專利名稱：用于在單子葉植物中基因表達的重組啟動子的制作方法
本申請基于1990年5月18日申請的美國專利申請07/525866。
本發(fā)明一般涉及植物分子生物學領域，特別是涉及使基因表達增強的啟動子區(qū)內的增強子序列及其重組排列。本發(fā)明可使得單子葉植物中所需的結構基因的選擇表達增強。
研究植物轉化過程所必須考慮的最重要因素之一是獲得一種在靶細胞中能提供引種基因的可靠的高水平表達的啟動子。例如，對于具有編碼抗生素抗性標志的DNA轉化植物細胞，顯然希望獲得引種基因的高水平表達以實現(xiàn)轉化體的有效選擇。況且，在未轉化組織，如在卡那霉素(Hauptmann et al.(1988)Plant Physiol.86602-606)上選擇的小麥和玉米的胚胎組織，對抗生素表現(xiàn)出一定程度的天然抗性的情況下，一種強型的選擇體系對于轉化植物的成功生產將是決定性的。
啟動子為基因起始處DNA序列的一部份，它含有RNA聚合酶開始轉錄的信號，以使蛋白質合成能隨后進行。其核啟動子是復雜的，且含有包括相對于規(guī)定為+1的轉錄起始位點或帽位點的約-75bp5′的TATA盒同感序列的成分(Breathnath and Chambon(1981)Ann.Rev.Biochem.50349-383;Messing et al.(1983)in Genetic Engineering of Plants，T.Kosuge，Meredith and Hollaender，(cds.)PP.211～227)。在很多情況下，對于精確的轉錄起始需要TATA盒。在通常于-80和-100間的上游處，可有一個與同感序列CCAAT同源的啟動子元件(Breathnach and Chambon(1981)，見上文)。在植物中，CCAAT盒可被位于距帽位點距離相當?shù)谋籑essing等人(1983)稱作AGGA盒的同感序列所取代。認為在5′未轉錄區(qū)的另外的DNA序列應環(huán)境刺激而影響基因表達，如得到光照或營養(yǎng)素或包括熱休克、厭氧生活的不利條件，或存在重金屬。還有些DNA序列在發(fā)育期間，或在組織特異性方式方面控制基因表達。已發(fā)現(xiàn)有些DNA序列提高附近基因表達的水平;這樣的序列在動植物體系中稱作“增強子”。在酵母中，類似的刺激序列是已知的，它們被稱為“上游激活序列”，還經常攜帶調節(jié)信息。啟動子通常處于相對于相應基因編碼區(qū)的起始處的5′端或上游，且包含影響調節(jié)或轉錄總水平的所有輔助元件的區(qū)段可含有低于100bp或多至1Kbp個堿基對。
被廣泛用于植物細胞轉化的啟動子為那些編碼醇脫氫酶，Adh1和Adh2的兩種基因。Adh1和Adh2在厭氧生活開始后都被誘導(Freeling(1973)Mol.Gen.Genet.127215～227)。這兩種酶中，Adh1在厭氧情況下是最為重要的(Freeling et al.(1973)Biochem.Genet.827-23)。如同Adh2已被克隆和序列分析(Dennis et al.(1985)Nucl.Acids Res.13727～743)，玉米Adh1也被克隆并序列分析(Dennis et al.(1984)Nucl.Acids Res.123983-4000)。來自其它源的Adh1基因最近也被克隆和序列分析(Lle -wellgn et al.(1987)J.Mel.Biol.195115-123)。Howard等人((1987)Planta 170535-540)測驗了玉米原生質體中內源Adh1基因和嵌合Adh1基因的表達。Adh1嵌合基因ADH-CAT由連接于氯霉素乙酰轉移酶(CAT)編碼序列的Adh1啟動子和nopaline合酶(nos)3′信號組成。以電穿孔法引種到玉米原生質體內的ADH-CAT在低氧濃度下的表達比在控制條件下高近四倍。ADH-CAT表達相當于在玉米原生質體中的內源Adh1基因的表達且在細胞培養(yǎng)基中的厭氧反應與在玉米籽苗中的反應定性地相似。Walker等人((1987)Proc。Natl.Acad.Sci.846624-6628)發(fā)現(xiàn)了基于一系列體外操作的ADH-CAT嵌合基因系表達的ADH-CAT的厭氧所必需的序列元件。他們指出，在玉米Adh1啟動子的-140至-99位置之間有一厭氧調節(jié)元件(ARE)，并且ARE由至少兩個位于-133至-124和位于-113至-99的序列元件組成，這兩個元件都是必要的，且兩者一起對ADH-CAT基因活性的低氧表達是充分的。
據進一步報導(Walker等人(1987)，見上文)，玉米的Adh2基因也通過厭氧生活調節(jié)且含有Adh1ARE的同源。該同源在ARE的Ⅰ區(qū)約為81%以及在Ⅱ區(qū)約為69%。此外，來自Arabidopsis和豌豆的Adh基因的5′側區(qū)在10pb的區(qū)域上的玉米Adh1ARE同源不多于60%。
花椰菜花葉病毒(Cauliflower Mosaic Virus)35S啟動子(Guilley et al.(1982)Cell30763-773;Odell et al.(1985)，見上文)是在植物轉化過程中最頻繁使用的啟動子之一。這種雙子葉植物病毒啟動子引導了引種入雙子葉和單子葉植物原生質體的基因表達(Fromm et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.825824-5828);Nagata et al.(1987)Mol.Gen.Genet.207242-244;Odell et al.(1988)Plant Mol.Biol.10263-273)。在轉化的煙草細胞中(Morelli el al.(1985)，in Biotechnology in Plant ScienceRelevance to Agriculture in the Eighties，M.Zaitlin，P.Day.and A.Hollaender，(eds.)，Academic Press，New York，PP.227-236)或轉基因矮牽牛植物中(Sander et al.(1987)Nucl.Acids Res.151543-1558)的相對轉錄本水平的定量測量表明，35S啟動子比nos啟動子至少強30倍。35S啟動子的強度是它廣泛用于轉基因植物中所要求的區(qū)段的高水平基因表達的原因。Fang等人((1989)，The Plant Cell 1141-150)已通過5′、3′和內缺失表明，-343至-46的上游片段可細分為三個官能區(qū)，-343至-208，-208至-90和-90至-46。他們指出，當以適當?shù)?55啟動子序列試驗時，前兩區(qū)加強了轉錄活性。比較起來，-90至-46區(qū)本身幾乎沒有活性，但它通過提高兩個遠側區(qū)的轉錄活性而起輔助作用。
盡管CaMV 35S啟動子是一強的啟動子，在各種植物包括遠于病毒寄主范圍之外的植物中引發(fā)高水平的RNA生產，而它在農業(yè)意義上的禾本科植物，如小麥中具有比較低的活性(Lee et al.(1987)in“Progress in Plant Protoplast Research”，Proceedings of the 7th International Protoplust Symposium，Wageningen.The Netherland，December 6-11，1987，Puite et al.(eds);Hauptmann et al.(1987)Plant Cell Rep.6265-270)。相反地，來自玉米Adh1基因的單子葉植物啟動子在雙子葉植物煙草(Nicotiana plumbaginifolia)(Ellis et al.(1987)EMBO J.611-16)原生質體中產生非常低的表達。這些觀察結果提示，就轉錄因子和啟動子序列的識別而論，單子葉植物和雙子葉植物間可能有些差別。
轉移基因的表達水平通?？赏ㄟ^加入來自啟動子的提高轉錄水平的增強子元件、順式作用序列來提高(Banerji et al.(1981)Cell27299-308)。如Khoury和Gruss((1983)Cell 33313-314)所定義，增強子為一組真核啟動子元件中的一種，它以相對地不受與附近基因相關的位置和取向制約的方式提高轉錄效率。在SV40的72bp重復內發(fā)現(xiàn)了原型增強子。它處在距轉錄起始位點多于100bp的上游，且有GTGGAAA(或TTT)G同感序列。作為一種慣例，動物或動物病毒增強子可在多達1Kbp 5′的距離范圍內，在任何取向而起作用，并可或在5′或在3′至該基因的區(qū)間起作用。序列主題往往要重復多次。增強子已用在動物病毒體系中以用弱啟動子研究基因(Lee et al.(1981)Nature 294228-232;Huang et al.(1981)Cell27245-255)。已有些源于植物基因的序列被認為與動物增強子同感核序列同源。Odell等人(1985)Nature 313810-812)已表明，-105至-46間的序列對CaMV 35S啟動子的最高表達是必要的。該區(qū)內所含的是與動物增強子核同感序列部份同源的序列。Bouchez等人((1989)EMBO.J.84197-4204)進一步指出，35S啟動子的-89至-59的31bp片段含有對玉米和煙草核中核內蛋白因子的束縛位點(Singh et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.863733-3737)且該片段對啟動子的最大活性是必要的。目前在玄參花葉病毒(FMV)、麝香石竹蝕刻環(huán)病毒(CERV)和來自Ri和Ti質粒的7個T-DNA認為(Opine)合酶基因的上游區(qū)已發(fā)現(xiàn)類似的增強子序列。
Ellis等人(1987)EMBO J.611-16)指出，Adh1啟動子上游序列位于-1094至-140的缺失產生在煙草轉移基因中只有極低表達的Adh1基因構建。然而，當由在雙子葉植物中表達的兩個基因(章魚堿合酶(OCS)和CaMV35S基因)衍生得到的且具有增強子型性能的序列位于玉米Adh1啟動子區(qū)上游時，則易于檢測其活性。它指出，玉米Adh1基因轉譯起始密碼子序列上游的前247bp對轉移基因煙草中的雜種基因提供厭氧調節(jié)和精確的轉錄起始。還進一步指出(Ellis et al.(1987)EMBO J.63203-3208)，由OCS啟動子上游區(qū)衍生的176bp DNA序列在Zea Mays(一種單子葉植物)和Nicotiana plumbaginifolia(一種雙子葉植物)的原生質體中起一增強子的作用。據報道，這種176OCS序列在兩個取向都起作用，但發(fā)現(xiàn)其增強活性依賴于它距Adh1啟動子的距離，并還由序列為ACGTAAGCGCTTACGT的16bp回文的存在而產生。
其它的研究(Kay et al.(1987)Science 2361299-1302)報道了在轉基因煙草植物中采用含260bpCaMV35S上游序列復制區(qū)的CaMV35S啟動子可得到高出10倍的轉錄活性。據報道，該復制區(qū)還具有異源啟動子的強增強子的作用，將相鄰和趨異的轉錄轉移DNA基因活性提高數(shù)百倍。
Ow(et al.(1987)Proc.Natl.Acad.SCi.844870-4874)還報道，當自然的35S啟動子相比，35S啟動子遠區(qū)的多體(位于-148和-89之間)能將35S啟動子核活化到更高的表達水平。Fang等人(1989)見上文)進一步指出，上游35S啟動子片段(-209至-46)的單體和多體可作為增強子以強化來自異源啟動子的轉錄。在這些研究中，將35S啟動子位于-209至-46間上游區(qū)的8個復拷貝克隆到rbcS-3A(雙磷酸核酮糖羧基酶的小亞基)基因的-50位;與采用rbcS-3A上游區(qū)所得結果(Fang等人(1989)，見上文)相比，該八聚物將rbcS-3A轉錄本提高到更高水平。
從諸如病毒或細菌的基因組中獲得的增強子在植物中強化所需基因表達方面顯示了一定的作用。在這一情況下，通過將來自Agrobacterium tumefaciens的章魚堿合酶(OCS)增強子加到玉米Adh1啟動子中而使啟動子的種特異性改變(Eills et al.(1987)EMBO J.611-16)。加入OCS增強子之后，該玉米Adh1啟動子能夠在轉基因煙草植物中表現(xiàn)出強烈的厭氧誘導表達。在另一情況下，報道了當將OCS增強子置于直接與ARE相鄰處時，該OCS-ARE構建在玉米原生質體中顯示最高表達，且CAT表達不再因厭氧刺激而提高(Peacock et al.(1987)in Plant Gene Systems and Their Biology，Alan R.Liss，Inc.PP.263-277)。另據報道(Callis et al.(1987)Genes and Dev.11183-1200)，未轉譯先導區(qū)中Adh1啟動子的玉米Adh1 Intron1下游的內含物表明，由于引種到玉米原生質體中的氯霉素乙酰轉移酶(CAT)標志基因，使得表達提高十倍。
本發(fā)明的首要目的是提供一種重組啟動子分子，它能夠使本領域普通技術人員在靶細胞中獲得引種基因的可靠的高水平表達。這一目的是通過利用來自植物可表達基因的5′未轉錄區(qū)的增強子序列的結合而實現(xiàn)的。在較佳的實施方案中，增強子序列由玉米醇脫氫酶1(Adh1)基因和章魚堿合酶基因衍生得到，且最佳為含有多個或結合的增強子元件，如含有厭氧調節(jié)元件(ARE)、章魚堿合酶元件(OCS)和來自Adh1基因的Intron1。
本發(fā)明的另一目的是提供一改進的啟動子構建，與采用花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)啟動子所得結果相比，它使單子葉植物懸浮細胞原生質體中的引種標志基因的表達提高10～50倍。較佳的是，本發(fā)明的重組啟動子分子含有彼此間或間隔或相鄰而組在一起的多個ARE拷貝和彼此間或間隔或相鄰而組在一起的多個OCS元件拷貝。更佳的是，ARE元件置于5′至OCS元件之間以及ARE和OCS元件置于5′至TATA盒區(qū)之間。在一示例方案中，用于單子葉植物的改進的啟動子構建含有玉米Adh1基因的6個ARE銜接重復拷貝、來自Agrobacterium tumefaciens(OCS)章魚堿合酶基因的OCS元件的4個銜接重復拷貝、來自植物可表達啟動子的TATA盒區(qū)、一個為植物可表達基因未轉譯先導區(qū)的一部份的內含子〔如玉米Adh1基因的Intron1(未轉譯先導區(qū)的一部份，從核苷酸-119至+672)〕、一個植物可表達的結構基因〔如大腸桿菌β-葡糖苷酸酶基因(GUS)〕以及一個植物可表達終止信號(如來自Agrobacterium tumefaciens的nopaline合酶基因的nos終止區(qū))。
本發(fā)明的再一目的是提供一改進的啟動子構建，它在單子葉植物細胞中優(yōu)于CaMV 355啟動子使標志基因的表達增強，如在大麥中約增強16倍;且在雙子葉植物原生質體中與CaMV 355啟動子相比，使標志基因表達增加7-10倍。較佳的是，該重組啟動子分子含有彼此間隔或相鄰定位的多個OCS元件拷貝。在一實施方案中，這種改進的啟動子構建含有4個銜接重復的OCS拷貝、一個來自植物可表達啟動子〔如截短的CaMV △35S啟動子(缺失到核苷酸-90)〕的TATA盒區(qū)、一個為植物可表達基因未轉譯先導區(qū)一部份的內含子(如來自玉米Adh1基因的Intron1)、一個植物可表達結構基因(如GUS編碼區(qū))以及一個植物可表達終止信號(如來自Agrobacterium tumefaciens nopaline合酶基因的nos終止區(qū))。
使轉化植物細胞的有效選擇體系得以發(fā)育也是本發(fā)明的一個目的。這一改進的選擇體系基于在轉基因組織中結構基因表達的可靠的增強上。例如，本發(fā)明提供的重組啟動子構建，當被連接到抗生素抗性基因上時，對導致轉化期選擇的抗生素抗性水平的提高是有效的。
本發(fā)明的又一目的是提供一用來顯示植物中高水平組織特異性表達的重組啟動子構建。在一實施方案中，本發(fā)明的p40CS△35SIGN構建對葉子特異性表達顯示出優(yōu)良的效力。
本發(fā)明還提供一種在單子葉植物細胞中獲得所要求基因高水平表達的方法。如本領域普通技術人員所公知，這類要求的植物可表達基因包括Bacillus thuringiensis結晶毒素蛋白質基因、甘草膦抗性基因、變異種子貯藏蛋白質基因等等。本方法包括構建重組啟動子分子，在一實施方案中，該構建含有位于5′至帶有TATA盒區(qū)的植物可表達截短的啟動子間的多個AREs和/或多個OCS元件，并在其3′方向可選擇地跟隨玉米Adh1基因Intron1、一植物可表達結構基因(如GUS基因)和來自Agrobacterium tumefaciens nopaline合酶基因的nos終止區(qū)。在一較佳方案中，在構建啟動子構建的過程中采用了6個ARE拷貝和4個OCS拷貝。
本發(fā)明的還一個目的是提供一種再現(xiàn)關于基因表達調節(jié)的誘導基因組成的方法，在本發(fā)明的一個實施方案中，將通常應厭氧生活而發(fā)生作用的Adh 1啟動子設計為帶有增強子元件并能以某一組成方式表現(xiàn)出高水平基因表達。
重組啟動子分子構建是采用如上所述的植物增強子片段以常規(guī)技術制成。進一步講，這類DNA分子的構建可以采用來自在此描述的已知基因的特異性序列或采用來自表現(xiàn)出可使置于調節(jié)控制下的異源基因表達增強的其它來源的功能相當序列，如780T-DNA增強子?？刹捎闷渌慕囟痰闹参锟杀磉_啟動子代替截短的Adh1啟動子和截短的CaMV△35S啟動子以提供這些構建中必需的TATA盒序列。任何植物可表達結構基因都可用于這些構建中。
構建之后，將含有在此所述的改進的啟動子分子的重組DNA表達體系引種到植物組織中以使增強子元件/截短的啟動子/結構基因的結合體在所需的植物組織中，較佳的為在單子葉植物組織中以高水平表達。采用異種DNA使植物細胞和組織的轉化可用本領域公知的多種方式完成。在一實施方案中，采用了電穿孔技術。
本發(fā)明方法一般可用于單子葉和雙子葉兩種植物中結構基因的表達。采用為單子葉植物構建的啟動子的這一方法特別適用于禾本科(Graminaceae)，尤其適用于玉米和小麥。
本發(fā)明的其它目的在于含有于此所述的重組啟動子分子的植物、植物細胞和植物組織。另外一些目的在于含有所述重組啟動子分子的載體和表達盒以及含有這類適于維持、復制和植物轉化的載體的細菌細胞。


圖1為用于不同重組啟動子分子構建的DNA結合體示意圖。(a)用于測定啟動子區(qū)×的啟動子活性的一般性質粒。(b)不同構建中啟動子區(qū)×的結構。(c)△ADH啟動子已標出TATA盒和轉錄起始位點。在此沒有轉錄起始位點下游的ATG轉譯起始。(d)△35S啟動子已標出TATA盒和OCS元件。(e)6ARE元件已標出每個ARE(在玉米Adh1基因中的-140至-99位置)的RegionⅠ和RegionⅡ。該元件由一個自然取向的ARE和在其之前的五個反取向ARE構成。(f)4OCS元件該元件含有四個來自OCS基因的-211至-172區(qū)的40bp直接重復。在(c)至(f)中所有堿基對編號指的是在產生該構建的基因序列中堿基對的天然位置。
為了免除其用于說明書和權利要求書中意義和范圍上的含混，作出如下定義。
表達是指結構基因的轉錄或轉譯以使蛋白質合成。
啟動子表示在結構基因5′端的引導轉錄開始的序列。啟動子序列用來引發(fā)下游基因的表達是必要的，但并非總是充分的。真核啟動子通常含有與同感序列5′-TATAAT-3′(TATA盒)同源的約10-35bp5′至轉錄起始(帽)位點(習慣以+1編號)的序列;3′至帽位點的堿基對給以正數(shù)編號而5′至帽位點的堿基對給以負數(shù)編號，該編號反映了其距帽位點的距離。約30-70bp5′至TATA盒間常常有另一個同源于典型形式5′-CCAAT-3′(R.Breathnach and P.Chambon(1981)Ann.Rev.Biochem.50349-383)的啟動子成分。在植物中CCAAT“盒”有時被AGGA“盒”(Messing et al.(1983)in Genetic Engineering of Plants，T.Kosuge et al.(eds)，Plenum Press，PP.211-227)替代?？梢园l(fā)現(xiàn)，響應于環(huán)境信號或轉錄最大效率的其它可給出組織特異性的序列也散布著這些啟動子元件，或發(fā)現(xiàn)其至5′方向距帽位點更遠。這樣的序列常常發(fā)現(xiàn)于距帽位點400bp以內，但也可能延伸遠至100bp或更遠。
截短的啟動子表示含有引發(fā)轉錄所需的近端序列但除增強子序列而外的TATA盒區(qū)。本發(fā)明中希望截短的啟動子所含的區(qū)位于距帽位點(+1)約200bp5′和約200bp3′之間，更佳的是該區(qū)位于距帽位點約100bp5′和約110bp3′之間。
ADH一般指植物可表達醇脫氫酶基因，且特別是指來自玉米的醇脫氫酶基因。
Adh1啟動子指跨越玉米醇脫氫酶基因1中核苷酸位置約-1094至約-106區(qū)間的DNA片段，或表示功能相當?shù)囊粋€同源片段。該序列是按Ellis等人(1987)上文)出版的校正法將帽位點定為+1而編號的。
前面有△符號的啟動子(如對Adh啟動子為△ADH或對35S啟動子為△35S)指文中所定義的截短的啟動子。
△ADH一般指能提供引發(fā)轉錄所必需的TATA盒序列的截短的植物可表達Adh啟動子，特別是指來自玉米Adh1基因的跨越約自核苷酸-100至核苷酸+106的DNA區(qū)的截短的Adh1啟動子(如Ellis等人(1987)見上文所述)，或指功能相當?shù)耐雌巍?br> △35S一般指能提供引發(fā)轉錄所必需的TATA盒序列的截短的植物可表達CaMV啟動子，特別是指來自花椰菜花葉病毒(CaMV)35S基因的跨越約自核苷酸-90至核苷酸+3的DNA區(qū)的截短的35S啟動子，或指功能相當?shù)耐雌?。在CaMV35S啟動子中的核苷酸約-90至-45區(qū)間含有一個OCS元件(Bouchez et al.(1989)，見上文)。
ARE或ARE元件指如Walker等人((1987)上文)所定義的厭氧調節(jié)元件，或指功能相當?shù)耐雌?。來自玉米Adh 1基因的ARE片段跨越核苷酸位置-140至-99間的DNA區(qū)。該ARE由至少兩個位于-133至-124和位于-113至-99的序列元件組成，兩者對Adh -CAT基因表達(Walker et al。(1987)見上文)的低氧表達是必要的而它們一起是充分的。區(qū)Ⅰ和區(qū)Ⅱ的DNA序列必須含有5′-GGTTT-3′，且大多須含有5′-TGGTTT-3′。在本發(fā)明中，希望ARE只含區(qū)Ⅰ而不含區(qū)Ⅱ。此外，希望起作用的植物ARE元件來自不同來源的厭氧誘導基因，這包括但不限于來自用于玉米Adh1和Adh2和玉米醛縮酶的基因上游區(qū)的序列。
OCS或OCS元件指章魚堿合酶基因的176bp的OCS增強子片段(跨越核苷酸位置-292至-116)，該基因用于增強轉基因煙草中玉米Adh1啟動子的表達(Ellis et al.(1987)EMBO J.611-16 and(1987)EMBO J.63203-3208)，或指功能相當?shù)耐雌?。該OCS含有16bp回文序列5′-ACGTAAGCGCTTACGT-3′的OCS元件，它是OCS增強子的基本成分。該OCS元件出現(xiàn)于來自Agrobacterium tumefaciens的章魚堿合酶基因中核苷酸-193至-178之間?，F(xiàn)已證實在其它來源中存在與OCS元件同源和功能相當?shù)男蛄?Bouchez et al.(1989)見上文)。希望在本發(fā)明中采用的OCS元件也含有與Ellis(et al.(1987)EMBO J.63202-3208)的OCS元件至少約50%同源和功能相當?shù)膩碜云渌鼇碓吹男蛄?Bouchez et al.(1989)見上文)。
在啟動子增強子元件設計中的I代表內含子(Intron)。
內含子一般指植物可表達基因中位于轉錄起始位點和轉譯起始位點之間的作為內含子而天然發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列。專用于本文實例中的內含子為來自玉米Adh1基因Intron1的跨越核苷酸119至672(核苷酸按Dennis et al.(1984)Nucl.Acids Res.123983-4000所述編序)的一個557bp的片段，或為功能相當?shù)耐雌巍?br> Emu或Emu盒指由“6ARE4OCS△ADH1”構建組成的表達盒。
pEmuGN為p6ARE4OCS△ADHIGN構建的縮寫。
G指大腸桿菌β-葡糖苷酸酶基因。
N指來自nopaline合酶基因的轉錄終止信號序列。
高水平表達指在相同植物系統(tǒng)中與在CaMV35S啟動子控制下所得結果相比，于單子葉植物中在本發(fā)明的重組啟動子控制下的所要求基因的表達至少提高約10-50倍。
調節(jié)控制一般指由DNA序列元件，特別是由那些位于(5′至)轉錄起始位點上游的DNA序列元件誘導的基因表達調節(jié)。調節(jié)可模擬成一響應環(huán)境條件的離合開關，或調節(jié)可導致基因表達水平的變化。例如，厭氧調節(jié)元件以這樣一種方式起作用，它使得下游基因表達僅在厭氧環(huán)境條件下產生。實驗性厭氧生活系指植物組織、培養(yǎng)細胞或原生質體處于含有5%氧/95%氮的氣氛中。
在啟動子或調節(jié)序列元件的調節(jié)控制下置放結構基因是指將該結構基因定位以使該基因的表達受控于這些序列。啟動子通常位于5′上游至它所控制的基因之間。在異源啟動子/結構基因的組合體的構建中，通常優(yōu)選地將啟動子定位于距基因轉錄開始位點的約與啟動子和基因間的距離相同處，該基因控制啟動子在其中的天然位置，即該啟動子由該基因衍生得到的。如本領域所公知，這一距離的某種變化是可調節(jié)的而不會損失啟動子的功能。類似地，調節(jié)序列元件相對于異源基因(置于調節(jié)序列元件的控制下)的較佳定位，由該元件在其天然位置的定位而確定，即該調節(jié)元件是由該基因衍生得到的。再次指出，如本領域所公知及本文中調節(jié)元件的多個拷貝所示，該距離可以發(fā)生某些變動。
結構基因為含有編碼為蛋白質、多肽或其一部份的DNA小片段的部份基因。該術語可指天然存在于細胞之中的結構基因的拷貝，但不指人工引種的，或可以編碼為蛋白質但通常在該基因所引入的植物細胞中不存在的結構基因，在后一種情況下稱之為異源基因。異源結構基因可全部或部分地由細菌的基因組或游離基因、真核的基因組DNA或質體DNA、cDNA、病毒DNA或化學合成DNA衍生得到。允許結構基因在或編碼區(qū)或未轉譯區(qū)含有一個或多變異，這將影響表達產物的生物活性或化學結構、表達速率或表達控制的方式。這類變異包括但不限于突變、插入、缺失以及一個或多個核苷酸的取代。該結構基因可構成一連續(xù)的編碼序列或可包括一個或多個以適宜的植物機能性交接點為界的內含子。該結構基因可為來自天然存在或合成的多種來源的小片段組合體。只要實驗性操作在編碼序列的連續(xù)處維持官能度，該結構基因還可編碼融合蛋白質。
結構基因、增強子或調節(jié)序列、或其它序列的同源體在此為功能相當?shù)耐葱蛄?，且在此至少?0%同源。這類序列可由本領域技術人員利用核酸在本領域公知的(如Hames and Higgins(eds)(1985)Nucleic Acid Hybridisation，IRL Press，Oxford，UK中所述)適當?shù)膰栏駰l件下的雜交能力加以證實。應當明確，在本發(fā)明中所使用或公開的序列或片段內可以有少數(shù)序列變化。這些變化可借助標準技術手段確定以使本領域普通技術人員能夠對調節(jié)元件、引發(fā)轉錄起始所需的啟動子元件和隨后附有植物可表達轉錄終點(也可是聚腺苷酸化)信號的結構基因等的功能性單元進行操作并加以使用。
例如，OCS元件首先是作為OCS基因啟動子中的增強子元件而分離的，它在該基因內被證實為-16bp回文序列(Ellis et al.(1987)EMBO J.611-16)。OCS元件的轉錄增強活性在體外與轉錄因子的結合有關。OCS元件還被證實存在于包括在認為(opien)合酶中的六種其它T-DNA基因啟動子區(qū)內和三種包括CaMV35S啟動子的植物病毒啟動子中(Bouchez et al.(1989)見上文)。這些元件顯示了在體外對OCS轉錄因子的約束和植物細胞中轉錄的強化。比較這十個元件(表現(xiàn)出與首先于OCS基因中證實的OCS元件至少同源50%)的20bp核苷酸序列，確定了20bp同感序列TGACG(T/C)AAG(C/G)(G/A)(A/C)T(G/T)ACG(T/C)(A/C)(A/C)，在其中心含有16bp回文。在本發(fā)明中可以予料該OCS元件通過其中的上述由Bouchez等人((1989)見上文)證實的10種增強子元件中任一種以及與在OCS基因(如Ellis et al.(1987)EMBO J.611-16中所述)中首先證實的OCS元件50%同源的同感序列和核苷酸序列來舉例說明。在本發(fā)明中還可予料，顯示出與玉米Adh 1基因中首先論述的ARE元件至少同源50%的DNA片段表現(xiàn)出了相當于ARE元件的功能并可用于在重組啟動子構建中代替ARE元件。
植物組織包括分化型和未分化型植物組織，它包括但不限于根莖、葉、花粉、種子、瘤組織以及培養(yǎng)細胞的各種形式，如單細胞、原生質體、胚胎和愈創(chuàng)組織。該植物組織可存在于植物中或在器官、組織或細胞培養(yǎng)基中。
在調節(jié)元件和一下游啟動子控制下表達結構基因的遺傳變異植物組織的生產是將本文所作的論述與本領域公知的各種技術和方法相結合來進行的。在大多數(shù)情況下，整個過程中每一階段采用的方法不同。方法的選擇取決于變量，諸如用于克隆和引種重組DNA分子所選擇質粒載體體系分子、需變異的植物種類、某具體的結構基因、所用的啟動子元件和調節(jié)元件。本領域技術人員能夠選擇和采用適當?shù)淖儞Q來達到官能度。在培養(yǎng)細胞中用于表達所要求結構基因的培養(yǎng)條件是本領域所公知的。本領域還公知，一些單子葉植物和雙子葉植物的物種都是可轉化的和再生的，這樣，便可獲得在本發(fā)明啟動子分子調節(jié)控制下含有和表達所要求基因的全部植物。如本領域技術人員所知，轉化植物中的表達可以是組織特異性的和/或特異于特定發(fā)育階段。截短的啟動子和結構基因的選擇為實現(xiàn)所要求植物表達最佳化的參量，這都是本領域技術人員公知的，也是本文所講述的。
本發(fā)明部分地基于本申請人的發(fā)現(xiàn)，即用截短到-45位置的CaMV△35S啟動子從-35至+106位置來置換部分的玉米Adh 1啟動子時，產生了雜種啟動子，當在玉米原生質體中測定時，該雜種啟動子保留了親代基因的厭氧調節(jié)。但是，如果使用截短到-90的CaMV△35S啟動子替代，則表達就重新組成。在該CaMV△35S啟動子中的-90和-45之間區(qū)域表現(xiàn)為含有OCS元件(Bouchez et al.(1989)，見上文)還含有最早發(fā)現(xiàn)于OCS增強子片段中的含16bp回文的同感序列(Ellis et al.(1987)EMBO J.63203-3208)。所以，來自CaMV△35S啟動子或OCS基因片段的OCS元件同玉米Adh1啟動子上游區(qū)的偶合產生一在玉米細胞中本質表達的構建。
另外還發(fā)現(xiàn)，在由Adh1啟動子引發(fā)的CAT基因的增強表達中，四個銜接重復的OCS元件(4OCS)的排列比單一的OCS元件具有更強的活性。類似地，用6個銜接重復的ARE在玉米Adh1啟動子中代替單個ARE，在厭氧條件下，其產生的表達增加十一倍。
在本發(fā)明中，制備了一些DNA構建，以使植物細胞中結構基因得以高水平表達。構建一系列的基于截短的玉米Adh1啟動子(跨越核苷酸-100至+106，Ellis et al.(1987)EMBO J.63203-3208)或者截短的35S啟動子(跨越核苷酸-90至+3)的啟動子(見附圖1)。將各種不同的OCS元件與AREs的結合體加入到上游以期制得高表達的啟動子。另外，在某些構建中，將含有玉米Adh1啟動子的Intron1的片段插入該啟動子和結構基因之間。
在一種雙子葉植物和四種單子葉植物細胞系的原生質體中，通過對報道基因產生的測定，確定了重組啟動子的相對強度，如GUS酶活性，測定方法是通過用電穿孔方法測定將DNA構建引入上述植物原生質體中44～48小時之后報道基因的產生。列于表1的結果通過將p35SGN的值設為1.0而進行了標準化。該標準化降低了在不同的制備原生質體的實驗中所產生的觀察誤差。所示的這些數(shù)值為至少5個多至8個使用取自至少三種不同分離法的原生質體的重復實驗的平均值。使用p35SGN、p40CS△35SIGN和p6ARE4OCS△ADHIGN產生的GUS的比活性范圍列于表2。盡管在多數(shù)情況下，重復實驗間的GUS比活性值是顯著變化的，但在每一植物種的重復實驗間，其排列順序通常是相同的。相對表達水平并不取決于所需結構基因的選擇。需強調的是，在本研究中所用的標準條件使用相對低含量的DNA(1.2μg/105原生質體)。已經發(fā)現(xiàn)，在不同構建中，DNA的濃度在GUS酶的活性方面產生最明顯不同的響應。當DNA濃度增加時，對某些低效的構建可觀察到較高的GUS活性。
如表1所示，在所有試驗的單子葉植物細胞系中，如玉米、小麥、單粒小麥(Triticum monococcum)毒麥(Lolium multiflorum)和水稻，該CaMV△35S啟動子表現(xiàn)為弱表達;該標志的GUS基因表達與對“減少的啟動子”(“promoterLess”)構建pGN和pIGN的記錄相當。通常，在單子葉植物中，基于截短的Adh1啟動子的構建的表達比其基于截短的CaMV△35S啟動子更高。在存在玉米Adh1 Intron1時，通過在其中將6個ARE元件聯(lián)接到玉米Adh1啟動子上的構建，在單子葉植物的細胞系中會產生恒定的高水平表達。該p6ARE4OCS△ADHIGN構建，其包括附加的4個OCS元件的拷貝，在所有單子葉植物細胞系中表現(xiàn)出最高的表達。在單子葉植物懸浮細胞原生質體中，這種質粒比CaMV△35S啟動子在GUS表達方面增加10至50倍。采用這種構建所得的高表達很可能由幾種因素造成。使用取自玉米Adh 1基因的單子葉植物TATA盒無疑會產生正作用。在這種構建中取自玉米Adh1基因的未轉譯先導區(qū)長(106堿基)，這也是很重要的因素，因在很多體系中，源于玉米Adh1基因中超出+80位置的3′末端的先導區(qū)缺失將表現(xiàn)為消除表達。通常在單子葉植物細胞系中基于△ADH的構建比基于△35S的更好。相反，在雙子葉植物(Nicotiana plumbaginifolia)細胞系中，△35S-基啟動子優(yōu)于△ADH-基啟動子。玉米Adh1 Intron1的內含物增加以p6ARE△ADHIGN和p6ARE4OCS△ADHIGN的表達，但在CaMV△35S啟動子-基構建中觀察到無效的內含子。在“減少的啟動子”構建的情況下，可觀察到對無DNA存在的電穿孔原生質體來說，pGN沒有產生高出基底的可測量的GUS表達。然而，包括玉米Adh 1 Intron 1的pIGN產生一低的可測量的GUS活性。
有助于從p6ARE4OCS△ADHIGN獲得的高水平表達的另一重要因素是OCS元件和AREs的多拷貝的存在。該OCS元件是一強型增強子，在雙子葉和單子葉植物中都起作用(Ellis et al.(1987)EMBO J.63203-3208)，并且在玉米原生質體中測定時，加入另外5個ARE拷貝增加由玉米Adh 1啟動子的表達。GUS標志基因可用其它植物可表達結構基因的編碼區(qū)代替。因此，在培養(yǎng)的單子葉植物細胞中需要高水平基因表達時，該｀6ARE4OCS△ADHI′盒是有用的。該｀6ARE4OCS△ADHI′盒已編碼命名為｀Emu′盒，并且相應地，該p6ARE4OCS△ADHIGN構建縮寫為pEmu GN。
本發(fā)明者已表明，該p6ARE4OCS△ADHIGN質粒在玉米中為可厭氧誘導的。厭氧誘導的細胞比需氧生長的細胞增加十倍的表達。本發(fā)明的pEmuGN構建比p6ARE△ADHIGN產生更高水平的表達，如表2所示。這提示，將OCS元件加入啟動子構建中，甚至在厭氧條件下可獲得相當于厭氧誘導水平的表達水平。這種提示可進一步描述。使用小麥(L1)原生質體測定了pEmuGN、p6ARE△ADHIGN和p6ARE△35SIGN的厭氧誘導能力。將一些試樣在25℃于空氣中振蕩培養(yǎng)(需氧)，而另一些試樣(稱為“厭氧誘導的”)置于5%O2/95%N2氣氛下并于25℃下在其培育期內振蕩(44-48小時)。如表3所示，在小麥(L1)原生質體中，p6ARE△ADHIGN厭氧誘導約3倍。另一方面，在厭氧和需氧兩種條件下，pEmuGN產生相當?shù)谋磉_水平，并且高于由p6ARE△ADHIGN全部誘導的表達。所以，將4OCS元件加入到p6ARE△ADHIGN中補償了厭氧誘導的需要。p6ARE△ADHIGN的類似物，將其中的△ADH用△35S代替(p6ARE△35SIGN)不能產生對其厭氧誘導能力有任何意義的足夠高水平的表達。
由列于表1的結果表明，在Nicotiana plumbaginifolia原生質體中，將4OCS元件加入到截短的啟動子△35SIGN構建中會大大增加其表達。這種構建中的啟動子可用于需要高基因表達水平的雙子葉植物中。在這種和其它高表達的構建中存在玉米Adh 1 Intron 1，表明在煙草屬(Nicotiana)中發(fā)生了玉玉米內含子的完好連接。不具有內含子的p4OCS△35SIGN的形式(p4OCS△35SGN)產生相似的高表達水平，這表明對在煙草屬(Nicotiana)中的高水平表達并不需要存在內含子?；诮囟痰腁dh 1啟動子的構建在煙草屬中幾乎不產生或根本不產生表達，除非是在含4OCS元件的pEmuGN存在情況下，且它產生的表達水平與由35S啟動子所產生的相似。
在不同的細胞系中觀察到特定構建的相對性能間的差異。在小麥、單粒小麥和水稻中，構建pEmuGN比p6ARE△ADHIGN的表達增加2倍，但在玉米中這一比例為5倍，而在毒麥(Lolium multiflorum)中為16倍，這一數(shù)值與在Nicotiana plumbaginifolia中所得到的很相近(17倍)。也已發(fā)現(xiàn)在Nicotiana中產生最高表達的構建(p4OCS△35SIGN)在Lolium中也具有相對高的表達(用pEmuGN獲得表達的44%)，然而對于小麥其相應值低于1%。這些差別大概反映出在不同的細胞系中其轉錄因子的補體不同。在這一方面，毒麥(Lolium)細胞系可能位于小麥和煙草屬(Nicotiana)細胞系之間的某處。
在葉組織中，例如在大麥(Hordeum vulgare)葉肉原生質體中，還試驗了不同啟動子構建的相對強度。如表2所示，大麥葉肉原生質體與其它細胞系相比需要稍不同的電穿孔條件。為此原因，盡管這一點是很清楚的，即由不同的啟動子產生的相對表達水平顯著不同于在確立細胞系中所觀察的，也不將由大麥獲得的絕對值與由其它細胞系獲得的絕對值進行嚴格的比較。構建pEmuGN不產生表達。能產生顯著高于背底的表達水平的唯一構建是p4OCS△35SIGN。該構建在大麥葉肉原生質體中產生的高表達水平可與在懸浮細胞原生質體中用pEmuGN所觀察到的相比較。這種結果示意，在單子葉植物葉肉組織中pEmuGN將不會有高的表達。在玉米中，在其葉組織中Adh 1基因未表達，示意其葉子不含有所必需的轉錄因子。
借助本領域技術人員已知的各種方法，可以將調節(jié)元件在調節(jié)控制下攜帶所需結構基因的重組DNA分子引種到植物組織中。用于產生植物物種或植物組織的特異類型的技術依賴于已知的成功的技術。將重組DNA引種到植物組織中的方法包括，但不限于，轉化(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.32717-2722)、電穿孔(Fromm et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA825824-5828)或DNA的顯微注射(Crossway et al.(1986)Mol.Gen.Genet.202179-185)或從土壤桿菌屬(Agrobacterium)將間型的T-DNA(T-DNA-mediated)移植到植物組織中。典型的T-DNA載體體系在如下參考文獻中有公開An et al.(1985)EMBO J.4277-284;Herrera-Estrella et al.(1983)Nature 303209-213;Herrera-Estrella et al.(1983)EMBO J.2987-995;Herrera-Estrella et al.1985 in Plant Genetic Engineering，Cambridge University Press，New York，PP.63-93。一但引種到植物組織中，則可在過渡表達體系中測定結構基因的表達，或者也可在植物基因組中選定穩(wěn)定整合后測量。在體外培育植物組織的技術是已知的，在一些情況下，再生成完整植物的技術也是已知的。將引種基因從原始轉化的植物中移植到商用栽培品種中的方法是現(xiàn)有技術中已知的。
除非另有說明，對于克隆、DNA分離、擴增和純化，對于酶的反應包括DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性核酸內切酶及其類似物的標準技術;PRC技術以及各種分離技術都是本技術領域內已知的和常用的現(xiàn)有技術。一些標準技術公開在如下文獻中Maniatis et al.(1982)Molecular Cloning，Cold，Spring Earbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York;Wu(ed.)(1979)Meth.Enzymol.68;Wu et al.1983 Meth.Enzymol.100 and 101;Grossman and Moldave(eds.)(1980)Meth.Enzymol.65;Miller(ed.)(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York;Old and Primrose(1981)Principles of Gene Manipulation.University of California Press，Berkeley;Schleif and Wensink(1982)Practical Method in Molecular Biology;Glover(ed.)(1985)DNA Cloning Vol Ⅰ and Ⅱ，IRL Press，Oxford，UK;Hames and Higgins(edS.)(1985)Nucleic Acid Hybridisation，IRL Press，Oxford，UK;Setlow and Hollaender(1979)Genetic EngineeringPrinciples and Methods，Vols.1-4，Plenum Press，New York。文中所用的縮寫及命文法也是本專業(yè)領域中標準的和專業(yè)文獻(如文中所引用的)中常用的。
在本技術領域中，對于并不損壞改進的基因表達的增強活性而作出的文中所公開的重組啟動子分子的結構排列特異增強子以及啟動子元件的各種改變都是可以理解的。例如，可以理解在植物可表達的增強子和啟動子元件的選擇中進行替代而對本發(fā)明的重組啟動子分子的功能沒有明顯影響，進一步可預料的是，可以便利地使用與文中所用的活性增強子元件同源的核苷酸序列，或者替代或者加入到重組啟動子構建中以改進植物細胞中基因表達。
本申請已經表明在植物種(包括單子葉和雙子葉植物)中，使用多種增強子元件與截短的啟動子結合可獲得高水平的基因表達。利用本文所公開的技術，例如本文表中提供的指示，在任一特定的物種中選擇適于最佳表達的元件是本專業(yè)的常規(guī)技術。還應理解，由不同增強子元件以及彼此相關的，且與TATA盒位置相關的某一元件的多拷貝的排列，取向和間隔也可造成最佳的基因表達。這點對于那些使用本文公開的技術的本領域普通技術人員來說是很顯然的。
使用本文公開的方法和技術的公知的變換的、修改的或等同的方法和技術，而不用進行過多的實驗即可獲得本發(fā)明的目的，這對于本領域的普通技術人員來說是可以理解的。不同于具體公開的其它替代方法在本領域內可用于獲得文中所公開的重組啟動子分子的功能特性，以及如何使用這些替代方法以獲得本發(fā)明的重組啟動子的等同功能，這些對于普通技術人員也是可理解的。本發(fā)明包括由普通技術人員所理解的那些變換、修改、替代和等同形式，并由本發(fā)明公開的精神和范圍所包括。
下面的實施例僅用于理解本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 含有雜種啟動子的質粒構建依照Maniatis et al.(1982)Molecular Cloninga Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，使用標準的分子生物技術。本領域普通技術人員通過使用本領域里易得到的原料依照本說明書的方法而不需做過多的實驗即可制備本發(fā)明所使用的所有質粒。
(a)p35SGN、p35SIGN、pGN和pIGN構建通過將來自含有CaMV△35S啟動子的pBI121的800bp Hin dIII/EcoR1片段連接到pUC118中而衍生得到質粒p35SGN(Vieira and Messing(1987)Methods Enzymol.1533-11)，該CaMV△35S啟動子驅動連接到NOS3′-末端信號的β-葡糖苷酸酶(GUS)基因(Jefferson et al.(1987)EMBO J.63901-3907)。為構建p35SIGN，用大腸桿菌(Escherichia coli)DNA聚合酶的Klenow片段將557bp的片段末端充填并克隆至pBI121中的Sma1位點，該557bp的片段源于跨越核苷酸119(Bcl1)至672(Bal 31-缺失)的玉米Adh1基因的Intron1。p35SIGN中的CaMV△35S啟動子、Intron1、GUS基因和nos3′-末端信號作為單個的HindIII-EcoR1片段亞克隆至pUC118中。
為制備減少型啟動子控制的質粒pIGN，將p35SIGN(Bam H1-Eco R1)中的內含子1-GUS-NOS-片段克隆至pUC118。通過用來自p35SGN的BamH1/SacI｀GUS′片段置換含有玉米Adh1內含子1和GUS的BamH1/SacI片段，由pIGN衍生得到質粒pGN。
(b)p△35SGN和p△35SIGN構建通過加入來自p△35S(-90)的Sal1/BamH1｀△35S′片段，由pGN和pIGN衍生得到質粒p△35SGN和p△35SIGN。親代質粒p35SCN和p35ICN全部公開在Walker et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.846624-6628中。將Sal1接點插入p35SCN中的CaMV△35S啟動子的位于-90位置的EcoR1位點(核苷酸7665);隨后將含有截短的35S啟動子片段、CAT基因和3′-末端信號的SalI至HindIII片段克隆至pUC19中以產生p△35S(-90)。該截短的啟動子的確定應使其具有距35S啟動子的帽位點45bp的上游終點(Odell et al.(1985)見上文)且保留了其TATA盒但缺失了35SCN表達所需的上游序列。
(c)p6ARE△ADHGN和p6ARE△ADHIGN親代載體，pADHCAT和pADHCAT-140的構建由Walker等人(1987)(見上文)已經描述。將含有Adh1啟動子的BamHI片段(從位置-1094至位置+106)克隆到pIGN中的Adh1內含子1序列的上游以產生pADHIGN。將跨越位置-140至位置+106的截短的Adh1啟動子片段亞克隆至來自pADHCAT-140的pGN和pIGN中以產生p△ADHGN和p△ADHIGN。
在玉米Adh1啟動子的位置-140和-99之間發(fā)現(xiàn)-厭氧調節(jié)元件(ARE)。該ARE由兩個序列元件組成跨越位置-133至-124的RegionI和跨越位置-113至-99的RegionII。將ARE分離出作為Pst1片段(Walker et al.(1987)見上文)并克隆p△ADHIGN中的截短的Adh1啟動子的上游以產生pARE△ADHIGN。為逆轉ARE的取向，將pARE△ADHIGN中的從聚接頭(上游位置-140)至位置-99的Sal1片段克隆至p△ADHIGN中唯一的Sal1位點，以產生pARE(-)△ADHIGN。含有多個ARE序列的克隆體(例如，p2ARE△ADHIGN、p4ARE△ADHIGN或p6ARE△ADHIGN)按如下進行克隆用HinCII消化pARE△ADHIGN并加入Pst1接點。然后分離從位置-140至-99的含ARE的Pst1片段，并反克隆至pARE△ADHIGN，Pst1位點(位置-140)的上游。重復ARE序列的數(shù)量及其取向由核苷酸序列分析所確定。
通過用來自p35SGN的BamH1/Sac1｀GUS′片段置換含有玉米Adh1 Intron1和GUS的BamH1/Sac1片段而由p6ARE△ADHIGN衍生得到質粒p6ARE△ADHGN。
(d)p4OCS△35SIGN、p6ARE4OCS△ADHIGN和p6ARE4OCS△35SIGN構建將OCS元件分離，作為含有OCS上游啟動子區(qū)的HpaII(-292)至BamHI(-116)部分的EcoRI-BamHI片段(DeGene et al.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-510)，如Ellis et al.(1987)EMBO J.611-16和(1987)EMBO J.63203-3208中所述。依照Ellis et al.(1987)EMBO J.63203-3208中的方法制備含有來自OCS基因的OCS一元件的四個銜接拷貝的質粒p4OCSADHCAT。制備4OCS元件作為來自p4OCSX的Sal1/Xho1片段，該p4OCSX為p4OCSADHCAT衍生物，而p4OCSADHCAT通過平端連接并將Xho1接點連接至Sam1位點而制得。將4OCS元件加至p△35SIGN中的Sal1位點以產生p4OCS△35SIGN，將4OCS元件加至p6ARE△ADHIGN中的Sal1位點以產生p6ARE4OCS△ADHIGN，兩者都具有相同的4OCS排列取向，如圖1e所示。通過用p△35SIGN的Sal1/EcoRI片段代替含有△ADHIGN的Sal1/EcoRI片段，由p6ARE4OCS△ADHIGN衍生得到質粒p6ARE4OCS△35SIGN。
(e)p6ARE△35SIGN和p6ARE△35SGN構建通過用來自△35SIGN的Sal1/Eco R1片段替代含有｀△ADHGN′的Sal1/Eco R1片段，由p6ARE△ADHGN衍生得到質粒p6ARE△35SIGN。通過用來自p△35S(-90)的Sal1/BamH1片段來代替Sal1/BamH1｀△ADH′，由p6ARE△ADHGN衍生得到質粒p6ARE△35SGN。
(f)質粒DNA的純化上述構建的質粒DNA由大腸桿菌JM109制備(Yanisch-Perron et al.(1985)Gene 33103-109)并且通過在CsCl梯度中的兩次離心法分離而純化。將最后制劑以1mg/ml重懸浮于10mM Tris-HCl(PH8.0)、1mM Na3EDTA中，通過使用Pharmacia T7儀器的DNA序列分析以及通過在用HindIII/SalI/BamHI的三重消化中和在用PvuII/SmaI的二重消化中對限制性片段的定量來檢測等分試樣，以保證不發(fā)生序列的重排。只有那些在凝膠電泳中不出現(xiàn)偽帶的制劑才用于后續(xù)的電穿孔。
實施例2 植物細胞的培養(yǎng)和原生質體的分離從下列細胞系中分離原生質體。TM一種單粒小麥(Triticum monococcum)的確立細胞系(Koa et al.(1970)Can.J.Genet.Cytol.12297-301);來自Zea mays(Black Mexican Sweet的變種)的BMS(Chourey and Zurawski(1981)Theor.and Appl，Genet.59341-344);L1，在六倍體小麥栽培品種Vilmorin 27中的二體加系，該Vilmorin 27除含有42個小麥染色體以外還含有自Thinopyrum intermedium的兩組7個染色體，并且該二體加系通過將小麥和Thinopyrum intermedium之間的部分雙倍體雜種回交至小麥(即Vilmorin27)中而產生;LM，由Lolium multiflorum胚乳衍生的系(Smith and Stone(1973)Aust.J.Biol.Sci.26123-133);由Nicotianaplumbaginifolia的葉原生質體培養(yǎng)體衍生的NpTs;以及ER，一種Oryza Sativa(Taipei 309的變種)的胚胎的培養(yǎng)體，它起始于未成熟的胚胎并保持在液體懸浮培養(yǎng)體中四個月。用于細胞懸浮液的維持液、用于分離原生質體的酶，以及用于原生質體培養(yǎng)的培養(yǎng)基的制備如表4所示。
實施例3 原生質體的電穿孔在完全消化后，通過328、110和5μm目篩子篩選原生質體(對L1和TM細胞系用50μm篩子篩兩次)。然后用慢速離心法(每分鐘80g)沉淀，將原生質體懸浮在發(fā)現(xiàn)特別適合于該特定細胞類型的洗滌溶液中(見表1)。將大麥葉肉原生質體在0.375M甘露醇、10mM MES、PH5.8、205mM NaCl、3.5mM KCl、9.4mM MgSO4、8.4mM MgCl23.4CaCl2和0.875mM NaHCO3中洗滌。
將原生質體再次沉淀、洗滌、沉淀并以2×106原生質體/ml的濃度懸浮于TBS9緩沖液(Tris3.63g/l、CaCl2·2H2O 876mg/l、NaCl8.78mg/l、甘露醇50g/l，PH9.0)中(Taylor and Larkin(1988)Austr.J.Biotech.152-55)。
在電穿孔之前，馬上將200μl的原生質體懸浮液(如是大麥葉肉則用100μl)加入到含有溶于5μl的10mM Tris HCl，PH8.0，1mM Na2EDTA中的5μl質粒DNA的試管中。將混合物轉至電穿孔室中(電極間距為2mm)并由24μF電容器在電極間加3個275V(1375V/cm)的脈沖，其脈沖寬度為5ms，延遲100ms(對于大麥葉肉原生質體用200V)。在使原生質體回收5秒鐘后，將原生質體懸浮液吸回到微驅動管中，并向其中加入600μl的洗滌溶液。緩慢地旋轉該管(＜100g)5分鐘，去除上清液并將原生質體再懸浮于1ml的培養(yǎng)基中。將原生質體懸浮液轉移到用石蠟膜密封的35mm的培養(yǎng)皿中，并在25℃于黑暗中培養(yǎng)以使GUS基因表達。
實施例4 在電穿孔原生質體中測定GUS基因的表達培養(yǎng)44-48小時之后，將400μl的洗滌溶液加入至每個培養(yǎng)皿中，并將每個原生質體樣品小心地吸到微驅動管中，以100g重量將試管離心分離8分鐘并去除上清液。原生質體的片狀沉淀物或者儲存于-80℃直至需用或馬上使用。借助渦旋混合器，每一片狀沉淀物均在250μl萃取緩沖液中再懸浮(Jefferson et al.(1987)見上文)。使用裝有顯微頂端探針的設置于55W的Labsonic 1510型近距離聲波定位器在冰上給樣品近距離聲波定位5秒鐘。通過在微驅動管中離心分離1分鐘將碎片片狀沉淀，并依照制造商的推薦使用Bio-Rad儀器測定該透明上清液的全蛋白質。對于每組構建，都在含有溶于100μl溶胞緩沖液的在5至50μg范圍內某一特定含量的全蛋白質的上清液的等分試樣上進行GUS熒光測定(Jefferson et al.(1987)見上文)再加入含有2mM 4-甲基-傘形基-β-D-葡糖苷酸(MUG)的100μl萃取緩沖液，將該混合物稍微旋轉一下并在37℃下培育20-160分鐘范圍內的某一特定時間。通過加入1000μl0.2M Na2CO3將反應停止，并用設置于365nm興奮波長的Perkin-Elmer熒光分光計來測量于455nm的熒光。
實施例5 溶液及培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基CM1是Scoworoft和Adamson(1976，Plant Sci.Lett.739-42)所述的CS5培養(yǎng)基，并將其PH調至5.8。CM2含有Murashige和Skoog無機鹽(1962，Physiol.Plant.15473-497).170mg/l L-天冬酰胺、0.77mg/l甘氨酸、0.13mg/l煙酸、0.025mg/l泛酸鈣、0.025mg/l鹽酸硫胺素、0.025mg/l鹽酸吡哆素、4mg/12，4-滴(2，4-d)、20g/l蔗糖，PH5.8。CM3是WtMl(Young et al.，1989，J.Gen，Virol.702245-2251)。CM4含有主要的White的無機鹽(1963，in The cultivation of animal and plant cells，2nd ed.，Ronald Press，New York)、次要的Murashige和Skoog的鹽和維生素(1962，見上文)、100mg/l肌醇、5g/l醇母萃、10mg/l檸檬酸鐵、1mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、40g/l蔗糖、PH5.5。CM5含有R2培養(yǎng)基的主要和次要無機元素(Ohira et al.，1973，Plant Cell Physiol.141113-1121)以及9mg/l FeCl3、11.2mg/l Na2EDTA、1mg/l鹽酸硫胺素、2mg/12，4-D、20g/l蔗糖、PH5.9。
原生質體洗滌溶液PW1含有0.3M甘露醇、156mM NaCl.3.5mM KCl、9.4mM MgSO4、8.4mM MgCl2、3.4mM CaCl2、0.9mM NaHCO3、PH6.0。PW2含有B5培養(yǎng)基的主要和次要無機鹽(Gamborg et al.(1968)Exp.Cell Res.50151-158)、27mM甘露醇、109mM KCl、105mM MgCl2、33mM CaCl2、3mM2-(N-嗎啉代)乙烷磺基酸(MES)、PH5.7。PW3含有0.568M甘露醇、80mM CaCl20.2%MES，PH5.8。PW4是將甘露醇濃度增至49mM后的PW2。
酶消化混合物ED1在PH調至5.8的洗滌溶液PW1中含有1%(W/V)Cellulysin(Calbiochem)、1%(W/V)Driselase、1%(W/V)Macerozyme(Onozuka R-10)。ED2含有1%(W/V)Cellulysin(Calbiochem)、0.5%(W/V)Hemicellulase(Sigma)、0.02%Pectolyase Y-23(Seishin Pharmaceutical)、50mM CaCl2、10mM乙酸鈉、0.2M甘露醇，PH5.8。ED3含有1%(W/V)Cellulase RS(Yakult Honsha)、0.1%(W/V)Driselase、0.06%(W/V)Pectolyase Y-23、0.2%(W/V)Hemicellulase、0.2%(W/V)Macerozyme R-10、0.495M甘露醇、0.189M葡萄糖、2mM維生素C、14mM CaCl2、3mM MES，PH5.8。ED4為0.5%(W/V)Cellulase RS、0.68%(W/V)Driselase、0.05%Pectolyase Y-23、6.5mM MES、0.325M甘露醇、40mM CaCl2、向其中加入0.5%(W/V)的活性炭。在緩慢攪拌30分鐘后，通過以10，000g離心分離去除活性炭，然后將該溶液的PH調至5.9并通過過濾而滅菌。ED5為1%(W/V)Cellulase RS、0.1%(W/V)Driselase、0.1%(W/V)Pectolyase Y-23、0.35M甘露醇、3mM MES、PH5.9。
該原生質體培養(yǎng)基在使用前都需通過過濾而殺菌。原生質體培養(yǎng)基PC1含有Kao和Michayluk(1975)(Planta126105-110)的培養(yǎng)基，而不含有游離的氨基酸、腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、維生素B2和維生素B12，正如Vasil和Vasil(1980)Theor.Appl.Gen.5697-99所建議的，但含有0.4M葡萄糖、0.1M蔗糖、1mg/12，4-D、0.2mg/l玉米素，PH調至5.6。在過濾滅菌之前通過Amicon YM10膜將該培養(yǎng)基超過濾(Davies et al.(1980)Plant Sci.60237-244)。PC2含有Murashige和Skoog的無機元素(1962，見上文)，7.7mg/l甘氨酸、1.3mg/l煙酸、0.25mg/l鹽酸硫胺素、0.25mg/l鹽酸吡哆素、0.25mg/l泛酸鈣、167mg/l L-天冬酰胺、1g/l L-谷氨酰胺、66g/l甘露醇、20g/l蔗糖、1.67g/l葡萄糖、2%(V/V)椰子水(Gibco)、4mg/l 2，4-D以及0.1mg/l 6-芐氨基嘌呤，PH5.8。PC3含有Kao和Michayluk的主要和次要無機物(1975，見上文)、1mg/l煙酰胺、1mg/l鹽酸吡哆素、1mg/l鹽酸硫胺素、1mg/l泛酸鈣、0.4mg/l葉酸、0.02mg/l對氨基苯甲酸、0.01mg/l維生素H、400mg/l m-肌醇、2%(V/V)椰子水、750mg/l酪蛋白水解物、200mg/l L-谷氨酰胺、150mg/l L-天冬氨酸、10g/l蔗糖、108g/l葡萄糖、1mg/l 2，4-D、0.2mg/l1-萘乙酸、0.2mg/l玉米素、PH5.6。PC4為加73g/l山梨醇的CM4.PC5具有CM5的無機組分，再加有B5培養(yǎng)基(Gamborg et al，1968，見上文)的維生素、糖和Kao的有機酸(1977，Mol Gen Genet.150225-230)、137g/l蔗糖、2mg/l2，4-D和0.1mg/l激動素，PH5.7。



跟隨p35SGN、p6ARE4OCS△ADHIGN和p4OCS△35SIGN的過渡表達的在原生質體萃取物中的β-葡糖苷酸酶的比活性。該大麥葉肉原生質體需要稍微不同的電穿孔條件，如實施例3中所述。
表3構建 平均比活性(微微摩爾的4MU/mg蛋白質/min)需氧 厭氧誘導的p6ARE△ADHIGN 1.4 〔0.73〕＊4.3 〔1.3〕p6ARE△35SIGN 0 0.21 〔0.04〕p6ARE4OCS△ADHIGN 29.3 〔6.7〕 28.7 〔4.5〕在需氧和厭氧條件下使用三種不同構建獲得的表達。
＊ 標準誤差示于括號內。

權利要求
1.一種用于在單子葉植物細胞中增強植物可表達結構基因的表達的重組啟動子分子，該重組啟動子分子含有(a)選自ARE和OCS元件所組成物組的多個增強子元件，(b)一種截短的植物可表達啟動子，該啟動子提供了位于3′至所述多個增強子元件的起始轉錄所必需的TATA盒區(qū)；以及(c)一種作為在植物可表達基因中位于轉錄起始位點和轉譯起始位點之間的內含子而天然發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列；其中位于3′至所述的重組啟動子分子的植物可表達結構基因在所述的重組啟動子分子的調節(jié)控制下于所述的單子葉植物細胞中表達。
2.權利要求1的重組啟動子分子，其中截短的啟動子選自截短的玉米Adh1啟動子和截短的CaMV35S啟動子所構成的物組。
3.權利要求1的重組啟動子分子，其中所述的截短的啟動子是截短的玉米Adh1啟動子。
4.權利要求1的重組啟動子分子，其中所述的截短的啟動子是截短的CaMV35S啟動子。
5.權利要求1的重組啟動子分子具有結構40CS△35SI，其中40CS指四個OCS的銜接重復拷貝，△35S是截短的CaMV35S啟動子，以及I是作為在植物可表達基因中位于轉錄起始位點和轉譯起始位點之間的內含子而天然發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列。
6.權利要求1的重組啟動子分子具有結構6ARE△ADHI，其中6ARE指六個ARE的銜接重復拷貝，△ADH是截短的Adh啟動子，以及I是作為在植物可表達基因中位于轉錄起始位點和轉譯起始位點之間的內含子而天然發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列。
7.權利要求1的重組啟動子分子具有結構6ARE40CS△ADH，其中的6ARE指六個ARE的銜接重復拷貝，4OCS指四個OCS的銜接重復拷貝，△ADH是截短的Adh啟動子，以及I是作為在植物可表達基因中位于轉錄起始位點和轉譯起始位點之間的內含子而天然發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列。
8.一種含有權利要求1所述的重組啟動子分子的載體。
9.一種包含含有權利要求1所述重組啟動子分子的載體的細菌細胞。
10.一種可轉變、可再生的單子葉植物，該單子葉植物轉變?yōu)楹袡嗬?的重組啟動子分子并在所述的重組啟動子分子的控制下表達結構基因。
11.一種權利要求10的玉米植物。
12.一種權利要求10的小麥植物。
13.一種權利要求10的大麥植物。
14.一種權利要求10的水稻植物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于增強植物可表達結構基因在單子葉植物細胞中表達的重組啟動子分子，該重組啟動子分子含有選自由ARE和OCS元件構成物組中的多個增強子元件、截短的植物可表達啟動子以及內含子。
文檔編號C12N15/82GK1063506SQ9110484
公開日1992年8月12日 申請日期1991年5月17日 優(yōu)先權日1990年5月18日
發(fā)明者戴維I·拉斯特, 理查德I·S·布雷特爾, 道格拉斯A·張伯倫, 菲利普J·拉金, 埃倫L·馬什, 詹姆斯W·皮科克, 伊麗莎白S·丹尼斯, 馬克R·奧利夫, 杰弗里G·埃利斯 申請人:盧布里紹爾遺傳學股份有限公司, 聯(lián)邦科學與工業(yè)研究組織