專利名稱：微生物發(fā)酵正烷烴生產(chǎn)長鏈α·ω-二羧酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是利用微生物發(fā)酵從正烷烴生產(chǎn)長鏈α·ω-二羧酸的方法，特別是高產(chǎn)十六碳二羧酸的方法。
長鏈二羧酸是一類重要的化工原料，可用來制造耐寒性增塑劑，工程塑料、樹脂、涂料以及香料。特別是十六碳二羧酸，是制造環(huán)十五烷酮的重要原料，后者具有純麝香香味、是一種高級麝香香料。
從七十年代起，各國利用微生物氧化正烷烴生產(chǎn)長鏈二羧酸的研究和應(yīng)用取得了突破性進(jìn)展，八十年代起進(jìn)入了工業(yè)化生產(chǎn)階段。1972年日本的內(nèi)尾良輔等人在《農(nóng)業(yè)·生物化學(xué)》雜志(Agr.Biol.Chem.Vol.36)“微生物利用正烷烴生產(chǎn)長鏈二羧酸”的文章中，報道了他們用陰溝假絲酵母MR-12菌株在1立升發(fā)酵罐中，用醋酸鈉作生長碳源，加入15%(V/V)的正十六烷發(fā)酵72小時，得到63.3克/升的十六碳二羧酸，正十六烷的轉(zhuǎn)化率為54%。1978年內(nèi)尾又在《石油和微生物》雜志(《石油と微生物》NO.20，1978)報導(dǎo)了擴大試驗的結(jié)果在300立升罐里，醋酸作為生長碳源，正十六烷作為發(fā)酵碳源發(fā)酵68小時，得到54克/升，十六碳二羧酸，正十六烷轉(zhuǎn)化率70%。這是目前十六碳二羧酸產(chǎn)量最高，規(guī)模最大的報導(dǎo)。1985年，日本植村等人在《石油和微生物》NO.33(《石油と微生物》NO.33)上報導(dǎo)用熱帶假絲酵母的突變菌株M2030在3升罐上發(fā)酵94-113小時從9-18個碳的正烷烴(加入量30%V/V)分別產(chǎn)生相應(yīng)的二羧酸。其中11-15個碳二羧酸的產(chǎn)量分別為62克/升。82克/升，96克/升，100克/升和90克/升，正烷烴轉(zhuǎn)化率在30-45%之間，而十六碳二羧酸產(chǎn)量較低，每升不到50克。
本發(fā)明的目的是提供一種用熱帶假絲酵母從10-18個碳正烷烴發(fā)酵生產(chǎn)長鏈α·ω-二羧酸的方法，特別是高產(chǎn)十六碳二羧酸的方法。
本發(fā)明所用的菌株為熱帶假絲酵母UH-3-9高產(chǎn)突變菌株(CandidatropiealisUH-3-9)，是以一株兩端氧化正烷烴生成長鏈二羧酸能力較強的熱帶假絲酵母(見《微生物學(xué)報》20(1)88-93，1980)為出發(fā)菌株，通過硝基胍和紫外線多次誘變，選育出來的一株ω-氧化能力更強，同化正烷烴能力和β-氧化能力更弱的突變株。本發(fā)明所用的菌株保藏在中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCCNO.0129。
本發(fā)明的種母培養(yǎng)基有(1)10個巴林的麥芽汁加2%瓊脂制成的固體斜面;(2)10個巴林的麥芽汁液體培養(yǎng)基;(3)烷烴液體培養(yǎng)基包含KH2PO46-8克/升，蔗糖2-4克/升，酵母膏2-4克/升，玉米漿2-4克/升，尿素2-4克/升，重蠟40-50毫升/升，消泡劑(甘油聚醚)約400ppm，自來水配制，PH值5左右。培養(yǎng)種母的過程為取一接種環(huán)UH-3-9酵母菌體，涂布在麥芽汁固體斜面上(15×180試管，每支裝液量6-7ml，放成斜面)于28-30℃培養(yǎng)兩天。取一支上述斜面菌種，接入30ml/250ml三角瓶的麥芽汁液體培養(yǎng)基或25ml/500ml三角瓶烷烴培養(yǎng)基，于28-30℃在200轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)36-48小時，作為發(fā)酵種母。
用本發(fā)明的高產(chǎn)突變菌株熱帶假絲酵母UH-3-9生產(chǎn)長鏈α·ω-二羧酸，特別是十六碳二羧酸的具體方法是將發(fā)酵種母接入PH值為5.5-8.0含有5-40%(V/V)，最好為10-25%(V/V)10-18個碳原子的正烷烴和95-60%(V/V)，最好為90-75%(V/V)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為堿金屬磷酸鹽4-10克/升，氯化鈉0.5-2.0克/升，尿素0.5-2克/升，丙烯酸0.5-2毫升/升，表面活性劑吐溫600.1-2.0克/升及其它營養(yǎng)源。將上述混合液在24-34℃，最好是26-32℃下維持48-144小時，然后將產(chǎn)生的α·ω-二羧酸進(jìn)行分離提純，其具體做法是發(fā)酵結(jié)束后的液體加熱至80-90℃加NaOH把PH值調(diào)至10-12，然后用離心機離心，收集離心清液和殘存烷烴，除去菌體。含有殘存烷烴的離心清液，在20℃以下靜置過夜，烷烴在表面形成白色固體塊，回收再用，大量大顆粒的十六碳二羧酸鈉鹽結(jié)晶沉于底部，傾出上清液，收集鈉鹽結(jié)晶，清液濃縮用同法處理收集十六碳二羧酸鈉鹽。把十六碳二羧酸鈉鹽溶解于80-90℃熱水中，加入濃HCl，調(diào)PH值至2-3，靜置冷卻結(jié)晶過夜。最后收集白色二羧酸結(jié)Ч?fàn)C?，?0℃烘烤至干。
堿金屬磷酸鹽在發(fā)酵培養(yǎng)中既作為磷源又作為一種緩沖劑成分，加入NaOH后，組成一個緩沖體系，維持發(fā)酵液適宜的PH值。其含量隨培養(yǎng)基中其它成分而變化，較適宜的磷酸鹽含量為6-8克/升，最好選擇KH2PO4和NaHPO4。尿素在培養(yǎng)基中含量要適宜，作為所用酵母菌的唯一氮源，尿素含量高些，對菌體生長有利，但過量尿素會降低細(xì)胞色素P450的容量，影響α·ω-二羧酸的生成，因此最適宜的尿素含量為0.8-1.2克/升。丙烯酸的存在，可阻斷酵母菌對二羧酸的β-氧化降解，提高α·ω-二羧酸的產(chǎn)量，最適宜濃度為0.5-1.2毫升/升。少量表面活性劑的加入，有利于正烷烴和水的乳化，縮短適應(yīng)期，加速菌體生長，提高二羧酸產(chǎn)量。較好的表面活性劑是吐溫60，最適宜的含量為0.3-0.7克／升.其它營養(yǎng)源包括酵母膏、玉米漿、蔗糖等，它們的含量通常為0.5-3克／升。
發(fā)酵培養(yǎng)基用自來水配制，用NaOH調(diào)PH值至6.8-7.3。在通常情況下不必加Mg、Fe、Zn、Mn等金屬元素，自來水中含有的微量就足夠了。15磅滅菌30分鐘。
用本發(fā)明的方法，可得到產(chǎn)量較高的10-18個碳α·ω-二羧酸。特別是十六碳α·ω-二羧酸，用16立升發(fā)酵罐，正十六烷投入量為20%(V/V)，在適宜條件下發(fā)酵70小時，產(chǎn)酸最高達(dá)77.5克/升，而延長發(fā)酵時間到17小時，產(chǎn)酸量高達(dá)123克/升，轉(zhuǎn)化率為79%，明顯優(yōu)于日本用陰溝假絲酵母突變株MR-12及熱帶假絲酵母突變株M2030所產(chǎn)生的十六碳二羧酸產(chǎn)量，后處理方法也較簡單。
用氣相色譜法對正烷烴發(fā)酵生產(chǎn)十六烷二羧酸進(jìn)行定性和定量分析，分析條件為柱溫230℃，N235ml/分，H20.6kg/cm2，Ar0.2Kg/cm2，氣化室280℃。


圖1，2，3以及表1可以證明十六烷發(fā)酵產(chǎn)生的二羧酸(用DC表示)是十六碳二羧酸(DC16)，純度為97.7%。圖4表明所用的正十六烷原料的純度為99.7%。
實施例(1)取一接種環(huán)的UH-3-9菌體，涂布在15×180的大試管麥芽汁固體斜面上，共6支，28℃培養(yǎng)2天;(2)把上述培養(yǎng)2天的一支大斜面菌種，接入裝30ml麥芽汁培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，共6瓶，28℃，在200轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)2天;(3)把(2)中培養(yǎng)的麥芽汁種液2瓶，接入一個裝50ml麥芽汁培養(yǎng)基的3000ml三角瓶中，共三瓶，在28℃，120轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)43小時，(4)把(3)中培養(yǎng)的種液兩瓶(約1000ml)接入一個裝有10升發(fā)酵培養(yǎng)基的16升自動控制罐中，其中含有KH2PO480克。NaCl 10克，酵母膏20克，玉米漿10克，丙烯酸10ml，尿素10克(溶于50ml水中，單獨滅菌，接種前加入)，消泡劑(甘油聚醚)10克，溶于7升自來水中，用NaOH調(diào)PH值至7.3，以及2000ml正十六烷，在121℃滅菌30分鐘后，29-30℃時接種，(5)接種后，在29℃，攪拌速度700-900轉(zhuǎn)/分，通氣量1∶1-1∶1.5，罐壓10-15磅/厘米2的條件下培養(yǎng)發(fā)酵117小時。24小時內(nèi)，繁殖菌體，到24小時用NaOH調(diào)一次PH值至7.0，40小時內(nèi)后再調(diào)一次PH值至7.5，從48小時開始，把PH值自動控制在7.7，直至發(fā)酵結(jié)束。測得十六碳二羧酸為123.4克/升，轉(zhuǎn)化率達(dá)79%;(6)發(fā)酵結(jié)束后，加熱升溫至80-90℃，加NaOH溶液，調(diào)PH值至10以上，趁熱離心去除菌體(已基本上沒有殘正十六烷)，清液放置冷卻過夜，大量大顆粒十六碳二羧酸鈉鹽結(jié)晶析出，倒出結(jié)晶母液(十六碳二羧酸還有1.8%)，鈉鹽結(jié)晶用少量自來水洗，抽干，結(jié)晶母液蒸發(fā)濃縮為少量體積后，放置冷卻結(jié)晶，收集十六碳二羧酸鈉鹽，合并待精制。每220克十六碳二羧酸鈉鹽(含水量約為55%)，溶解于3升熱水中(約90℃)，加熱HCl調(diào)PH值至2-3，生成白色沉淀，放置冷卻結(jié)晶過夜，抽濾干，在60℃烘干，得白色十六碳二羧酸91克。發(fā)酵液中十六碳二羧酸的分離精制總收率為80%左右。
圖1.為標(biāo)準(zhǔn)二羧酸及發(fā)酵產(chǎn)物的色譜圖數(shù)據(jù)如下名稱時間含量MK峰面積1.20.399135371.720.200317752.128.9584793972.638.399∨744383.316.2976∨1444424.1913.2711∨1176195.371.2669112296.9451.2071453836總量99.9999886275
圖2.為正十六烷發(fā)酵生產(chǎn)十六烷二羧酸的純度分析數(shù)據(jù)如下名稱時間含量MK峰面積1.710.02621332.10.0984992.350.06343232.620.11135672.970.11655933.30.6172∨31434.180.677234484.860.05642875.350.513926176.9197.7194497647總量99.9999509261
圖3.二羧酸碳數(shù)規(guī)律圖說明圖3是根據(jù)圖1的色譜結(jié)果，按圖1的出峰時間，進(jìn)行碳數(shù)規(guī)律作圖。
圖4.發(fā)酵原料正十六烷純度分析數(shù)據(jù)如下名稱時間含量MK峰面積1.060.0005381.480.020515471.840.00654892.3599.97247521908總量100752398
權(quán)利要求
1.一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)長鏈α·ω-二羧酸的方法，其特征在于(1)把用一株熱帶假絲酵母UH-3-9(Candida tropicalis UH-3-9)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC NO.0129)培養(yǎng)成的種母液接入PH值為5.5-9.0含有5-40%(V/V)10-18個碳原子的正烷烴和95-60%(V/V)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為堿金屬磷酸鹽4-12克/升，氯化鈉0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，丙烯酸0.5-2毫升/升，表面活性劑葉吐溫600.1-2.0克/升及其它營養(yǎng)源。(2)上述混合物在24-34℃下維持48-144小時，然后將產(chǎn)生的α·ω-二羧酸進(jìn)行分離提純。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于混合液中正烷烴的含量為10-25%(V/V)，發(fā)酵培養(yǎng)基含量90-75%(V/V)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基的組成中堿金屬磷酸鹽6-8克/升，尿素0.8-1.2克/升，丙烯酸0.5-1.2毫升/升，表面活性劑吐溫60 0.3-0.7克/升。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，2的方法其特征在于所說的正烷烴含有14-16個碳原子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2的方法其特征在于所說的正烷烴含有16個碳原子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，3所述的方法，其特征是堿金屬磷酸鹽最好是KH2PO4和Na2HPO4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是發(fā)酵混合液的溫度控制在26-32℃，PH值為6.5-8。
全文摘要
一種利用微生物發(fā)酵正烷烴生產(chǎn)長鏈α·ω-二羧酸的方法，特別是涉及高產(chǎn)十六碳二羧酸的方法。把一株熱帶假絲酵母UH-3-9(Candida tropicalisUH-3-9)培養(yǎng)成的種母液接入pH值為5.5-9.0含有5-40％(V/V)10-18個碳原子的正烷烴和95-60％(V/V)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。上述混合物在24-34℃下維持48-144小時，然后將獲得的α·ω-二羧酸進(jìn)行分離提純。
文檔編號C12P7/44GK1034579SQ8710544
公開日1989年8月9日 申請日期1987年8月12日 優(yōu)先權(quán)日1987年8月12日
發(fā)明者陳遠(yuǎn)童, 郝秀玲 申請人:中國石油化工總公司, 中國科學(xué)院微生物研究所