1500AsaveYAprintNCPRGβ-葡糖苷酶25℃400nm120Pts ( )/()16sintYmin＝0.0Ymax＝1.0空白2ml溶液A+0.5ml溶液C2樣品2ml溶液B+0.5ml溶液C2存儲資料2G0898G1…4.SP
為了進一步說明本發(fā)明及由之獲得效應，進行下述動力學分析。
動力學分析如前面舉例說明的吸光率曲線數(shù)據(jù)，揭示了在不同氣壓下酶促活性在產(chǎn)率和速率兩個方面的差異。可在達到平衡后通過比較曲線差異來計算產(chǎn)率，但也可使用計算速率所需的外形線性化和計算法計算。使市場上出售的計算機程序(ENZFITTER，GRAFIT，ENZPACK，PEAKFIT)〔用于將初始Uv/vis吸光率數(shù)據(jù)曲線(在這些例子中為動力曲線)轉化成直線(動力曲線的線性回歸)〕計算速率差異。這些線可表達為一個數(shù)學方程式，其中斜率接近于速率，極限Y軸截距為近似產(chǎn)率。這些數(shù)據(jù)可在進一步處理后推導出Michaelis-Menten或其他標準生物化學關系式(以圖解或數(shù)學式表示)，進而可由之準確地推導出速率和產(chǎn)率。下面所述的實例和附圖將以舉例形式說明這些步驟。
圖45圖解說明在空氣下，有5個不同的底物濃度時β-葡糖苷酶的Uv/vis吸光率動力曲線。
表1說明米-曼氏(Michaelis-Menten)酶動力學方程的Vmax和Km計算值，以及各反應的速率。Vmax是極限速率，Km是米-曼氏常數(shù)。
圖16和表2說明與圖45和表1相同的結論，但它們針對氙反應的。從中很容易看出，氙的Vmax和Km更大。
圖47、表3、圖48和表4圖解說明上述空氣和氙充氣反應的一級動力曲線回歸速率線性轉化，顯示其近似于米-曼氏方程數(shù)據(jù)，其中Xe/空氣速率關系式有如上所述的同樣比例。
圖49、圖50和表5圖解說明該實驗中研究的所述氣體均有同樣的一級速率近似回歸線性化特征。在此情況下，只有氙在動力曲線分析中顯示了明顯的增強作用，但線性化處理后則清楚地表明其他氣體也增強反應。
圖51、表6、圖52和表7圖解說明得自單一酪氨酸酶實驗中前160秒鐘的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)均作為以空氣然后以氙充氣所得到的動力曲線來表示。線性化速率回歸表明，而且經(jīng)米-曼氏方程式計算進一步證實，氙強烈地抑制酪氨酸酶活性。
表1氣體1:空氣酶動力學樣品稱重拆算×平方=0.0000變量數(shù)值標準誤Vmax0.00250.0002Km-3.17832.6341XY[S]速率G1計算值120.00000.00290.0029240.00000.00280.0027360.00000.00250.0026480.00000.00300.00265100.00000.00220.0026
其余各組數(shù)據(jù)在上述附圖中以圖解方式給出。
表2氣體5: 氙酶動力學樣品稱重拆算×平方(Reduced Chi squared = 0.0000)變量數(shù)值標準誤V max0.00280.0001Km-2.45391.3570XY[S]速率G5計算值120.00000.00320.0032240.00000.00290.0029360.00000.00270.0029480.00000.00300.00295100.00000.00290.0028
表3[S]=60微克/ml一級速率方程樣品稱重折算×平方=0.0002變量數(shù)值標準誤極限0.80210.0146速度常數(shù)0.00320.0001XY時間吸光率計算值10.00000.04710.0000215.00000.07770.0377330.00000.10710.0737445.00000.13460.1080560.00000.16260.1406675.00000.18900.1717790.00000.21360.20148105.00000.23860.22969120.00000.26230.256610135.00000.28490.282211150.00000.30670.306712165.00000.32870.330013180.00000.34850.352214195.00000.36910.373415210.00000.38810.393516225.00000.40660.412817240.00000.42440.431118255.00000.44140.448519270.00000.45790.465220285.00000.47410.481021300.00000.48970.496122315.00000.50440.510523330.00000.51900.524224345.00000.53250.537325360.00000.54480.549826375.00000.55690.561627390.00000.56870.5730
表4[S]=60μg/ml一級速率方程樣品稱重折算×平方=0.0014變量數(shù)值標準誤極限0.83820.0228速度常數(shù)0.00450.0003XY(時間)(吸光率[S3])計算值10.00000.12610.0000215.00000.15900.0544330.00000.19280.1053445.00000.22170.1529560.00000.25140.1974675.00000.28110.2390790.00000.30850.27798105.00000.33490.31439120.00000.36080.348310135.00000.38310.380111150.00000.40650.409912165.00000.43000.437713180.00000.45110.463714195.00000.47190.488015210.00000.49400.510816225.00000.51120.532017240.00000.53110.551918255.00000.55030.570519270.00000.56750.587920285.00000.58420.604221300.00000.60110.619422315.00000.61650.633623330.00000.63130.646924345.00000.64600.659325360.00000.65880.670926375.00000.67110.681827390.00000.68340.6919
表5氣體1:空氣1級速率方程樣品稱重折算×平方=0.0002變量數(shù)值標準誤極限0.80210.0146速度常數(shù)0.00320.0001XY時間吸光率G1計算值10.00000.04710.0000215.00000.07770.0377330.00000.10710.0737445.00000.13460.1080560.00000.16260.1406675.00000.18900.1717790.00000.21360.20148105.00000.23860.22969120.00000.26230.256610135.00000.28490.282211150.00000.30670.306712165.00000.32870.330013180.00000.34850.352214195.00000.36910.373415210.00000.38810.393516225.00000.40660.412817240.00000.42440.431118255.00000.44140.448519270.00000.45790.465220285.00000.47410.481021300.00000.48970.496122315.00000.50440.510523330.00000.51900.524224345.00000.53250.537325360.00000.54480.549826375.00000.55690.561627390.00000.56870.5730
＆＆〉表6氣體1:空氣酶動力學樣品稱重折算×平方=0.0000變量數(shù)值標準誤V max0.00030.0003Km-17.06613.5059XY[S]氣體1:空氣計算值110.00000.0018-0.0004220.00000.00190.0021330.00000.00110.0007440.00000.00180.0005550.00000.00180.0005
表7氣體5:氙酶動力學樣品稱重折算×平方=0.0000變量數(shù)值標準誤V max0.00010.0003Km-27.96236.3527XY[S]氣體5:氙計算值110.00000.0007-0.0001220.00000.0019-0.0003330.00000.00190.0017440.00000.00190.0004550.00000.00040.0003
因此，本發(fā)明提供了一種調節(jié)任何形式的任何一種酶之酶促活性的方法。另外，這種調節(jié)作用可在所指出的寬溫度和壓力范圍內(nèi)進行。
如前面已提到的，用本發(fā)明方法調節(jié)的酶例如可以是在含水或有機溶液中，呈固相化形式、在分散劑中或在任何一種有機基質(如凝膠)中。這樣的溶液、固相化形式、分散劑或有機基質是本領域技術人員已知的。
再者，根據(jù)本發(fā)明，可通過抑制其中一種或多種酶或增強其中一種或多種酶活性來調節(jié)酶的混合物。還有可能同時抑制混合物中的一種或多種酶和增強一種或多種酶來進行調節(jié)。
另外，本領域技術人員可根據(jù)上文中提到的本發(fā)明內(nèi)容及原則來確定用于調節(jié)所研究之特定酶體系或混合酶體系的最適PH、溫度、壓力、〔E〕和〔S〕水平。
例如，當購買酶并使用已知的參考手冊時，可針對所研究的特定酶體系或混合酶體系來確定最適PH、壓力、溫度、〔E〕和〔S〕的最適條件。例如參見SigmaChemicalCompany1990和1991年的商品目錄，以及Dixon和Webb的Enzymes(第三版，Willey，1979)。本領域技術人員可基于上述知識，然后利用本發(fā)明公開的技術內(nèi)容確定最佳氣體混合物、溫度及壓力，以便按照本發(fā)明得到預期效果。
基于已公開的上述內(nèi)容，本領域技術人員雖然可在不違背本發(fā)明之精神和范圍的前提下進行許多改動和改進。
權利要求
1.一種調節(jié)酶活性的方法，其包括使一種或多種酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體相接觸。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的氣體基本上是由一種或多種稀有氣體組成的。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的氣體調節(jié)一種分離的酶。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其中通過抑制其中的一種或多種酶、增強其中的一種或多種酶或抑制其中的一種或多種酶并增強其中的一種或多種其他酶來調節(jié)酶的混合物。
6.根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的一種或多種酶是在溶液中、呈固相化形式、在分散劑中或在有機基質中。
7.一種增強酶活性的方法，其中包括使一種或多種酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸。
8.根據(jù)權利要求7的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體組成。
9.根據(jù)權利要求7的方法，其中所說的稀有氣體選自于氖、氬、氪和氙。
10.根據(jù)權利要求7的方法，其中由所說的氣體調節(jié)一種分離的酶。
11.根據(jù)權利要求7的方法，其中在酶混合物中，其中的一種或多種酶的酶促活性被增強。
12.一種抑制酶活性的方法，其包括使一種或多種酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸。
13.根據(jù)權利要求12的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體組成。
14.根據(jù)權利要求12的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
15.根據(jù)權利要求12的方法，其中由所說的氣體調節(jié)一種分離的酶。
16.根據(jù)權利要求15的方法，其中在酶的混合物中，其中的一種或多種酶的酶促活性被抑制。
17.根據(jù)權利要求15的方法，其中所說的一種或多種酶是在溶液中、呈固相化形式、在分散劑中或在有機基質中。
18.一種調節(jié)酶活性的方法，其包括使一種或多種酶在足以使一種或多種稀有氣體經(jīng)受從酶活性抑制劑轉變?yōu)槊富钚栽鰪妱?，或從酶活性增強劑轉變?yōu)槊富钚砸种苿┲^程的溫度范圍內(nèi)，與含一種或多種所說之稀有氣體或其混合物的氣體接觸。
19.一種通過使一種或多種氧化還原酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以調節(jié)氧化還原酶活性的方法。
20.根據(jù)權利要求19的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體或其混合物組成。
21.根據(jù)權利要求19的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
22.根據(jù)權利要求19的方法，其中由所說的氣體調節(jié)一種分離的氧化還原酶。
23.根據(jù)權利要求19的方法，其中含有氧化還原酶的酶混合物是通過抑制所說的氧化還原酶，抑制所說混合物中的一種或多種其他酶或增強所說的氧化還原酶進行調節(jié)的。
24.根據(jù)權利要求19的方法，其中所說的一種或多種酶是在溶液中、呈固相化形式、在分散劑中或在有機基質中。
25.一種通過使一種或多種水解酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸來調節(jié)水解酶活性的方法。
26.根據(jù)權利要求25的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體或其混合物組成。
27.根據(jù)權利要求25的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
28.根據(jù)權利要求25的方法，其中用所說的氣體調節(jié)一種分離的水解酶。
29.根據(jù)權利要求25的方法，其中含有水解酶的酶混合物是通過抑制所說的水解酶、抑制所說混合物中的一種或多種其他酶或增強所說的水解酶進行調節(jié)的。
30.根據(jù)權利要求25的方法，其中所說的一種或多種酶是在溶液中、呈固相化形式、在分散劑中或在有機基質中。
31.一種通過使一種或多種裂解酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸來調節(jié)裂解酶活性的方法。
32.根據(jù)權利要求31的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體或其混合物組成。
33.根據(jù)權利要求31的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
34.根據(jù)權利要求31的方法，其中用所說的氣體調節(jié)一種分離的裂解酶。
35.根據(jù)權利要求31的方法，其中含有裂解酶的酶混合物是通過抑制所說的裂解酶、抑制所說混合物中的一種或多種其他酶或增強所說的裂解酶進行調節(jié)的。
36.根據(jù)權利要求31的方法，其中所說的一種或多種酶是在溶液中、呈固相化形式、在分散劑中或在有機基質中。
37.一種通過使一種或多種轉移酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以調節(jié)轉移酶活性的方法。
38.根據(jù)權利要求37的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體或其混合物組成。
39.根據(jù)權利要求37的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
40.根據(jù)權利要求37的方法，其中由所說的氣體調節(jié)一種分離的轉移酶。
41.根據(jù)權利要求37的方法，其中含有轉移酶的酶混合物是通過抑制所說的轉移酶，抑制所說混合物中的一種或多種其他酶或增強所說的轉移酶進行調節(jié)的。
42.一種通過使一種或多種異構酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以調節(jié)異構酶活性的方法。
43.根據(jù)權利要求42的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體或其混合物組成。
44.根據(jù)權利要求42的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
45.根據(jù)權利要求42的方法，其中由所說的氣體調節(jié)一種分離的異構酶。
46.根據(jù)權利要求42的方法，其中含有異構酶的酶混合物是通過抑制所說的異構酶，抑制所說混合物中的一種或多種其他酶或增強所說的異構酶進行調節(jié)的。
47.根據(jù)權利要求42的方法，其中所說的一種或多種酶是在溶液中、呈固相化形式、在分散劑中或在有機基質中。
48.一種通過使一種或多種連接酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸以調節(jié)連接酶活性的方法。
49.根據(jù)權利要求48的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體或其混合物組成。
50.根據(jù)權利要求48的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
51.根據(jù)權利要求48的方法，其中由所說的氣體調節(jié)一種分離的連接酶。
52.根據(jù)權利要求48的方法，其中含有連接酶的酶混合物是通過抑制所說的連接酶，抑制所說混合物中的一種或多種其他酶或增強所說的連接酶進行調節(jié)的。
53.一種變動酶促反應之最適相對酶和底物濃度的方法，其包括使一種或多種酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸。
54.根據(jù)權利要求53的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體或其混合物組成。
55.根據(jù)權利要求53的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
56.一種調節(jié)一種或多種酶之反應速率的方法，其包括使一種或多種酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸。
57.根據(jù)權利要求56的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體組成。
58.根據(jù)權利要求56的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
59.一種提高一種或多種酶之反應速率的方法，其包括使一種或多種酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸。
60.根據(jù)權利要求59的方法，其中所說的氣體基本上由一種或多種稀有氣體組成。
61.根據(jù)權利要求59的方法，其中所說的稀有氣體選自氖、氬、氪和氙。
全文摘要
一種調節(jié)酶活性的方法，該方法包括使一種或多種酶與含一種或多種稀有氣體或其混合物的氣體接觸。
文檔編號C12N9/90GK1068369SQ92103909
公開日1993年1月27日 申請日期1992年5月27日 優(yōu)先權日1991年5月28日
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