專利名稱：轉(zhuǎn)基因玉米品系mon89034 pcr-dhplc檢測(cè)引物及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)，特別是涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米品系的PCR-DHPLC檢測(cè)弓I物及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
目前對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的檢測(cè)方法主要采用常規(guī)PCR，實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR_基因芯片等檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的常規(guī)PCR檢測(cè)方法在平臺(tái)擴(kuò)展方面具有一定的局限性，隨著待檢目標(biāo)的增加，需要對(duì)體系中的每套引物的用量及比例重新進(jìn)行優(yōu)化，并且兼顧擴(kuò)增效率等因素，工作量較大；另一方面，通常采用的凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，區(qū)分效率不高，檢測(cè)結(jié)果不理想。實(shí)時(shí)熒光PCR雖然在檢測(cè)靈敏度等方面較多重常規(guī)PCR檢測(cè)方法有優(yōu)勢(shì)，但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時(shí)提供互不干擾的4個(gè)熒光通道，也限制了該技術(shù)在檢測(cè)通量擴(kuò)展，并且檢測(cè)成本高。常規(guī)的多套PCR-基因芯片檢測(cè)方法，需要多套引物進(jìn)行擴(kuò)增，操作步驟繁瑣，并不適合大規(guī)模的高通量檢測(cè)。變性高效液相色譜技術(shù)(Denaturing High-performance Liquid Chromatography,DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法，具有分辨率好、擴(kuò)展性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。該方法在50°C條件分析樣品，樣品峰的洗脫只由堿基對(duì)的數(shù)量決定洗脫順序，當(dāng)過柱的乙腈濃度提高，核酸片段會(huì)根據(jù)分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與marker比較確定分子量大小，判定是否含有目標(biāo)檢測(cè)基因。目前，尚沒有轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034的PCR結(jié)合DHPLC的檢測(cè)技術(shù)(PCR-DHPLC)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034的PCR-DHPLC檢測(cè)的引物。本發(fā)明的另一目的是提供一種基于上述引物的擴(kuò)展性能好、靈敏度和分辨率高的轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034的PCR-DHPLC檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了用于轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034的PCR-DHPLC檢測(cè)的引物，所述引物的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No. I :5’ -TTTTTCTCCATATTGACCATCATACTC-3’Seq ID No. 2 :5，-ATATAGATGGACGGTTTAGATTGGC-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2是與轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034的檢測(cè)靶標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的特異序列，具有很強(qiáng)的特異性識(shí)別性。進(jìn)一步的，所述上游引物的5’端還包括Seq ID No. 3所示序列，所述下游引物的5’端還包括Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’
Seq ID No. 4 :5’ -CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3’。需要指出的是，上述Seq ID No. 3和Seq ID No. 4是分別在上游引物和下游引物的5 ’端添加的與檢測(cè)靶標(biāo)序列無關(guān)的一段序列，該序列可以是與檢測(cè)靶標(biāo)序列同源性很遠(yuǎn)的其它物種的序列，也可以是一段隨機(jī)生成的序列。該序列可以用于調(diào)控PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，以便于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的進(jìn)一步分析。本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游引物具有Seq ID No. 5所示序列，下游引物具有SeqID No. 6所示序列；Seq ID No. 5 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTTTTTCTCCATATTGACCATCATACTC-3’Seq ID No. 6 :5’ -CTCAGCGGCGGAGCTACAGAATATAGATGGACGGTTTAGATTGGC-3’。需要說明的是，所述Seq ID No. 5和Seq ID No. 6序列是由上述Seq ID No. I和·Seq ID No. 2序列分別在其5’端添加調(diào)控序列而成，盡管上述已經(jīng)說明Seq ID No. 3和SeqID No. 4所示調(diào)控序列可以是隨機(jī)生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具體到本發(fā)明中，需要考慮調(diào)控序列與Seq ID No. I和Seq ID No. 2所示序列的理化性質(zhì)的統(tǒng)一協(xié)調(diào)，并且還需要考慮添加調(diào)控序列后的Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示序列作為檢測(cè)引物的整體性能。本發(fā)明還公開了一種用于轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034的PCR-DHPLC檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括采用所述引物，以玉米DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性高效液相色譜分析。進(jìn)一步的,所述檢測(cè)方法還包括以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行變性高效液相色譜分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與marker的變性高效液相色譜分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。優(yōu)選的上述檢測(cè)方法包括如下步驟(A)采用所述引物，以玉米DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(B)以步驟(A)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為樣品進(jìn)行DHPLC分析，同時(shí)以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DHPLC分析；(C)將步驟⑶中樣品的DHPLC分析結(jié)果與marker的DHPLC分析結(jié)果進(jìn)行比較，確定樣品的分子量大小，從而判斷是否含有檢測(cè)的靶標(biāo)序列。由于采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034檢測(cè)引物具有較強(qiáng)的特異性，能夠用于后續(xù)的多重PCR擴(kuò)增以及DHPLC分析。本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)的電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果不理想的問題，將PCR與DHPLC相結(jié)合，提供了一種操作簡便、擴(kuò)展性能好、靈敏度和分辨率高的轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034檢測(cè)方法。利用DHPLC對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，對(duì)不同大小的PCR產(chǎn)物片段區(qū)分率可達(dá)數(shù)個(gè)堿基，甚至能夠區(qū)分出I個(gè)堿基大小差異的片段。本發(fā)明的引物和檢測(cè)方法為轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034檢測(cè)提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測(cè)方法，特別適合用于口岸檢驗(yàn)檢疫等部門使用。


圖為本發(fā)明實(shí)施例中DHPLC分析的部分結(jié)果；圖中自上而下的曲線分別標(biāo)記為M、1-18，]\1為11^11 51'、1為非轉(zhuǎn)基因玉米0嫩、2為玉米皿例88017 DNA、3為玉米MIR604 DNA、4為玉米Btl76 DNA、5為玉米Btll DNA、6為玉米M0N810 DNA、7為玉米GA21 DNA、8為玉米 NK603 DNA、9 為玉米 M0N863DNA、10 為玉米 M0N89034 DNA、11 為玉米 T25 DNA、12 為大豆A2704-12DNAU3 為大豆 A5547-12 DNAU4 為油菜 DNA、15 為棉花 LLcotton25 DNA、16 為非轉(zhuǎn)基因棉花DNA、17為Bt63 DNA、18為土豆EH92-527-1 DNA ；marker的各峰值從左至右依次為 80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公布了用于轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034的PCR-DHPLC檢測(cè)的引物，該引物針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034品系的特異序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。進(jìn)一步的，還在引物的上游和下游分別添加了一段與檢測(cè)靶標(biāo)序列無關(guān)或者同源性很遠(yuǎn)的調(diào)控序列，用于實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小的調(diào)控。需要指出的是，所述調(diào)控序列的加入只是為了獲得更優(yōu)異的檢測(cè)效果，因此，本發(fā)明優(yōu)選的，用于轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034的PCR結(jié)合DHPLC技術(shù)檢測(cè)的引物是加入了調(diào)控序列的引物，分別具有Seq ID No. 5至Seq ID No. 6所示序列。 本發(fā)明還公開了一種用于轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034的PCR-DHPLC檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括采用所述引物，以玉米DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性高效液相色譜分析。進(jìn)一步的，所述檢測(cè)方法還包括以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行變性高效液相色譜分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與marker的變性高效液相色譜分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，從而判斷是否含有檢測(cè)的靶標(biāo)序列。本發(fā)明中，所述引物擴(kuò)增產(chǎn)物的DHPLC洗脫峰為301bp。下面通過具體實(shí)驗(yàn)例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)驗(yàn)例僅僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I DNA提取 采用CTAB法提取樣品DNA，具體如下a)稱取樣品5g，在研缽中加入液氮研磨至樣品呈O. 5mm左右大小的粉末；b)稱取300mg磨碎的樣品，迅速轉(zhuǎn)入2mL離心管中，加65°C預(yù)熱的CTAB提取液700 μ L，混勻，放入65°C水浴鍋中水浴30min ；c)力口 5 μ L RNase (10mg/mL)，37°C 水浴 30min ；d)加入等體積Tris飽和酹,充分混勻，12000r/min離心15min ；e)取上清,加入等體積的氯仿/異戍醇(24 I)混勻，12000r/min離心15min ；f)取上清,加入等體積的氯仿/異戍醇(24 I)混勻，12000r/min離心15min ；g)加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖晃，置于_20°C冰箱靜置30min，12000r/min離心15min ；h)棄上清,加70%乙醇500 μ L, 12000r/min離心3min,去上清,重復(fù)2次；i)得到DNA沉淀，用冷凍干燥儀進(jìn)行干燥，加入50 μ L 100 μ L TE或無菌去離子水，充分溶解后，測(cè)量DNA的純度和濃度后置于_20°C冰箱中保存。 實(shí)施例2 DNA濃度測(cè)定對(duì)提取的樣品DNA進(jìn)行濃度和純度測(cè)定；采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm處吸收值，分別計(jì)算核酸的純度和濃度，計(jì)算公式如下DNA 純度=0D260/0D280
DNA 濃度=50 X 0D260mg/mLDNA的純度比值在I. 7 L 9之間，濃度大于IOng/μ L。實(shí)施例3 PCR擴(kuò)增根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米Μ0Ν89034品系設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物的結(jié)合位點(diǎn)，并在特異性檢測(cè)引物結(jié)合位點(diǎn)的5’端添加調(diào)控序列，合成含有調(diào)控序列的檢測(cè)引物(表1)，采用添加調(diào)控序列的上/下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，樣品設(shè)置包括非轉(zhuǎn)基因玉米DNA、玉米品系Μ0Ν88017的DNA、玉米品系MIR604的DNA、玉米品系Bt176的DNA、玉米品系Btll的DNA、玉米品系Μ0Ν810的DNA、玉米品系GA21的DNA、玉米品系ΝΚ603的DNA、玉米品系Μ0Ν863的
DNA、玉米品系Μ0Ν89034的DNA、玉米品系Τ25的DNA、大豆品系Α2704-12的DNA、大豆品系Α5547-12的DNA、非轉(zhuǎn)基因油菜的DNA、LLcotton25品系的DNA、非轉(zhuǎn)基因棉花DNA、Bt63品系的 DNA、土豆品系 EH92-527-1 的 DNA。表I轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034檢測(cè)引物結(jié)合位點(diǎn)及引物
權(quán)利要求
1.用于轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034PCR-DHPLC檢測(cè)的引物，其特征在于所述引物的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No. I :5’ -TTTTTCTCCATATTGACCATCATACTC-3’Seq ID No. 2 :5’ -ATATAGATGGACGGTTTAGATTGGC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物，其特征在于所述上游引物的5’端還包括SeqID No. 3所示序列，所述下游引物的5’端還包括Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于所述上游引物具有SeqID No. 5所示序列，下游引物具有Seq ID No. 6所示序列；Seq ID No. 5 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTTTTTCTCCATATTGACCATCATACTC-3’Seq ID No. 6 :5’ _CTCAGCGGCGGAGCTACAGAATATAGATGGACGGTTTAGATTGGC_3’。
4.一種用于轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034的PCR-DHPLC檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)方法包括采用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的引物，以玉米DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性高效液相色譜分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)方法還包括以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行變性高效液相色譜分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與marker的變性高效液相色譜分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034的PCR-DHPLC檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，所述引物具有較強(qiáng)的特異性，能夠用于PCR擴(kuò)增以及DHPLC分析。所述檢測(cè)方法提供了一種操作簡便、擴(kuò)展性能好、靈敏度高的轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034的多靶標(biāo)檢測(cè)。利用DHPLC對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，其片段大小區(qū)分率可達(dá)數(shù)個(gè)堿基，分辨率高。本發(fā)明的引物和檢測(cè)方法為轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034檢測(cè)提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測(cè)方法，特別適合用于口岸檢驗(yàn)檢疫等部門使用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102952862SQ201110248329
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者章桂明, 向才玉, 凌杏園, 潘廣, 程穎慧, 康林, 李鶴遙 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心