鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株及其應(yīng)用，屬于鵝副黏病毒的分離及應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明首先分離了一株鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株，其微生物保藏編號(hào)是：CGMCC No.9901。本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種制備預(yù)防鵝副黏病毒滅活疫苗的方法，包括以下步驟：(1)培養(yǎng)鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株，收集病毒液；(2)滅活病毒液；(3)離心，取病毒上清液，與佐劑混合，乳化，即得。本發(fā)明分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞高度適應(yīng)，適合細(xì)胞培養(yǎng)；免疫原性良好，與胚毒制備的疫苗相比，具有產(chǎn)生抗體效價(jià)高并且節(jié)約生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)。
CGMCC No. 9901
20141022
【專利說明】鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鵝副黏病毒，尤其涉及一株分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng) 株，本發(fā)明還涉及所述分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株在制備預(yù)防鵝副黏病毒病 的疫苗中的用途，屬于鵝副黏病毒的分離及應(yīng)用領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 鵝副黏病毒（Goose paramyxovirus, GPMV)是副黏病毒科，副黏病毒亞科，腿腺炎 病毒屬。鵝副黏病毒病是以消化道病變?yōu)橹饕卣鞯木哂懈叨劝l(fā)病率和死亡率的烈性傳染 病，一年四季均可發(fā)生，發(fā)病率為40% -100%，平均為60%左右，死亡率為30% -100%，平 均為40%左右。不同日齡的鵝均易感染，但日齡越小發(fā)病率和死亡率越高，其中15日齡以 內(nèi)雛鵝的發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100%。隨鵝群日齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率和死亡率也隨之下降， 部分病鵝可逐漸康復(fù)。種鵝感染發(fā)病后，除死亡外，產(chǎn)蛋量大大下降，受精率也很低。
[0003] 目前，部分養(yǎng)殖戶用新城疫疫苗免疫鵝，以預(yù)防鵝副黏病毒。根據(jù)報(bào)道，新城疫病 毒一般不感染鵝，即使感染也不發(fā)?。℅agic et al，1999)。任濤等（2000)曾用國(guó)內(nèi)NDV標(biāo) 準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E8攻擊28日齡的鵝，發(fā)現(xiàn)NDV強(qiáng)毒株對(duì)鵝的發(fā)病率和死亡率均為0。鵝副黏 病毒病至今仍無有效的治療方法，預(yù)防該病最行之有效的辦法是疫苗的接種。目前，市售的 鵝副黏病毒疫苗絕大多數(shù)為雞胚生產(chǎn)的組織苗，相對(duì)于細(xì)胞苗而言，其具有成本高、產(chǎn)品質(zhì) 量批間差較大等缺點(diǎn)。因此，分離一株鵝副黏病毒細(xì)胞適應(yīng)毒株，對(duì)于降低鵝副黏病毒疫苗 的生產(chǎn)成本、穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株鵝副黏病毒（Goose paramyxovirus)雞胚 成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株，其具有在雞胚成纖維細(xì)胞上增殖的特性，免疫原性良好，產(chǎn)生 抗體效價(jià)高，且降低疫苗生產(chǎn)成本。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明首先分離了一株鵝副黏病毒株，其具有在雞胚成纖維細(xì)胞上增殖的特性； 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步馴化分離出了一株細(xì)胞適應(yīng)毒，命名為DQ03株。
[0007] 本發(fā)明將分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu) 進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號(hào)為：CGMCC No. 9901 ;分類命名是：鵝副黏病毒；保藏時(shí)間是： 2014年10月22日；保藏單位是：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地 址是：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0008] 本發(fā)明從黑龍江省大慶市郊某養(yǎng)殖場(chǎng)無菌采集病死鵝的肝臟、脾臟等組織中分離 出一株鵝副黏病毒。分離病毒能被ND陽性血清所抑制，HI效為2 8;不能被EDS 76陽性血清、 H5和H9禽流感陽性血清所抑制。分離毒株的EID5tl為10 81VO. lml，腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI) 為0. 16,雞胚平均致死時(shí)間（MDT)為114h，表明本發(fā)明分離的鵝副黏病毒毒株為低毒力病 毒。
[0009] 本發(fā)明將分離毒株接種在生長(zhǎng)良好的雞胚成纖維細(xì)胞（CEF)上，36h后開始出現(xiàn) 典型的細(xì)胞病變，病變初期表現(xiàn)為細(xì)胞聚縮，之后，合胞體數(shù)量逐漸增多、變大；60h時(shí)75% CEF出現(xiàn)細(xì)胞病變，細(xì)胞逐漸脫落，細(xì)胞之間的空白區(qū)逐漸增大，殘留的細(xì)胞呈拉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)70%時(shí)，測(cè)定細(xì)胞液的HA效價(jià)為1 : 512。表明，分離毒株具有CEF細(xì)胞適 應(yīng)株的特性。
[0010] 本發(fā)明將分離病毒進(jìn)行蝕斑純化，挑選中等大小的5個(gè)蝕斑進(jìn)行傳代純化，分離 得到5個(gè)病毒株，分別命名為DQOl株、DQ02株、DQ03株、DQ04株和DQ05株。分離到的5個(gè) 病毒株（DQ01?DQ05株）的HA及TCID5tl檢測(cè)結(jié)果表明，病毒DQ03株性能最優(yōu)，其對(duì)雞胚 成纖維細(xì)胞高度適應(yīng)，HA效價(jià)達(dá)1 :1024, TCID5tl達(dá)10 9_ 38TCID5tlA). lml，顯著高于其他分離毒 株。
[0011] 本發(fā)明分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株能夠應(yīng)用于制備預(yù)防鵝 副黏病毒病的疫苗。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種預(yù)防鵝副黏病毒病的疫苗組合物，包括：免疫有效量的 鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株和藥學(xué)上可接受的佐劑。
[0013] 本發(fā)明還公開了一種制備預(yù)防鵝副黏病毒滅活疫苗的方法，包括以下步驟：
[0014] (1)培養(yǎng)所述鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株，收集病毒液；（2)滅活病 毒液；（3)離心，取病毒上清液，與佐劑混合，乳化，即得。
[0015] 其中，步驟（1)所述培養(yǎng)是經(jīng)雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)或者經(jīng)SPF雞胚培養(yǎng)；優(yōu)選為， 經(jīng)雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。
[0016] 步驟（2)所述滅活是向病毒液中加入終濃度為0. 1 %甲醛溶液，37°C滅活24小時(shí)。
[0017] 步驟（3)所述離心是5000r/min離心30min ;所述病毒上清液與佐劑按照體積比 I :1. 5混合；所述佐劑優(yōu)選為進(jìn)口油佐劑。
[0018] 本發(fā)明所述方法制備得到的鵝副黏病毒滅活疫苗，能夠有效預(yù)防鵝副粘病毒。
[0019] 本發(fā)明將分離的鵝副黏病毒DQ01-DQ05株分別制備油乳劑滅活疫苗；經(jīng)雞胚成纖 維細(xì)胞培養(yǎng)，病毒液半成品的HA及TCID 5tl測(cè)定結(jié)果表明，DQ03株HA效價(jià)達(dá)1 :1024, TCID 5Q 達(dá)IO9 38TCID5tlA). lml，高于雞胚擴(kuò)增的原始病毒液及其他分離株。動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 表明，分離的鵝副粘病毒DQ03株免疫原性良好，免疫后不同時(shí)間抗體效價(jià)均高于其他實(shí)驗(yàn) 組，免疫后21天HI抗體效價(jià)達(dá)8. 51og2 ;與胚毒制備的疫苗相比，具有產(chǎn)生抗體效價(jià)高，并 且節(jié)約生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)。
[0020] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0021] 本發(fā)明分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞高度 適應(yīng)，適合細(xì)胞培養(yǎng)；免疫保護(hù)試驗(yàn)表明，分離的鵝副粘病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03 株免疫原性良好，與胚毒制備的疫苗相比，具有產(chǎn)生抗體效價(jià)高，并且節(jié)約生產(chǎn)成本、產(chǎn)品 質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
[0022] 本發(fā)明所渉及到的術(shù)語定義
[0023] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0024] 術(shù)語"分離的"意指所指代的材料從其天然環(huán)境中取出。因此，經(jīng)分離的生物材料 可以不含某些或所有細(xì)胞組分，即其中天然材料自然存在的細(xì)胞的組分（例如細(xì)胞質(zhì)或膜 組分）。如果材料存在于細(xì)胞提取物或上清液中，那么它是經(jīng)分離的。
[0025] 可互換使用的術(shù)語"疫苗"或"疫苗組合物"指這樣的藥物組合物，其包括在動(dòng)物 中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護(hù)動(dòng)物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強(qiáng)活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對(duì)于疫苗或疫苗組合物典型的進(jìn)一步組分，包括 例如佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在 經(jīng)修飾的活疫苗中作為經(jīng)減毒的生物體，或在經(jīng)殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時(shí)超 過一種上述組分。
[0026] 術(shù)語"佐劑"意指包括一種或多種物質(zhì)的組合物，所述物質(zhì)增強(qiáng)疫苗組合物的抗原 性。佐劑可以充當(dāng)緩慢釋放抗原的組織儲(chǔ)存，并且還充當(dāng)非特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答的淋巴樣 系統(tǒng)激活。通常，在不存在佐劑的情況下，用單獨(dú)抗原的初次疫苗接種將無法引發(fā)體液或細(xì) 胞免疫應(yīng)答。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、礦物質(zhì)凝膠例如氫氧化 鋁、表面活性物質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為分離毒在雞胚成纖維細(xì)胞中增殖；其中，A為細(xì)胞接毒前形態(tài)；B為細(xì)胞接 毒產(chǎn)生病變。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 實(shí)施例1鵝副黏病毒的分離和鑒定
[0030] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0031] 1.1病毒的分離
[0032] 病料來自黑龍江省大慶市郊某養(yǎng)殖場(chǎng)，無菌采集病死鵝的肝臟、脾臟等病料混合 剪碎并研磨，按I : 3(v/v)加入雙抗含量為2000IU/mL的滅菌PBS，置4°C冰箱作用4h， 4000r/min離心5min ;取上清經(jīng)尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚，0. 2mL/枚，置37°C孵育 120h ;棄去24h內(nèi)死亡雞胚，以后每天照蛋兩次，將死亡雞胚放置4°C冰箱保存4-24小時(shí)； 收取48h?120h死亡雞胚尿囊液及羊水,作為傳代毒種，-20°C保存。
[0033] 1.2病毒的鑒定
[0034] I. 2. 1 血凝試驗(yàn)（HA)
[0035] 取雞胚病毒液在96孔微量凝集板上用生理鹽水作倍比稀釋至212,同時(shí)設(shè)空白對(duì) 照及雞新城疫L系毒（購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）陽性對(duì)照，再加等體積1 %雞紅細(xì)胞后于 震蕩器上震蕩2?3min，置室溫25min后觀察結(jié)果。
[0036] 1. 2. 2血凝抑制試驗(yàn)（HI)
[0037] 取25 μ 1雞新城疫陽性血清、EDS76陽性血清、H5和H9禽流感陽性血清在96孔微 量凝集板上用生理鹽水作倍比稀釋至2 12,每孔加25 μ 1血凝價(jià)4個(gè)單位的分離毒，并設(shè)陽性 對(duì)照（雞新城疫陽性血清，每孔加25 μ 1血凝價(jià)4個(gè)單位的雞新城疫L系毒），同時(shí)設(shè)陰性 (陰性血清+雞新城疫L系毒）及空白對(duì)照，再加1 %雞紅細(xì)胞25 μ 1后于震蕩器震蕩2? 3min，置室溫25min后觀察結(jié)果。
[0038] 1. 2. 3雞胚血清病毒中和試驗(yàn)
[0039] 分別取收集的雞胚病毒液作10倍稀釋后與新城疫病毒陽性血清等量混合，感作 后，尿囊腔接種10日齡雞胚，每組5枚胚，0. Iml/胚，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組和空白對(duì)照組，觀察 雞胚死亡情況。
[0040] 1. 2. 4動(dòng)物回歸試驗(yàn)
[0041] 將雞胚病毒液肌肉注射15日齡的鵝、雞各5羽，每羽0. 5ml，同時(shí)分別設(shè)空白對(duì)照 組。嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，每天觀察試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病和死亡情況。
[0042] 1. 2. 5 病毒 EID5tl測(cè)定
[0043] 將分離病毒用滅菌生理鹽水作KT1?KT9稀釋，并設(shè)立空白對(duì)照組，每個(gè)稀釋度接 種5枚10日齡非免疫雞胚，棄24h死亡胚，于接種后120h4°C過夜凍死雞胚，收獲雞胚尿囊 液，測(cè)定其HA效價(jià)，并參考Reed-Muench方法計(jì)算出病毒EID 5Q。
[0044] 1. 2. 6腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI)的測(cè)定
[0045] 按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定的方法測(cè)定ICPI。取1日齡SPF 雛雞10只，各腦內(nèi)注射KT1稀釋的新鮮毒液50yL(接種針頭直徑0. 45mm，長(zhǎng)5mm);另取2 只1日齡SPF雛雞以同樣方法注射生理鹽水50 μ L。接種后，每天在相應(yīng)接種的時(shí)間觀察并 記錄雛雞的狀態(tài)，分正常（活動(dòng)靈活，行動(dòng)無共濟(jì)失調(diào)現(xiàn)象）、發(fā)病（包括麻痹、臥地不起，但 不包括只表現(xiàn)遲鈍的雞）和死亡，觀察8d，計(jì)算正常、發(fā)病、死亡雞的總數(shù)，根據(jù)不同的權(quán)值 (正常為〇、發(fā)病為1、死亡為2)累計(jì)總分?jǐn)?shù)。ICPI為累計(jì)總分除以正常、發(fā)病和死亡雞的 累計(jì)總數(shù)的平均值。
[0046] 1. 2. 7雞胚平均致死時(shí)間（MDT)的測(cè)定
[0047] 將病毒用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，自KT4?KTltl分別接種9?10日齡 SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，0. Iml/枚，剩余病毒液4°C保存，8h后再將每個(gè)稀釋度接種 另外5枚雞胚。接種雞胚于37°C孵化7天，每天早晚各觀察1次，記錄使所有雞胚死亡的最 高稀釋度致死雞胚的平均時(shí)間。OEI推薦的判定標(biāo)準(zhǔn)是MDT < 60h為強(qiáng)毒型；60?90h為 中等毒力型；90h以上為低毒力。
[0048] 1. 3分離毒在雞胚成纖維細(xì)胞中增殖
[0049] (1)在無菌條件下取9日齡雞胚，取出胚胎置于滅菌平皿中，除去頭、爪、翅、內(nèi)臟， 用Hanks液漂洗3次，去除血污，并剪成1?2mm 3大小的塊，加入Hank' s液充分沖洗，并 靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加 Hank' s液，如此反復(fù)沖洗3遍后，吸棄上 清液；于沉淀組織塊內(nèi)加入約4倍量的0. 25%胰酶溶液，振蕩混勻后置于37°C水浴中感作 5min，每隔Imin輕輕搖動(dòng)一次。
[0050] (2)消化完畢后立即小心吸棄上層胰酶溶液，沿瓶壁加入5?6mLDMEM輕洗2次； 之后加入20mL I XDMEM營(yíng)養(yǎng)液，用大口吸管吹打數(shù)十次，并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸 取上層液體，用6層紗布過濾；沉淀組織塊中再加20mL的I XDMEM營(yíng)養(yǎng)液，如此反復(fù)進(jìn)行3 遍。按每個(gè)雞胚80mL的量補(bǔ)加 DMEM營(yíng)養(yǎng)液。
[0051] (3)吸取細(xì)胞液用計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X106個(gè)/mL，以每孔 4mL的量加入到6孔培養(yǎng)板中，將其置入CO 2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)24h，將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中 已長(zhǎng)成單層的雞胚成纖維原代細(xì)胞中的營(yíng)養(yǎng)液吸棄，用Hanks液反復(fù)沖洗單層細(xì)胞3次；之 后，用不含血清的IXDMEM培養(yǎng)液將分離病毒尿囊液作IXlO 4倍稀釋，接種于單層細(xì)胞，每 孔接種量為500 μ L，置37°C感作lh，其間每隔20min輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板一次，使病毒與 細(xì)胞充分接觸、吸附；吸附完畢后吸出病毒液，每孔補(bǔ)加4mL含新生牛血清為2%的I XDMEM 營(yíng)養(yǎng)液，將其置〇)2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)；同時(shí)，設(shè)空白對(duì)照孔；每日觀察記錄CPE情況，當(dāng)細(xì) 胞病變達(dá)70 %時(shí)，經(jīng)3次凍融后收毒，分裝于玻璃瓶?jī)?nèi)，留樣檢測(cè)HA ;按照上述方法，將分離 到的鵝副粘病毒在雞胚成纖維細(xì)胞上連續(xù)傳8-10代，直至分離毒在雞胚成纖維細(xì)胞上增 殖良好。
[0052] 1. 4分離毒蝕斑純化
[0053] (1)按照雞胚成纖維原代細(xì)胞培養(yǎng)所敘述的方法，制備雞胚成纖維原代細(xì)胞并接 毒，接毒后置37°C感作lh，其間每隔20min輕輕晃動(dòng)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板一次，使病毒與細(xì)胞充 分接觸、吸附；吸附完畢后，吸出病毒液，鋪一層不含中性紅的營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖，厚度約2mm，待 瓊脂糖凝固后倒置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0054] (2)有細(xì)胞病變出現(xiàn)時(shí)滴加100 μ L含量為1/10000的中性紅溶液，倒置于37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)并觀察出斑情況。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)板上出現(xiàn)清晰可見的蝕斑時(shí)， 即可進(jìn)行挑斑。選擇蝕斑間間距明顯的培養(yǎng)孔，從中挑取具有代表性的優(yōu)勢(shì)蝕斑，用200 μ L 去尖吸頭吸取選定的蝕斑后連同瓊脂糖一起放入500 μ L不含血清的I XDMEM培養(yǎng)液中。 將含有蝕斑及瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)液反復(fù)凍融三次，使病毒充分釋放；之后再按上述方法將 其做連續(xù)的10倍稀釋（一般為IO 1?1〇4)后接種雞胚成纖維原代單層細(xì)胞，按上述方法挑 斑。
[0055] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0056] 2. 1病毒分離結(jié)果
[0057] SPF雞胚尿囊腔接種，雞胚在48?120h死亡；致死胚體充血，尿囊膜水腫出血。
[0058] 2. 2血凝、血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果
[0059] 尿囊液的HA效價(jià)為1 : 128,隨著代次增加，HA效價(jià)增大，最高達(dá)1 : 512。
[0060] 分離病毒能被ND陽性血清所抑制，HI效為28, HI試驗(yàn)呈陽性；不能被EDS76陽性 血清、H5和H9禽流感陽性血清所抑制，HI試驗(yàn)呈陰性。
[0061] 2. 3病毒中和試驗(yàn)結(jié)果
[0062] 試驗(yàn)組雞胚IOd后全部存活，而對(duì)照組雞胚在48?120h全部死亡。
[0063] 2. 4動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果
[0064] 接種病毒分離物的鵝、雞均于第2d開始發(fā)病。病禽精神萎頓，食欲與飲水減少直 至廢絕。病程2?3d，至接種后第6d全部死亡。對(duì)照組均未受影響。
[0065] 病死鵝的臨診癥狀和剖檢病變與自然感染相似，接種后5d左右死亡，剖檢腸道可 見散在性淡黃色痂塊，易剝離，剝離后見潰瘍面，胰腺有灰白色壞死灶，腺胃及肌胃粘膜充 血、出血。病死雞的臨診癥狀和剖檢病變與雞新城疫非常相似。
[0066] 2. 5EID5(^UlJ定結(jié)果
[0067] 用 Reed 和 Muench 法計(jì)算毒株 EID5tl，得出分離毒株 EID5tl= 10 81V〇. 1ml。
[0068] 2. 6腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI)及（MDT)的測(cè)定結(jié)果
[0069] ICPI = 13/80 = 0. 16 ;雞胚平均致死時(shí)間（MDT)為114h，確定分離的毒株為低毒 力病毒。
[0070] 2. 7分離毒在雞胚成纖維細(xì)胞中增殖結(jié)果
[0071] 將分離株接種在生長(zhǎng)良好的CEF上，36h后開始出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，病變初期表 現(xiàn)為細(xì)胞聚縮，之后，合胞體數(shù)量逐漸增多、變大；60h時(shí)75% CEF出現(xiàn)細(xì)胞病變，細(xì)胞逐漸 脫落，細(xì)胞之間的空白區(qū)逐漸增大，殘留的細(xì)胞呈拉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖1);當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)70% 時(shí)，收集細(xì)胞連同細(xì)胞液反復(fù)凍融三次，測(cè)定細(xì)胞液的HA效價(jià)為1 : 512。結(jié)果表明，分離 株具有CEF細(xì)胞適應(yīng)株的特性。
[0072] 2. 8分離毒蝕斑純化結(jié)果
[0073] 分離株滴加中性紅5?8h后形成無色、透明、清亮的圓形蝕斑；鏡檢發(fā)現(xiàn)蝕斑中 心為圓縮成葡聚團(tuán)狀的不著色的死細(xì)胞，周圍被吞噬大量中性紅顆粒的正常細(xì)胞所包圍。 挑選中等大小的5個(gè)蝕斑進(jìn)行傳代純化，將分離到的5個(gè)病毒株（DQ01-DQ05)蝕斑克隆作 5 X IO3倍稀釋，接種雞胚成纖維細(xì)胞后置37°C孵育72h ;當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)70%時(shí)，經(jīng)3次凍融 后收毒，并進(jìn)行雜菌檢驗(yàn)。同時(shí)，測(cè)定其血凝價(jià)（HA)及TCID5Q。
[0074] 分離到的5個(gè)病毒株DQOl?DQ05株HA及TCID5tl檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0075] 表IDQO1?DQ05株HA及TCID5tl檢測(cè)結(jié)果
[0076]

【權(quán)利要求】
1. 一株分離的鵝副黏病毒（Goose paramyxovirus)雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株，其 特征在于，其微生物保藏編號(hào)是：CGMCC No. 9901。
2. 權(quán)利要求1所述的鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株在制備預(yù)防鵝副黏病 毒病的疫苗中的用途。
3. -種預(yù)防鵝副黏病毒病的疫苗組合物，其特征在于，包括：免疫有效量的權(quán)利要求1 所述鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株和藥學(xué)上可接受的佐劑。
4. 一種制備預(yù)防鵝副黏病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)培養(yǎng)權(quán)利要求1所述鵝副黏病毒雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)株DQ03株，收集病毒液；（2) 滅活病毒液；（3)離心，取病毒上清液，與佐劑混合，乳化，即得。
5. 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（1)所述培養(yǎng)是經(jīng)雞胚成纖維細(xì)胞 培養(yǎng)或者經(jīng)SPF雞胚培養(yǎng)；優(yōu)選為，經(jīng)雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。
6. 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（2)所述滅活是向病毒液中加入終 濃度為〇. 1%甲醛溶液，37°C滅活24小時(shí)。
7. 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（3)所述離心是5000r/min離心 30min〇
8. 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（3)所述病毒上清液與佐劑按照體 積比1 :1. 5混合；所述佐劑優(yōu)選為進(jìn)口油佐劑。
9. 由權(quán)利要求4至8任何一項(xiàng)所述方法制備得到的鵝副黏病毒滅活疫苗。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK104498440SQ201410707310
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】孫德君, 丁國(guó)杰, 楊萬秋, 梁宛楠, 李來旭, 宋揚(yáng), 藏玉婷, 劉鑫瑩, 張智明, 李鑫, 竇海艷 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司