專利名稱：高效超聲波基因?qū)敕椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程中的基因?qū)敕椒?，屬動植物遺傳工程。
植物基因工程的關(guān)鍵技術(shù)之一，是如何高效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并再生出轉(zhuǎn)基因植株，用于作物品種改良，以培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的新品種。目前，植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移有生物方法，化學(xué)方法和物理方法。比較常用的物理方法是電激基因轉(zhuǎn)移法。操作過程是將盛有細(xì)胞和DNA(脫氧核糖核酸)液的特制小容器置于電脈沖儀的正負(fù)電極之間，然后施加電脈沖。在高壓電脈沖的作用下，細(xì)胞膜因發(fā)生臨時性破裂而形成微小的孔洞，在其自動修復(fù)以前，溶液中的DNA分子會籍助濃度差通過孔洞擴(kuò)散到細(xì)胞中，并最終進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部，整合到受體細(xì)胞的染色體中。這種方法的優(yōu)點是操作簡便，基因轉(zhuǎn)移效率較高以及無宿主范圍限制等，因此，電激法是動植物基因工程中較常用的基因轉(zhuǎn)移方法。缺點是在進(jìn)行植物基因轉(zhuǎn)移時受體一般是原生質(zhì)體，而原生質(zhì)體培養(yǎng)再生出植株比較困難，特別對于有經(jīng)濟(jì)意義的禾谷類作物更是如此，因此電激基因轉(zhuǎn)移法在植物基因轉(zhuǎn)移中受到了限制。
本發(fā)明的目的是提出一種新的物理方法轉(zhuǎn)移基因，即應(yīng)用超聲波誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，此方法同時適用于動植物以及微生物的基因轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的內(nèi)容是將生物材料(植物組織塊、植物懸浮細(xì)胞、動物細(xì)胞、微生物細(xì)胞等)與DNA溶液混合放入超聲小室中;再將超聲波引入超聲小室，作用于DNA溶液中的生物材料上。超聲波為連續(xù)或脈沖型，生物材料感受到的超聲波聲強為小于10W/cm2，頻率為小于5MHZ，作用時間為大于0.01秒。
超聲波誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的原理是，超聲波在液體中傳播時，能夠產(chǎn)生空化作用。所謂空化作用，就是液體中存在的一些微小氣泡，在超聲波的作用下發(fā)生共振并伴隨產(chǎn)生一系列物理現(xiàn)象。如空化作用發(fā)生時，在空化中心會產(chǎn)生局部的高溫高壓，使得細(xì)胞壁產(chǎn)生局部的穿孔，也使得細(xì)胞膜產(chǎn)生局部的和暫時的結(jié)構(gòu)改變，即也造成一系列的穿孔效應(yīng)，溶液中的DNA分子可以籍此擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。在高等植物的許多組織中，細(xì)胞間的通道里存在一些微小氣泡，這些氣泡在超聲作用下將成為空化中心，從而對周圍的細(xì)胞發(fā)生作用。由于這種氣泡是普遍存在的，這就使得大量細(xì)胞都能感受到超聲波的空化作用。
超聲波誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法不受宿主范圍限制，而且可將外源基因直接導(dǎo)入帶壁的植物細(xì)胞，特別是植物體的組織塊中，由它們再生植株比從原生質(zhì)體培養(yǎng)要容易得多。超聲波基因轉(zhuǎn)移方法同樣適用于動物的基因轉(zhuǎn)移和微生物的基因轉(zhuǎn)移，同時超聲波法導(dǎo)入基因還具有裝置簡單，操作方便等優(yōu)點，在動植物基因工程中有廣泛的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的五個實施例為1.用聲強為0.5W/cm2及1.0W/cm2，頻率為800KHZ的脈沖超聲波，作用時間為30分鐘，實現(xiàn)將外源基因?qū)胄←溣姿胝T導(dǎo)愈傷組織，獲短暫表達(dá)。
2.用聲強為0.5W/cm2，頻率為800KHZ的脈沖超聲波，作用時間30分鐘，實現(xiàn)將外源基因?qū)霟煵萑~塊，獲穩(wěn)定表達(dá)。
3.用聲強為2.0W/cm2，頻率為800KHZ的連續(xù)超聲波，作用時間為30秒，將外源熒光物質(zhì)鈣黃素導(dǎo)入衣藻細(xì)胞中。
4.用聲強為0.5W/cm2，頻率為800KHZ的脈沖超聲波，作用時間為15秒，將外源熒光物質(zhì)鈣黃素導(dǎo)入紅細(xì)胞中。
5.用聲強為2.0W/cm2，頻率為800KHZ的脈沖超聲波，作用時間為10分鐘，將外源熒光物質(zhì)鈣黃素導(dǎo)入酵母細(xì)胞中。
權(quán)利要求
1.一種高效超聲波基因?qū)敕椒?，其特征在于基因?qū)氲牟襟E為(1)將生物材料(植物組織塊、植物懸浮細(xì)胞、動物細(xì)胞或微生物細(xì)胞等與DNA溶液混合；(2)引入超聲波，作用于DNA溶液中的生物材料上。
2.如權(quán)利要求1所述的基因?qū)敕椒ǎ涮卣髟谟谝氲某暡檫B續(xù)或脈沖超聲波，作用在生物材料上的超聲波聲強小于10W/cm2，頻率小于5MHZ，作用時間大于0.01秒。
3.如權(quán)利要求1所述的基因?qū)敕椒?，其特征在于所述的生物材料為小麥幼穗誘導(dǎo)愈傷組織，引入的超聲波為脈沖超聲波，作用在衣藻細(xì)胞上的超聲波聲強為1.0W/cm2，頻率為800KHZ，作用時間為30分鐘。
4.如權(quán)利要求1所述的基因?qū)敕椒?，其特征在于所述的生物材料為衣藻?xì)胞，引入的超聲波為連續(xù)超聲波，作用在衣藻細(xì)胞上的超聲波聲強為2.0W/cm2，頻率為800KHZ，作用時間為30秒。
5.如權(quán)利要求1所述的基因?qū)敕椒?，其特征在于所述的生物材料為紅細(xì)胞，引入的超聲波為脈沖超聲波，作用在紅細(xì)胞上的超聲波聲強為0.5W/cm2，頻率為800KHZ，作用時間為15秒。
6.如權(quán)利要求1所述的基因?qū)敕椒ǎ涮卣髟谟谒龅纳锊牧蠟榻湍讣?xì)胞，引入的超聲波為脈沖超聲波，作用在酵母細(xì)胞上的超聲波聲強為2.0W/cm2，頻率為800KHZ，作用時間為10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種動植物基因工程中新的基因?qū)敕椒ǎ锤咝С暡ɑ驅(qū)敕椒?。本方法是將超聲波作用于DNA溶液中的生物材料上，由于超聲波使細(xì)胞膜產(chǎn)生局部和暫時的結(jié)構(gòu)改變，溶液中的DNA分子可以藉此擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。超聲波誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法不受宿主范圍限制，而且可將外源基因直接導(dǎo)入帶壁的植物細(xì)胞，特別是植物體的組織塊中，由它們再生植株比從原生質(zhì)體培養(yǎng)要容易得多，超聲波法導(dǎo)入基因還具有裝置簡單，操作方便等優(yōu)點，在動植物基因工程中有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/87GK1056124SQ9110362
公開日1991年11月13日 申請日期1991年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1991年6月5日
發(fā)明者許寧, 趙南明, 章力建, 賈士榮 申請人:清華大學(xué), 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心