用于浮游動(dòng)物、浮游植物和浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的dna分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于浮游動(dòng)物、浮游植物和浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法，包括以下步驟：步驟(1)：采集環(huán)境樣品，從中提取出浮游動(dòng)物和植物的DNA；步驟(2)：對(duì)所述的浮游動(dòng)物和植物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到浮游動(dòng)物和植物DNA的PCR產(chǎn)物；步驟(3)：對(duì)所述的浮游動(dòng)物和植物DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，得到帶有浮游動(dòng)物和植物DNA的凝膠；步驟(4)：對(duì)所述的帶有浮游動(dòng)物和植物的DNA的凝膠進(jìn)行二代測(cè)序，得到環(huán)境樣品中浮游動(dòng)物和植物物種的rDNA序列；步驟(5)：將所述的浮游動(dòng)物和植物物種的rDNA序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種比對(duì)，進(jìn)行浮游動(dòng)物和植物結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)和分析。此方法簡(jiǎn)便高效準(zhǔn)確，設(shè)計(jì)巧妙，十分具有實(shí)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】用于浮游動(dòng)物、浮游植物和浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié) 構(gòu)的DNA分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及物種鑒定方面，具體是指一種用于浮游動(dòng) 物、浮游植物和浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法

【背景技術(shù)】
[0002] 浮游動(dòng)植物的鑒定和群落結(jié)構(gòu)研宄，是水域生態(tài)學(xué)調(diào)查和環(huán)境監(jiān)測(cè)當(dāng)中的一項(xiàng)重 要工作；同時(shí)，在對(duì)浮游生物食性的水生生物的生態(tài)學(xué)研宄當(dāng)中，類似的研宄也被經(jīng)常用 到。在傳統(tǒng)的研宄當(dāng)中，都是以顯微鏡鏡檢作為手段對(duì)上述內(nèi)容進(jìn)行研宄的。顯微鏡作為傳 統(tǒng)的研宄手段，被廣泛用于該領(lǐng)域的研宄，但是，卻存在這如下問(wèn)題：1、動(dòng)植物樣品由于體 積差異大，難以在同一個(gè)樣品中被同時(shí)進(jìn)行分析，雖然可以通過(guò)換算將動(dòng)植物的比例關(guān)系 進(jìn)行計(jì)算，但是轉(zhuǎn)換過(guò)程中產(chǎn)生的誤差較大。2、鏡檢需要依賴完整的動(dòng)植物樣品進(jìn)行鑒定， 對(duì)于采集過(guò)程中導(dǎo)致的鏡檢生物的破壞產(chǎn)生的殘?bào)w往往無(wú)法鑒定，尤其是在鑒定浮游生物 食性的水生生物的消化道的時(shí)候，殘?bào)w更多，會(huì)給需要依賴完整個(gè)體的檢測(cè)鏡檢方法帶來(lái) 極大的困難。3、在物種鑒定上面，需要通過(guò)對(duì)形態(tài)的判斷進(jìn)行定種，雖然有很多的定種依據(jù) 和檢索表，但是想要準(zhǔn)確判斷物種的難度較大。
[0003] 通過(guò)查閱文獻(xiàn)和專利，還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于浮游動(dòng)植物的群落結(jié)構(gòu)或組分的鑒定研宄較 為少見(jiàn)，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)提供的真核生物的通用引物的通用性也較差，同時(shí)，由于藻類包括 了真核藻類和原核藻類（藍(lán)藻）兩個(gè)類群，真核生物的通用引物也無(wú)法對(duì)藍(lán)藻類生物進(jìn)行 鑒定。
[0004] 所以一種能夠用于浮游動(dòng)物、浮游植物和浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的分析 方法是十分具有實(shí)用價(jià)值的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種能夠用于浮游動(dòng)物、 浮游植物和浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種用于浮游動(dòng)物的物種組成和群落 結(jié)構(gòu)的DNA分析方法，其特點(diǎn)在于，包括以下步驟：步驟（1):采集環(huán)境樣品，從中提取出浮 游動(dòng)物DNA ;
[0007] 步驟（2):對(duì)所述的浮游動(dòng)物DNA采用核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的SSU F04和 SEQ ID NO: 2的SSU R22作為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該通用引物為后生動(dòng)物基因組18s rDNA的通用引物，其擴(kuò)增片段在400?450bp，得到浮游動(dòng)物DNA的PCR產(chǎn)物；
[0008] 步驟（3):對(duì)所述的浮游動(dòng)物DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，得到帶有浮游動(dòng)物 DNA的凝膠；
[0009] 步驟⑷：對(duì)所述的帶有浮游動(dòng)物的DNA的凝膠進(jìn)行二代測(cè)序，得到環(huán)境樣品中浮 游動(dòng)物物種的rDNA序列；
[0010] 步驟（5):將所述的浮游動(dòng)物物種的rDNA序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種比對(duì)，進(jìn)行浮 游動(dòng)物結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)和分析。
[0011] 較佳地，PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：25 y 1 體系中：lmmol/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 1.5U DNA 聚合酶、300nmol/L 通用引物、2.5yl 10XPCR buffer，滅菌 H2O 補(bǔ)足至 25yl。
[0012] 較佳地，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min ;95°C變性30s，55°C退火30s， 72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。
[0013] 本發(fā)明第二方面提供了一種用于浮游植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法， 其特點(diǎn)在于，包括以下步驟：
[0014] 步驟（1):采集環(huán)境樣品，從中提取出浮游植物DNA ;
[0015] 步驟（2):對(duì)所述的浮游植物DNA采用核苷酸序列為SEQ ID NO:3的p23SrV fl和 SEQID NO:4的p23SrV rl作為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該通用引物為真核藻類葉綠體23s rDNA和原核藻類23s rDNA的共同通用引物，擴(kuò)增產(chǎn)物也在400?450bp左右，得到浮游植 物DNA的PCR產(chǎn)物；
[0016] 步驟（3):對(duì)所述的浮游植物DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，得到帶有浮游植物 DNA的凝膠；
[0017] 步驟⑷：對(duì)所述的帶有浮游植物的DNA的凝膠進(jìn)行二代測(cè)序，得到環(huán)境樣品中浮 游植物物種的rDNA序列；
[0018] 步驟（5):將所述的浮游植物物種的rDNA序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種比對(duì)，進(jìn)行浮 游植物結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)和分析。
[0019] 較佳地，PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：25 y 1 體系中：lmmol/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 1.5U DNA 聚合酶、300nmol/L 通用引物、2.5yl 10XPCR buffer，滅菌 H2O 補(bǔ)足至 25yl。
[0020] 較佳地，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min ;95°C變性30s，55°C退火30s， 72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。
[0021] 本發(fā)明第三方面提供了一種用于浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA聯(lián)合分 析方法，其特點(diǎn)在于，包括以下步驟：
[0022] 步驟（1):采集環(huán)境樣品，從中提取出浮游動(dòng)植物DNA ;
[0023] 步驟（2):對(duì)所述的浮游動(dòng)植物DNA采用兩端增加接頭的核苷酸序列為SEQ ID NO:8的UT-p23SrV rl作為復(fù)合引物、核苷酸序列為SEQ ID NO:9的UT作為通用引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到浮游動(dòng)植物DNA的PCR產(chǎn)物；
[0024] 步驟（3):對(duì)所述的浮游動(dòng)植物的DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，得到帶有浮游動(dòng) 植物DNA的凝膠；
[0025] 步驟（4):對(duì)所述的帶有浮游動(dòng)植物的DNA的凝膠進(jìn)行二代測(cè)序，得到環(huán)境樣品中 浮游動(dòng)植物物種的rDNA序列；
[0026] 步驟（5):將所述的浮游動(dòng)植物物種的rDNA序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種比對(duì)，進(jìn)行 浮游動(dòng)植物結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)和分析。
[0027] 較佳地，PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：1. 8mmoI/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 I. 5U DNA 聚合酶、300nmol/L通用引物UT、2nmol/L每個(gè)復(fù)合引物、2.5ul 10XPCR buffer，滅菌H2O 補(bǔ)足至25y 1。
[0028] 較佳地，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，56°C退火30s， 72°C延伸50s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。
[0029] 上述的二代測(cè)序可使用Illumina公司開(kāi)發(fā)的HiSeq 300PE測(cè)序平臺(tái)或其他二代 測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行二代測(cè)序，采用的數(shù)據(jù)庫(kù)可為GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)。采用的凝膠電泳均一般采用 1.2%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。
[0030] 采用本發(fā)明的用于浮游動(dòng)物、浮游植物和浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA 分析方法，其選用的后生動(dòng)物的18s rDNA的通用引物是一種非常理想的浮游動(dòng)物的鑒定 的通用引物，其通用性良好，已被廣泛用于后生動(dòng)物的多樣性鑒定；選用的浮游植物的23s rDNA的引物，很好的解決了真核浮游植物和原核浮游植物共同鑒定的難點(diǎn)，為評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)浮 游植物的群落結(jié)構(gòu)和種群動(dòng)態(tài)提供了極大的便利。上述兩個(gè)引物的通用性要好于常用的真 核生物ISsrDNA通用引物，且兩個(gè)引物的退火溫度和PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度都一致，這為對(duì)上 述兩對(duì)引物的聯(lián)合分析提供了可能性。在添加接頭序列UT形成復(fù)合引物后，通過(guò)控制復(fù)合 引物的含量，使得復(fù)合引物在PCR前5-10個(gè)循環(huán)被消耗完，余下的循環(huán)則由UT作為引物 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有UT序列的目的片段，且擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)槭怯梢粚?duì)引物UT合成出來(lái) 的，因此不同組分（浮游動(dòng)物和浮游植物）的基因片段的擴(kuò)增效率是相等的，擴(kuò)增產(chǎn)物的組 分能夠很好地反應(yīng)樣品中各組分的組成。利用二代測(cè)序的平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序后，可以得到大量 的生物條形碼序列的數(shù)據(jù)，利用數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，即可確定物種種類并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。同 時(shí)，由于本技術(shù)體系測(cè)定出來(lái)的浮游動(dòng)植物的組成情況是反應(yīng)了動(dòng)植物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成 的功能單位，且rDNA在基因組中往往是串聯(lián)存在的，因此，該類基因可以在某種程度上反 應(yīng)出生物物種的生物量之間的比例關(guān)系，且這種比例關(guān)系反應(yīng)的是樣品中所有浮游動(dòng)植物 細(xì)胞（而不是個(gè)體，包括了殘破的肢體），因此有效地規(guī)避了鏡檢中必須依賴完整的個(gè)體形 態(tài)計(jì)數(shù)而產(chǎn)生的誤差，對(duì)于樣品的要求降低了，尤其是在浮游生物食性的水生生物消化道 的分析上，更具有優(yōu)勢(shì)。最后，由于本技術(shù)是依靠生物的基因序列作為生物條形碼進(jìn)行物種 鑒定，因此在定種上面實(shí)現(xiàn)了完全的數(shù)字化，而比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類更為客觀和準(zhǔn)確。而且 由于分子生物學(xué)的序列數(shù)據(jù)的數(shù)字化保存形式，隨著數(shù)據(jù)庫(kù)資源的完善，該種方法產(chǎn)生的 序列結(jié)果也具有可追溯性，可以對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行再挖掘，數(shù)據(jù)可以永久留存和反復(fù)比較。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例浮游生物通用引物的擴(kuò)增效果驗(yàn)證圖。
[0032] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例浮游動(dòng)物通用引物的擴(kuò)增效果驗(yàn)證圖。
[0033] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例PCR聯(lián)合分析浮游動(dòng)植物群落的原理圖。
[0034] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例浮游動(dòng)物、真核浮游植物、原核浮游植物等比例混合樣品聯(lián) 合分析的擴(kuò)增效果驗(yàn)證圖。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方法作進(jìn)一 步說(shuō)明。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 對(duì)浮游動(dòng)物18s rDNA引物SSU F04和SSU R22和浮游植物23s rDNA引物p23SrV fl和p23SrV rl的擴(kuò)增效果進(jìn)行驗(yàn)證：
[0038] 使用CTAB法分別提取培養(yǎng)的真核浮游植物小球藻和原核浮游植物微囊藻的DNA， 使用SDS法提取培養(yǎng)的浮游動(dòng)物透明潘的DNA。
[0039] 使用浮游植物23s rDNA引物p23SrV fl和p23SrV rl對(duì)小球藻和微囊藻的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳分別得到條帶1、2 (小球藻）和3、4 (微囊藻），如圖1所示，擴(kuò)增效果良 好。
[0040] 使用浮游動(dòng)物18s rDNA引物SSU F04和SSU R22對(duì)透明潘的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠 電泳分別得到條帶5、6，如圖2所示，擴(kuò)增效果良好。
[0041] 實(shí)施例2
[0042] 對(duì)復(fù)合引物結(jié)合接頭引物聯(lián)合擴(kuò)增浮游動(dòng)植物的擴(kuò)增效果驗(yàn)證，其原理如圖3所 不O
[0043] 將上述的小球藻、微囊藻、透明潘的DNA等濃度混合，形成一個(gè)等濃度的混合DNA 樣品，由數(shù)據(jù)庫(kù)查閱可知，小球藻23s rDNA和透明潘18s rDNA的目的片段在395bp左右， 而微囊藻23s rDNA的目的片段為420bp左右。
[0044] 反應(yīng)體系為 25 y 1 體系中：1. 8mmoI/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 I. 5U DNA 聚合 酶、300nmol/L 通用引物 UT、2nmol/L 每個(gè)復(fù)合引物（UT-SSU F04 和 UT-SSU R22 ;UT-p23SrV 打和譏12351^1'1)、2.511110\?〇?131^€61'，滅菌1120補(bǔ)足至25111。反應(yīng)的溫度條件 ：94°C預(yù)變性 2min ;94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 50s，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
[0045] 使用2.4%的高濃度瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物，平行樣品7、8分別出現(xiàn)兩條帶，一 條帶約在425bp左右，另外一條帶在400bp左右，且兩條帶經(jīng)圖譜分析后顯示出的亮度比 為1:2. 01，可知425bp左右的條帶為微囊藻的PCR產(chǎn)物，400bp左右則是小球藻和透明潘的 PCR產(chǎn)物，且產(chǎn)物的濃度與樣品DNA的初始濃度一致，如圖4所示，擴(kuò)增效果良好。
[0046] 實(shí)施例3
[0047] 千島湖鰱鳙魚(yú)的食性比較
[0048] 步驟一：樣品采集：取千島湖鰱、鳙各5條，取其前腸內(nèi)含物混勻，取0. Ig放 入-20 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0049] 步驟二DNA提取
[0050] 使用Qiagen公司的糞便基因組提取試劑盒，對(duì)前腸內(nèi)含物進(jìn)行DNA提取。
[0051 ] 步驟三DNA濃度測(cè)定
[0052] 測(cè)定提取的DNA濃度和純度，調(diào)整DNA濃度至IOng/ y 1。
[0053] 步驟四PCR擴(kuò)增
[0054] 25yl 體系中：L8mmoI/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 1.5U DNA 聚合酶、300nmol/ L 通用引物 UT、2nmol/L 每個(gè)復(fù)合引物（UT-SSU F04 和 UT-SSU R22 ;UT-p23SrV f 1 和 UT-p23SrVrl)、2.5yl IOXPCR buffer，滅菌 H2O 補(bǔ)足至 25yl。反應(yīng)的溫度條件：94°C 預(yù) 變性 2min ;94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 50s，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
[0055] 步驟五PCR產(chǎn)物檢測(cè)
[0056] 使用1. 2%凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，結(jié)果得到一條在500bp左右的亮帶。PCR成功。
[0057] 步驟六PCR產(chǎn)物的測(cè)序
[0058] 采用Illumina公司的HiSeq 300PE測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣品得到20000+條 序列。
[0059] 步驟七序列比對(duì)和數(shù)據(jù)分析
[0060] 將上述序列在GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行大規(guī)模比對(duì)，得到樣品序列的物種信息和物 種組成比例信息，利用這些信息分析千島湖鰱鳙魚(yú)之間的食性差異。
[0061] 采用本發(fā)明的用于浮游動(dòng)物、浮游植物和浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA 分析方法，其選用的后生動(dòng)物的18s rDNA的通用引物是一種非常理想的浮游動(dòng)物的鑒定 的通用引物，其通用性良好，已被廣泛用于后生動(dòng)物的多樣性鑒定；選用的浮游植物的23s rDNA的引物，很好的解決了真核浮游植物和原核浮游植物共同鑒定的難點(diǎn)，為評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)浮 游植物的群落結(jié)構(gòu)和種群動(dòng)態(tài)提供了極大的便利。上述兩個(gè)引物的通用性要好于常用的真 核生物ISsrDNA通用引物，且兩個(gè)引物的退火溫度和PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度都一致，這為對(duì)上 述兩對(duì)引物的聯(lián)合分析提供了可能性。在添加接頭序列UT形成復(fù)合引物后，通過(guò)控制復(fù)合 引物的含量，使得復(fù)合引物在PCR前5-10個(gè)循環(huán)被消耗完，余下的循環(huán)則由UT作為引物 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有UT序列的目的片段，且擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)槭怯梢粚?duì)引物UT合成出來(lái) 的，因此不同組分（浮游動(dòng)物和浮游植物）的基因片段的擴(kuò)增效率是相等的，擴(kuò)增產(chǎn)物的組 分能夠很好地反應(yīng)樣品中各組分的組成。利用二代測(cè)序的平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序后，可以得到大量 的生物條形碼序列的數(shù)據(jù)，利用數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，即可確定物種種類并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。同 時(shí)，由于本技術(shù)體系測(cè)定出來(lái)的浮游動(dòng)植物的組成情況是反應(yīng)了動(dòng)植物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成 的功能單位，且rDNA在基因組中往往是串聯(lián)存在的，因此，該類基因可以在某種程度上反 應(yīng)出生物物種的生物量之間的比例關(guān)系，且這種比例關(guān)系反應(yīng)的是樣品中所有浮游動(dòng)植物 細(xì)胞（而不是個(gè)體，包括了殘破的肢體），因此有效地規(guī)避了鏡檢中必須依賴完整的個(gè)體形 態(tài)計(jì)數(shù)而產(chǎn)生的誤差，對(duì)于樣品的要求降低了，尤其是在浮游生物食性的水生生物消化道 的分析上，更具有優(yōu)勢(shì)。最后，由于本技術(shù)是依靠生物的基因序列作為生物條形碼進(jìn)行物種 鑒定，因此在定種上面實(shí)現(xiàn)了完全的數(shù)字化，而比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類更為客觀和準(zhǔn)確。而且 由于分子生物學(xué)的序列數(shù)據(jù)的數(shù)字化保存形式，隨著數(shù)據(jù)庫(kù)資源的完善，該種方法產(chǎn)生的 序列結(jié)果也具有可追溯性，可以對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行再挖掘，數(shù)據(jù)可以永久留存和反復(fù)比較。
[0062] 在此說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以做出 各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說(shuō)明書(shū)應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的而非限 制性的。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于浮游動(dòng)物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法，其特征在于，包括以下步 驟： 步驟（1):采集環(huán)境樣品，從中提取出浮游動(dòng)物DNA; 步驟（2):對(duì)所述的浮游動(dòng)物DNA采用核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的SSU F04和SEQ ID NO: 2的SSU R22作為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到浮游動(dòng)物DNA的PCR產(chǎn)物； 步驟（3):對(duì)所述的浮游動(dòng)物DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，得到帶有浮游動(dòng)物DNA的 凝膠； 步驟（4):對(duì)所述的帶有浮游動(dòng)物的DNA的凝膠進(jìn)行二代測(cè)序，得到環(huán)境樣品中浮游動(dòng) 物物種的rDNA序列； 步驟（5):將所述的浮游動(dòng)物物種的rDNA序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種比對(duì)，進(jìn)行浮游動(dòng) 物結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)和分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于浮游動(dòng)物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法，其特征 在于，PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：25yl 體系中：lmmol/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 1.5U DNA 聚合酶、300nmol/L 通用引物、2.5yl 10XPCR buffer，滅菌 H20 補(bǔ)足至 25yl。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于浮游動(dòng)物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法，其特 征在于，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min ;95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸 458,30個(gè)循環(huán)；72°0延伸1〇111111。
4. 一種用于浮游植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法，其特征在于，包括以下步 驟： 步驟（1):采集環(huán)境樣品，從中提取出浮游植物DNA; 步驟（2):對(duì)所述的浮游植物DNA采用核苷酸序列為SEQ ID N0:3的p23SrV fl和SEQ ID NO: 4的p23SrV rl作為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到浮游植物DNA的PCR產(chǎn)物； 步驟（3):對(duì)所述的浮游植物DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，得到帶有浮游植物DNA的 凝膠； 步驟（4):對(duì)所述的帶有浮游植物的DNA的凝膠進(jìn)行二代測(cè)序，得到環(huán)境樣品中浮游植 物物種的rDNA序列； 步驟（5):將所述的浮游植物物種的rDNA序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種比對(duì)，進(jìn)行浮游植 物結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)和分析。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于浮游植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法，其特征 在于，PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：25yl 體系中：lmmol/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 1.5U DNA 聚合酶、300nmol/L 通用引物、2.5yl 10XPCR buffer，滅菌 H20 補(bǔ)足至 25yl。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于浮游植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法，其特 征在于，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min ;95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸 458,30個(gè)循環(huán)；72°0延伸1〇111111。
7. -種用于浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA聯(lián)合分析方法，其特征在于，包括 以下步驟： 步驟（1):采集環(huán)境樣品，從中提取出浮游動(dòng)植物DNA; 步驟（2):對(duì)所述的浮游動(dòng)植物DNA采用核苷酸序列為SEQ ID N0:5的UT-SSU R)4、 SEQ ID N0:6 的 UT-SSU R22、SEQ ID N0:7 的 UT-p23SrV fl 和 SEQ ID N0:8 的 UT-p23SrV rl作為復(fù)合引物、核苷酸序列為SEQ ID NO: 9的UT作為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到浮游 動(dòng)植物DNA的PCR產(chǎn)物； 步驟（3):對(duì)所述的浮游動(dòng)植物的DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，得到帶有浮游動(dòng)植物 DNA的凝膠； 步驟（4):對(duì)所述的帶有浮游動(dòng)植物的DNA的凝膠進(jìn)行二代測(cè)序，得到環(huán)境樣品中浮游 動(dòng)植物物種的rDNA序列； 步驟（5):將所述的浮游動(dòng)植物物種的rDNA序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種比對(duì)，進(jìn)行浮游 動(dòng)植物結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)和分析。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法，其特 征在于，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：1. 8mmoI/lMgCl2、200ummol/l dNTPs和1. 5U DNA聚合酶、 300nmol/L通用引物UT、2nmol/L每個(gè)復(fù)合引物、2.5ul 10XPCR buffer，滅菌H20補(bǔ)足至 25 y 1〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于浮游動(dòng)植物物種組成和群落結(jié)構(gòu)的DNA分析方法，其特 征在于，？〇?擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：941：預(yù)變性2111111;941：變性3〇8,561：退火3〇8,721：延伸 5〇8,30個(gè)循環(huán)；72°0延伸1〇111111。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450950SQ201510003909
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2015年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月6日
【發(fā)明者】劉其根, 羅衡, 趙良杰, 胡忠軍, 王烽竹 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)