一種驢皮成纖維細胞體外快速培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及驢皮成纖維細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種驢皮成纖維細胞體外快速培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]阿膠為我國藥、食兩用傳統(tǒng)中藥材，系補血之上品，與人參、鹿茸并稱為“滋補三寶”，享譽國內(nèi)外市場。而馬科動物驢的皮是生產(chǎn)阿膠的唯一原料。驢皮中的主要蛋白質(zhì)是I型膠原蛋白，它和血清白蛋白等多肽類物質(zhì)、多糖類物質(zhì)及其它小分子物質(zhì)構(gòu)成了阿膠的主要成分。但近年來由于毛驢作為畜力的角色逐漸被機械取代，加上毛驢養(yǎng)殖周期長、收益慢，使我國毛驢存欄量迅速下降，因而使得市場對驢皮需求產(chǎn)生巨大缺口，已成為制約阿膠業(yè)發(fā)展的一大瓶頸。
[0003]針對這一問題，一方面國家制定了相應(yīng)的策略，鼓勵并擴大了驢的養(yǎng)殖。另一方面，結(jié)合現(xiàn)代生物學(xué)的知識，來提高驢皮的利用率和開發(fā)新的阿膠生產(chǎn)途徑也是科研上急需跟進解決的問題。這首先需要解決的問題就是要在體外高效快速的培養(yǎng)起驢皮成纖維細胞，以便進一步研宄驢皮成纖維細胞合成I型膠原蛋白的調(diào)控機理。
[0004]細胞培養(yǎng)方法主要有兩種:組織塊法及酶消化法。酶消化法是培養(yǎng)上皮細胞的常用方法，但消化液的用量、消化溫度及時間不好掌握，可能導(dǎo)致細胞極易老化、凋亡等結(jié)果，消化時間較長，細胞容易受損，解決辦法是分次收集細胞，從而使實驗比較繁瑣。組織塊法培養(yǎng)細胞時，有的組織塊經(jīng)長時間培養(yǎng)僅得到較少的細胞，有的甚至無細胞爬出，達不到所需細胞量。目前未見專門關(guān)于驢皮成纖維細胞體外培養(yǎng)的報道，而同為馬屬動物的馬皮成纖維細胞的體外培養(yǎng)方法依舊采用的是傳統(tǒng)的組織貼壁法。即剪取一塊皮膚組織，75%酒精浸泡I分鐘左右，再用含雙抗的DPBS沖洗3遍，剔除皮膚間結(jié)締組織后，將皮膚組織剪成Icm3左右的小塊，然后將其均勻分布在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶倒置后加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37.5°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4-6h后，正置培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液緩慢浸沒組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。或是將組織塊直接貼于培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶中，隨后用含有10 % FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37.5°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在經(jīng)歷至少4-6天，甚至是18天之后，馬的皮膚成纖維細胞才能被傳代，進而建立起穩(wěn)定的細胞株，培養(yǎng)時間長，效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種驢皮成纖維細胞體外快速培養(yǎng)的方法，利用胰蛋白酶和膠原蛋白酶I先后消化作用于驢皮的組織塊，使相應(yīng)的驢皮成纖維細胞被分離出來，進而高效快速地建立起驢皮成纖維細胞體外培養(yǎng)體系。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:一種驢皮成纖維細胞體外快速培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
[0007]A.取一塊驢皮組織，放入75%酒精消毒漂洗后，用含100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DPBS沖洗至少3次；
[0008]B.將驢皮組織取出并用滅菌后的手術(shù)刀片將其表皮和皮下結(jié)締組織剔除干凈，再用滅菌后的手術(shù)剪刀將其剪成肉糜狀組織塊；
[0009]C.將肉糜狀組織塊放入經(jīng)滅菌的圓底玻璃瓶中，加入0.25%胰蛋白酶在37°C溫度下孵育Ih后，再加入0.5%的膠原蛋白酶I在37°C溫度下處理6h，可見肉糜狀組織塊大部分都已經(jīng)消失，顯微鏡下可觀察到懸浮離散的細胞以及一些毛發(fā)和少許游離組織塊，再用0.45 μ m過濾器過濾后可得較為純凈的驢皮成纖維細胞的懸浮液；
[0010]D.將懸浮液離心處理，棄去上清，加培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，再加Iml培養(yǎng)液，在37°C、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，將含有大部分上皮細胞的培養(yǎng)液棄去，重新加入培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)；
[0011]E.2-3天后，待細胞長滿即可消化傳代，至此，穩(wěn)定的驢皮成纖維細胞體外培養(yǎng)體系建成。
[0012]作為對本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述步驟D中的懸浮液的離心處理采用1000r/min，離心處理4min。
[0013]作為對本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述步驟D中的培養(yǎng)液包括DMEM及10% FBS。
[0014]作為對本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述步驟C中的圓底玻璃瓶采用上小下大的結(jié)構(gòu)。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果是:克服了驢皮成纖維細胞因驢皮中含有大量膠原蛋白而不便被體外培養(yǎng)的難題，且僅需三天左右便可建立穩(wěn)定的驢皮成纖維細胞體外培養(yǎng)體系，時間短，效率高。
【具體實施方式】
[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0017]一種驢皮成纖維細胞體外快速培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
[0018]A.用剃毛刀將驢身上一小片區(qū)域的毛發(fā)剔除干凈，利用消毒后的取皮器取下約Icm3的驢皮組織，迅速放入事先加入含有100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DPBS中，帶回實驗室；用滅菌的鑷子將驢皮組織取出，放入75%酒精中漂洗lmin，隨后再放入含有100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DPBS中沖洗三次以上；
[0019]B.將驢皮組織取出并用滅菌后的手術(shù)刀片將其表皮和皮下結(jié)締組織剔除干凈，再用滅菌后的手術(shù)剪刀將其剪成肉糜狀組織塊；
[0020]C.將肉糜狀組織塊放入經(jīng)滅菌的圓底玻璃瓶中，其中圓底玻璃瓶的選擇原則為采用上小下大的結(jié)構(gòu)，加入2ml,0.25%胰蛋白酶在37°C水浴鍋或者培養(yǎng)箱中孵育Ih后，再加入21111、0.5%的膠原蛋白酶1在37°0溫度下處理611，可見肉糜狀組織塊大部分都已經(jīng)消失，顯微鏡下可觀察到懸浮離散的細胞以及一些毛發(fā)和少許游離組織塊，再用0.45 μ m過濾器過濾后可得較為純凈的驢皮成纖維細胞的懸浮液；
[0021]D.將懸浮液利用1000r/min離心處理4min，棄去上清，加含DMEM及10% FBS的培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，再加Iml培養(yǎng)液，在37°C、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，將含有大部分上皮細胞的培養(yǎng)液棄去，重新加入培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)；
[0022]E.2-3天后，待細胞長滿即可消化傳代，至此，穩(wěn)定的驢皮成纖維細胞體外培養(yǎng)體系建成。
[0023]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種驢皮成纖維細胞體外快速培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括以下步驟: A.取一塊驢皮組織，放入75%酒精消毒漂洗后，用含100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DPBS沖洗至少3次； B.將驢皮組織取出并用滅菌后的手術(shù)刀片將其表皮和皮下結(jié)締組織剔除干凈，再用滅菌后的手術(shù)剪刀將其剪成肉糜狀組織塊； C.將肉糜狀組織塊放入經(jīng)滅菌的圓底玻璃瓶中，加入0.25 %胰蛋白酶在370C溫度下孵育Ih后，再加入0.5%的膠原蛋白酶I在37°C溫度下處理6h，可見肉糜狀組織塊大部分都已經(jīng)消失，顯微鏡下可觀察到懸浮離散的細胞以及一些毛發(fā)和少許游離組織塊，再用0.45 μ m過濾器過濾后可得較為純凈的驢皮成纖維細胞的懸浮液； D.將懸浮液離心處理，棄去上清，加培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，再加Iml培養(yǎng)液，在37°C、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，將含有大部分上皮細胞的培養(yǎng)液棄去，重新加入培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)； E.2-3天后，待細胞長滿即可消化傳代，至此，穩(wěn)定的驢皮成纖維細胞體外培養(yǎng)體系建成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的驢皮成纖維細胞體外快速培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述步驟D中的懸浮液的離心處理采用1000r/min，離心處理4min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的驢皮成纖維細胞體外快速培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述步驟D中的培養(yǎng)液包括DMEM及10 % FBSo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的驢皮成纖維細胞體外快速培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述步驟C中的圓底玻璃瓶采用上小下大的結(jié)構(gòu)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及驢皮成纖維細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種驢皮成纖維細胞體外快速培養(yǎng)的方法。該方法利用胰蛋白酶和膠原蛋白酶I先后消化作用于驢皮的組織塊，使相應(yīng)的驢皮成纖維細胞被分離出來，進而高效快速地建立起驢皮成纖維細胞體外培養(yǎng)體系。本發(fā)明克服了驢皮成纖維細胞由于驢皮中含有大量膠原蛋白而不便被體外培養(yǎng)的難題，且僅需三天左右便可建立穩(wěn)定的驢皮成纖維細胞體外培養(yǎng)體系，時間短，效率高。
【IPC分類】C12N5-071
【公開號】CN104830750
【申請?zhí)枴緾N201510234370
【發(fā)明人】曾維斌, 王艷萍, 高帥, 王惠娥, 馬國海, 王莉
【申請人】塔里木大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月5日