對除草劑具有增強的耐受性的植物的制作方法
【專利說明】對除草劑具有増強的耐受性的植物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明一般涉及賦予植物對除草劑具有農(nóng)業(yè)水平耐受性的方法。特別地，本發(fā)明 涉及對PPO抑制性除草劑具有增強的耐受性的植物。更具體地，本發(fā)明涉及通過誘變和雜 交育種以及轉(zhuǎn)化而獲得對PPO抑制性除草劑增強的耐受性的方法和植物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 自20世紀60年代以來，抑制原卟啉IX生物合成中關(guān)鍵酶原卟啉原氧化酶（在下 文中稱為Protox或PPO ;EC: 1. 3. 3. 4)的除草劑己用于選擇性雜草控制。PPO催化葉綠素和 血紅素生物合成中最后的共同步驟，即將原卟啉原IX氧化成原卟啉IX(Matringe等，1989. Biochem. 1.260:231)。PPO抑制性除草劑包括許多不同結(jié)構(gòu)類別的分子（Duke等，1991. Weed Sci. 39:465 ;Nandihalli 等，1992. Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 ;Matringe 等，1989. FEBS Lett.245:35 ;Yanase和 Andoh，1989. Pesticide Biochem. Physiol. 35:70)〇 這些除草劑化合物包括二苯基醚類（diphenylethers)(例如，乳氟禾草靈（Iactofen)， 5-[2-氯-4-(三氟甲基）苯氧基]-2-硝基苯甲酸（+-)-2-乙氧基-1-甲基-2-氧代乙基 酯；氟鎖草醚（a CiflU〇rfen)，5-[2-氯-4-(三氟甲基）-苯氧基]-2-硝基苯甲酸；其甲酯； 或乙氧氟草釀（〇xyfluorfen)，2_氯-1-(3-乙氧基_4_硝基苯氧基）_4_(二氟苯）） 二挫類（oxidiazoles)(例如，^惡草酮（oxidiazon)，3_{2, 4-二氯-5-(1-甲基乙氧基）苯 基}-5-(1，1-二甲基乙基）-1，3,4_巧惡二唑啉-2-(3H)_酮）；環(huán)狀亞胺類（cyclic imides) (例如，S_23142, N-[4-氯-2-氟-5-塊丙氧基苯基]-3, 4, 5, 6-四氫苯鄰二甲酰亞胺；氯釀 酰亞胺（^11〇1'〇卩111:11&1;[111)，1^-(4-氯苯基）-3,4,5,6.四氫苯鄰二甲酰亞胺）；苯基[1比挫類 (phenyl pyrazoles)(例如，TNPP-乙基，2-{1-(2,3,4_ 三氯苯基）-4-硝基吡唑基-5-氧 基}丙酸乙酯；M&B39279);吡啶衍生物（例如LS 82-556);以及phenopylate及其0-苯 基吡咯烷與哌啶氨基甲酸酯的類似物。這些化合物中的許多競爭性抑制該酶催化的正常反 應(yīng)，看起來起底物類似物的作用。
[0004] PPO抑制性除草劑的施用導(dǎo)致葉綠體和線粒體中原卟啉原IX的積累，據(jù)認為，所 積累的原卟啉原IX泄露到胞液中并在那里被過氧化物酶氧化。當(dāng)暴露于光下時，原卟啉 IX導(dǎo)致胞液中單線態(tài)氧的形成和其它活性氧類的形成，這可以引起脂質(zhì)過氧化作用和膜破 裂，從而導(dǎo)致細胞迅速死亡（Lee等，1993. Plant Physiol. 102:881) 〇
[0005] 不是所有的PPO酶都對抑制植物PPO酶的除草劑敏感。大腸桿菌（Escherichia coli)和枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis)PPO 酶（Sasarmen 等，1993. Can. J. Microbiol. 39:1155 ;Dailey 等，1994. J. Biol. Chem. 269:813)對這些除草劑抑制劑具有 抗性。單細胞藻類雷氏衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)對苯基亞胺（phenylimide)除 草劑S-23142具有抗性的突變體已被報道（Kataoka等，1990. J. Pesticide ScL 15:449 ; Shibata 等，1992.于 Research in Photosynthesis 中，卷 III，N. Murata 編輯， Kluwer:Netherlands，第567-70頁）。這些突變體中的至少一種看起來具有改變的PPO活 性，其不僅對用于篩選突變體的除草劑抑制劑具有抗性，而且對其它類別的原卟啉原氧化 酶（protox)抑制劑也具有抗性（Oshio 等，1993. Z. Naturforsch. 48c:339 ;Sato 等，1994. 于 ACS Symposium on Porphyric Pesticides 中，S. Duke 編輯，ACS Press:Washington, D. C.)。對抑制劑S-21432具有抗性的突變煙草細胞系也已被報道（Che等，1993. Z. Naturforsch. 48c: 350)。營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌突變體已用于確認所克隆的植物PPO抑制 性除草劑的除草劑抗性。
[0006] 現(xiàn)有3種主要策略可用于使植物耐受除草劑，即（1)使用可以將除草劑或其 活性代謝物轉(zhuǎn)化成無毒產(chǎn)物的酶（例如，賦予對溴苯腈（bromoxynil)或basta的耐受 性的酶（EP242236、EP337899))，將除草劑脫毒；（2)將靶酶突變成對除草劑或其活性代 謝物敏感性較低的功能性酶，例如耐受草甘膦（glyphosate)的酶（EP293356、Padgette S. R.等，J. Biol. Chem.，266, 33, 1991);或（3)過表達敏感性酶，使得鑒于此酶的動力學(xué) 常數(shù)，在植物中生產(chǎn)相對于除草劑足夠的靶酶量，以致盡管存在其抑制劑，但仍有足夠的 功能性酶可用。第三種策略用于成功獲得對PPO抑制劑具有耐受性的植物已有描述（見 例如，US5, 767, 373 或 US5, 939, 602,及其專利族成員）。此外，US 2010/0100988 和 WO 2007/024739公開了編碼具有酶促活性的氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列對 PPO抑制劑除草劑具有抗性，特別是對3-苯基尿嘧啶抑制劑特異的PPO突變體。
[0007] 迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)尚未描述過含有至少一個根據(jù)本發(fā)明的野生型或突變的PPO 核酸的PPO抑制性除草劑耐受性植物?，F(xiàn)有技術(shù)亦尚未描述過在PPO基因來源的基因組以 外的基因組上含有突變的PPO抑制性除草劑耐受性作物植物。因此，本領(lǐng)域需要鑒定來自 其它基因組及物種的PPO抑制性除草劑耐受基因。本領(lǐng)域亦需要對除草劑（例如PPO抑制 性除草劑）具有增強的耐受性、以及含有至少一個野生型和/或突變的PPO核酸的作物。亦 需要控制作物附近的雜草生長的方法。當(dāng)向具有作物的區(qū)域或向作物施用除草劑時，這些 組合物及方法將允許使用噴藥技術(shù)。 發(fā)明概要
[0008] 通過本發(fā)明解決技術(shù)問題，本發(fā)明涉及在植物栽培場所控制非期望植物的方法， 所述方法包括以下步驟：
[0009] a)在該場所提供包含至少一種核酸的植物，所述核酸包含編碼野生型原卟啉原氧 化酶（PPO)或突變原卟啉原氧化酶（mut-PPO)的核苷酸序列，所述植物對PPO抑制性除草 劑具有抗性或耐受性，
[0010] b)向該場所施用有效量的所述除草劑。
[0011] 此外，本發(fā)明涉及通過使用由如下核酸編碼的本發(fā)明的野生型或mut-PPO鑒定 PPO抑制性除草劑的方法，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1，3, 5, 7, 9, 11，13, 15, 17, 1 9, 21，23, 25, 27, 29, 31，33, 35, 37, 39, 41，43 或 45 或其變體。
[0012] 所述方法包括以下步驟：
[0013] a)產(chǎn)生包含編碼本發(fā)明的mut-PPO的核酸的轉(zhuǎn)基因細胞或植物，其中表達本發(fā)明 的 mut-PPO ;
[0014] b)向a)的轉(zhuǎn)基因細胞或植物及相同品種的對照細胞或植物施用PPO抑制性除草 劑；
[0015] c)在施用所述測試化合物之后，測定轉(zhuǎn)基因細胞或植物及對照細胞或植物的生長 或生存力，以及
[0016] d)選擇使對照細胞或植物的生長較之轉(zhuǎn)基因細胞或植物的生長降低的測試化合 物。
[0017] 另一目的涉及鑒別編碼對PPO抑制性除草劑具有抗性或耐受性的mut-PPO的核苷 酸序列的方法，該方法包括：
[0018] a)生成mut-PPO編碼核酸的文庫，
[0019] b)通過在細胞或植物中表達每種所述核酸并用PPO抑制性除草劑處理所述細胞 或植物，篩選所得的mut-PPO編碼核酸群體，
[0020] C)比較由所述mut-PPO編碼核酸群體提供的PPO抑制性除草劑耐受性水平與由對 照PPO編碼核酸提供的PPO抑制性除草劑耐受性水平，
[0021] d)選擇至少一種mut-PPO編碼核酸，所述核酸較之對照PPO編碼核酸提供對PPO 抑制性除草劑顯著增加的耐受性水平。
[0022] 在優(yōu)選的實施方案中，較之由對照PPO編碼核酸提供的對PPO抑制性的耐受性，步 驟d)中選出的mut-PPO編碼核酸提供至少2倍的對PPO抑制性除草劑的耐受性。
[0023] 抗性或耐受性可通過生成包含步驟a)的文庫的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物并且比較 所述轉(zhuǎn)基因植物與對照植物，加以測定。
[0024] 另一目的涉及鑒別含有編碼對PPO抑制性除草劑具有抗性或耐受性的mut-PPO的 核酸的植物或藻類之方法，該方法包括：
[0025] a)在植物細胞或綠藻的培養(yǎng)物中鑒定有效量的PPO抑制性除草劑，
[0026] b)用誘變劑處理所述植物細胞或綠藻，
[0027] c)使所述經(jīng)誘變處理的細胞群體與a)中鑒定的有效量的PPO抑制性除草劑接觸，
[0028] d)選擇在這些測試條件下存活的至少一個細胞，
[0029] e)對來自