單增李斯特菌 lamp-lfd檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種單增李斯特菌快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。所述技術(shù)可用于單增李斯特菌型的檢測(cè)。其特征是：試劑盒中含有LAMP特異性引物組SEQ ID NO：1-4和1個(gè)特異性探針SEQ ID NO：5，該技術(shù)將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與橫向流膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，能夠肉眼直觀的判定檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、方便、高效、特異、靈敏的特點(diǎn)，適用于進(jìn)出口檢疫、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)等的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，對(duì)于保障食品安全具有重要意義。
【專利說明】單增李斯特菌LAMP-LFD檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物衛(wèi)生和食品檢驗(yàn)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于檢測(cè)單增李斯特菌菌株 的LAMP-LFD試劑盒及其檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM)，簡(jiǎn)稱單增李斯特菌， 是一種重要的人畜共患病的病原菌。該菌屬兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性菌，其PH值生長(zhǎng)范圍為 4. 39?9. 40,在4°C條件下可生長(zhǎng)繁殖，因此對(duì)冷藏食品的危害性很大。單增李斯特菌廣泛 存在于各種環(huán)境中，極易污染各類食品，據(jù)統(tǒng)計(jì)，單增李斯特菌主要是通過污染乳制品生奶 和軟奶酪、畜禽產(chǎn)品、生熟肉制品、蔬菜等，引起食源性李斯特菌病，病死率高達(dá)30%。近幾年 來(lái)，因食品污染單增李斯特菌導(dǎo)致的食物中毒事件日漸增多，已引起不少國(guó)家的廣泛關(guān)注。 1986年WHO將其列為食品四大致病菌之一，并于2000年在WHO食品安全工作計(jì)劃中，將該 菌列為重點(diǎn)檢測(cè)的食源性致病菌之一。及時(shí)有效地控制食品中單增李斯特菌的污染，是當(dāng) 今食品安全的重要課題之一。因此建立一種快速、準(zhǔn)確而又適用于臨床的檢測(cè)方法對(duì)于有 效診斷單增李斯特菌感染，監(jiān)測(cè)食品污染具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 對(duì)于突發(fā)性傳染病，快速檢測(cè)和鑒定病原體是控制疫情的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的單增李斯 特菌診斷主要通過病原分離與生化鑒定完成，但其存在細(xì)菌培養(yǎng)操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，不易鑒 別相近物種或亞型等缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，以hlyA基因、ini基因 、iap 基因等為靶標(biāo)建立的PCR或?qū)崟r(shí)定量熒光PCR技術(shù)已成功應(yīng)用于單增李斯特菌的實(shí)驗(yàn)室診 斷，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和速度快等優(yōu)點(diǎn)，但該方法必須配備昂貴的儀器設(shè)備，需專門 的操作人員，在適應(yīng)性上有一定的缺陷。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是Notomi等于2000年建立 的，該技術(shù)通過針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase)在等溫65°C左右，幾十分鐘，即可實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增。該方法僅 需要簡(jiǎn)單的水浴鍋或加熱器，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)快速，適合于基層及現(xiàn)場(chǎng) 使用。
[0004] 2008年Kiatpathomchai首次將橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié) 合（LAMP-LFD)，用于 LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)（Kiatpathomchai et al·，2008)。目前，該方 法已被成功用于嗜鹽弧菌、人的非洲錐蟲病、副溶血霍亂弧菌、桃拉病毒、傳染性肌肉壞死 病毒、對(duì)蝦白斑癥病毒等病原的檢測(cè)。在橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)檢測(cè)反應(yīng)中FITC標(biāo)記的探針 與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，并與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體結(jié)合形成三 元復(fù)合物，并結(jié)合在橫向流動(dòng)試紙條具有生物素抗體的檢測(cè)線上；未雜交的FITC標(biāo)記探針 與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體形成不含生物素的兩元復(fù)合物，通過檢測(cè)線，結(jié)合在控制線 上。這樣可以通過檢測(cè)帶是否顯色判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)。該檢測(cè)方法依賴于序列之間的 特異性擴(kuò)增，避免了瓊脂糖凝膠電泳或熒光染料染色肉眼觀察由非特異性擴(kuò)增造成的假陽(yáng) 性，進(jìn)一步提高了反應(yīng)的特異性和靈敏度。并且不需要電泳裝置和凝膠成像系統(tǒng)，無(wú)需EB 等有毒試劑，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果可肉眼觀察。因此，LAMP-LFD方法安全、快速、高效且無(wú)設(shè)備 及技術(shù)限制，具有其他技術(shù)無(wú)法替代的優(yōu)勢(shì)。
[0005] 本專利將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP))與橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)（LFD)相結(jié)合，針 對(duì)單增李斯特菌重要的毒力因子A基因設(shè)計(jì)一套引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立單增 李斯特菌LAMP-LFD檢測(cè)技術(shù)。本試劑盒操作簡(jiǎn)便，作為單增李斯特菌的初篩工具，尤其適 用于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)，為單增李斯特菌的疫情監(jiān)控和快速檢測(cè)提供了新的發(fā)展方向。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種用于檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP特異性引物組和 1個(gè)特異性探針，它包括： LM-F3 GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA SEQ ID NO ： 1 LM-B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA SEQ ID NO ：2 LM-FIP ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG SEQ ID NO ：3 LM-BIP TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC SEQ ID NO ：4 LM-HP GTTTACGCTAAAGAATGC SEQ ID NO ：5 其中 LM-F3 0· 5 μ L ;LM -B3 0· 5 μ L ;LM -FIP 0· 5 μ L ;LM -BIP 0· 5 μ L ;LM-HP 為 20pmol ;所述LM-FIP引物的5'端標(biāo)記生物素，LM-HP探針的5'端標(biāo)記有異硫氰酸熒光素。
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了采用用于檢測(cè)單增李斯特菌LAMP-LFD特異性引物組和1個(gè) 特異性探針制成的檢測(cè)試劑盒，其特征在于它的組成如下： (1) LAMP反應(yīng)液： LAMP 反應(yīng)液中含有：2 XBuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L ;LM-F3 0. 5 μ L ；LM -B3 0. 5 μ L ； LM -FIP 0· 5 μ L ;LM -BIP 0· 5 μ L ; dNTPs 3· 5 μ L (2) 超純水 (3) Bst 酶（8υ/μ L) (4) 01-即探針2(^111〇1 (5) 橫向流動(dòng)試紙條 (6) 用于檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP特異性引物和1個(gè)特異性探針；其中的引物和探針 指的是： LM-F3 GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA SEQ ID NO ： 1 LM-B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA SEQ ID NO ：2 LM-FIP ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG SEQ ID NO ：3 LM-BIP TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC SEQ ID NO ：4 LM-HP GTTTACGCTAAAGAATGC SEQ ID NO ：5 其中LM-FIP和LM-HP分別標(biāo)記有生物素和異硫氰酸熒光素。
[0008] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開了采用此試劑盒，用于檢測(cè)食源性單增李斯特菌的LAMP-LFD 方法，其特征在于，按如下的步驟進(jìn)行： (1) LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2 XBuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L ;LM-F3 0. 5 μ L ；LM -B3 0· 5 μ L ;LM-FIP 0· 5 μ L ;LM-BIP 0· 5 μ L ; dNTPs 3· 5 μ L ;8U/ μ L Bst 酶 1 μ L ;力口入樣品 DNA模板1至5 μ L ;用超純水補(bǔ)充至終體積25 μ L (2) 擴(kuò)增反應(yīng)過程：63 °C進(jìn)行60min。
[0009] (3)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后不經(jīng)過終止反應(yīng)，而在反應(yīng)體系中加入20pmol的探針LM-HP， 63°C雜交5min。雜交結(jié)束后，從反應(yīng)液中取8μ?雜交液加入到10〇μ? Buffer中混勻，將 LFD試紙條浸入其中，反應(yīng)約5分鐘讀取檢測(cè)結(jié)果。
[0010] (4)結(jié)果判定：試紙條的質(zhì)控線和檢測(cè)線均出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則 說明樣品中含有單增李斯特菌；試紙條只有質(zhì)控線出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測(cè)結(jié)果為陰性；如 只有檢測(cè)線出現(xiàn)條帶或不出現(xiàn)任何條帶，則檢測(cè)結(jié)果為無(wú)效。
[0011] 本發(fā)明同時(shí)也公開了用于檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP特異性引物組在制備用于檢 測(cè)單增李斯特菌LAMP-LFD試劑盒中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用本發(fā)明所公開的單增李 斯特菌的LAMP特異性引物組制備的試劑盒在檢測(cè)單增李斯特菌LAMP-LFD方面具有良好 的積極效果。
[0012] 本發(fā)明公開的用于檢測(cè)單增李斯特菌的試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效 果在于： (1)本發(fā)明采用的LAMP技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、快速、敏感等特點(diǎn)，其敏感性可達(dá)到1至 l〇pg，比常規(guī)PCR高10倍以上；而且檢測(cè)過程只需恒溫水浴鍋即可完成，不需要PCR儀等昂 貴的設(shè)備，更適合于基層推廣應(yīng)用。此外，本發(fā)明將LAMP技術(shù)與橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)相結(jié) 合，可以通過肉眼直接觀察和判定結(jié)果，僅需5-10min，比PCR方法(瓊脂糖凝膠電泳）縮短 15-20min，且避免了電泳染料對(duì)環(huán)境的污染，使檢測(cè)更為便捷、環(huán)保。
[0013] (2)基于LAMP-LFD方法的敏感、特異，成本低廉，便于操作等諸多優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明在 一定程度上提高了我國(guó)單增李斯特菌菌株的檢測(cè)能力，為單增李斯特菌疾病的臨床實(shí)時(shí)快 速診斷、動(dòng)物和食品的出入境檢驗(yàn)檢疫中該菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)提供了新技術(shù)來(lái)源，對(duì)提高 我國(guó)檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)單增李斯特菌的疫情監(jiān)控和快速檢測(cè)水平，以及普及先進(jìn)技術(shù)在基層檢 驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)的推廣應(yīng)用均具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為L(zhǎng)AMP-LFD試驗(yàn)圖；自左向右，依次為1 :單增李斯特菌；2 :空白對(duì)照； 圖2為食品樣品的單增李斯特菌LAMP-LFD試驗(yàn)圖；自左向右，依次為1-9 =IOtlUO' 1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇- 6、1〇-7、1〇_8稀釋；1〇:陰性對(duì)照 ； 圖3為L(zhǎng)AMP-LFD特異性試驗(yàn)圖；自左向右，依次為1 :空白；2 :單增李斯特菌；3 :金黃 色葡萄球菌；4 :沙門氏菌；5 :志賀氏菌；6 :副溶血性弧菌；7 :大腸埃希氏菌0157 ;8 :空腸 彎曲桿囷；9 :布魯氏桿囷。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了更充分地解釋本發(fā)明的實(shí)施方法，提供了用于檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP-LFD 引物組和1個(gè)特異性探針的實(shí)施實(shí)例。這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范 圍。其中所用的試劑原料均有市售。本發(fā)明所述的單增李斯特菌引物組和探針序列見表1。
[0016] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP特異性引物組，其特征在于它是由下述引物組 成： LM-F3 GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA SEQ ID NO ： 1 LM-B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA SEQ ID NO ：2 LM-FIP ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG SEQ ID NO ：3 LM-BIP TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC SEQ ID NO :4 ;其中LM-FIP的5'端標(biāo)記生物素。
2. -種用于檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性探針，其特征在于它是由下 述基因組成：LM-HP GTTTACGCTAAAGAATGC SEQ ID NO :5 ;所述的 LM-HP 的 5' 端標(biāo)記 有異硫氰酸熒光素。
3. -種含有權(quán)利要求1、2所述用于檢測(cè)單增李斯特菌LAMP-LFD特異性引物組和1個(gè) 特異性探針的檢測(cè)試劑盒，其特征在于它的組成如下： (1) LAMP反應(yīng)液： LAMP 反應(yīng)液中含有：2XBuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L ;LM-F3 0. 5 μ L ； LM-B3 0. 5 μ L ； LM-FIP 0· 5 μ L ;LM-BIP 0· 5 μ L ;dNTPs 3· 5 μ L 超純水 Bst 酶（8U/y L) (4) 01-即探針2(^111〇1 (5) 橫向流動(dòng)試紙條 (6) 用于檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP特異性引物和1個(gè)特異性探針；其中的引物和探針 指的是： LM-F3 GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA SEQ ID NO ： 1 LM-B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA SEQ ID NO ：2 LM-FIP ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG SEQ ID NO ：3 LM-BIP TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC SEQ ID NO ：4 LM-HP GTTTACGCTAAAGAATGC SEQ ID NO :5 ;所述的LM-FIP引物和LM-HP探針分 別標(biāo)記有生物素和異硫氰酸熒光素。
4. 一種采用權(quán)利要求2所述試劑盒用于檢測(cè)食源性單增李斯特菌的LAMP-LFD方法，其 特征在于，按如下的步驟進(jìn)行： (1) LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2 XBuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L ;LM-F3 0. 5 μ L ； LM-B3 0· 5 μ L ;LM-FIP 0· 5 μ L ;LM-BIP 0· 5 μ L ; dNTPs 3· 5 μ L ;8U/ μ L Bst 酶 1 μ L ;力口入樣品 DNA模板1至5 μ L ;用超純水補(bǔ)充至終體積25 μ L (2) 擴(kuò)增反應(yīng)過程：63 °C進(jìn)行60min; (3) 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后不經(jīng)過終止反應(yīng)，而在反應(yīng)體系中加入20pmol的探針LM-HP，63°C 雜交5min ;雜交結(jié)束后，從反應(yīng)液中取8μ?雜交液加入到10〇μ? Buffer中混勻，將LFD試 紙條浸入其中，反應(yīng)約5分鐘讀取檢測(cè)結(jié)果； (4)結(jié)果判定：試紙條的質(zhì)控線和檢測(cè)線均出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則說明 樣品中含有單增李斯特菌；試紙條只有質(zhì)控線出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測(cè)結(jié)果為陰性；如只有 檢測(cè)線出現(xiàn)條帶或不出現(xiàn)任何條帶，則檢測(cè)結(jié)果為無(wú)效。
5.權(quán)利要求1、2所述用于檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP特異性引物組和1個(gè)特異性探針 在制備用于檢測(cè)單增李斯特菌LAMP-LFD試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104263838SQ201410537396
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】李秀梅, 郭戀, 李穎, 梁智選, 石瑜, 朱雅寧, 袁雪濤, 張立新, 王健春, 楊愛華, 尹春博, 王虹, 趙靜 申請(qǐng)人:天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心