本發(fā)明涉及一種納米顆粒及其制備方法，特別涉及一種包埋活性肽的納米顆粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，食源性活性肽因其安全性高，又能夠?yàn)槿梭w提供氨基酸，調(diào)節(jié)某些生理機(jī)能，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

雞蛋，因其具有非常高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和蛋白質(zhì)生物利用率而歷來(lái)被人們所青睞。我國(guó)是蛋品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，蛋品的生產(chǎn)量和消費(fèi)量已連續(xù)多年世界第一，但是蛋品深加工還是以蛋殼為主，蛋品深加工程度仍然較低，尤其在功能性蛋制品方面發(fā)展嚴(yán)重不足，不能滿足日益擴(kuò)大的市場(chǎng)需求。

雞蛋清中蛋白質(zhì)含量較多，含有8種人體必需氨基酸，是獲取生物活性肽的良好蛋白質(zhì)資源。蛋清蛋白被酶解后得到由氨基酸組成的多個(gè)肽段，即蛋清源活性肽，蛋清源活性肽具有獨(dú)特的體內(nèi)或體外生物活性，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，生物活性多樣，幾乎無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，但由于其在體內(nèi)胃腸道消化系統(tǒng)中極易被降解而不能以完整形式被吸收，而蛋清源活性肽要在體內(nèi)發(fā)揮生物活性就必須通過(guò)胃腸道復(fù)雜的消化酶降解，然后以完整形式透過(guò)小腸上皮吸收滲透屏障，被機(jī)體完整吸收后，再通過(guò)血液循環(huán)等輸送到作用靶點(diǎn)，且積累到一定的量才有可能最終實(shí)現(xiàn)其發(fā)揮調(diào)節(jié)生理功能的作用。因此，開(kāi)發(fā)一種對(duì)蛋清源活性肽進(jìn)行有效保護(hù)的技術(shù)手段以提高其穩(wěn)定性和體內(nèi)吸收利用率迫在眉睫。

殼聚糖(chitosan)，化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-b-d葡萄糖，是由甲殼素經(jīng)脫乙酰作用得到的。是自然界中除纖維素外含量最高的多糖，因其無(wú)毒、易降解、生物活性多樣、能被生物體完全吸收而在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域內(nèi)有廣泛的應(yīng)用。利用殼聚糖作為納米包材對(duì)蛋清源活性肽進(jìn)行包埋保護(hù)具有重要意義。

隨著研究者對(duì)蛋清源活性肽功能活性和結(jié)構(gòu)特性研究的逐漸深入，如何確保其以完整形式被機(jī)體吸收也成為了一個(gè)亟需解決的難題，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蛋清源活性肽通過(guò)納米包埋的形式提高其穩(wěn)定性和體內(nèi)生物利用率的相關(guān)專利和論文文獻(xiàn)幾乎沒(méi)有。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)階段蛋清源活性肽在體內(nèi)胃腸道消化系統(tǒng)中極易被降解而不能以完整形式被吸收的問(wèn)題，提供的一種包埋活性肽的納米顆粒及其制備方法。

本發(fā)明提供的包埋活性肽的納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、蛋清源活性肽的制備：取一定量蛋清蛋白粉，按料液質(zhì)量比為1:10～1:100配制成蛋清蛋白粉原料液，加熱至80℃～100℃，持續(xù)5min～20min，進(jìn)行變性處理，然后冷卻至30℃～50℃，調(diào)節(jié)ph值至8～10，加入堿性蛋白酶，持續(xù)水解100min～300min后，進(jìn)行沸水浴滅酶，最后離心處理，取上清液，進(jìn)行超濾膜過(guò)濾、凍干，得到蛋清源活性肽樣品；

步驟二、殼聚糖-三聚磷酸鈉納米顆粒的制備：采用離子凝膠法，即稱取一定量殼聚糖，通過(guò)降解法將殼聚糖溶解于0.1wt％～10wt％的乙酸溶液中，使其濃度為0.01mg/ml～4mg/ml,按殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為10:1～1:1的比例，加入一定量濃度為0.1mg/ml～1mg/ml的三聚磷酸鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)ph值至1～7，測(cè)量其粒徑和電勢(shì)分布情況，得到粒徑＜200nm，電勢(shì)大于30mv，穩(wěn)定性良好的殼聚糖-三聚磷酸鈉納米顆粒溶液；

步驟三、蛋清肽-殼聚糖納米顆粒的制備：按照蛋清源活性肽：殼聚糖的質(zhì)量比為20:1～1:10，取一定量的由步驟一制得的蛋清源活性肽，攪拌狀態(tài)下加入到一定量的由步驟二制得的殼聚糖溶液中，攪拌1min～10min后進(jìn)行超聲波處理1min～20min，加入步驟二中得到的對(duì)應(yīng)體積的三聚磷酸鈉溶液，調(diào)節(jié)ph值至2～7，測(cè)量其粒徑和電勢(shì)分布情況，得到粒徑＜200nm，電勢(shì)大于30mv，穩(wěn)定性良好的蛋清肽-殼聚糖納米顆粒溶液。

步驟一中用1m氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至8～10。

步驟一中加入堿性蛋白酶的量是蛋清蛋白粉質(zhì)量的1％～10％。

步驟一中超濾膜為分子量分別是10k、3k和1k的超濾膜，將上清液依次經(jīng)過(guò)分子量為10k、3k和1k的超濾膜過(guò)濾后，得到分子量分別為＜10kda的活性肽、10kda～3kda、3kda～1kda和＜1kda的四種蛋清源活性肽。

步驟二中使用的殼聚糖分子量為150kda。

步驟二中降解法采用聲波降解法。

步驟二中殼聚糖的初始濃度為0.01mg/ml～4mg/ml。

步驟二中殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為10:1～1:1。

步驟二中制備蛋清肽-殼聚糖納米顆粒時(shí)，添加順序?yàn)閷⒌扒咫募尤霘ぞ厶侨芤褐?，?jīng)攪拌超聲后加入三聚磷酸鈉。

步驟三中超聲波處理過(guò)程為240w超聲波處理10min～60min。

本發(fā)明提供的一種包埋活性肽的納米顆粒由以上方法制得。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明采用了離子凝膠的方式，以殼聚糖和三聚磷酸鈉為納米包材，對(duì)酶解得到的四種不同分子量構(gòu)成的蛋清源活性肽進(jìn)行包埋，制備得到了包埋性能較好的蛋清肽-殼聚糖納米顆粒，填補(bǔ)了保護(hù)和促進(jìn)蛋清源活性肽生物吸收利用方面的空白；

(2)本發(fā)明屬蛋品資源的精深加工技術(shù)，采用自然界存在廣泛、性能優(yōu)良的殼聚糖為納米包材原料，制備蛋清肽-殼聚糖納米顆粒，對(duì)其在諸如飲料、保健品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用具有較大的借鑒意義，能促進(jìn)蛋品產(chǎn)業(yè)高附加值成分的綜合開(kāi)發(fā)利用，提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值；

(3)本發(fā)明運(yùn)用了離子凝膠技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，參數(shù)條件溫和，生產(chǎn)周期短，易于在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用；

(4)操作過(guò)程中采用的原材料殼聚糖屬保健食品，無(wú)毒易降解，對(duì)其利用也能加大水產(chǎn)產(chǎn)品的綜合利用和精深加工；三聚磷酸鈉的使用量遠(yuǎn)小于國(guó)標(biāo)所設(shè)定的最低標(biāo)準(zhǔn)(5g/kg)，其他溶劑均安全無(wú)毒，且使用量較少，在一定程度上可較好的節(jié)約成本；

(5)制備出的蛋清肽-殼聚糖納米顆粒均一穩(wěn)定，且粒徑較小，能夠較好的被人體吸收，發(fā)揮相應(yīng)功效；

(6)制備出的蛋清肽-殼聚糖納米顆粒能夠較好的保持蛋清肽的相應(yīng)功能，同時(shí)，乙酸的酸味也能較好地掩蓋蛋清肽的腥味，能夠較好的滿足生產(chǎn)保健食品如蛋清肽類降血壓、抗衰老食品等生產(chǎn)的原料需求，又能為高端藥品的生產(chǎn)提供優(yōu)等的原材料。

希望通過(guò)本發(fā)明，能夠推動(dòng)對(duì)保護(hù)和促進(jìn)蛋清源活性肽生物吸收利用方面的系統(tǒng)研究，對(duì)蛋品產(chǎn)業(yè)的精深加工提供新的思路，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋品資源的整合和最大化的合理運(yùn)用。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明制備得到的殼聚糖-三聚磷酸鈉納米顆粒透射電鏡(tem)圖。

圖2為本發(fā)明制備得到的蛋清肽-殼聚糖納米顆粒粒徑分布圖。

圖3為本發(fā)明制備得到的蛋清肽-殼聚糖納米顆粒電勢(shì)分布圖。

具體實(shí)施方式

請(qǐng)參閱圖1至圖3所示：

實(shí)施例一：

本發(fā)明提供的包埋活性肽的納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、蛋清源活性肽的制備：取200g蛋清蛋白粉，按料液質(zhì)量比為1:10配制成蛋清蛋白粉原料液，加熱至85℃，持續(xù)10min，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理，然后冷卻至50℃，用1m氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至10，加入8g堿性蛋白酶，持續(xù)水解100min后，沸水浴10min滅酶，最后離心處理，取上清液，依次經(jīng)過(guò)分子量為10k、3k和1k的超濾膜過(guò)濾后，得到分子量分別為＜10kda的活性肽、10kda～3kda、3kda～1kda和＜1kda的四種蛋清源活性肽，分別凍干，得到蛋清源活性肽樣品；

步驟二、殼聚糖-三聚磷酸鈉納米顆粒的制備：采用離子凝膠法，即稱取分子量為150kda的殼聚糖50mg，采用聲波降解法將殼聚糖溶解于100ml0.1wt％的乙酸溶液中，按殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為3:1的比例，攪拌狀態(tài)下加入20.8ml濃度為0.8mg/ml的三聚磷酸鈉溶液，調(diào)節(jié)ph值至3，測(cè)量其粒徑和電勢(shì)分布情況，得到粒徑為150±15nm，zeta電勢(shì)為51±0.92mv的殼聚糖-三聚磷酸鈉納米顆粒的溶液；

步驟三、蛋清肽-殼聚糖納米顆粒的制備：按蛋清源活性肽：殼聚糖＝1:1的比例稱取分子量為3k-10k的蛋清源活性肽50mg，攪拌狀態(tài)下加入到由步驟二方法制得的100ml殼聚糖溶液中，240w超聲波處理10min后，加入20.8ml濃度為0.8mg/ml的三聚磷酸鈉溶液，混勻后調(diào)節(jié)ph值至3，測(cè)量其粒徑和電勢(shì)分布情況，得到粒徑為195±12nm，zeta電勢(shì)為46.3±3.8mv，包埋率為30.37±0.005％的蛋清肽-殼聚糖納米顆粒溶液。

實(shí)施例二：

本發(fā)明提供的包埋活性肽的納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、蛋清源活性肽的制備：取400g蛋清蛋白粉，按料液質(zhì)量比為1:50配制成蛋清蛋白粉原料液，加熱至90℃，持續(xù)15min，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理，然后冷卻至50℃，用1m氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至9，加入16g堿性蛋白酶，持續(xù)水解200min后，沸水浴10min滅酶，最后離心處理，取上清液，依次經(jīng)過(guò)分子量為10k、3k和1k的超濾膜過(guò)濾后，得到分子量分別為＜10kda的活性肽、10kda～3kda、3kda～1kda和＜1kda的四種蛋清源活性肽，分別凍干，得到蛋清源活性肽樣品；

步驟二、殼聚糖-三聚磷酸鈉納米顆粒的制備：采用離子凝膠法，即稱取分子量為150kda的殼聚糖100mg，采用聲波降解法將殼聚糖溶解于100ml1wt％的乙酸溶液中，按殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為4:1的比例，攪拌狀態(tài)下加入31.25ml濃度為0.8mg/ml的三聚磷酸鈉溶液，調(diào)節(jié)ph值至3，測(cè)量其粒徑和電勢(shì)分布情況，得到粒徑為195.9±14nm，zeta電勢(shì)為52±0.91mv的殼聚糖-三聚磷酸鈉納米顆粒的溶液；

步驟三、蛋清肽-殼聚糖納米顆粒的制備：按蛋清源活性肽：殼聚糖＝1:1的比例稱取分子量為＜10kda的活性肽的蛋清源活性肽100mg，攪拌狀態(tài)下加入到由步驟二方法制得的100ml殼聚糖溶液中，240w超聲波處理20min后，加入31.25ml濃度為0.8mg/ml的三聚磷酸鈉溶液，混勻后調(diào)節(jié)ph值至3，測(cè)量其粒徑和電勢(shì)分布情況，得到粒徑為176.2±4nm，zeta電勢(shì)為49.9±1.36mv，包埋率為40.18±0.92％的蛋清肽-殼聚糖納米顆粒溶液。