一種新的轉(zhuǎn)基因玉米品系mir604檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明通過巧妙地設(shè)計針對轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604的帶標記的特異性引物和競爭性引物，應(yīng)用PCR擴增和試紙條聯(lián)合檢測技術(shù)，實現(xiàn)了MIR604的高效快速檢測。該方法特異性強，靈敏度高和穩(wěn)定性好，使用方便快捷，節(jié)約成本和時間，原理和操作簡單，不需特殊儀器，適合檢驗檢疫部門運用和推廣。
【專利說明】-種新的轉(zhuǎn)基因玉米品系MlR604檢測試劑盒及其檢測方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測領(lǐng)域，提供了一種利用PCR擴增和核酸試紙條聯(lián)合 檢測技術(shù)快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604的方法及其試劑盒，適用于口岸檢驗檢疫機構(gòu) 應(yīng)用對轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604的檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 伴隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物種類越來越多，種植面積也逐年遞增， 轉(zhuǎn)基因涉及的作物種類繁多，包括大豆、玉米、小麥、棉花、番茄、馬鈴薯等，而每個轉(zhuǎn)基因品 系都有獨特的基因組插入位置及邊界序列，目前我國對進口轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)品采取審批制 度，未經(jīng)允許的玉米品系禁止進入我國，建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系鑒定方法有實際的需求。
[0003] 由于普通PCR方法的凝膠成像檢測、實時熒光PCR檢測方法都需要價格高昂的專 用檢測設(shè)備，昂貴的儀器設(shè)備成本限制了 PCR檢測方法的推廣。
[0004] 本發(fā)明本研究通過巧妙地設(shè)計針對轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604的帶標記的特異性 引物和競爭性引物，應(yīng)用PCR擴增和核酸試紙條聯(lián)合檢測技術(shù)，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因玉米品系 MIR604的高效快速檢測。該方法特異性強，靈敏度高和穩(wěn)定性好，對于提高MIR604品系的 準確性、縮短檢測時間具有重要的作用。該檢測方法方便快捷，節(jié)約成本和時間，原理和操 作簡單，不需特殊儀器，適合檢驗檢疫部門運用和推廣，同時對其他玉米品系的快速檢測也 具有重要的借鑒意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供用于檢測MIR604的特異性引物和競爭性引 物。
[0006] 本發(fā)明需要解決的另一問題是提供包含上述引物的PCR檢測試劑盒。
[0007] 本發(fā)明用于檢測MIR604的PCR引物序列為： 上游引物 604-F-bio : 5' biotin - TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT -3' 下游引物 604-B-fit : 5'fitc一TATTATAATCCGAAACGGAGCA- 3' 競爭引物 604-F-comp: 5' 一GGCCTTAATAACACATTGCGGA-3'。
[0008] 本發(fā)明的MIR604檢測試劑盒，包括以下成分： (1) MIR604DNA模板和陰性對照擬MIR604 DNA模板 (2) MIR604上下游引物和競爭引物 上游引物 604-F-bio : 5' biotin - TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT -3' 下游引物 604-B-fit : 5'fitc一TATTATAATCCGAAACGGAGCA- 3' 競爭引物 604-F-comp: 5' 一GGCCTTAATAACACATTGCGGA-3'。
[0009] (3) lOXExTaq PCR Buffer，DDH20, 2. 5mM dNTP，5υ/μ 1 ExTaq 酶 用上述方法對待測樣品DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用試紙條檢測，若控制線正常，檢 測線呈現(xiàn)陽性，則說明該樣品含有MIR604,若呈現(xiàn)陰性，則說明該樣品中不含有MIR604。 [0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進步在于：使用儀器簡單，無需瓊脂糖凝膠電泳、紫外 凝膠成像，從而避免了溴化乙錠的污染，節(jié)省時間，特異性強，靈敏度高，穩(wěn)定性好，降低了 實驗室的投入，適合基層實驗室推廣使用。
[0011]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1為轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604試紙條特異性檢測結(jié)果，1為M0N810, 2為M0N863、3為 TC1507、4 為 ES3272、5 為 GA21、6 為 59122、7 為 MIR604、8 為 BT11、9 為 BT176、10 為 NK603、 11為非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA、12為DDH20,從圖1可以看出使用本試劑盒能準確地檢測出 轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604。
[0012]

【具體實施方式】
[0013] MIR604 引物設(shè)計： 1 TCCGCAATGT GTTATTAAGA GTTGGTGGTA CGGGTACTTT AACTAACGAG GTGTGTCGCG 61 CAGCGCTCCT GCACGGATGT AGCTTTGGAT TGCTGGATAA TGTCTCGCGC AAGCGTCGTA 121 TTTATTTATT TATTTATTAC AGCCTCCACC GCCGTGCGTG CTCCGTTTCG GATTATAATA 根據(jù)轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的重組DNA序列，利用引物設(shè)計軟件設(shè)計兩組引物、探針(下 劃線位置)，上游引物5'標記生物素（biotin)，下游引物5'標記熒光素（fitc)，以及上游引 物競爭引物。
[0014] 上游引物 604-F-bio : 5' biotin -TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT-3' 下游引物 604-B-fit : 5'fitc一TATTATAATCCGAAACGGAGCA- 3' 競爭引物 604-F-comp: 5' 一GGCCTTAATAACACATTGCGGA-3'。
[0015] 本實驗測試了 10種轉(zhuǎn)基因玉米品系及一種非轉(zhuǎn)基因玉米，見下表：

【權(quán)利要求】
1. 一種用于轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604檢測的特異性引物和競爭性引物，其特征在于，序 列為： 上游引物 604-F-bio : 5' Biotin - TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT -3' 下游引物 604-B-fit : 5' Fite - TATTATAATCCGAAACGGAGCA- 3' 競爭引物 604-F-comp: 5' 一GGCCTTAATAACACATTGCGGA-3'。
2. -種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604的試劑盒其特征在于，包括如下成分： (1) 陽性對照轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604 DNA模板和陰性對照非轉(zhuǎn)基因玉米DNA模板 (2) MIR604上下游引物和競爭引物 上游引物 604-F-bio : 5' Biotin - TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT -3' 下游引物 604-B-fit : 5' Fite - TATTATAATCCGAAACGGAGCA-3' 競爭引物 604-F-comp: 5' 一GGCCTTAATAACACATTGCGGA- 3' (3) lOXExTaq PCR Buffer，ddH20, 2. 5mM dNTP，5υ/μ 1 ExTaq 酶 (4) 生物素（Biotin)、熒光素（Fite)抗原標記的薄膜層析試紙條。
3. -種轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604的快速檢測方法，包括如下步驟： (1) PCR反應(yīng)體系： 10XExTaq Buffer 2. 5 μ 1 dNTP (2. 5mmol/L) 1 μ 1 上游引物（l〇ymol/L) 0. 5μ 1 下游引物（l〇ymol/L) 0. 5μ 1 競爭引物（l〇ymol/L) 4 μ 1 模板DNA 1 μ 1 ExTaq 酶（5U/ μ L) 0. 25 μ 1 ddH20 15. 25 μ 1 總體積： 25 μ 1 (2) ?〇?反應(yīng)條件：94 1：預(yù)變性11^11，94 1：變性30 8,57 1：退火30 8,72 1：延伸 30 s，30個循環(huán)，72 °C延伸5 min (3) 判定結(jié)果：PCR產(chǎn)物用試紙條檢測，若控制線正常，檢測線呈現(xiàn)陽性，則說明該 樣品含有轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604,若呈現(xiàn)陰性，則說明該樣品中不含有轉(zhuǎn)基因玉米品系 MIR604。
【文檔編號】C12N15/11GK104195260SQ201410485406
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】張裕君, 郭京澤, 趙瑾源, 劉鵬, 賀艷 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心