亚洲狠狠干,亚洲国产福利精品一区二区,国产八区,激情文学亚洲色图

一種高產(chǎn)蛋白酶k的黑曲霉菌株及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):505252閱讀:1017來源:國知局
一種高產(chǎn)蛋白酶k的黑曲霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種黑曲霉,其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2014677。本發(fā)明通過紫外誘變方法獲得的黑曲霉突變菌mk37能夠高效表達(dá)來源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶K,其發(fā)酵酶活高達(dá)7772.9U/mL,比出發(fā)菌株提高了42%。與出發(fā)菌株相比,突變菌株mk37的菌落較小、較密實(shí),產(chǎn)孢子數(shù)量多,且菌絲分支多、短,菌絲生長(zhǎng)更密集,更適合高密度發(fā)酵,能有效降低蛋白酶K的生產(chǎn)成本。此外,本發(fā)明所述黑曲霉突變菌mk37重組表達(dá)的蛋白酶K可廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。CCTCC NO:M20146772014.12.30
【專利說明】一種高產(chǎn)蛋白酶K的黑曲霉菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶基因工程技術(shù)和微生物誘變篩選【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種高產(chǎn)蛋白 酶K的黑曲霉菌株及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白酶K(E.C. 3.4. 21.64)是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶,是由真菌林伯 氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)合成的胞外內(nèi)肽酶,它是具有典型催化三元 組Asp39-His69-Ser 224的絲氨酸蛋白酶類中的一員。蛋白酶K具有高于30U/mg的特異活性, 是已知的內(nèi)肽酶中最有活性的之一,并且非特異性水解天然的和變性的蛋白質(zhì)。
[0003] 蛋白酶K具有非常重要的生物學(xué)意義,具有極高的酶活性和廣泛的底物特異性, 能優(yōu)先分解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端鄰接的酯鍵和肽鍵,常被用 于降解蛋白生產(chǎn)短肽。成熟蛋白酶K由279個(gè)氨基酸組成,兩個(gè)二硫橋和兩個(gè)鍵合的鈣離子 使得緊密結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。所以,與其他枯草桿菌蛋白酶相比,蛋白酶K對(duì)極端pH值、高溫、離液 劑和去污劑具有高得多的穩(wěn)定性,蛋白酶K在高溫(達(dá)65°C )和寬pH范圍(ρΗ7· 5 -12. 0) 具有高穩(wěn)定性。在變性劑例如脲或SDS存在下其活性得以提高。上述性質(zhì)使得蛋白酶K在 要求非特異性蛋白質(zhì)降解的生物【技術(shù)領(lǐng)域】中具有很好的應(yīng)用,特別是從粗提取液中分離核 酸(DNA或RNA)以及在DNA分析中預(yù)制備樣品,另外蛋白酶K也可應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域, 例如結(jié)構(gòu)釋析。
[0004] 但因?yàn)榱植习咨钋蚓L(zhǎng)緩慢,不適合大規(guī)模發(fā)酵,而且菌體在產(chǎn)生蛋白酶K 的同時(shí)還會(huì)分泌表達(dá)其他蛋白酶,加之對(duì)林伯氏白色念球菌的基因操作比大腸桿菌、酵母 菌和枯草芽孢桿菌等常用基因工程菌困難許多,這些都給蛋白酶K的高效大規(guī)模生產(chǎn)帶來 困難。因此利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)蛋白酶K的異源重組表達(dá)是目前研宄的重點(diǎn)和發(fā)展趨 勢(shì)。很多科研學(xué)者對(duì)改變蛋白酶K宿主菌做了多次嘗試。Gunkel F.A.等將蛋白酶K轉(zhuǎn)入 大腸桿菌體內(nèi),實(shí)現(xiàn)了蛋白酶K的胞內(nèi)表達(dá),然而表達(dá)量極低,Muelle R.等構(gòu)建了蛋白酶 K的表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母體內(nèi),證明了蛋白酶K可以在酵母體內(nèi)表達(dá);但還存在著 表達(dá)量難以滿足生產(chǎn)要求的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)蛋白酶K的黑曲霉菌株及其應(yīng)用,從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技 術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明一方面提供了一種黑曲霉mk37 (Aspergillus niger mk37),已于2014年 12月30日被保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2014677〇
[0007] 上述的黑曲霉mk37用于代謝合成蛋白酶K ;
[0008] 所述蛋白酶K的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。
[0009] 編碼上述蛋白酶K的基因,其一種編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
[0010] 本發(fā)明通過紫外誘變方法獲得的黑曲霉突變菌mk37能夠高效表達(dá)來源于林伯氏 白色念球菌的蛋白酶K,其發(fā)酵酶活高達(dá)7772. 9U/mL,比出發(fā)菌株提高了 42%。與出發(fā)菌 株相比,突變菌株mk37的菌落較小、較密實(shí),產(chǎn)孢子數(shù)量多,且菌絲分支多、短,菌絲生長(zhǎng)更 密集,更適合高密度發(fā)酵,能有效降低蛋白酶K的生產(chǎn)成本。此外,本發(fā)明所述黑曲霉突變 菌mk37重組表達(dá)的蛋白酶K可廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域,經(jīng)蛋白酶K嫩化后的牦牛肉在色 澤、口感方面表現(xiàn)均優(yōu)于對(duì)照組,且肉的平均剪切力、失水率、肌纖維直徑,分別比對(duì)照組低 49. 12N/cm2、6. 21%、8. 56ym,從而說明本發(fā)明所述蛋白酶K對(duì)冷卻牦牛肉的嫩化效果顯 著。除了食品加工領(lǐng)域外,本發(fā)明所述蛋白酶K還可廣泛應(yīng)用于皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、釀 造等領(lǐng)域,均具有很好的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為突變株黑曲霉mk37與出發(fā)菌株菌落形態(tài)對(duì)比圖;
[0012] 圖2為突變株黑曲霉mk37與出發(fā)菌株菌絲形態(tài)對(duì)比圖;
[0013] 圖3為突變株黑曲霉mk37發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖,箭頭所指處即為重 組表達(dá)的蛋白酶K。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。但實(shí)例僅限于說明,并不限于此。下 列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通??砂闯R?guī)條件,如J.薩姆布魯克(Sambrook) 等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。
[0015] 實(shí)施例1、蛋白酶K基因的合成
[0016] 來源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶K的氨基酸序列為SEQ ID NO :1,將此序列按 照黑曲霉的密碼子偏愛性翻譯成相應(yīng)的核酸序列,使其不被Xho I和Xba I兩個(gè)酶切位 點(diǎn)切斷,得到的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。在蛋白酶K的核苷酸序列兩端加 Xho I和Xba I酶切位點(diǎn),交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成,合成的蛋白酶K核苷酸序列被連 接在載體PSG-TS上,插入位點(diǎn)為t-a克隆,受體菌為大腸桿菌DH5a菌株。
[0017] 實(shí)施例2、蛋白酶K基因重組載體的構(gòu)建
[0018] 將連在PSG-TS載體上的蛋白酶K基因用Xho I和Xba I雙酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠 電泳,切膠回收酶切產(chǎn)物片段,與同樣用Xho I和Xba I雙酶切并切膠回收的質(zhì)粒pGm連 接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E. coli)DH5a后,用氨芐青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確,對(duì)若干 克隆進(jìn)行測(cè)序(Invitrogen)。
[0019] 使用質(zhì)粒小量制備試劑盒(Axygen)從測(cè)序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì) 粒。獲得1個(gè)重組質(zhì)粒,測(cè)序結(jié)果顯示獲得的DNA序列為SEQ ID NO: 2,其編碼的蛋白序列 為SEQ ID N0:1。從而說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,命名為pGm-ProK。
[0020] 其中的酶切及連接反應(yīng)均參照表1。
[0021] 表1酶切體系及連接體系
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種黑曲霉,其特征在于,所述的黑曲霉的保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2014677。
2. 如權(quán)利要求1所述的黑曲霉,其特征在于,所述的黑曲霉是通過誘變篩選獲得的。
3. 權(quán)利要求1所述的黑曲霉在代謝合成蛋白酶K中的應(yīng)用。
4. 一種蛋白酶K,其特征在于,所述的蛋白酶K是由權(quán)利要求1所述的黑曲霉發(fā)酵制備 的。
5. 如權(quán)利要求4所述的蛋白酶K,其特征在于,所述的蛋白酶K的氨基酸序列為SEQ ID NO:1〇
6. -種基因,其特征在于,所述的基因編碼權(quán)利要求5所述的蛋白酶K。
7. 如權(quán)利要求6所述的基因,其特征在于,所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK104480027SQ201510003396
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2015年1月4日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月4日
【發(fā)明者】王華明, 林艷梅 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1