專利名稱：從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖及其衍生物可被廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品、化工、農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)、高分子材料等許多領(lǐng)域。當(dāng)前市場上出售的殼聚糖主要來自蝦、蟹等的外殼，制備工藝成熟，已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)，但該工藝存在著原料產(chǎn)地及分散性、季節(jié)性、品質(zhì)的差異性等許多固有的缺點(diǎn)，這些給甲殼素的提取帶來了困難。在甲殼素和殼聚糖生產(chǎn)的原料來源上，人們忽視了另一重要途徑，即微生物中的甲殼素和殼聚糖，其實(shí)在子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、藻類綱及半知菌綱等真菌細(xì)胞壁中的含量是十分可觀的(甲殼素含量為菌體干重的20％～22％)。從菌絲體中提取的殼聚糖與用蝦殼生產(chǎn)的殼聚糖相比非常接近，但其對金屬離子(如Cu、Hg)的吸附能力遠(yuǎn)大于蝦殼來源的殼聚糖，特別適用于含重金屬離子較多的廢水；且用菌絲殼聚糖制成的食品保鮮劑的抗菌(對乳酸菌、枯草菌等)能力比蝦殼來源的殼聚糖高1～2倍。
檸檬酸工廠是生產(chǎn)檸檬酸的專業(yè)廠家，在檸檬酸生產(chǎn)過程中，有大量的副產(chǎn)物廢菌體產(chǎn)生，這些廢菌體中含有較大比例的甲殼素，如果這些廢菌體被棄掉，不僅會(huì)造成資源的浪費(fèi)，而且會(huì)帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染。從各種微生物的甲殼素和殼聚糖含量來看，黑曲霉的甲殼素含量較高，檸檬酸發(fā)酵所用的菌株為黑曲霉，在以薯干為原料的發(fā)酵過程中，每生產(chǎn)1噸檸檬酸可產(chǎn)生500kg左右的干濾渣，其中含160kg左右的干菌體，即在發(fā)酵液中菌絲體的含量為20g/L左右，黑曲霉菌絲體中殼聚糖按20％計(jì)，其殼聚糖產(chǎn)率可達(dá)到4.0g/L。我國是一個(gè)大規(guī)模的檸檬酸生產(chǎn)國，且生產(chǎn)廠家也相對集中，每年可產(chǎn)生近百萬噸的廢菌體，這些菌體的排放不僅會(huì)帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染，而且會(huì)造成殼聚糖生產(chǎn)原料的巨大浪費(fèi)。
在國外，有關(guān)從真菌中提取甲殼素和殼聚糖的報(bào)道越來越多，但未見利用發(fā)酵工廠廢菌體制備甲殼素和殼聚糖的文獻(xiàn)報(bào)道。在國內(nèi)，婁永江采用膠體磨處理檸檬酸工廠廢渣，使菌絲體顆粒變細(xì)，水溶性物質(zhì)最大限度地溶出，同時(shí)采用濃堿分段處理提取甲殼素和殼聚糖，所得產(chǎn)品的分子量為7.89×104，脫乙酰度為96.82％，殼聚糖相對干菌體的得率為3.35％；趙繼倫等采用酸堿交替法脫檸檬酸發(fā)酵工廠廢菌體的蛋白，然后利用濃堿液脫乙?；苽錃ぞ厶?；曹健等人研究采用電解法和間歇提取法提取檸檬酸發(fā)酵工廠廢菌體中的甲殼素和殼聚糖。但這些研究所得產(chǎn)品的分子量低，提取收率低，提取過程會(huì)帶來較多的環(huán)境污染物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法，該方法提取的殼聚糖分子量、提取收率較高，對環(huán)境帶來的污染低。
產(chǎn)品的應(yīng)用范圍廣，且該工藝與傳統(tǒng)的酸堿水解提取法相比，提取過程產(chǎn)生較少的廢水。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法，將檸檬酸生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物廢菌絲體在膠體磨中處理1～1.5小時(shí)，將用膠體磨處理過的菌絲體，按1克菌絲體2-5mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液的比例，置入0.2M pH6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中，加入枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶，于50～55℃連續(xù)攪拌2～3小時(shí)，收集固形物，按1克固形物2-5mLTris-HCl緩沖溶液的比例，置入50mM pH6.0～8.5的Tris-HCl緩沖溶液中，加入甲殼素脫乙酰酶，于50～55℃連續(xù)攪拌6～8小時(shí)，收集固形物，用10～30g/升醋酸溶液提取殼聚糖，用NaOH調(diào)pH7.5～8.0沉淀，離心分離得殼聚糖，沉淀物用去離子水及75～95％乙醇洗滌，離心分離干燥后即得殼聚糖。
上述枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶的用量為廢菌絲體的0.05～0.30wt％。
上述甲殼素脫乙酰酶為藍(lán)色犁頭霉(Absidia coerulae)產(chǎn)生的甲殼素脫乙酰酶，甲殼素脫乙酰酶的用量為每百克廢菌絲體加入800～2000units。
本發(fā)明采用膠體磨破碎細(xì)胞及多種酶連續(xù)作用相結(jié)合來處理檸檬酸發(fā)酵工廠廢菌體，使細(xì)胞膜中的物質(zhì)釋放出來、細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)被降解去除、脫去細(xì)胞壁中甲殼素的N-乙?；?，最后提取殼聚糖。該工藝所得產(chǎn)品的分子量、提取收率比傳統(tǒng)的酸堿水解提取法高，且該工藝與傳統(tǒng)的酸堿水解提取法相比，提取過程產(chǎn)生較少的廢水，環(huán)境污染將大幅度的降低。
具體實(shí)施例方式
將新鮮的檸檬酸工廠廢菌體(原料來自湖南銀海石油化工有限公司。由于目前國內(nèi)生產(chǎn)檸檬酸的廠家均采用黑曲霉為菌種，且工藝基本相似，因此不同廠家的廢菌體組成相似，結(jié)果基本沒有區(qū)別。)在膠體磨中反復(fù)處理1～1.5小時(shí)，然后，按1∶3(g/ml)的比例加入到0.2MpH6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4的緩沖溶液中，加入0.17％(g/g廢菌絲體)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶脫蛋白，于12000轉(zhuǎn)20分鐘離心收集固形物，洗滌三次，按1∶3(g/ml)的比例加入到50mM pH6.0～8.5Tris-HCl的緩沖溶液中，加入1200units％(1unit/g廢菌絲體，1unit是指每毫克酶每分鐘催化六聚N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)生1μmol乙?；?的Absidia coerulae(藍(lán)色犁頭霉)產(chǎn)生的甲殼素脫乙酰酶進(jìn)行脫乙?；?，于12000轉(zhuǎn)20分鐘離心收集固形物，水洗滌三次，用1～3％(g/ml)醋酸溶液提取殼聚糖，用NaOH調(diào)pH7.5～8.0沉淀，離心分離得殼聚糖，沉淀物用去離子水及75～95％(ml/ml)乙醇各洗滌三次，離心分離干燥后即得殼聚糖。
按照上述提取過程，原料中蛋白質(zhì)的脫除率為58.9％，殼聚糖的提取率為50.0％，平均分子量為267.97kDa，產(chǎn)品中殼聚糖的含量為84.4％，脫乙酰度為73.6％，與化學(xué)提取法(蛋白質(zhì)的脫除率為62.3％，殼聚糖的提取率為41.7％，平均分子量為84.04kDa，產(chǎn)品中殼聚糖的含量為82.7％，脫乙酰度為76.8％)相比，酶法提取所得產(chǎn)品的提取率、分子量、殼聚糖含量都比化學(xué)法提取高。
權(quán)利要求
1.從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法，其特征在于將檸檬酸生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物廢菌絲體在膠體磨中處理1～1.5小時(shí)，將用膠體磨處理過的菌絲體，按1克菌絲體2-5mLNa2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液的比例，置入0.2M pH6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中，加入枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶，于50～55℃連續(xù)攪拌2～3小時(shí)，收集固形物，按1克固形物2-5mLTris-HCl緩沖溶液的比例，置入50mM pH6.0～8.5的Tris-HCl緩沖溶液中，加入甲殼素脫乙酰酶，于50～55℃連續(xù)攪拌6～8小時(shí)，收集固形物，用10～30g/升醋酸溶液提取殼聚糖，用NaOH調(diào)pH7.5～8.0沉淀，離心分離得殼聚糖，沉淀物用去離子水及75～95％乙醇洗滌，離心分離干燥后即得殼聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶的用量為廢菌絲體的0.05～0.30wt％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于甲殼素脫乙酰酶為藍(lán)色犁頭霉(Absidiacoerulae)產(chǎn)生的甲殼素脫乙酰酶，甲殼素脫乙酰酶的用量為每百克廢菌絲體加入800～2000units。
全文摘要
從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法，將檸檬酸生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物廢菌絲體在膠體磨中處理1～1.5小時(shí)，將用膠體磨處理過的菌絲體，置入0.2M pH6.0～8.0的Na
文檔編號C08B37/08GK1629197SQ20041006098
公開日2005年6月22日 申請日期2004年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者杜予民, 蔡俊, 楊建紅, 邱雁臨 申請人:武漢大學(xué)