專利名稱：：來(lái)自玉米的次生壁形成基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明--般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：在過(guò)去的100年中在玉米中，收獲指數(shù)(谷物與地上總生物量的比例)己經(jīng)保持恒定在大約50%(Sinclair,(1998)"Historicalchangesinharvestindexandcropnitrogenaccumulation";CropScience38:638-643);(TollenaarandWu.(1999)"Yieldimprovementintemperatemaizeisattributabletogreaterstresstolerance";CropScience39:1597-1604)。因此，在過(guò)去50-60年中谷物產(chǎn)量的四倍化是由于每單位土地面積總生物量生產(chǎn)的增加，其由增加的種植密度來(lái)完成(DuvickandCassman，(1999)"Post-greenrevolutiontrendsinyieldpotentialoftemperatemaizeinthenorth-centralUnitedStates";CropScience39:1622-1630)。在漸增的種植密度下選擇更高谷物產(chǎn)量導(dǎo)致了植物結(jié)構(gòu)的顯著構(gòu)造變化(architecturalchange),即相對(duì)直立和窄的葉子以最小化遮蔽。更密集的種植的不期望的結(jié)果是增加了莖倒伏的頻率。種植密度和生物量生產(chǎn)之間關(guān)系顯著地偏離線性關(guān)系，因?yàn)閷?duì)于每單位土地面積的最大生物量產(chǎn)量獲得最佳密度。這反映在個(gè)體植物生物量的成比例的更高下降中，其顯示為更弱的莖并因此增加的倒伏的形式。單位長(zhǎng)度的玉米莖中的纖維素已被發(fā)現(xiàn)是機(jī)械強(qiáng)度的最佳指示物(Appenzeller，etal.，(2004)"Cellulosesynthesisinmaize-isolationandexpressionanalysisofthecellulosesynthase(CesA)genefamily";Cellulose11:287-299;Ching，etal.，(2006)"Brittlestalk2encodes鄰utativeglycosylphosphatidylinositol-anchoredproteinthataffectsmechanicalstrengthofmaizetissuesbyalteringthecompositionandstructureofsecondarycellwalls，，；Planta224:1174-1184)。纖維素構(gòu)成了成熟的莖千物質(zhì)的大約50%(Dhugga，未出版)。盡管在種質(zhì)中玉米莖壁中纖維素濃度可發(fā)生相當(dāng)大的改變，而對(duì)于木質(zhì)素其基本上是不變的(Dhugga，未出版)。這暗示了纖維素濃度的改變是以其它細(xì)胞壁成分例如半纖維素和可溶成分為代價(jià)的。在干物質(zhì)中增加的纖維素濃度應(yīng)該允許改善收獲指數(shù)，而不會(huì)不利地影響莖機(jī)械強(qiáng)度。因此最優(yōu)選的改善莖強(qiáng)度的手段是通過(guò)增加的纖維素濃度和次生壁成分。本發(fā)明涉及涉及細(xì)胞壁形成，特別是次生壁形成(SCW)的一組玉米基因。纖維素可占例如玉米的植物的次生細(xì)胞壁的最多6()%。作為本發(fā)明主題的基因被揭示是與次生壁形成有關(guān)的，這是基于它們的表達(dá)模式與先前己經(jīng)顯示涉及次生細(xì)胞壁形成的ZmCesA10，ZmCesAll，ZmCesA12，ZmCesA13，禾RBk2基因(Appenzeller，etal.，(2004)"Cellulosesynthesisinmaize-isolationandexpressionanalysisofthecellulosesynthase(CesA)genefamily";Cel丄ulose11:287—299;Ching，etal.，(2006)"Brittlestalk2encodesaputetiveglycosylphosphatidylinositol-anchoredproteinthataffectsmechanicalstrengthofmaizetissuesbyalteringthecompositionandstructureofsecondarycellwalls，，？Planta224:1丄74—1丄84^Dhugga，5未出版)的表達(dá)模式的強(qiáng)相關(guān)性。本發(fā)明中的許多這些基因除了這些專有分析之外沒(méi)有已知與細(xì)胞壁形成相關(guān)。這些基因可被用于在幾個(gè)領(lǐng)域增強(qiáng)作物植物性能和價(jià)值l)植物站立性(standability)，收獲指數(shù)，和產(chǎn)量潛力；2)作為用于乙醇或用于其它可再生生物產(chǎn)品的原料的植物干物質(zhì)；和3)青貯飼料。除了它作為組織強(qiáng)度(一種在構(gòu)造中令人非常興趣的性狀)的主要決定因子的作用之外，纖維素構(gòu)成了地球上最過(guò)剩的可再生能量資源。每年僅僅在美國(guó)從玉米中就生產(chǎn)大約2.75億公噸的秸稈。大約三分之二的秸稈可潛在地被用于乙醇，丁醇和來(lái)自一些玉米生長(zhǎng)區(qū)域的其它燃料或生物產(chǎn)品(Graham,etal.，(2007)"CurrentandpotentialU.S.cornstoversupplies";AgronomyJournal99:1-11)。世界范圍內(nèi)來(lái)自谷物秸稈和稻草的木質(zhì)纖維素廢料的生產(chǎn)預(yù)期是每年30億噸(KuhadandSingh(1993)"Lignocellulosebiotechnology:Currentandfutur印rospects，，；Critic.Rev.Biotechnol.13:151-172)。次生壁占了地球植物的植物生物量的大部分，并且因此是用于處理以改善用于能量生產(chǎn)的生物量的數(shù)量和質(zhì)量的適當(dāng)?shù)陌袠?biāo)。為了改善的青貯飼料質(zhì)量而改變次生壁可通過(guò)改變木質(zhì)素濃度而完成。木質(zhì)素的類型和數(shù)量都長(zhǎng)久已知會(huì)影響青貯飼料可消化性。木質(zhì)素也是用于乙醇生產(chǎn)的細(xì)胞壁多糖消化中的障礙。我們的列表中的幾種基因擴(kuò)大了我們可以用于改變用于改善的青貯飼料質(zhì)量的細(xì)胞壁組成的候選物數(shù)量。本發(fā)明提供了至少三個(gè)領(lǐng)域的農(nóng)業(yè)問(wèn)題的解決途徑1)植物站立性，收獲指數(shù)，和產(chǎn)量潛能；2)作為用于乙醇或用于其它可再生生物產(chǎn)品的原料的植物干物質(zhì)；和3)青貯飼料可消化性。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了控制植物生長(zhǎng)和次生細(xì)胞壁形成以增加產(chǎn)量的組成和方法。該組成包括來(lái)自玉米的SCW序列。本發(fā)明組成包括選自SEQIDN0:1-456及其變體和片段的氨基酸序列和核苷酸序列。在相關(guān)植物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體中提供編碼SCW序列的多核苷酸。進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明序列的表達(dá)盒、植物、植物細(xì)胞、植物部分和種子。在具體的實(shí)施方案中，該多核苷酸與組成性啟動(dòng)子可操作地相連。本文提供了在植物或植物部分中調(diào)節(jié)SCW序列水平的方法。該方法包括向植物或植物部分導(dǎo)入包含本發(fā)明SCW序列的異源多核苷酸。SCW多肽的水平可被增加或降低。這類方法可用于增加植物的產(chǎn)量，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法被用于增加谷類的谷粒產(chǎn)量。附圖簡(jiǎn)述圖1:玉米莖外皮和內(nèi)部組織對(duì)不同莖特征和機(jī)械強(qiáng)度的相對(duì)貢獻(xiàn)。圖2:在玉米雜種的干物質(zhì)中的纖維素濃度。從來(lái)源于三塊田地復(fù)本的每塊的兩株植物收集數(shù)據(jù)。纖維素在獲自成熟的穗下的第三節(jié)間的粉末化千物質(zhì)上通過(guò)Updegraff方法(Updegraff(1969)"Semimicrodeterminationofcelluloseinbiologicalmaterials";Ana:[.Biochem.32:120-124)確定。圖3:對(duì)于4種參考次生細(xì)胞壁基因和38種已發(fā)現(xiàn)基因的橫跨十二種玉米組織的轉(zhuǎn)錄物分布。四種參考次生細(xì)胞壁基因(Bk2，CesA10，CesAll，CesA12)和具有相關(guān)表達(dá)模式的38種己發(fā)現(xiàn)基因的信使RNA分布。組織表達(dá)水平代表了代表參考和己發(fā)現(xiàn)組的基因的MPSS17-mer標(biāo)簽組的平均(和SE)值?？傮w基因表達(dá)模式在這些組之間非常類似，顯示了在莖中的峰表達(dá)，在根和葉中的更微弱的表達(dá)，和在其它組織中的很少的表達(dá)，特別是頂端分生組織，其缺少次生細(xì)胞壁。平均表達(dá)強(qiáng)度沒(méi)有組織表達(dá)模式的對(duì)應(yīng)重要，因?yàn)榛蛑g轉(zhuǎn)錄物和標(biāo)簽水平將天然地和由于技術(shù)原因而改變。發(fā)明詳述在下文中參考附圖更全面描述本發(fā)明，其中顯示了本發(fā)明的一些而不是全部實(shí)施方案。的確，這些發(fā)明可以許多不同形式實(shí)施并不應(yīng)限制于本文列出的實(shí)施方案；而本文提供這些實(shí)施方案以使本公開滿足適用的法律要求。全文中同樣的數(shù)字表示同樣的要素。本文列出的本發(fā)明許多變體和其他實(shí)施方案(利用之前的說(shuō)明書和相關(guān)附圖中的教導(dǎo))對(duì)于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是熟知的。因此應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明不限于公開的具體實(shí)施方案并且所述修改和其他實(shí)施方案均包含于附加權(quán)利要求的范圍。雖然本文應(yīng)用了具體的術(shù)語(yǔ)，但是它們僅用于通用和描述性意義并不具有限制性。除非另外說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施將應(yīng)用植物學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)和重組DNA技術(shù)的傳統(tǒng)技術(shù)，其均屬于本
技術(shù)領(lǐng)域：
。該類技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)說(shuō)明。見(jiàn)例如Langenheim和Thimann,植物學(xué)植物生物學(xué)及其與人類事務(wù)的關(guān)系(BOTANY:PLANTBIOLOGYANDITSRELATIONTOHUMANAFFAIRS),JohnWiley(1982);植物細(xì)胞培養(yǎng)和體細(xì)胞遺傳學(xué)(CELLCULTUREANDSOMATICCELLGENETICSOFPLANTS),第1巻，Vasil編輯.(1984);Stanier等，微生物世界(THEMICROBIALWORLD)，第5版，Prentice-Hall(1986);Dhringra和Sinclair,基礎(chǔ)植物病理學(xué)方法(BASICPLANTPATHOLOGYMETHODS),CRCPress(1985);Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)(1982);DNA克隆(DNACLONING)，第I和II巻，Glover編輯，(1985);寡聚核苷酸合成(OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS)，Gait編輯，(1984);核酸雜交(NUCLEICACIDHYBRIDIZATION)，Hames和Higgins編輯，(1984);及酶學(xué)方法(METHODSINENZYM()L()GY)系列，Co固ck禾口Kaplan編輯，AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA。[酬單位、字首和符號(hào)表示為SI接受形式。除非另外指明，分別地,核酸由左向右以5'至3'方向書寫；氨基酸序列由左向右從氨基至羧基的方向書寫。數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)值。本文中提及的氨基酸可為它們普遍使用的三字母符號(hào)或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)建議使用的單字母符號(hào)。同樣，核苷酸以它們被普遍接受的單字母編碼表示。通過(guò)整體引用詳細(xì)說(shuō)明更加全面定義下文中定義的術(shù)語(yǔ)。在描述本發(fā)明中可應(yīng)用下列術(shù)語(yǔ)，其定義如F所示。術(shù)語(yǔ)"微生物"指任何微生物(包括真核和原核微生物)，例如真菌、酵母、細(xì)菌、放線菌、藻類和原生動(dòng)物以及其他單細(xì)胞結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增"指使用至少該核酸序列之-作為模板構(gòu)建核酸序列的多個(gè)拷貝或與該核酸序列互補(bǔ)的多個(gè)拷貝。擴(kuò)增體系包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)系統(tǒng)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)系統(tǒng)、核酸序列為基礎(chǔ)的擴(kuò)增(NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario)、QP復(fù)制酶7系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)和鏈置換擴(kuò)增(SM)。例如見(jiàn)診斷分子生物學(xué)原理和應(yīng)用(DIAGNOSTICMOLECULARMICROBIOLOGY-PRINCIPLESANDAPPLICATIONS)，Persing等編輯，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC(1993)。擴(kuò)增產(chǎn)物被稱作擴(kuò)增子。術(shù)語(yǔ)"保守修飾變異體"應(yīng)用于氨基酸和核酸序列。就具體核酸序列而言，保守修飾變異體指編碼該氨基酸序列相同或保守修飾變異體的核酸。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，許多功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此在任何用密碼子規(guī)定丙氨酸的位置，該密碼子可被改變成任何所述相應(yīng)密碼子而不會(huì)改變被編碼的多肽。這種核酸變異為"沉默變異"并代表了一類保守修飾變異。本文的每一個(gè)編碼多肽的核酸序列也描述了該核酸每個(gè)可能的沉默變異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，核酸中每一個(gè)密碼子(除了AUG,其為甲硫氨酸的唯一密碼子;一個(gè)例外是紅色微球菌(Micrococcusrubens),它的甲硫氨酸密碼子為GTG(]:shizuka等.，(1993)J.Gen.Microbiol.139:425-32))均可以被修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼本文多肽的核酸的每一個(gè)沉默變異都內(nèi)含在每個(gè)所述多肽序列并以引用形式并于本文。對(duì)于氨基酸序列而言，技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到當(dāng)該變化引起用化學(xué)相似的氨基酸置換氨基酸時(shí)，改變、添加或缺失被編碼序列中的單個(gè)氨基酸或一小部分氨基酸的對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的單個(gè)置換、缺失或添加為"保守修飾變異體"。因此，可改變選自1至15的整數(shù)的任何數(shù)量的氨基酸殘基。因此，例如，可進(jìn)行1、2、3、4、5、7或10個(gè)改變。保守修飾變異體通常與它們所來(lái)源自的未修飾多肽序列具有相似的生物活性。例如,對(duì)天然底物的底物特異性、酶活力、或配體/受體結(jié)合通常至少為天然蛋白的30%、40%、50%，、60%、70%、80%或90%，優(yōu)選60-90%。保守取代表提供了本領(lǐng)域熟知的功能相似氨基酸。下列六組均包含可相互保守替換的氨基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)，賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M),纈氨酸(V);及6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。還參見(jiàn)Creighton，PROTEINS,W.H.FreemanandCo.(1984)。如本文所使用，"基本上由…組成"意指在目標(biāo)多核苷酸中包含附加序列，其中在嚴(yán)格雜交條件下該附加序列不會(huì)與相同于該多核苷酸的cDNA選擇性雜交并且其中該雜交條件包括在65。C().IXSSC和O.1%十二烷基硫酸鈉中的洗滌步驟。"編碼"或"被編碼"，對(duì)于特定核酸而言，意指包含翻譯成特定蛋白質(zhì)的信息。編碼蛋白質(zhì)的核酸可能在該核酸的翻譯區(qū)內(nèi)含有非翻譯序列(例如，內(nèi)含子)，或者可能缺少這些插入的非翻譯序列(例如，在cDNA中)。編碼蛋白質(zhì)的信息由密碼子的使用來(lái)確定。通常，核酸編碼氨基酸序列采用"通用"遺傳密碼。但是,例如在一些植物、動(dòng)物、真菌線粒體、細(xì)菌山羊支原體細(xì)菌(Mycoplasmacapricolum)(Yamao等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:2306-2309)或纖毛蟲Macro皿cleus中，當(dāng)使用這些生物體表達(dá)核酸時(shí)可使用通用密碼的變異體。當(dāng)以合成方式制備或改變核酸時(shí),可利用表達(dá)該核酸的預(yù)期宿主的已知密碼子偏好。例如，雖然本發(fā)明的核酸序列可在單子葉和雙子葉植物種二者中表達(dá)，但是由于這些偏好已顯示出不同所以可修飾序列以滿足單子葉植物或雙子葉植物的具體密碼子偏好和GC含量偏好(Murray等，(1989)NucleicAcidsRes.17:477-98,此處通過(guò)引用并入)。因此，對(duì)特定氨基酸的玉米偏好密碼子可來(lái)源自已知玉米基因序列。來(lái)自玉米植物中28個(gè)基因的玉米密碼子使用列于上文中Murray等的表4。如本文所使用，提及核酸的"異源"指源自外來(lái)物種的核酸,或者如果來(lái)自同一物種則通過(guò)刻意的人為干預(yù)使相對(duì)于其天然形式在組成和/或基因組基因座上發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變。例如，與異源結(jié)構(gòu)基因上可操作地連接的啟動(dòng)子是來(lái)自與該結(jié)構(gòu)基因所來(lái)源自的物種不同的物種，或者，如果來(lái)自相同物種，則其中之一或二者均從其天然形式發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變。異源蛋白質(zhì)可來(lái)自外來(lái)物種，或者，如果來(lái)自同一物種，則被刻意的人為干預(yù)相對(duì)于其天然形式發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變。"宿主細(xì)胞"意指含有載體并支持該表達(dá)載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞例如大腸桿菌，或真核細(xì)胞例如酵母、昆蟲、植物、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞優(yōu)選地為單子葉或雙子葉植物細(xì)胞,包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麥、苜蓿、稻、棉花、油菜、大麥、黍和番茄。尤其優(yōu)選的單子葉植物宿主細(xì)胞為玉米宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"雜交復(fù)合物"包括由兩條單鏈核酸序列選擇性相互雜交形成的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)。在向細(xì)胞插入核酸的上下文中，術(shù)語(yǔ)"導(dǎo)入"意指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"并包括將核酸整合入真核或原核細(xì)胞，其中該核酸可被整合入細(xì)胞基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或者被瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。術(shù)語(yǔ)"己分離"指實(shí)質(zhì)上或基本上沒(méi)有在自然存在環(huán)境中通常與其伴隨或相互作用的組分中的物質(zhì)(例如核酸或蛋白質(zhì))。已分離物質(zhì)任選包含在其天然環(huán)境中未發(fā)現(xiàn)伴隨該物質(zhì)的物質(zhì)。如本文定義，"已分離"核酸也指"異源"核酸。除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"SCW核酸"意指包含編碼SCW多肽的多核苷酸("SCW多核苷酸")的核酸。如本文所使用，"核酸"包括單鏈形式或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另外限定，涵蓋已知的具有天然核苷酸基本特性即能與單鏈核酸以類似天然核苷酸的方式雜交的類似物(例如，肽核酸)。"核酸文庫(kù)"意指分離的DNA或RNA分子的集合，其包含并實(shí)質(zhì)上代表了特定生物基因組的全部轉(zhuǎn)錄部分。在標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)參考文獻(xiàn)中教導(dǎo)了構(gòu)建示例核酸文庫(kù)(例如基因組和c廳文庫(kù))的方法，例如Berger和Kimrael，分子克隆技術(shù)指南(GUIDETOM0LECULARCL0NINGTECHNIQUES)，來(lái)自酶學(xué)方法叢書(theseriesMETHODSINENZYM0L0GY)，第152巻，AcademicPress,Inc.，SanDiego，CA(1987);Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)，第2版，卜3巻，(1989);以及分子生物學(xué)通用規(guī)程(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY),Ausubel等編輯，通用規(guī)禾呈(CurrentProtocols)，GreenePublishing-Associates,Inc.禾卩JohnWiley&Sons,Inc合資企業(yè)(1994增刊)。如本文所使用，"可操作地連接"包括第一個(gè)序列(例如啟動(dòng)子)和第二個(gè)序列之9間的功能性連接，其中該啟動(dòng)子序列起始并介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二個(gè)序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般而言，可操作地連接意指被連接的核酸序列是鄰近的，在需要連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)是鄰近的并且在同一閱讀框內(nèi)。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"植物"包括完整植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子和植物細(xì)胞及其后代。如本文使用的，植物細(xì)胞包括但不限于種子懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉以及小孢子。本發(fā)明方法中可用的植物種類通常寬泛至適用轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物種類，包括單子葉植物和雙子葉植物，包括以下屬的物種南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、核桃屬(Juglans)、草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢食豆屬(Onobrychis)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Li誦)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(D塞us)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Si卿is)、顛茄屬(At.ropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersi固)、煙草屬(Nicotiana)、茄屬(Sola誦)、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana、Ciahorium、向曰葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Broraus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Heterocallis、Neraesis、天竺葵屬(Pelargonium)、Panieum、狼尾草屬(Pennisetum)、毛茛屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、Salpiglossis、黃瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(0ryza)、燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeuni)、黑麥屬(Secale)、蔥屬(A:1.1i，)、及小麥屬(Triti固)。尤其優(yōu)選的植物為玉米(Zeamays)。如本文使用的，"產(chǎn)量"包括指收獲時(shí)每英畝谷類作物的蒲式耳(bushel)，對(duì)于谷物水分校正(通常為15%)。收獲時(shí)測(cè)定谷物水分。測(cè)定校正后的谷物測(cè)試重量作為每蒲式耳重量(以磅計(jì)算)，對(duì)于收獲時(shí)的谷物水分水平校正。如本文使用的，"多核苷酸"包括脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其類似物，所述類似物具有天然核糖核苷酸的基本性質(zhì)，即可在嚴(yán)格雜交條件下和與天然存在核苷酸實(shí)質(zhì)相同的核苷酸序列雜交和/或者允許翻譯成與天然存在核苷酸相同的氨基酸。多核苷酸可為天然或異源結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的全長(zhǎng)序列或子序列。除非另外指明，該術(shù)語(yǔ)包括特定序列及其互補(bǔ)序列。因此，為穩(wěn)定性或其它原因而主鏈被修飾的DNA或RNA為該術(shù)語(yǔ)在本文中所指的"多核苷酸"。此外，含有罕見(jiàn)堿基(例如肌苷)或修飾堿基(例如三苯甲基化堿基)(僅舉兩例)的DNA或RNA為該術(shù)語(yǔ)在本文所指的多核苷酸。應(yīng)該理解已經(jīng)對(duì)可達(dá)到本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多有用目的的DNA和:RM進(jìn)行了許多修飾。本文使用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸涵蓋多核苷酸的化學(xué)、酶或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞(尤其包括單細(xì)胞和復(fù)雜細(xì)胞)特有DNA和RNA的化學(xué)形式。術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)用于其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基為對(duì)應(yīng)天然氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物以及天然氨基酸聚合物。如本文所使用，"啟動(dòng)子"包括從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的上游DNA區(qū)域并涉及識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶和其它起始轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。"植物啟動(dòng)子"為可在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。示例植物啟動(dòng)子包括但不限于從植物、植物病毒以及包含在植物細(xì)胞表達(dá)的基因的細(xì)菌(例如農(nóng)桿菌(Agrobact.erium)或根瘤菌(Rhizobium))中獲得的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子實(shí)例優(yōu)選起始特定組織的轉(zhuǎn)錄，例如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部管、管胞或厚壁組織。這些啟動(dòng)子被稱為"組織優(yōu)選的"。"細(xì)胞類型"特異啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng)一個(gè)或更多個(gè)器官中特定細(xì)胞類型的表達(dá)，例如,根或葉的維管細(xì)胞。"誘導(dǎo)型"或"調(diào)節(jié)型"啟動(dòng)子為受環(huán)境調(diào)控的啟動(dòng)子。可通過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括缺氧條件或光照存在。另一類啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)控型啟動(dòng)子，例如,驅(qū)動(dòng)花粉發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的啟動(dòng)子。組織優(yōu)選、細(xì)胞類型特異性、發(fā)育調(diào)節(jié)型以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成了"非組成型"類啟動(dòng)子。"組成型"啟動(dòng)子為在大多數(shù)環(huán)境條件下處于活性形式的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)"SCW多肽"指一個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列。該術(shù)語(yǔ)也包括其片段、變異體、同系物、等位基因或前體(例如，前蛋白原或蛋白原)。"scw蛋白"含有scw多肽。除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"scw核酸"意指包含編碼scw多肽的多核苷酸("scw多核苷酸")的核酸。如本文所使用，"重組體"包括通過(guò)導(dǎo)入外源核酸而修飾的細(xì)胞或載體，或該細(xì)胞來(lái)源自這樣修飾獲得的細(xì)胞。因此，例如，作為刻意人為介入的結(jié)果，重組細(xì)胞可表達(dá)未發(fā)現(xiàn)在天然(非重組體)形式的細(xì)胞內(nèi)以相同形式存在的基因，或者表達(dá)或被異常表達(dá)、低表達(dá)(underexpressed)或根本不表達(dá)的天然基因。本文所用術(shù)語(yǔ)"重組體"不包含通過(guò)天然事件對(duì)細(xì)胞或載體的改變(例如，自發(fā)性突變、自然轉(zhuǎn)化Z轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)，例如在沒(méi)有刻意人為介入下發(fā)生的事件。如本文所使用，"重組表達(dá)盒"為具有一系列特定核酸元件由重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其可在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄特定核酸。重組表達(dá)盒可整合入質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段。通常，表達(dá)載體的重組表達(dá)盒部分包括將要轉(zhuǎn)錄的核酸以及啟動(dòng)子等等。術(shù)語(yǔ)"殘基"或"氨基酸殘基"或"氨基酸"在本文中可互換使用，指整合入蛋白質(zhì)、多肽或肽(統(tǒng)稱為"蛋白質(zhì)")的氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸，除非另外限制，也可涵蓋已知的與天然氨基酸以相似形式發(fā)揮功能的天然氨基酸類似物。術(shù)語(yǔ)"選擇性雜交"包括核酸序列與特定核酸目標(biāo)序列在嚴(yán)格雜交條件下以比其與非目標(biāo)核酸序列的雜交具有更高的可檢測(cè)程度(例如，至少為背景的兩倍)并實(shí)質(zhì)上排除了非目標(biāo)核酸的雜交。選擇性雜交序列相互間通常具有約至少4()%的序列同一性,優(yōu)選60_90%的序列同一性，且最優(yōu)選100%序列同-一性(即互補(bǔ))。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格雜交條件"包括探針以比與其它序列更高可檢測(cè)程度(例如,至少為背景的兩倍)與其目標(biāo)序列雜交的條件。嚴(yán)格條件依賴于序列并隨環(huán)境不同而不同。通過(guò)調(diào)控雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格程度，可鑒定與探針最高l()O%互補(bǔ)的目標(biāo)序列(同源探測(cè))?；蛘撸烧{(diào)節(jié)嚴(yán)格度使序列中得以存在-些錯(cuò)配以檢測(cè)較低相似度(異源探測(cè))。探針的最佳長(zhǎng)度為約500個(gè)核苷酸，但其長(zhǎng)度也可從少于500個(gè)核苷酸到等于目標(biāo)序列全長(zhǎng)的范圍內(nèi)隨意變化。嚴(yán)格條件通常為鹽濃度小于約1.5M鈉離子的條件，通常約0.01到1.()M鈉離子濃度(或其它鹽)，pH為7.0至8.3,用于短探針(例如，10到50個(gè)核苷酸)的溫度至少為約3(TC，用于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)的溫度至少為約6(TC。也可通過(guò)加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺或Denhardt's以達(dá)到嚴(yán)格條件。示例性低嚴(yán)格度條件包括在37°C、含30至35%甲酰胺、1MNaCl、l%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液中雜交，在50至55。C用IX至2XSSC(20XSSC=3.OMNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)洗滌。示例性中等嚴(yán)格度條件包括在37°C、40至45%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中雜交，在55至6(TC用0.5X至1XSSC洗滌。示例性高嚴(yán)格度條件包括在37°C、50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS雜交，在60至65。C用0.1XSSC洗滌。特異性通常為雜交后洗滌的函數(shù),關(guān)鍵因素為終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于DNA-DNA雜交體，可通過(guò)Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.138:267-84的方程估計(jì)Tm:Tm=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%甲酰胺)-500/L;其中，M為一價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，^GC為DNA中鳥嘌呤核苷和胞嘧啶核苷酸百分比，％甲酰胺為雜交溶液中甲酰胺百分比，L為雜交體的堿基對(duì)長(zhǎng)度。Tm為在給定離子強(qiáng)度和pH下50%互補(bǔ)目標(biāo)序列與完全匹配探針雜交時(shí)的溫度。每1%的錯(cuò)配會(huì)使Tra下降約1°C;因此，可調(diào)節(jié)T,u、雜交條件和/或洗滌條件使其與具有期望同一性的序列雜交。例如，如果要找尋同一性》9()%的序列，可將Tni降低l(rC。通常，所選嚴(yán)格條件比給定離子強(qiáng)度和pH:下特異序列和其互補(bǔ)序列的熱熔點(diǎn)(Tm)約低5t:。但是，非常嚴(yán)格條件可使用低于熱熔點(diǎn)(TJ1、2、3或(C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可使用低于熱熔點(diǎn)(T,》6、7、8、9或l(TC的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可使用低于熱熔點(diǎn)(Tm)11、12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。通過(guò)使用方程、雜交和洗滌組合以及期望Tm，一般專業(yè)人員即可理解雜交嚴(yán)格度和/或洗滌溶液的變化已闡述在內(nèi)。如果錯(cuò)配結(jié)果的期望程度為低于45t:(水溶液)或32t:(甲酰胺溶液)的Tra，那么優(yōu)選提高SSC濃度以使用更高的溫度。核酸雜交的廣泛指導(dǎo)參見(jiàn)Tiis線生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)一核酸探針雜交(LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDM()LECULA:RBIOLOGY—HYBRIDIZATIONWITHNUCLEICACII)P腿ES)，第]:部分，第2章，雜交原理及核酸探針?lè)治霾呗跃C述("Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyof皿cleicacidprobeassays,，，)Elsevier,NewYork(1993);以及分子生物學(xué)通用規(guī)程(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)，第2章，Ausubel等編輯，GreenePublishing禾口Wi:[ey—:[nterscience，NewYork(1995)。除非另夕卜說(shuō)明，本申i青中高嚴(yán)格度定義為在65。C、4XSSC、5XDenhardt.'s(500ml水中含5gFicoll、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.lmg/ml煮沸過(guò)的鮭精DNA以及25mM磷酸鈉中雜交，以及在65t:、0.1XSSC、0.1%SDS中洗滌。如本文所使用，"轉(zhuǎn)基因植物"包括基因組中包含異源多核苷酸的植物。通常，異源多核苷酸可穩(wěn)定地整合在基因組中，這樣該多核苷酸傳遞至連續(xù)世代。異源多核苷酸可單獨(dú)或者作為重組表達(dá)盒的一部分整合入基因組。本文中使用的"轉(zhuǎn)基因"包括因異源核酸的存在而使基因型被改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括起始被如此改變的轉(zhuǎn)基因以及由起始轉(zhuǎn)基因的有性雜交或無(wú)性繁殖產(chǎn)生者。本文所用術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"不包括因常規(guī)植物育種方法或自然發(fā)生事件例如隨機(jī)異體受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變引起的基因組(染色體或染色體外)的改變。如本文所使用，"載體"包括用于宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染并可在其中插入多核苷酸的核酸。載體通常為復(fù)制子。表達(dá)載體允許插入其中的核酸轉(zhuǎn)錄。以下術(shù)語(yǔ)用于描述兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系(a)"參比序列"，(b)"對(duì)比窗口"，(c)"序列同一性"，(d)"序列同一性百分比"，以及(e)"實(shí)質(zhì)同一性"。12如本文所使用，"參比序列"為用作序列對(duì)比基準(zhǔn)的已定義序列。參比序列可以是特定序列的子序列或全部；例如，為全長(zhǎng)cDNA或基因序列、或完整cDNA或基因序列的片段。如本文所使用,"對(duì)比窗口"指包括多核苷酸序列的連續(xù)和特定片段,其中該多核苷酸序列可與參比序列對(duì)比并且其中對(duì)比窗口中的多核苷酸序列部分可含有相對(duì)于參比序列(不含添加或缺失)用于優(yōu)化兩個(gè)序列比對(duì)的添加或缺失(即缺口)。通常，對(duì)比窗口長(zhǎng)度至少為20個(gè)連續(xù)核苷酸，任選30、40、50、100或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解通常引入缺口罰分并將其從匹配數(shù)值中減去以避免由于在多核苷酸序列中包含缺口而引起的與參比序列的高度相似。用于對(duì)比核苷酸和氨基酸序列的比對(duì)方法為本領(lǐng)域人員熟知。Smith和Waterman，(1981)Adv.A卯l.Math2:482中的局部同源性算法(BESTFIT)可優(yōu)化比較序列的比對(duì)；也可通過(guò)Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443-53中的同源比對(duì)算法(GAP);還可通過(guò)Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA85:2444的相似性檢索方法(Tfasta和Fast.a);通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施，包括但不限于PC/Geneprogram中的CLUSTAL，(Intelligenet.ics，MountainView，California)禾口WisconsinGeneticsSoftwarePackage第8片反(可購(gòu)自GeneticsComputerGroup(GCGprograms(Accelrys，Inc.，SanDiego，CA))中的GAP、BESTF]:T、BLAST、FASTA和TFASTA。下列文獻(xiàn)詳細(xì)地闡述了CLUSTAL程序Higgins禾卩Sharp,(1988)Gene73:237-44;Higgins禾PSharp,(1989)CABIOS5:15卜3;Corpet等，(1988)NucleicAcidsRes.16:1088卜90;Huang等，(1992)ComputerApplicationsintheBiosciences8:155-65;以及Pearson等，(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-31。用于優(yōu)化多序列總體比對(duì)的優(yōu)選程序?yàn)镻i:l.eUp(Feng和I)oolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25:35卜60，且其與Higgins和Sharp，(1989)CABI0S5:151-53描述的方法相似，以引用形式并于本文)。用于數(shù)據(jù)庫(kù)相似性檢索的BLAST家族程序包括在核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列中進(jìn)行核苷酸查詢序列的BLASTN;在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)序列中進(jìn)行核苷酸查詢序列的BLASTX;在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)序列中進(jìn)行蛋白質(zhì)查詢序列的BLASTP;在核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列中進(jìn)行蛋白質(zhì)查詢序列的TBLASTN和在核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列中進(jìn)行核苷酸查詢序列的TBLASTX。參見(jiàn)分子生物學(xué)通用規(guī)程(CURRENTPROTOCOLSI雨OLECULARBIOLOGY)，第19章，Ausubel等編車茸,GreenePublishing禾卩Wiley-Interscience，NewYork(1995)。GAP使用了Needleman和Wunsch，上文的算法以尋找既能最大化匹配數(shù)量又能最小化缺口數(shù)量的兩個(gè)完整序列的比對(duì)。GAP考慮所有可能的比對(duì)及缺口位置，并創(chuàng)建最多匹配堿基數(shù)目和最少缺口的比對(duì)。這使得能夠在匹配堿基單元中提供缺口生成罰分和缺口延伸罰分。GAP必須為其插入的每一個(gè)缺口利用匹配的缺口生成罰分?jǐn)?shù)量。如果選擇缺口延伸罰分大于()，GAP必須額外為每個(gè)被插入的缺口利用缺口長(zhǎng)度與缺口延伸罰分的乘積。WisconsinGeneticsSoftwarePackage第10版本中的默認(rèn)缺口生成罰分值和缺口延伸罰分值分別為8和2。缺口生成和缺口延伸罰分可表示為選自0至100的整數(shù)。因此，例如，缺口生成和缺口延伸罰分可以為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多。GAP代表了是最佳比對(duì)家族的一員。雖然這一家族中有很多成員，但是其它成員均沒(méi)有更好的質(zhì)量。GAP顯示四個(gè)比對(duì)品質(zhì)因數(shù)(figureofmerit):質(zhì)量、比率、同一性和相似性。質(zhì)量是為了比對(duì)序列而最大化的度量。比率是將質(zhì)量除以較短片段的堿基數(shù)目。同一性百分比是實(shí)際匹配符號(hào)的百分比。相似性百分比是相似符號(hào)的百分比。忽略從缺口13跨越的符號(hào)。當(dāng)一對(duì)符號(hào)的評(píng)分矩陣數(shù)值大于或等于O.50(相似性閾值)時(shí)會(huì)給出相似性評(píng)分。WisconsinGeneticsSoftwarePackage第10版本中用的評(píng)分矩陣為BL0SUM62(參見(jiàn)，Henikoff和Ifenikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)。除非另外說(shuō)明，本文提及的序列同一性/相似性數(shù)值指使用默認(rèn)參數(shù)的BLAST2.0程序組件獲得的數(shù)值(Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-402)。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解，BLAST檢索假設(shè)可將蛋白質(zhì)建模為隨機(jī)序列。但是,很多真實(shí)的蛋白質(zhì)包含非隨機(jī)序列區(qū)域(如同聚物段(tract)、短周期重復(fù))或富含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域。盡管蛋白質(zhì)的其它區(qū)域完全不類似,這些低復(fù)雜度區(qū)域仍可在非相關(guān)蛋白質(zhì)之間比對(duì)?？墒褂煤芏嗟蛷?fù)雜度過(guò)濾程序減少這樣的低復(fù)雜度比對(duì)。例如，可單獨(dú)或聯(lián)合使用SEG(Woot.en和Federhen，(1993)Comput.Chem.17:149-63)和XNU(Claverie和States,(1993)Comput.Chem.17:19卜201)低復(fù)雜度過(guò)濾器。如本文所使用，兩個(gè)核酸或多肽序列的"序列同一性"或"同一性"包括指在特定對(duì)比窗口下比對(duì)最大相應(yīng)性時(shí)相同的兩個(gè)序列中的殘基。當(dāng)序列同--'性百分比用于指蛋白質(zhì)時(shí)，人們認(rèn)識(shí)到不相同的殘基位置通常由于保守氨基酸替換而不同，其中氨基酸殘基被其它具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基替換并因此不改變?cè)摲肿拥墓δ苄再|(zhì)。在序列區(qū)別在于保守替換時(shí)，可上調(diào)序列同一性百分比以校正該替換的保守性質(zhì)。由于這些保守替換而不同的序列被稱為具有"序列相似性"或"相似性"。進(jìn)行這一調(diào)整的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通常其中涉及將保守置換作為部分錯(cuò)配而非全部錯(cuò)配進(jìn)行評(píng)分,藉此提高序列同一性百分比。因此,例如，當(dāng)相同氨基酸評(píng)分為1且非保守替換評(píng)分為()時(shí)，保守替換評(píng)分介于0和1之間。例如，根據(jù)Meyers和Miller,(1988)ComputerApplic.Biol.Sci.4:1卜17的算法計(jì)算保守替換的評(píng)分，例如，如程序PC/GENE所實(shí)施(Intelligenetics，MountainView，California,USA)。如本文所使用，"序列同一性百分比"指通過(guò)在對(duì)比窗口下比較兩個(gè)優(yōu)化比對(duì)序列得到的數(shù)值,其中對(duì)比窗口中的多核苷酸序列部分可包含與參比序列(其不包含增加或缺失)相比用于兩個(gè)序列最佳比對(duì)的添加或缺失(即，缺口)。百分比如下計(jì)算通過(guò)測(cè)定兩序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)量以得到匹配位置的數(shù)量，將匹配位置的數(shù)量除以對(duì)比窗口中總位置數(shù)量并將該結(jié)果乘以100即得到序列同一性百分比。術(shù)語(yǔ)多核苷酸序列的"實(shí)質(zhì)同一性"指用所述采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的比對(duì)程序之一與參比序列對(duì)比時(shí)，含有介于50_100%序列同一性的序列的多核苷酸，優(yōu)選至少50%序列同-性，優(yōu)選至少60%序列同一性，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可通過(guò)考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等適當(dāng)調(diào)整這些數(shù)值來(lái)測(cè)定由兩條核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的對(duì)應(yīng)同一性。用于這些目的的氨基酸序列實(shí)質(zhì)同一性通常指介于55-100%的序列同一性，優(yōu)選至少55%，優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%、80%、90%，且最優(yōu)選至少95%的序列同一性。核苷酸序列實(shí)質(zhì)同一的另一個(gè)指征為兩個(gè)分子是否在嚴(yán)格條件下相互雜交。遺傳密碼的簡(jiǎn)并性允許很多可引起編碼相同氨基酸的核苷酸序列變化的氨基酸替換，因此可能編碼相同多肽的DNA序列在嚴(yán)格條件下并不會(huì)相互雜交。例如當(dāng)使用遺傳密碼許可的最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)就可能發(fā)生這種情況。兩個(gè)核酸序列實(shí)質(zhì)同一的一個(gè)指征為由第一個(gè)核酸編碼的多肽與第二個(gè)核酸編碼的多肽有免疫交叉反應(yīng)性。肽的上下文中的術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)同--'性"表明肽包含在特定對(duì)比窗口中與參比序列的序列同一性介于55-100%的序列，優(yōu)選至少55%序列同一性，優(yōu)選60%，優(yōu)選70%，更優(yōu)選80%，最優(yōu)選至少90%或95%的序列同一性。優(yōu)選采用Needleman和Wunsch,上文的同源性比對(duì)算法進(jìn)行最佳比對(duì)。兩個(gè)肽序列實(shí)質(zhì)同一的一個(gè)指征是第一個(gè)肽與抗第二多肽的抗體有免疫反應(yīng)性。因此,例如當(dāng)兩個(gè)肽僅是由于保守替換而不同時(shí)第一個(gè)肽與第二個(gè)肽實(shí)質(zhì)同一。此外，當(dāng)兩個(gè)肽因非保守改變而不同時(shí)，如果抗體識(shí)別的表位實(shí)質(zhì)同一，那么第一個(gè)多肽與第二個(gè)多肽是實(shí)質(zhì)同一的。"實(shí)質(zhì)類似"的肽共有如上所述的序列，除了不相同的殘基位置可由于保守氨基酸變化而不同。本發(fā)明公開SCW多核苷酸和多肽。本發(fā)明的新穎核苷酸和蛋白質(zhì)的表達(dá)形式表明它們改變細(xì)胞壁形成并因此在植物發(fā)育中發(fā)揮重要作用。該多核苷酸可在多種植物組織中表達(dá)。因此該多核苷酸和多肽可為操縱植物發(fā)育以改變種子和營(yíng)養(yǎng)組織發(fā)育、時(shí)間安排(timing)或組成提供機(jī)會(huì)。可利用這一點(diǎn)產(chǎn)生不育植株、無(wú)種子植物或改變胚乳組成的植物。核酸本發(fā)明提供，特別是含有SCW多核苷酸的RNA、DNA的已分離核酸及其類似物和./或嵌合體。本發(fā)明也包括在不同組織中被優(yōu)化表達(dá)的多核苷酸。例如，對(duì)于在玉米植物中多核苷酸的表達(dá)，可改變序列以符合特異密碼子偏好并可依據(jù)Murray等....匕文所述改變GC含量。玉米植物中28個(gè)基因的玉米密碼子的使用列于如Murray等上文所述表4。本發(fā)明的SCW核酸包含已分離的SCW多核苷酸，其包括(a)編碼SCW多肽及其保守修飾的和多態(tài)變異體的多核苷酸；(b)與(a)或(b)的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；(c)(a)或(b)的多核苷酸的互補(bǔ)序列。下表(表1)列出了本文公開的玉米序列的的特定同一性。另外的表，表2，列出了本文公開的稻(0ryzasat.iva(0s))，擬南芥菜(Arabidopsisthaliana(At))，Populustrichocarpa(Pt)，Medicagotrimcatula(Mt)，禾口兩色蜀黍(Sorghumbicolor(Sb))中的SCW序列直向同源物的特定同一性。表1SCW組玉米序列身份SEQIDNO:SCW01多核苷酸0RF多肽多核苷酸轉(zhuǎn)錄物啟動(dòng)子SEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:77SEQIDNO:42515<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸被克隆、擴(kuò)增或另外地構(gòu)建自真菌或細(xì)菌。該核酸可方便地包含除本發(fā)明多核苷酸之外的序列。例如，可將包含一個(gè)或更多個(gè)核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)插入該核酸以輔助該多核苷酸的分離。也可插入可翻譯序列輔助分離本發(fā)明已翻譯的多核苷酸。例如，六-組氨酸標(biāo)記序列提供了純化本發(fā)明蛋白質(zhì)的便利方法。本發(fā)明核酸-不包括多核苷酸序列-任選為載體、接合體(adapter)或接頭以克隆和/或表達(dá)本發(fā)明多核苷酸?？上蛟摽寺『?或表達(dá)序列加入其它序列優(yōu)化它們?cè)诳寺『?/或表達(dá)中的功能、輔助分離該多核苷酸或促進(jìn)將該多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞。通常，本發(fā)明核酸的長(zhǎng)度小于本發(fā)明其多核苷酸的長(zhǎng)度，小于2()K堿基對(duì)，通常小于15Kb,經(jīng)常小于10Kb。克隆載體、表達(dá)載體、接合體和接頭的使用為本領(lǐng)域已知。示例性核酸包括該類載體，例如M13、入ZAPExpress、入ZAPII、入gt10、入gtll、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescriptII、ADASHII、AEMBL3、AEMBL4、pWE15、S叩erCos1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pS:PUTK、p3，SS、pGEM、pSK十/-、pGEX、pSP()RTI和11、pOPRSVICAT、p0PI3CA、pXTl、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、pOG44、pOG45、pFRTPGAL、pNEOPGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、入MOSSlox和AMOSElox。本發(fā)明的任選載體包括但不限于入ZAPII和pGEX。各種核酸的描述參見(jiàn)，例如，StratageneCloningSystems，Catalogs1995，1996，1997(LaJolla，CA)禾卩AmershamLifeSciences，Inc，Catalog'97(ArlingtonHeights,IL)。構(gòu)建核酸的合成方法可通過(guò)直接化學(xué)合成得到本發(fā)明己分離的核酸，通過(guò)如下方法如Narang等，(1979)Meth.Enzymo:[.68:90-9的磷酸三酯法;:Brown等，(1979)Meth.Enzymo:[.68:109-51的磷酸二酯法；Beaucage等，(1981)Tetra.Letts.22(20):1859-62的二乙基亞磷酰胺法；Beaucage等上文中描述的固相亞磷酰胺三酯法，例如使用自動(dòng)合成儀(例如Needham-VanDevanter，等.,(1984)NucleicAcidsRes.12:6159-68所述)和美國(guó)專利第4，458，066號(hào)的固體載體方法。化學(xué)合成通常產(chǎn)生單鏈寡聚核苷酸。這可通過(guò)與互補(bǔ)序列雜交或使用單鏈作為模板通過(guò)DNA聚合酶的聚合作用轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA。技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到雖然化學(xué)合成DNA限制于約100個(gè)堿基的序列，但是可通過(guò)連接較短序列得到更長(zhǎng)的序列。UTRs和密碼子偏好—般而言，已發(fā)現(xiàn)翻譯效率受RNA5'非編碼或非翻譯區(qū)(5'UTR)特異序列元件的調(diào)控。陽(yáng)性序列基序包括翻譯起始共有序列(Kozak，(1987)NucleicAcidsRes.15:8125)和5〈G〉7甲基GpppGRNA帽結(jié)構(gòu)(Dru咖ond等.，(1985)NucleicAcidsRes.13:7375)。陰性元件包括穩(wěn)定的分子內(nèi)5，UTR莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(Muesing等，(1987)Cell48:691)和AUG序列或在5，UTR中位于適當(dāng)AUG之后的短開放閱讀框(Kozak,上文，Rao等，(1988)Mol.andCell.Biol.8:284)。因此本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)異源編碼序列翻譯的5'和Z或3'UTR區(qū)。[O訓(xùn)]此外，可修飾本發(fā)明多核苷酸的多肽編碼區(qū)段以改變密碼子使用。被改變的密碼子使用可用于改變翻譯效率和/或優(yōu)化在期望宿主中表達(dá)的編碼序列或優(yōu)化在玉米中表達(dá)的異源序列的密碼子使用?？墒褂蒙虡I(yè)購(gòu)買的軟件包例如購(gòu)自UniversityofWisconsinGenet.icsComputerGroup的"密碼子偏好"分析本發(fā)明多核苷酸編碼區(qū)的密碼子使用。參見(jiàn)Devereaux等，(1984)NucleicAcidsRes.12:387_395;或MacVector4.1(EastmanKodakCo.,NewHaven,Conn.)。因此，本發(fā)明提供了至少一種本發(fā)明多核苷酸編碼區(qū)特有的密碼子使用頻率?？捎糜跍y(cè)定密碼子使用頻率的多核苷酸數(shù)量(每個(gè)氨基酸3個(gè)核苷酸)可為從3至本文提供的本發(fā)明多核苷酸數(shù)量之間的任何整數(shù)。任選地，該多核苷酸為全長(zhǎng)序列。用于統(tǒng)計(jì)分析的示例性序列數(shù)量可為至少1、5、10、20、50或100個(gè)。序列改組本發(fā)明提供了使用本發(fā)明多核苷酸進(jìn)行序列改組的方法和藉此得到的組成。序列改組闡述于PCT出版物第96/19256號(hào)。也可參見(jiàn)Zhang等.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-9;和Zhao等.，(1998)NatureBiotech16:258-61。一般而言，序列改組可提供產(chǎn)生具有期望特性的多核苷酸文庫(kù)，其可供選擇或用于篩選。重組多核苷酸文庫(kù)產(chǎn)生自相關(guān)序列多核苷酸群，其包含序列區(qū)，其具有實(shí)質(zhì)序列同-"性并可體外或體內(nèi)同源重組。序列重組多核苷酸群包含具有期望或有利特性并可通過(guò)適當(dāng)選擇或篩選方法選擇的多核苷酸亞群。該特性可為可用于在篩選系統(tǒng)中選擇或檢測(cè)的任何性質(zhì)或特性,可包括下列的性質(zhì)被編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄元件、基因或轉(zhuǎn)基因的序列控制轉(zhuǎn)錄、:RM加工、RNA穩(wěn)定性、染色質(zhì)構(gòu)象、翻譯或其它表達(dá)性質(zhì)、復(fù)制元件、蛋白質(zhì)-結(jié)合元件等，例如任何可賦予可選擇或可檢測(cè)性質(zhì)的特性。在一些實(shí)施方案中，該所選擇特性為與本文提供的野生型蛋白質(zhì)相比改變的K。,和/或K^t。在其它實(shí)施方案中，產(chǎn)生自序列改組的蛋白質(zhì)或多核苷酸比非改組野生型多核苷酸的配體結(jié)合親和性更強(qiáng)。在又一實(shí)施方案中，產(chǎn)生自序列改組的蛋白質(zhì)或多核苷酸與非改組野生型多核苷酸相比其最優(yōu)PH改變。該類性質(zhì)的增加可至少為野生型數(shù)值的110%、120%、130%、140%或大于150%。重組表達(dá)盒本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明核酸的重組表達(dá)盒?？墒褂镁幋a本發(fā)明期望多核苷酸的核酸(例如編碼足夠長(zhǎng)的多肽以編碼本發(fā)明活性蛋白質(zhì)的基因組序列的cDNA)構(gòu)建可導(dǎo)入期望宿主細(xì)胞的重組表達(dá)盒。重組表達(dá)盒通常包含與翻譯起始調(diào)節(jié)序列可操作地連接的本發(fā)明多核苷酸，所述翻譯起始調(diào)節(jié)序列可引導(dǎo)該多核苷酸在預(yù)期宿主細(xì)胞中(例如被轉(zhuǎn)化植物的組織)的轉(zhuǎn)錄。例如，植物表達(dá)載體可包括(1)5，和3'調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)錄控制下的克隆植物基因和(2)顯性選擇標(biāo)記。需要時(shí)該類植物表達(dá)載體也可包含啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(例如，賦予誘導(dǎo)型或組成型、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)型或細(xì)胞或組織特異性/選擇性表達(dá))、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、:RM加工信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或多腺苷酸化信號(hào)。可使用可在再生植物的所有組織中引導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸表達(dá)的植物啟動(dòng)子片段。該類啟動(dòng)子在本文中被稱作"組成型"啟動(dòng)子，其在大多數(shù)環(huán)境條件下和發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)下是活性的。組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的T-I)NA的1'或2'啟動(dòng)子、Smas啟動(dòng)子、肉桂醇脫氫酶啟動(dòng)子(美國(guó)專利第5，683，439號(hào))、Nos啟動(dòng)子、rubisco啟動(dòng)子、GRP卜8啟動(dòng)子、來(lái)自花椰菜花斑病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子(如0dell等，(1985)Nature313:810-2所述)；稻肌動(dòng)蛋白(McElroy等，(1990)PlantCell163-171);泛素(Christensen等,(1992)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen等，(1992)PlantMo:1.Biol.18:675-89);pEMU(Last等，(1991)Theor.Appl.Genet.81:58卜8);MAS(Velten，等，(1984)EMB0J.3:2723-30);玉米H3組蛋白(L印et.it等，(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-85;和At.anassvoa等，(1992)PlantJournal2(3):291-300);ALS啟動(dòng)子如PCT申請(qǐng)第W096/30530號(hào)所述；G0S2(美國(guó)專利第6，504，083號(hào))32和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的來(lái)自各種植物基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。就本發(fā)明而言泛素為單子葉植物表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子?；蛘?，該植物啟動(dòng)子可引導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸在特異性組織中或在更精確的環(huán)境或發(fā)育控制條件下表達(dá)。該類啟動(dòng)子被稱作"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子(Rab17，RAD29)?？赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件包括病原體攻擊、厭氧環(huán)境或存在光照。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例為Adhl啟動(dòng)子，其可被缺氧或冷應(yīng)激誘導(dǎo)，Hsp70啟動(dòng)子，其可被熱應(yīng)激誘導(dǎo)，PPDK啟動(dòng)子，其可被光誘導(dǎo)。發(fā)育控制下的啟動(dòng)子實(shí)例包括僅在或優(yōu)選在某些組織例如葉、根、果實(shí)、種子或花中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的操作也可根據(jù)其在基因組中的位置而變化。因此，誘導(dǎo)型啟動(dòng)可在某些位點(diǎn)成為完全或部分組成型的。如果需要多肽表達(dá)，通常期望在多核苷酸編碼區(qū)的3'-端包含多腺苷酸化區(qū)。該多腺苷酸化區(qū)可來(lái)自各種植物基因或來(lái)自T-DNA。被加入的3'端序列可來(lái)源自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因或來(lái)自另--植物基因或較少優(yōu)選地來(lái)自任何其它真核基因。該類調(diào)節(jié)元件的實(shí)例包括但不限于3'終止和/或多腺苷酸化區(qū)例如來(lái)自根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合酶(nos)基因者(Bevan等,(1983)NucleicAcidsRes.12:369-85);馬鈴薯蛋白水解酶抑制劑II:(P皿]:)基因(Keil等，(1986)NucleicAcidsRes.14:5641-50;禾卩An等，(1989)PlantCell1:115-22);以及CaMV19S基因(Mogen等，(1990)PlantCell2:126卜72)的那些?？稍诓糠志幋a序列的5'非翻譯區(qū)或編碼序列加入內(nèi)含子序列以增加在胞質(zhì)溶膠中積累的成熟信號(hào)的量。在植物和動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體二者的轉(zhuǎn)錄單元中包含可剪接內(nèi)含子已顯示可在mRNA和蛋白質(zhì)二者水平上增加基因表達(dá)至1000-倍(Buchman和Berg，(1988)Mol.CellBiol.8:4395-4405;Callis等，(1987)GenesDev.1:1183-200)。當(dāng)置于轉(zhuǎn)錄單位的5'端附近時(shí)該基因表達(dá)的內(nèi)含子增強(qiáng)作用通常最強(qiáng)。使用玉米內(nèi)含子Adh卜S內(nèi)含子1、2和6，Bronze-1內(nèi)含子為本領(lǐng)域已知。一般地，可參見(jiàn)THEMAIZEHANDBOOK(玉米手冊(cè))，第116章，F(xiàn)reeling和Wal.bo(編輯)，Springer,NewYork(1994)。本發(fā)明可用植物信號(hào)序列包括但不限于將蛋白質(zhì)靶向于植物細(xì)胞胞外基質(zhì)的編碼信號(hào)肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos等，(1989)J.Biol.Chem.264:4896-900)，例如白花丹葉煙草(Nicotianaplumbaginifolia)擴(kuò)展基因(DeLoose等，(1991)Gene99:95-100);將蛋白質(zhì)耙向于液泡的信號(hào)肽，例如甘薯儲(chǔ)藏蛋白(sporaniin)基因(Matsuka等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:834)和大麥凝集素基因(Wilkins等，(1990)PlantCell，2:30H3);可引起蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)肽，例如PRIb(Lind等，(1992)PlantMol.Biol.18:47-53)或大麥a淀粉酶(BAA)信號(hào)肽(Rahmatullah等.，(1989)PlantMol.Biol.12:119，以引用形式并于本文)或?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶向于質(zhì)體的信號(hào)肽，例如油菜籽烯?；鵄CP還原酶信號(hào)肽(Verwaert等，(1994)PlantMol.Biol.26:189-202)。與SCW多核苷酸融合的大麥a淀粉酶信號(hào)序列為本發(fā)明用于在玉米中表達(dá)的優(yōu)選構(gòu)建體。包含來(lái)自本發(fā)明多核苷酸序列的載體通常包含標(biāo)記基因，其賦予植物細(xì)胞的選擇性表型。通常該選擇性標(biāo)記基因編碼抗生素抗性，適當(dāng)?shù)幕虬ň幋a抗生素大觀霉素抗性的基因(例如，aada基因)、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(SPT)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因、編碼可抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草劑(尤其是磺酰脲類除草33劑)抗性的基因(例如含有引起該抗性的突變的乙酰乳酸合成酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突變)、編碼可抑制谷氨酰胺合成酶作用的除草劑抗性的基因，例如膦絲菌素或basta(例如bar基因)或其它本領(lǐng)域己知基因。該bar基因編碼對(duì)除草劑basta的抗性，ALS基因編碼對(duì)除草劑氯磺隆的抗性。可用于高等植物中基因表達(dá)的常用載體為本領(lǐng)域已知并包括來(lái)源自如Rogers等，(1987)Meth.Enzymol.153:253-77所描述的根癌農(nóng)桿菌的腫瘤-誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒。這些載體為植物整合型載體，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)化時(shí)該載體將載體DM的一部分整合入宿主植物的基因組中。可用于本文的示例性根癌農(nóng)桿菌載體為Schardl等，(1987)Gene61:1-ll和Berger等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86:8402-6描述的質(zhì)粒pKYLX6和pKYLX7。本文另一可用載體為購(gòu)自CLONTECHLaboratories，Inc.(PaloAlto，CA)的質(zhì)粒pBI101.2。宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)使用本發(fā)明的核酸可在重組工程細(xì)胞例如細(xì)菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物或優(yōu)選植物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)。該細(xì)胞在非-天然條件(例如，數(shù)量、組成、位置和/或時(shí)間)下生產(chǎn)該蛋白質(zhì)，因?yàn)樗鼈円淹ㄟ^(guò)人為介入發(fā)生遺傳學(xué)改變以做到這一點(diǎn)。預(yù)期本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可用于表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸的很多表達(dá)系統(tǒng)。本文不詳細(xì)描述在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的各種方法。簡(jiǎn)略而言，可通過(guò)例如將DNA或cDNA與啟動(dòng)子(可為組成型或誘導(dǎo)型)可操作地連接然后將其并入表達(dá)載體以完成編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的已分離核酸的表達(dá)。該載體適用于原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中的復(fù)制和整合。典型的表達(dá)載體包含可用于調(diào)節(jié)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和啟動(dòng)子。為了得到已克隆基因的高水平表達(dá)，需要構(gòu)建至少包含引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子(例如泛素)、用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子的表達(dá)載體。將組成型啟動(dòng)子分類為提供一定范圍的表達(dá)。因此，有些為弱組成型啟動(dòng)子，其它為強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。通常,"弱啟動(dòng)子"意指驅(qū)動(dòng)編碼序列低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。"低水平"意指約1/10000轉(zhuǎn)錄物至約1/100000轉(zhuǎn)錄物至約1/500，000轉(zhuǎn)錄物的水平。相反，"強(qiáng)啟動(dòng)子"可驅(qū)動(dòng)編碼序列"高水平"表達(dá)，或約1Z10轉(zhuǎn)錄物至約1/100轉(zhuǎn)錄物至約1/1000轉(zhuǎn)錄物。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可修飾本發(fā)明蛋白質(zhì)而不降低其生物學(xué)活性。一些修飾可促進(jìn)分子的克隆、表達(dá)或靶向并入融合蛋白。該類修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并包括，例如，在氨基端加入甲硫氨酸以提供起始位點(diǎn)，或在兩端之一放置附加氨基酸(例如聚組氨酸)以產(chǎn)生方便定位的限制酶切位點(diǎn)或終止密碼子或純化序列。原核細(xì)胞中的表達(dá)原核細(xì)胞可用作表達(dá)宿主。原核細(xì)胞最普遍的代表為各種大腸桿菌株(E.coli);但是也可使用其它微生物株。通常使用的原核控制序列(本文定義為包括轉(zhuǎn)錄起始啟動(dòng)子，任選含有操作子，還有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列)包括這些通常使用的啟動(dòng)子例如P-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等，(1977)Nature198:1056)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goedde:l.,等，(1980)NucleicAcidsRes.8:4057)和來(lái)源自A的PL啟動(dòng)子和N-基因核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shimat.ake等，(1981)Nature292:128)。也可在在轉(zhuǎn)染大腸桿菌的DNA載體中包含選擇標(biāo)記。該類標(biāo)記的實(shí)例包括指定對(duì)氨芐青霉素、四環(huán)素或氯霉素抗性的基因。所選擇載體允許將相關(guān)基因?qū)脒m當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中。細(xì)菌載體通常為質(zhì)?；蚴删w來(lái)源。用噬菌體載體顆粒感染或用裸露的噬菌體載體DNA轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)募?xì)菌細(xì)胞。如果使用質(zhì)粒載體，用該質(zhì)粒載體DNA轉(zhuǎn)染細(xì)菌細(xì)胞?？墒褂醚挎邨U菌屬物種(Bacillussp.)和沙門氏茵屬(Salmonella)獲得用于表達(dá)本發(fā)明蛋白的表達(dá)系統(tǒng)(Palva等，(1983)Gene22:229-35;Mosbach等，(1983)Nature302:543-5)。Pharmacia的pGEX_4T_l質(zhì)粒載體為本發(fā)明優(yōu)選的大腸桿菌表達(dá)載體。真核細(xì)胞中的表達(dá)許多真核表達(dá)系統(tǒng)例如酵母、昆蟲細(xì)胞系、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。如下簡(jiǎn)述,本發(fā)明可在這些真核系統(tǒng)中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，將如下文所討論的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞作為生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。在酵母中合成異源蛋白質(zhì)已廣為人知。Sherman等，(1982)METH0DSINYEASTGENETICS,ColdSpringHarborLaboratory為廣為認(rèn)可的描述可用于在酵母中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的各種方法的專著。用于生產(chǎn)真核蛋白質(zhì)的兩種廣泛使用的酵母為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。用于在酵母屬和畢赤酵母屬中表達(dá)的載體、菌株和方案為本領(lǐng)域已知并可從供應(yīng)商購(gòu)買(例如，Invitrogen)。期望時(shí)，適當(dāng)?shù)妮d體通常具有表達(dá)控制序列，例如啟動(dòng)子，包括3…磷酸甘油酸酯激酶或醇氧化酶，和復(fù)制起點(diǎn)、終止序列等。本發(fā)明蛋白質(zhì)一旦表達(dá)即可通過(guò)裂解細(xì)胞并將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分離技術(shù)應(yīng)用于該裂解產(chǎn)物或沉淀從酵母中分離?？赏ㄟ^(guò)使用Western印跡技術(shù)或其它標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定技術(shù)的放射免疫測(cè)定法監(jiān)控純化過(guò)程。也可將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的序列與各種表達(dá)載體連接用于轉(zhuǎn)染例如哺乳動(dòng)物、昆蟲或植物來(lái)源的細(xì)胞培養(yǎng)物。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)常為單層細(xì)胞形式雖然也可使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸液。本領(lǐng)域已開發(fā)了許多可表達(dá)完整蛋白質(zhì)的適當(dāng)宿主細(xì)胞系，包括HEK293、BHK21和CH()細(xì)胞系。這些細(xì)胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列，例如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子(例如，CMV啟動(dòng)子、HSVtk啟動(dòng)子或pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動(dòng)子)、增強(qiáng)子(Queen等，(1986)Immunol.Rev.89:49)和必要的加工信息位點(diǎn)，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)(例如，SV40大TAgpolyA附加位點(diǎn))和轉(zhuǎn)錄終止子序列。用于生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的其它動(dòng)物細(xì)胞可來(lái)自例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞系和雜交瘤目錄(第7版，1992)。用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的適當(dāng)載體通常來(lái)源自SF9桿狀病毒。適當(dāng)?shù)睦ハx細(xì)胞系包括蚊幼蟲、蠶、粘蟲、蛾和果蠅(Drosophia)細(xì)胞系，例如Schneider細(xì)胞系(參見(jiàn)，例如，Schneider,(1987)J.Erabryol.Exp.Morphol.27:353-65)。對(duì)于酵母而言，當(dāng)使用更高級(jí)的動(dòng)物或植物宿主細(xì)胞時(shí)通常將多腺苷酸化或轉(zhuǎn)錄終止子序列并入載體中。終止子序列的一個(gè)實(shí)例為來(lái)自牛生長(zhǎng)激素基因的多腺苷酸化序列。也可包括用于準(zhǔn)確剪接轉(zhuǎn)錄物的序列。剪接序列的一個(gè)實(shí)例為來(lái)自SV40的VP1內(nèi)含子(Sprague等，(1983)J.Virol.45:773-81)。此外，可將在宿主細(xì)胞中控制復(fù)制的基因序列并于載體中例如存在于牛乳頭狀瘤病毒類型_載體中者(S辜ia-C卿o，"BovinePapillomaVirusDNAaEukaryoticCloningVect.or，，，DNACLONING:APRACTICALAPPROACH,第二巻，Glover(編輯),IRL出版社，Arlington,VA,第213—38頁(yè)(1985))。此外，可使用置于適當(dāng)植物表達(dá)載體中的SCW基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。然后可從植物愈傷組織中分離該多肽或用轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物?？墒斋@該轉(zhuǎn)基因植物，并可對(duì)適當(dāng)?shù)慕M織(例如，種子或葉)運(yùn)用大規(guī)模蛋白質(zhì)提取和純化技術(shù)。植物轉(zhuǎn)化方法已知很多向植物中導(dǎo)入外源基因的方法并可用于向植物宿主中插入SCW多核苷酸，包括生物學(xué)和物理學(xué)植物轉(zhuǎn)化方案。參見(jiàn)，例如，Miki，等，"ProcedureforIntroducingForeignDNAintoPlants,"METHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECIINOLOGY,GlickandThompson(編輯)，CRCPress,Inc.,Boca:Raton，第67-88頁(yè)(1993)。所選方法隨宿主植物而變化，包括化學(xué)轉(zhuǎn)染方法例如磷酸鈣、微生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移例如農(nóng)桿菌屬(Horsch，等，(1985)Science227:1229-31)、電穿孔、顯微注射和生物射彈轟擊。植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化和植物再生的表達(dá)盒和載體以及體外培養(yǎng)方法為已知并可獲得。參見(jiàn)，例如，Gruber,等.，"Vectorsfor:P:l.antTransformation."METHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY,上文，第89-119頁(yè)。可通過(guò)一種或更多種通常使用的直接導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)將已分離多核苷酸或多肽導(dǎo)入植物。該類方案可根據(jù)靶向用于基因修飾的生物體、細(xì)胞、植物或植物細(xì)胞的類型(即單子葉或雙子葉)而變化。用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的適當(dāng)方法包括顯微注射(Crossway等，(1986)Biot.echniques4:320-334;美國(guó)專利第6300543號(hào))、電穿孔(Riggs等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等，(1984)EMB0J.3:2717-2722)和生物射彈顆粒加速(參見(jiàn)，例如，Sanford等，美國(guó)專利第4945050號(hào)；W091/10725;和McCabe等，(1988)Biotechnology6:923-926)。也可參見(jiàn)Tomes,等，通過(guò)微粒轟擊直接向完整植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移DNA(DirectDNATransferintolntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment).第197-213頁(yè)，PlantCell,TissueandOrganCulture,FundamentalMethods.0丄Gamborg&G.C.Phillips(編輯)，Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork，1995;美國(guó)專利第5736369號(hào)(分生組織);Weissinger等，(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477;Sanford,等，(1987)ParticulateScienceandTechnology5:27-37(洋蔥)；Christ.ou等，(1988)PlantPhysiol.87:671-674(大豆)；Datt.a等.，(1990)Biotechnology8:736-740(稻);Klein等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米);Klein等，(1988)Biotechnology6:559-563(玉米);W()91/10725(玉米)；Klein等，(1988)Plant.Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm等，(1990)Biotechnology8:833-839;和Gordon-Kamm等，(1990)PlantCell2:603-618(玉米)；Hooydaas-VanSlogteren&Hooykaas(1984)Nature(London)311:763-764;Bytebier等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349(百合科(Li:1.iaceae));DeWet等，(1985)TheExperimentalManipulationofOvuleTissues,G.P.Chapman等(編車lj;)，第197-209頁(yè)；Longman，NY(花粉)；Ka印pler等，(1990)PlantCellR印orts9:415-418;以及Ka印pler等，(1992)Theor.A卯l.Genet.84:560-566(頸須—介導(dǎo)轉(zhuǎn)化);美國(guó)專利第5693512號(hào)(超聲);1)，Hal:l.uin等，(1992)PlantCell4:1495-1505(電穿孔)；Li等，(1993)PlantCellR印ortsl2:250-255;Christou禾口Ford(1995)A麗lsofBotany75:407-413(稻);0sjoda等，(1996)NatureBiotech.14:745-750;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化(美國(guó)專利第5981840號(hào));碳化硅頸須方法(Frame等，(1994)PlantJ.6:941-948);激光方法(Guo等，(1995)PhysiologiaPlanta進(jìn)93:19-24);超聲方法(Bao等，(1997)UltrasoundinMedicine&Biology23:953-959;FinerandFiner(2000)LettApplMicrobiol.30:406-10;Amoah等，(2001)JExpBot52:1135-42);聚乙二醇方法(Krens等，(1982)Nature296:72-77);可使用電穿孔(Froram等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5824-5828)和顯微注射(Crossway等，(1986)Mol.Gen.Genet.202:179-185)轉(zhuǎn)化單子葉和雙子葉細(xì)胞的原生質(zhì)體；均以引用形式并于本文。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體導(dǎo)入植物最普遍使用的方法是基于農(nóng)桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)為植物致病性土壤細(xì)菌，其可遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒分別攜帶用于遺傳轉(zhuǎn)化植物的基因。參見(jiàn)，例如，Kado,(1991)Crit.Rev.PlantSci.10:1。農(nóng)桿菌屬載體系統(tǒng)和農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法闡述于Gruber等，上文；Miki等，上文；和Moloney等，(1989)PlantCe:l.1R印ort.s8:238。相似的，該基因可插入分別來(lái)自根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)。因此,可使用這些質(zhì)粒如上所述構(gòu)建表達(dá)盒。己知許多控制序列，當(dāng)其與異源編碼序列偶聯(lián)并轉(zhuǎn)化入宿主有機(jī)體時(shí)就原始編碼序列的組織/器官特異性而言呈現(xiàn)出保真基因表達(dá)。參見(jiàn)，例如，Benfey和Chua，(1989)Science244:174-81。尤其適用于這些質(zhì)粒的控制序列為該基因在各種靶植物中組成型葉-特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。其它可用的控制序列包括來(lái)自胭脂堿合酶(N0S)基因的啟動(dòng)子和終止子。N0S啟動(dòng)子和終止子存在于質(zhì)粒pARC2，可購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為ATCC67238。如果使用該體系則來(lái)自Ti或Ri質(zhì)粒之--的毒性(vir)基因也必須存在，或與T-DNA部分一起或通過(guò)二元系統(tǒng)(其中vir基因存在于另一獨(dú)立的載體中)。該類系統(tǒng)，其中使用的載體以及轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法闡述于美國(guó)專利第4658082號(hào)，美國(guó)專利申請(qǐng)第913914號(hào)，申請(qǐng)日期1986年10月1日，如美國(guó)專利第5262306號(hào)中引用，授權(quán)于1993年11月16日;禾口Simpson等，(1986)PlantMol.Biol.6:403-15(也被'306專利引用)；其完整內(nèi)容均以引用形式并于本文。構(gòu)建之后可將這些質(zhì)粒置于發(fā)根農(nóng)桿菌或根癌農(nóng)桿菌并將這些載體用于轉(zhuǎn)化植物種細(xì)胞，其對(duì)鐮孢茵屬(Fusarium)或鏈格孢屬(Alternaria)的感染敏感。本發(fā)明也涵蓋幾種其它轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、稻、三葉草、巻心菜、香蕉、咖啡、芹菜、煙草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。選擇發(fā)根農(nóng)桿菌還是根癌農(nóng)桿菌取決于藉此轉(zhuǎn)化的植物。通常根癌農(nóng)桿菌為轉(zhuǎn)化優(yōu)選的生物體。大多數(shù)雙子葉植物、一些裸子植物和少數(shù)單子葉植物(例如，Liliales和Arales的某些成員)對(duì)根癌農(nóng)桿菌感染敏感。發(fā)根農(nóng)桿菌的宿主范圍也較寬，包括大多數(shù)雙子葉植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成員。單子葉植物的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在取得一些成功。歐洲專利申請(qǐng)第604662A1號(hào)公開了用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法。歐洲專利第672752A1公開了用未成熟胚的盾片以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法。Ishida等討論了通過(guò)將根癌農(nóng)桿菌與未成熟胚接觸轉(zhuǎn)化玉米的方法(NatureBiotechnology14:745-50(1996))。-一經(jīng)轉(zhuǎn)化，這些細(xì)胞可用于再生轉(zhuǎn)基因植物。例如，可用這些載體通過(guò)損傷植物并將載體引入傷口位點(diǎn)從而感染整個(gè)植物?？蓳p傷植物的任何部分，包括葉、莖和根?；蛘呖捎眠@些載體接種外植體形式的植物組織,例如子葉組織或葉盤并在促進(jìn)植物再生的條件下培養(yǎng)。用發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌(包含編碼煙曲霉毒素降解酶的基因)接種植物組織轉(zhuǎn)化的根或枝條可作為植物組織來(lái)源，或通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生或器官發(fā)生再生煙曲霉毒素抗性轉(zhuǎn)基因植物。該類再生植物組織的方法的實(shí)例公開于Shahin,Theor.Appl.Genet.69:235-40(1985);美國(guó)專利第4658082號(hào);Sirapson，等，上文；美國(guó)專利申請(qǐng)第913913號(hào)和913914號(hào)，均申請(qǐng)于1986年10月1日，如美國(guó)專利申請(qǐng)第5262306號(hào)(授權(quán)于1993年11月16日)所引用，完整公開內(nèi)容以引用形式并于本文。直接基因轉(zhuǎn)移雖然農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的宿主范圍很廣，一些主要的谷類作物種和裸子植物通常對(duì)該基因轉(zhuǎn)移模式具有抗性，盡管最近已在稻中取得一些成功(Hiei，等，(1994)ThePlantJournal6:271-82)。已研發(fā)了數(shù)種植物轉(zhuǎn)化的方法(總稱為直接基因轉(zhuǎn)化)作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的另一選擇。一種廣泛適用的植物轉(zhuǎn)化方法為微粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，其中將DNA載于約1-4ura微粒的表面。用可將微粒加速至300至600m,Zs速度足以穿透植物細(xì)胞壁和膜的生物射彈設(shè)備將該表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織(Sanford等，(1987)Part.Sci.Technol.5:27;Sanford，(1988)TrendsBiotech6:299;Sanford，(1990)Physiol.Plant79:206;和Klein等，(1992)Biotechnology10:268)。另一種向植物物理傳遞DNA的方法為如Zang，等，(1991)BioTechnology9:996中闡述的靶細(xì)胞超聲?；蛘撸褂弥|(zhì)體或原生質(zhì)球融合體向植物中導(dǎo)入表達(dá)載體。參見(jiàn)，Deshayes等，(1985)EMB0J.4:2731;和Christou等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3962。也有報(bào)導(dǎo)使用CaCl2沉淀,聚乙烯醇或聚L-鳥氨酸可直接攝取DM至原生質(zhì)體。參見(jiàn)，例如，Hain，等，(1985)Mol.Gen.Genet.199:161;andDraper,etal.，(1982)PlantCellPhysiol.23:451。已闡述了原生質(zhì)體、完整細(xì)胞和組織的電穿孔。參見(jiàn)，例如，Donn等，(1990)，AbstractsoftheV]:]:th]:nt'1.CongressonPlantCellandTissueCultureI:A:PTC，A2-38，第53頁(yè)；D，Halluin，等，(1992)PlantCel14:1495-505;和Spence等，(1994)PlantMol.Biol.24:5卜61。增加SCW多肽的活性和/或水平提供了增加本發(fā)明SCW多肽活性和/或水平的方法?？赏ㄟ^(guò)向植物提供SCW多肽增加本發(fā)明scw多肽的水平和/或活性。可通過(guò)向植物中導(dǎo)入編碼scw多肽的氨基酸序列、向植物中導(dǎo)入編碼scw多肽的核苷酸序列或通過(guò)選擇編碼本發(fā)明scw多肽的基因組基因座不同基因組變體提供SCW多肽。如本文其它部分所述,本領(lǐng)域已知許多向植物提供多肽的方法，包括但不限于向植物中直接導(dǎo)入多肽，向植物中導(dǎo)入(瞬時(shí)或穩(wěn)定)編碼具有次生細(xì)胞壁發(fā)育活性的多肽的多核苷酸構(gòu)建體。也應(yīng)該認(rèn)識(shí)到本發(fā)明方法可應(yīng)用不可在已轉(zhuǎn)化植物中引導(dǎo)蛋白質(zhì)或RNA表達(dá)的多核苷酸。因此，可通過(guò)改變編碼SCW多肽或其啟動(dòng)子的基因增加SCW多肽的水平和/或活性。參見(jiàn)，例如，Kniiec，美國(guó)專利第5565350號(hào)；Zarling等，PCT/US93/03868。因此提供了攜帶SCW基因突變的誘變植物，其中該突變可增加SCW基因的表達(dá)或增加被編碼SCW多肽的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性。降低SCW多肽的活性和/或水平38提供了通過(guò)用表達(dá)抑制SCW多肽表達(dá)的多核苷酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞降低或消除本發(fā)明SCW多肽活性的方法。該多核苷酸可通過(guò)防止SCW信使RNA的翻譯直接地或通過(guò)編碼抑制編碼SCW多肽的SCW基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的多肽間接地抑制SCW多肽的表達(dá)。抑制或消除植物細(xì)胞基因表達(dá)的方法為本領(lǐng)域已知，本發(fā)明中可使用任何這種方法抑制SCW多肽的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，如果SCW多肽的蛋白水平低于未經(jīng)基因修飾或誘變以抑制該SCW多肽表達(dá)的植物中相同SCW多肽蛋白水平的70%，則SCW多肽的表達(dá)被抑制。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明被修飾的植物中SCW多肽的蛋白水平低于不是突變體或未經(jīng)基因修飾以抑制該SCW多肽表達(dá)的植物中相同SCW多肽蛋白水平的60%、低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于10%、低于5%或低于2%?？赏ㄟ^(guò)例如檢測(cè)植物細(xì)胞或植物中SCW多肽的表達(dá)水平直接地或例如通過(guò)測(cè)定植物細(xì)胞或植物中SCW多肽的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性或通過(guò)測(cè)定植物的生物量間接地測(cè)定scw多肽的表達(dá)水平。進(jìn)行該類檢測(cè)的方法闡述于本文其它部分。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，通過(guò)用包含編碼抑制SCW多肽活性的多肽的多核苷酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞降低或消除SCW多肽活性。根據(jù)本發(fā)明如果SCW多肽的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性小于未經(jīng)修飾以抑制該SCW多肽的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性的植物中相同SCW多肽的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性的70%，則該SCW多肽的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性被抑制。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明被修飾的植物中該scw多肽的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性小于未經(jīng)修飾以抑制該SCW多肽表達(dá)的植物中該相同SCW多肽的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性的60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%或小于5%。當(dāng)通過(guò)本文別處描述的檢測(cè)方法不可檢測(cè)時(shí)則根據(jù)本發(fā)明SCW多肽的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性被"消除"。測(cè)定SCW多肽植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性的方法闡述本文其它部分。在其它實(shí)施方案中，可通過(guò)破壞SCW多肽的編碼基因降低或消除SCW多肽的活性。本發(fā)明涵蓋具有SCW基因突變的誘變植物，其中該突變降低SCW基因的表達(dá)或抑制被編碼的scw多肽的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性。因此，很多方法可用于降低或消除SCW多肽的活性。此外，不止一種方法可用于降低單個(gè)scw多肽的活性。降低或消除scw多肽表達(dá)的非限制性實(shí)例見(jiàn)以下內(nèi)容。1.基于多核苷酸的方法在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用可表達(dá)抑制本發(fā)明SCW多肽表達(dá)的多核苷酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"指基因產(chǎn)物的生物合成，包括所述基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，為達(dá)到本發(fā)明目的，可表達(dá)抑制至少一種scw多肽表達(dá)的多核苷酸的表達(dá)盒為可產(chǎn)生抑制至少一種本發(fā)明SCW多肽轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的RNA分子的表達(dá)盒。從DNA分子"表達(dá)"或"生產(chǎn)"蛋白質(zhì)或多肽指轉(zhuǎn)錄或翻譯該編碼序列以產(chǎn)生該蛋白或多肽，而從RNA分子"表達(dá)"或"生產(chǎn)"蛋白質(zhì)或多肽指翻譯RNA編碼序列以產(chǎn)生該蛋白質(zhì)或多肽。抑制SCW多肽表達(dá)的多核苷酸實(shí)例如下所示i.有義抑制/共抑制在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可通過(guò)有義抑制或共抑制抑制SCW多肽的表達(dá)。對(duì)于共抑制而言，設(shè)計(jì)一個(gè)表達(dá)盒表達(dá)相應(yīng)于全部或部分以"有義"方向編碼scw多肽的信使RNA的RNA分子。該RNA分子的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致天然基因表達(dá)降低。因此，篩選經(jīng)共抑制表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的多種植物系以鑒定呈現(xiàn)SCW多肽表達(dá)最大抑制者。用于共抑制的多核苷酸可對(duì)應(yīng)于全部或部分編碼SCW多肽的序列，全部或部分SCW多肽轉(zhuǎn)錄物的5'和/或3'非翻譯區(qū)，或全部或部分編碼SCW多肽轉(zhuǎn)錄物的編碼序列和非翻譯區(qū)兩者。在一些實(shí)施方案中多核苷酸包含部分或全部SCW多肽的編碼區(qū)，將該表達(dá)盒設(shè)計(jì)成消除該多核苷酸的起始密碼子這樣就不會(huì)翻譯任何蛋白質(zhì)產(chǎn)品。共抑制可用于抑制植物基因表達(dá)以產(chǎn)生具有不可檢測(cè)蛋白水平的由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的植物。例如，參見(jiàn)，Broin等.，(20()2)PlantCel:[14:1417-1432。共抑制也可用于抑制相同植物中的多種蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如，參見(jiàn)，美國(guó)專利第5942657號(hào)。使用共抑制抑制植物內(nèi)源基因表達(dá)的方法闡述于Flavell等.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3490-3496;Jorgensen等，(1996)PlantMol.Biol.31:957-973;Johansen和Carrington(2001)PlantPhysiol.126:930-938;Broin等，(2002)PlantCell.14:1417-1432;Stout.jesdijk等，(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731;Yu等，(2003)Phytochemistry63:753-763;和美國(guó)專利第5034323號(hào)、5283184號(hào)和5942657號(hào)，均以引用形式并于本文。可通過(guò)在表達(dá)盒于有義序列的3'位置和多腺苷酸化信號(hào)的5'位置導(dǎo)入多聚-dT區(qū)增加共抑制效率。參見(jiàn)，美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20020048814號(hào)，以引用形式并于本文。通常這種核苷酸序列與內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄物序列具有實(shí)質(zhì)同--'性，優(yōu)選大于約65%序列同一性，更優(yōu)選大于約85%序列同一性，最優(yōu)選大于約95%序列同一性。參見(jiàn)，美國(guó)專利第5283184號(hào)和5034323號(hào)，以引用形式并于本文。ii.反義抑制在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)反義抑制獲得對(duì)SCW多肽表達(dá)的抑制。對(duì)于反義抑制而言，將該表達(dá)盒設(shè)計(jì)為表達(dá)與編碼SCW多肽的信使RNA的全部或部分互補(bǔ)的RNA分子。該反義RNA分子的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致原始基因的表達(dá)降低。因此,篩選用該反義抑制表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的多種植物系以識(shí)別呈現(xiàn)SCW多肽表達(dá)最大抑制者。用于反義抑制的多核苷酸可對(duì)應(yīng)于編碼SCW多肽的序列的互補(bǔ)體的全部或部分，SCW轉(zhuǎn)錄物5'和/或3'非翻譯區(qū)的全部或部分，或編碼SCW多肽的轉(zhuǎn)錄物的編碼序列和非翻譯區(qū)二者的互補(bǔ)體的全部或部分。此外，該反義多核苷酸可與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)(即與目標(biāo)序列的互補(bǔ)物同一性為1()()%)或部分互補(bǔ)(即與目標(biāo)序列的互補(bǔ)物同一性小于100%)。反義抑制可用于抑制相同植物中多種蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利第5942657號(hào)。而且，反義核苷酸的部分可用于破壞目標(biāo)基因的表達(dá)。一般而言，可使用至少50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸，300、400、450、500、550或更多的核苷酸的序列。使用反義抑制來(lái)抑制植物中內(nèi)源基因表達(dá)的方法闡述于，例如Liu等，(2()()2)PlantPhysiol.129:1732-1743和美國(guó)專利第5759829號(hào)和第5942657號(hào)，均以引用形式并于本文。通過(guò)在表達(dá)盒于反義序列的3'位置和多腺苷酸化信號(hào)的5'位置包含多聚-dT區(qū)可增加反義抑制的效率。參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20020048814號(hào)，以引用形式并于本文。iii.雙鏈RNA干擾在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可通過(guò)雙鏈RNA(dsRNA)干擾獲得對(duì)SCW多肽表達(dá)的抑制。對(duì)于dsRNA千擾而言，將如....匕所述用于共抑制的有義RNA分子和與有義RNA分子完全或部分互補(bǔ)的反義RNA分子表達(dá)在相同的細(xì)胞中，從而抑制了對(duì)應(yīng)內(nèi)源信使RNA的表達(dá)。通過(guò)設(shè)計(jì)包含有義序列和反義序列兩者的表達(dá)盒完成該有義和反義分子的表達(dá)。或者，對(duì)有義和反義序列可使用單獨(dú)的表達(dá)盒。然后篩選用單個(gè)dsRNA千擾表達(dá)盒或復(fù)數(shù)個(gè)表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的多種植物系以鑒別呈現(xiàn)SCW多肽表達(dá)最大抑制的植物系。使用dsRNA干擾抑制內(nèi)源植物基因表達(dá)的方法闡述于Waterhouse等.，(1998):Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13959-13964，Liu等，(2002)PlantPhysiol.129:1732-1743，以及WO99/49029、WO99/53050、WO99/61631和WO00/49035，均以引用形式并于本文。iv.發(fā)夾RNA干擾和含內(nèi)含子發(fā)夾RNA干擾在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可通過(guò)發(fā)夾RNA(hpRNA)干擾或含內(nèi)含子發(fā)夾RNA(ihpRNA)干擾抑制SCW多肽的表達(dá)。這些方法可高效抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。參見(jiàn)Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38，及其中引用的文獻(xiàn)。對(duì)于hpRNA干擾,將表達(dá)盒設(shè)計(jì)為表達(dá)可與其自身雜交以形成包含單鏈環(huán)區(qū)和堿基配對(duì)莖的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的:rm分子。該堿基配對(duì)莖區(qū)包含對(duì)應(yīng)于全部或部分編碼表達(dá)被抑制的基因的內(nèi)源信使RNA的有義序列，和與該有義序列完全或部分互補(bǔ)的反義序列。因此，該分子的堿基配對(duì)莖區(qū)通常決定了該RNA千擾的特異性。hpRNA分子可高效抑制內(nèi)源基因的表達(dá)，它們所誘導(dǎo)的RNA干擾可遺傳至植物后代中。參見(jiàn)，例如Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4985-4990;Stoutjesdijk等，(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38。用于hpRNA干擾抑制或沉默基因表達(dá)的方法闡述于例如，Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4985-4990;Stoutjesdijk等,(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38;Pandolfini等，:BMCBiotechnology3:7，美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20030175965號(hào)；均以引用形式并于本文。hpRNA構(gòu)建體沉默體內(nèi)基因表達(dá)的有效性的瞬時(shí)分析闡述于Panstruga，et.al.，(2003)Mol.Biol.R印.30:135-140，通過(guò)引用并于本文。對(duì)于ihp:RM而言，該干擾分子具有與hp:RM相同的通用結(jié)構(gòu)，但是該RNA分子還包含可在表達(dá)該ihpRNA的細(xì)胞內(nèi)被剪接的內(nèi)含子。使用內(nèi)含子可在剪接后最小化發(fā)夾RNA分子環(huán)的大小并且增加千擾效率。參見(jiàn)，例如，Smith等，(2000)Nature407:319-320。事實(shí)上Smith等人證實(shí)了使用ihpRNA介導(dǎo)干擾100%抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。使用ihpRNA干擾抑制內(nèi)源植物基因表達(dá)的方法闡述于，例如，Smith等，(2000)Nature407:319-320;Wesley等，(2001)PlantJ.27:58卜590;Wang和Wat.erhouse(2001)Curr.Opin.PlantBiol.5:146-150;Waterhouse和Helliwell(2003)Nat..Rev.Genet.4:29-38;Helliwell和Waterhouse(2003)Methods30:289-295,以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20030180945號(hào)，均以引用形式并于本文。用于hpRNA干擾的表達(dá)盒還可設(shè)計(jì)為該有義序列和反義序列不對(duì)應(yīng)于內(nèi)源RNA的形式。在這一實(shí)施方案中，該有義序列和反義序列在環(huán)序列側(cè)翼，其包含對(duì)應(yīng)于目標(biāo)基因的全部或部分內(nèi)源信使RNA的核苷酸序列。因此,是該環(huán)區(qū)決定了RNA干擾的特異性。參見(jiàn)，例如，WO02/00904，以引用形式并于本文。v.擴(kuò)增子介導(dǎo)的干擾擴(kuò)增子表達(dá)盒包含植物病毒來(lái)源序列，其包含全部或部分目標(biāo)基因但一般不是該天然病毒的全部基因。存在于該表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的該病毒序列允許轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物引導(dǎo)自身的復(fù)制。由擴(kuò)增子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物相對(duì)于目標(biāo)序列(即該SCW多肽的信使RNA)可為有義或反義。使用擴(kuò)增子抑制內(nèi)源植物基因表達(dá)的方法闡述于，例如，Angell和Baulcombe(1997)EMBOJ.16:3675-3684，Angell和Baulcombe(1999)PlantJ.20:357-362，及美國(guó)專利第6646805號(hào)，均以引用形式并于本文。vi.核酶在一些實(shí)施方案中，由本發(fā)明表達(dá)盒表達(dá)的多核苷酸為催化性RNA或具有對(duì)SCW多肽的信使RNA特異的核酶活性。因此，該多核苷酸引起該內(nèi)源信使RNA的降解,導(dǎo)致SCW多肽表達(dá)降低。這一方法闡述于，例如，美國(guó)專利第4987071號(hào)，以引用形式并于本文。vii.小干擾RNA或微小RNA在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可通過(guò)表達(dá)編碼微小RNA(miRNA)的基因進(jìn)行RNA千擾從而抑制SCW多肽的表達(dá)。miRNA為由約22個(gè)核糖核苷酸組成的調(diào)節(jié)劑。miRNA高效抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。參見(jiàn)，例如，Javier等，(2003)Nature425:257-263，以引用形式并于本文。對(duì)于miRNA千擾而言，將該表達(dá)盒設(shè)計(jì)為表達(dá)建模于內(nèi)源miRNA基因上的RNA分子。該miRNA基因編碼形成含有與另一內(nèi)源基因(目標(biāo)基因)互補(bǔ)的22-核苷酸序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA。對(duì)于SCW表達(dá)抑制而言，該22-核苷酸序列選自SCW轉(zhuǎn)錄物序列并含有所述SCW序列有義方向的22個(gè)核苷酸和與該有義序列互補(bǔ)的對(duì)應(yīng)反義序列的21個(gè)核苷酸。miRNA分子可高效抑制內(nèi)源基因的表達(dá)并且它們誘導(dǎo)的RNA千擾可遺傳至植物后代。2.基于多肽的基因表達(dá)抑制在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸編碼與編碼SCW多肽基因結(jié)合的鋅指蛋白，導(dǎo)致該基因表達(dá)降低。在具體的實(shí)施方案中，該鋅指蛋白與scw的調(diào)控區(qū)結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，該鋅指蛋白與編碼SCW多肽的信使RNA結(jié)合并防止其翻譯。篩選鋅指蛋白靶向位點(diǎn)的方法闡述于,例如，美國(guó)專利第6453242號(hào)，使用鋅指蛋白抑制植物基因表達(dá)的方法闡述于，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20030037355號(hào)，均以引用形式并于本文。3.基于多肽的蛋白活性抑制在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼與至少一種SCW多肽結(jié)合的抗體并減少scw多肽的次生細(xì)胞壁形成活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體的結(jié)合通過(guò)細(xì)胞數(shù)量控制機(jī)制導(dǎo)致抗體-SCW復(fù)合物周轉(zhuǎn)增加。在植物細(xì)胞中表達(dá)抗體和通過(guò)抗體的表達(dá)和與植物細(xì)胞蛋白結(jié)合來(lái)抑制分子途徑為本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知。參見(jiàn)，例如，Conrad和Sonnewald(2003)NatureBiotech.21:35-36，以引用形式并于本文。4.基因破壞(disruption)在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)破壞編碼SCW多肽的基因降低或消除SCW多肽的活性?？赏ㄟ^(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的任何方法破壞編碼scw多肽的基因。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)阻斷該基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用隨機(jī)或靶向誘變誘變植物并篩選次生細(xì)胞壁發(fā)育活性降低的植物以破壞該基因。i.轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)降低或消除一個(gè)或更多個(gè)SCW多肽的SCW活性。轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)包括將轉(zhuǎn)座子插入內(nèi)源SCW基因以降低或消除SCW多肽的表達(dá)。"SCW基因"意指編碼依據(jù)本發(fā)明的SCW多肽的基因。42在該實(shí)施方案中，通過(guò)將轉(zhuǎn)座子插入編碼SCW多肽基因的調(diào)控區(qū)或編碼區(qū)降低或消除一個(gè)或更多個(gè)SCW多肽的表達(dá)。可使用位于SCW基因的外顯子、內(nèi)含子、5'或3'非翻譯序列、啟動(dòng)子或任何其它調(diào)控序列內(nèi)的轉(zhuǎn)座子降低或消除被編碼的SCW多肽的表達(dá)和/或活性。用于轉(zhuǎn)座子標(biāo)記植物中特異基因的方法為本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知。參見(jiàn)，例如，Maes等.，(1999)TrendsPlantSci.4:90-96;Dharmapuri和Sonti(1999)FEMSMicrobiol.Lett.179:53-59;Meissner等，(2000)PlantJ.22:265-274;Phoga等，(2000)J.Biosci.25:57-63;Walbot(2000)Curr.()pin.PlantBiol.2:103-107;Gai等，(2000)NucleicAcidsRes.28:94-96;Fitzmaurice等，(1999)Genetics153:1919-1928)。此夕卜，用于在已選擇基因中篩選Mu插入的TUSC步驟已闡述于Bensen等，(1995)PlantCell7:75-84;Mena等，(1996)Science274:1537-1540;和美國(guó)專利第5962764號(hào)；均以引用形式并于本文。ii.活性降低的突變植物降低或去除植物內(nèi)源基因表達(dá)的其它方法也為本領(lǐng)域已知并可相似的應(yīng)用于本發(fā)明。這些方法包括其它形式的誘變作用，例如反求遺傳學(xué)意義(用PCR)上使用的用于鑒別內(nèi)源基因缺失植物系的甲磺酸乙酯誘導(dǎo)的誘變作用、缺失誘變和快中子缺失誘變。這些方法的實(shí)例見(jiàn)0hshima等.，(1998)Virology243:472-481;0kubara等，(1994)Genetics137:867-874;以及Quesada等，(2000)Genetics154:42卜436;均以引用形式并于本文。此外,篩選化學(xué)誘導(dǎo)突變的快速和自動(dòng)方法-TILLING(靶向基因組中誘導(dǎo)的局部損害(TargetingInducedLocalLesionsInGenomes))，(使用變性:HPLC或選擇性核酸內(nèi)切酶消化已選擇的PCR產(chǎn)物)也可用于本發(fā)明。見(jiàn)McCallum等，(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457，以引用形式并于本文。可影響被編碼蛋白的基因表達(dá)或干擾其功能(次生細(xì)胞壁形成活性)的突變?yōu)楸绢I(lǐng)域已知。基因外顯子中的插入突變通常形成無(wú)效突變體。保守殘基的突變?cè)谝种票痪幋a蛋白的次生細(xì)胞壁形成活性中是特別有效的。已闡述了適于以消除次生細(xì)胞壁發(fā)育活性為目標(biāo)的誘變作用的植物scw多肽的保守殘基。可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的步驟分離該類突變體，并可通過(guò)遺傳雜交堆疊(stack)不同SCW基因座中的突變。參見(jiàn)，例如，Gruis等，(2002)PlantCe:l114:2863-2882。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，由于基因倒置和重復(fù)基因座重組顯性突變體可用于引起RNA沉默。參見(jiàn)，例如，Kusaba等，(2003)PlantCell15:1455-1467。本發(fā)明涵蓋降低或去除一個(gè)或更多個(gè)SCW多肽活性的其它方法。改變或突變植物基因組核苷酸序列其它方法的實(shí)例為本領(lǐng)域已知并包括但不限于使用RNA:DNA載體、RNA:DNA突變載體、RNA:DNA修復(fù)載體、雜雙鏈寡核苷酸、自身互補(bǔ)RNA:DNA寡聚核苷酸和重組劑(re固bino卿ic)寡核苷堿基。所使用的該類載體和方法為本領(lǐng)域已知。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第5565350號(hào)；5731181號(hào)；5756325號(hào);5760012號(hào)；5795972號(hào)和5871984號(hào)，均以引用形式并于本文。也可參見(jiàn)W()98/49350、WO99/07865、WO99/25821,以及Beetham等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8774-8778;均以引用形式并于本文。iii.調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育活性在具體方法中，通過(guò)增加植物中SCW多肽的水平或活性增加植物中次生細(xì)胞壁發(fā)43育基因的水平和/活性。增加植物中SCW多肽的水平和/或活性的方法闡述于本文其它部分。簡(jiǎn)略而言，該類方法包括向植物提供本發(fā)明SCW多肽并藉此增加SCW多肽的水平和/或活性。在其它實(shí)施方案中，可通過(guò)將包含本發(fā)明SCW核苷酸序列的多核苷酸導(dǎo)入植物中從而提供編碼SCW多肽的SCW核苷酸序列、表達(dá)該SCW序列、增加該SCW多肽的活性并藉此增加植物或植物部分的次生細(xì)胞壁形成。在其它實(shí)施方案中，導(dǎo)入植物中的該sew核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定整合入該植物的基因組中。在其它方法中，可通過(guò)增加植物中SCW多肽的水平和./或活性增加植物組織的細(xì)胞數(shù)量和生物量。該類方法詳細(xì)闡述于本文其它部分。在一個(gè)該類方法中，將scw核苷酸序列導(dǎo)入植物中，該SCW核苷酸序列的表達(dá)降低SCW多肽的活性并藉此增加植物生長(zhǎng)和/或植物或植物部分的次生細(xì)胞壁發(fā)育。在其它實(shí)施方案中，該導(dǎo)入植物的scw核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定整合入該植物的基因組中。如上文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可識(shí)別用于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和/或植物中次生細(xì)胞壁發(fā)育多核苷酸和多肽的水平/活性的適當(dāng)啟動(dòng)子。本實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子闡述于本文其它部分。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了相對(duì)于對(duì)照植物組織的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育具有被修飾的植物生長(zhǎng)和/或次生細(xì)胞壁發(fā)育的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明植物中本發(fā)明sew多肽的水平/活性增加并因此植物生長(zhǎng)和/或該植物組織中的次生細(xì)胞壁發(fā)育增加。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明植物中本發(fā)明scw多肽水平被降低或消除并因此植物生長(zhǎng)和/或該植物組織中次生細(xì)胞壁發(fā)育降低。在其它實(shí)施方案中，該類植物具有被穩(wěn)定整合入它們基因組的核酸分子，該分子包含與驅(qū)動(dòng)該植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接的本發(fā)明的SCW核苷酸序列。iv.調(diào)節(jié)根發(fā)育本文提供了調(diào)節(jié)根發(fā)育的方法。通過(guò)"調(diào)節(jié)根發(fā)育"預(yù)期達(dá)到與對(duì)照植物相比植物根發(fā)育的任何改變。這些根發(fā)育的改變包括但不限于初生根的生長(zhǎng)速率、新生根重量、側(cè)根和不定根形成的范圍、維管系統(tǒng)、分生組織發(fā)育或徑向膨脹的改變。特別地,最期望的結(jié)果是具有更強(qiáng)維管系統(tǒng)的根，所述更強(qiáng)的維管系統(tǒng)改善了植物的站立性并因此降低根倒伏以及對(duì)害蟲的敏感性更低。本文提供了調(diào)節(jié)根發(fā)育的方法。該方法包含調(diào)節(jié)植物中SCW多肽的水平和/或活性。在一個(gè)方法中，向植物提供本發(fā)明的scw序列。在另--個(gè)方法中，通過(guò)向植物中導(dǎo)入包含本發(fā)明SCW核苷酸序列的多核苷酸從而提供SCW核苷酸序列、表達(dá)該SCW序列并藉此修飾根發(fā)育。在又另一個(gè)方法中，導(dǎo)入該植物的SCW核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定整合入該植物的基因組中。在其它方法中，通過(guò)改變植物中SCW多肽的水平或活性調(diào)節(jié)根發(fā)育。SCW活性的增加可導(dǎo)致根發(fā)育的至少一種或更多種以下改變，包括但不限于相對(duì)于對(duì)照植物根分生組織更大、根生長(zhǎng)增加、徑向膨脹增強(qiáng)、維管系統(tǒng)增強(qiáng)、根分枝增加、不定根更多和/或新生根重量增加。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"根生長(zhǎng)"涵蓋單子葉和雙子葉植物中組成其發(fā)育不同階段根體系的不同部分生長(zhǎng)的所有方面。也應(yīng)該理解的是根生長(zhǎng)增強(qiáng)可由其一個(gè)或更多個(gè)部分包括初生根、側(cè)根、不定根等的生長(zhǎng)增強(qiáng)引起。測(cè)量根體系中該發(fā)育改變的方法為本領(lǐng)域已知。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)第2003/0074698號(hào)和Werner等，(2001)PNAS18:10487-10492，二者均以引用形式并于本文。如上所述,本領(lǐng)域技術(shù)人員可識(shí)別用于調(diào)節(jié)植物中根發(fā)育的適當(dāng)啟動(dòng)子。這一實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子和根優(yōu)選啟動(dòng)子。示例性根優(yōu)選啟動(dòng)子闡述于本文其它部分。通過(guò)增加SCW多肽的活性和/或水平刺激根生長(zhǎng)并增加根質(zhì)量也可用于提高植物的站立穩(wěn)定性。術(shù)語(yǔ)"倒伏抗性"或"站立穩(wěn)定性"指植物將其自身固定于土壤中的能力。對(duì)于具有直立或半直立生長(zhǎng)習(xí)慣的植物而言，該術(shù)語(yǔ)也指在不利(環(huán)境的)條件下保持立式位置的能力。這一'性狀與根系統(tǒng)的大小、深度和形態(tài)學(xué)有關(guān)。此外,通過(guò)增加SCW多肽的水平和/或活性刺激根生長(zhǎng)并增加根質(zhì)量也可用于促進(jìn)外植體的體外繁殖。而且，由SCW活性的水平和./或活性增加引起的更高根生物量的產(chǎn)生對(duì)產(chǎn)量具有直接作用并對(duì)由根細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因根細(xì)胞或所述轉(zhuǎn)基因根細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的化合物的生產(chǎn)具有間接作用。由根培養(yǎng)物生產(chǎn)的一種相關(guān)化合物的實(shí)例為紫草素，通過(guò)該方法可有利增強(qiáng)其產(chǎn)量。因此本發(fā)明進(jìn)一步提供與對(duì)照植物的根發(fā)育相比根發(fā)育被調(diào)節(jié)的植物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明植物的本發(fā)明sew多肽的水平/活性增強(qiáng)并且根生長(zhǎng)和/或根生物量增加。在其它實(shí)施方案中，該類植物將包含與驅(qū)動(dòng)該植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接的本發(fā)明SCW核苷酸序列的核酸分子穩(wěn)定整合入它們的基因組。v.調(diào)節(jié)枝條和葉發(fā)育本發(fā)明也提供調(diào)節(jié)植物中枝條和葉發(fā)育的方法。"調(diào)節(jié)枝條和/或葉發(fā)育"意指植物枝條和/或葉發(fā)育中的任何改變。這些枝條和/或葉發(fā)育的改變包括但不限于根分生組織發(fā)育、葉數(shù)量、葉大小、葉和莖維管、節(jié)間長(zhǎng)度和葉衰老的改變。如本文所使用，"葉發(fā)育"和"枝條發(fā)育"涵蓋單子葉和雙子葉植物中在其發(fā)育不同階段分別組成葉體系和枝條體系的不同部分的生長(zhǎng)的所有方面。測(cè)量枝條和葉體系中這些發(fā)育改變的方法為本領(lǐng)域已知。參見(jiàn)，例如Werner等，(2001)PNAS98:10487-10492和美國(guó)專利申請(qǐng)第2003/0074698號(hào)，均以引用形式并于本文。調(diào)節(jié)植物中枝條和/或葉發(fā)育的方法包括調(diào)節(jié)本發(fā)明SCW多肽的活性和/或水平。在一個(gè)實(shí)施方案中提供了本發(fā)明的scw序列。在其它實(shí)施方案中，可通過(guò)向植物中導(dǎo)入包含本發(fā)明scw核苷酸序列的多核苷酸以提供本發(fā)明scw核苷酸序列、表達(dá)該scw序列并藉此修飾根和/或葉發(fā)育。在其它實(shí)施方案中，導(dǎo)入植物的該SCW核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定整合入該植物的基因組中。在具體的實(shí)施方案中，通過(guò)降低植物中SCW多肽的水平和/或活性調(diào)節(jié)枝條和/或葉發(fā)育。sew活性的降低可引起與對(duì)照植物相比至少一種或更多種以下枝條和Z或葉發(fā)育的改變，包括但不限于葉數(shù)量減少、葉表面減少、維管減少、節(jié)間變短和生長(zhǎng)矮小以及葉衰老推遲。如上文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可識(shí)別用于調(diào)節(jié)植物枝條和葉發(fā)育的適當(dāng)啟動(dòng)子。該實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、枝條-優(yōu)選啟動(dòng)子、枝條分生組織-優(yōu)選啟動(dòng)子和葉-優(yōu)選啟動(dòng)子。示例性啟動(dòng)子已闡述于本文其它部分。降低植物中SCW活性和/或水平可引起節(jié)間變短和生長(zhǎng)矮小。因此，本發(fā)明方法可45用于生產(chǎn)矮生植物。此外,如上文所述，調(diào)節(jié)植物中SCW活性可調(diào)節(jié)根和枝條二者的生長(zhǎng)。因此本發(fā)明進(jìn)一步提供了改變根/枝條比例的方法。可通過(guò)降低植物中SCW多肽的水平和Z或活性進(jìn)一步調(diào)節(jié)枝條或葉的發(fā)育。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供與對(duì)照植物相比根和/或葉發(fā)育被調(diào)節(jié)的植物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明植物中本發(fā)明sew多肽水平/活性增強(qiáng)，枝條和Z或葉發(fā)育被改變。這些改變包括但不限于與對(duì)照植物相比葉數(shù)量增加、葉表面增加、維管形成增加、節(jié)間變長(zhǎng)和植物增高以及葉衰老的改變。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明植物具有水平/活性降低的本發(fā)明sew多肽。vi.調(diào)節(jié)生殖組織發(fā)育本文提供了調(diào)節(jié)生殖組織的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中提供了調(diào)節(jié)植物中花發(fā)育的方法。"調(diào)節(jié)花發(fā)育"意指與其中sew活性或水平未被調(diào)節(jié)的對(duì)照植物相比植物生殖組織結(jié)構(gòu)的任何改變。"調(diào)節(jié)花發(fā)育"進(jìn)一步包括與其中scw活性或水平未被調(diào)節(jié)的對(duì)照植物相比植物生殖組織發(fā)育時(shí)間安排的任何改變(即花發(fā)育時(shí)間的推遲或加速)。肉眼可見(jiàn)的改變包括生殖組織大小、形狀、數(shù)量或位置，這些結(jié)構(gòu)形成的發(fā)育時(shí)間段或在環(huán)境壓力下維持或進(jìn)行開花過(guò)程的能力的變化。微觀改變可包括組成該生殖組織的細(xì)胞類型或形狀的改變。調(diào)節(jié)植物花發(fā)育的方法包括調(diào)節(jié)植物中的SCW活性。在一種方法中提供了本發(fā)明的scw序列?？赏ㄟ^(guò)向植物中導(dǎo)入包含本發(fā)明scw核苷酸序列的多核苷酸以提供scw核苷酸序列、表達(dá)該scw序列并藉此調(diào)節(jié)花發(fā)育。在其它實(shí)施方案中，該導(dǎo)入植物的scw核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定整合入該植物的基因組中。在具體方法中，通過(guò)降低植物中SCW多肽的水平或活性調(diào)節(jié)花發(fā)育。SCW活性的降低可引起與對(duì)照植物相比至少--種或更多種以下花發(fā)育的改變，包括但不限于開花推遲、花數(shù)量減少、部分雄株不育和結(jié)實(shí)率(seedset)降低。誘導(dǎo)開花推遲或抑制開花可用于提高飼料作物例如苜蓿的產(chǎn)量。測(cè)量這些花發(fā)育的發(fā)育改變的方法為本領(lǐng)域已知。參見(jiàn)，例如，Mouradov等，(2()02)ThePlantCell—SI11-S130,以引用形式并于本文。如上所述,本領(lǐng)域技術(shù)人員可識(shí)別用于調(diào)節(jié)植物花發(fā)育的啟動(dòng)子。用于該實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、枝條-優(yōu)選啟動(dòng)子和花序-優(yōu)選啟動(dòng)子。在其它方法中，通過(guò)增強(qiáng)本發(fā)明SCW序列的水平和/或活性調(diào)節(jié)花發(fā)育。該類方法可包括將SCW核苷酸序列導(dǎo)入植物并增強(qiáng)該SCW多肽的活性。在其它方法中，導(dǎo)入植物的scw核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定整合入植物的基因組中。增強(qiáng)本發(fā)明scw序列的表達(dá)可調(diào)節(jié)應(yīng)激期間的花發(fā)育。該類方法闡述于本文其它部分。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了與對(duì)照植物的花發(fā)育相比花發(fā)育被調(diào)節(jié)的植物。組成包括本發(fā)明scw多肽水平或活性被增強(qiáng)并且花發(fā)育被改變的植物。組成也包括本發(fā)明SCW多肽水平/活性被增強(qiáng)的植物，其中該植物可在應(yīng)激期間維持或進(jìn)行開花過(guò)程。也提供可使用本發(fā)明SCW序列增加種子大小和/或重量的方法。該方法包括增強(qiáng)植物或植物部分例如種子中scw序列的活性。種子大小和/或重量的增加包括該種子大小或重量的增加和/或一個(gè)或更多個(gè)種子部分包括例如胚、胚乳、種皮、糊粉層或子葉的大小或重量的增加。如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可識(shí)別用于增加種子大小和/或種子重量的啟動(dòng)子。用于該實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、種子-優(yōu)選啟動(dòng)子、胚_(dá)優(yōu)選啟動(dòng)子和胚乳_優(yōu)選啟動(dòng)子。用于降低植物中種子大小和/或種子重量的方法包括降低植物中的SCW活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)向植物中導(dǎo)入包含本發(fā)明SCW核苷酸序列的多核苷酸以提供SCW核苷酸序列、表達(dá)該SCW序列并藉此提高種子重量和/或大小。在其它實(shí)施方案中，導(dǎo)入植物的SCW核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定整合入該植物的基因組中。應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到也可通過(guò)增加幼苗的生長(zhǎng)速度或增強(qiáng)早期活力來(lái)增加種子大小和/或重量。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"早期活力"指植物在早期發(fā)育階段快速生長(zhǎng)的能力并與發(fā)芽后成功建立良好發(fā)育的根體系和良好發(fā)育的光合器官相關(guān)。此外，與對(duì)照相比，種子大小和/或重量的增加也可引起植物產(chǎn)量的增加。因此,本發(fā)明進(jìn)一步提供與對(duì)照植物相比種子重量和./或種子大小增加的植物。在其它實(shí)施方案中還提供了活力和植物產(chǎn)量增加的植物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明植物中本發(fā)明scw多肽的水平/活性增強(qiáng)并且種子重量和/或種子大小增加。在其它實(shí)施方案中該類植物具有被穩(wěn)定整合入它們的基因組中的包含與驅(qū)動(dòng)該植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接的scw核苷酸序列的核酸分子。Vii.用于SCW啟動(dòng)子多核苷酸的使用方法包含本發(fā)明公開的SCW啟動(dòng)子及其變異體和片段的多核苷酸當(dāng)與DNA構(gòu)建體裝配在一起(這樣該啟動(dòng)子序列可與包含相關(guān)多核苷酸的核苷酸序列可操作地連接)時(shí)可用于任何宿主細(xì)胞的基因操作，優(yōu)選植物細(xì)胞。以這一方式，在表達(dá)盒中與在相關(guān)宿主細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)多核苷酸序列一起提供本發(fā)明scw啟動(dòng)子多核苷酸。本發(fā)明scw啟動(dòng)子序列可在包含具有次生壁的細(xì)胞的多種組織中表達(dá)，因此該啟動(dòng)子序列可用于特別是在包含次生壁細(xì)胞中調(diào)節(jié)相關(guān)多核苷酸的時(shí)間和/或空間表達(dá)。合成雜合啟動(dòng)子區(qū)為本領(lǐng)域已知。該區(qū)包含與其它多核苷酸啟動(dòng)子元件可操作地連接的多核苷酸的上游啟動(dòng)子元件。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)包含本發(fā)明scw啟動(dòng)子序列的合成雜合啟動(dòng)子或其變異體或片段(與異源啟動(dòng)子的上游啟動(dòng)子元件可操作地連接)控制異源序列的表達(dá)。已鑒定出參與植物防御系統(tǒng)的--匕游啟動(dòng)子元件，其可用于產(chǎn)生合成啟動(dòng)子。參見(jiàn)，例如，Rushton等，(1998)Curr.0pin.PlantBiol.1:311-315?；蛘?，合成SCW啟動(dòng)子序列可包含存在于SCW啟動(dòng)子序列中的上游啟動(dòng)子元件的副本。應(yīng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明啟動(dòng)子序列可與其天然SCW編碼序列-一起使用。包含與其天然SCW基因可操作地連接的SCW啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化任何相關(guān)植物以得到期望的表型改變,例如調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量、調(diào)節(jié)根、枝條、葉、花和胚的發(fā)育、應(yīng)激耐受力和本文其他部分闡述的任何其他表型的改變。本文公開的啟動(dòng)子核苷酸序列和方法可用于調(diào)節(jié)宿主植物中任何異源核苷酸序列的表達(dá)以改變?cè)撝参锏谋硇?。人們感興趣的各種表型改變包括改變植物的脂肪酸組成、改變植物的氨基酸含量、改變植物的病原體防御機(jī)制等?？赏ㄟ^(guò)提供植物中異源產(chǎn)物的表達(dá)或增加內(nèi)源產(chǎn)物的表達(dá)得到這些結(jié)果?；蛘撸赏ㄟ^(guò)提供一種或更多種內(nèi)源產(chǎn)物(尤其是植物中的酶或輔因子)表達(dá)的降低得到這些結(jié)果。這些變化可引起被轉(zhuǎn)化植物表型的改變。相關(guān)基因反映商業(yè)市場(chǎng)和參與農(nóng)作物研發(fā)者的興趣。相關(guān)農(nóng)作物和市場(chǎng)發(fā)生變化，發(fā)展中國(guó)家開放世界市場(chǎng),新的農(nóng)作物和技術(shù)就會(huì)出現(xiàn)。此外，隨著我們對(duì)于農(nóng)作物性狀和特性例如產(chǎn)量和雜交優(yōu)勢(shì)認(rèn)識(shí)的增加，用于轉(zhuǎn)化的基因選擇隨之變化。相關(guān)基因的大致分類包括，例如，參與信息的基因，例如鋅指，參與通信的基因，例如激酶以及參與管家的基因，例如熱休克蛋白。更具體的轉(zhuǎn)基因分類，例如，包括編碼農(nóng)作物重要性狀、昆蟲抗性、疾病抗性、除草劑抗性、不育性、谷粒特性和商業(yè)產(chǎn)品的基因。相關(guān)基因一般包括涉及油、淀粉、糖或營(yíng)養(yǎng)物代謝以及影響核仁大小、蔗糖載量等的基因。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明核苷酸序列可與其他相關(guān)多核苷酸序列組合(堆疊)以產(chǎn)生具有期望表型的植物。該產(chǎn)生的組合可包括任何一種或更多種相關(guān)多核苷酸的多拷貝。本發(fā)明多核苷酸可與任何基因或基因組合堆疊以生產(chǎn)具有多種期望性狀組合的植物，包括但不限于動(dòng)物飼料需要的性狀例如高油基因(例如，美國(guó)專利第6232529號(hào))；平衡的氨基酸(例如，hordothionins(美國(guó)專利第5990389號(hào)、5885801號(hào)、5885802號(hào)和5703409號(hào));大麥高賴氨酸(Williamson等，(1987)Eur.J.Biochera.165:99-106;和WO98/20122);高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等，(1986)J.Biol.Chem.261:6279;Kirihara等，(1988)Gene71:359;Musumura等，(1989)PlantMol.Biol.12:123));消化性增強(qiáng)(例如，被修飾的貯存蛋白(美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/053410,2001年11月7日申請(qǐng))；硫氧還蛋白(美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/005429，2001年12月3日申請(qǐng)))，其公開內(nèi)容均以引用方式并于本文。本發(fā)明的多核苷酸也可與下列性狀堆疊有利于昆蟲、疾病或除草劑抗性的性狀(例如，蘇云金芽孢桿菌(Bacillust.huringiensis)毒性蛋白(美國(guó)專利第5366892號(hào);5747450號(hào);5737514號(hào);5723756號(hào);5593881號(hào);Geiser等.，(1986)Gene48:109);凝集素(VanI)arame等.，(1994)PlantMol.Biol.24:825);煙曲霉毒素解毒基因(美國(guó)專利第5792931號(hào));無(wú)毒和疾病抗性基因(Jones等，(1994)Science266:789-Martin等，(1993)Science262:1432;Mindrinos等，(1994)Cell78:1089);可產(chǎn)生除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體，例如S4和/或I--Ira突變；谷氨酰胺合酶抑制劑,例如膦絲菌素或basta(例如，bar基因)；草甘磷(glyphosate)抗性(EPSPS基因))；以及有利于加工處理或加工產(chǎn)品的性狀，例如高油(例如，美國(guó)專利第6，232，529號(hào))；被改良的油類(例如脂肪酸去飽和酶基因(美國(guó)專利第5952544號(hào)；W094/11516));被改良的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分枝酶(SBE)和淀粉脫枝酶(SDBE));聚合物或bi鄰:l.astics(例如美國(guó)專利第5602321號(hào)；P-酮硫解酶，聚羥基丁酸合酶和乙酰乙酰CoA還原酶(Schubert等，(1988)J.Bacterid.170:5837-5847)促進(jìn)聚羥基鏈烷酸酯的表達(dá)(PHAs))，其公開以引用形式并于本文。也可將本發(fā)明的多核苷酸與影響農(nóng)業(yè)性狀(例如雄株不育(例如參見(jiàn)美國(guó)專利第5583210號(hào))、莖強(qiáng)度、開花時(shí)間)或轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀例如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或基因打靶(例如，WO99/61619;W()00/17364;WO99/25821)的多核苷酸組合，其公開以引用形式并于本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，相關(guān)序列促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或農(nóng)作物產(chǎn)量。例如，相關(guān)序列包括可改良初生根或側(cè)根系統(tǒng)的農(nóng)業(yè)重要基因。這些基因包括但不限于養(yǎng)分/水運(yùn)輸物和生長(zhǎng)誘導(dǎo)物。該類基因的實(shí)例包括但不限于玉米細(xì)胞膜HtATP酶(M:HA2)(Frias等，(1996)PlantCell8:1533-44);AKTl,擬南芥(Arabidopsis)中的鉀攝取器官的組分(Spalding等，(1999)JGenPhysiol113:909-18);可在根頂端細(xì)胞中活化細(xì)胞分裂周期的RML基因(Cheng等.，(1995)PlantPhysiol108:881);玉米谷氨酰胺合成酶基因48(Sukanya等，(1994)PlantMolBiol26:1935-46)和血紅蛋白(Duff等，(1997)J.Biol.Chem27:16749-16752，Arredondo-Peter等，(1997)PlantPhysiol.115:1259-1266;Arredondo-Peter等，(1997)PlantPhysiol114:493-500及其中引用的參考文獻(xiàn))。相關(guān)序列也可用于表達(dá)負(fù)性影響于根發(fā)育的基因的反義核苷酸序列。此外，除了使用傳統(tǒng)的育種方法也可遺傳學(xué)改變農(nóng)業(yè)上重要的性狀例如油、淀粉和蛋白含量。改良包括增加油酸、飽和和不飽和油的含量、增加賴氨酸和硫的水平，提供必須氨基酸及對(duì)淀粉的改良。IIordothionin蛋白的改良闡述于美國(guó)專利第5703049號(hào)、5885801號(hào)、58858()2號(hào)核5990389號(hào)，以引用形式并于本文。另一個(gè)實(shí)例為由大豆2S白蛋白編碼的富含賴氨酸和/或硫的種子蛋白(闡述于美國(guó)專利第5850016號(hào))以及來(lái)自大麥的糜蛋白酶抑制劑(闡述于Williamson等，(1987)Eur.J.Biochem.165:99-106)，其公開內(nèi)容均以引用形式并于本文?？赏ㄟ^(guò)定點(diǎn)誘變得到編碼序列的衍生物以增加被編碼多肽中預(yù)選定氨基酸的水平。舉例而言，編碼大麥高賴氨酸多肽(BHL)的基因來(lái)源自大麥糜蛋白酶抑制劑，美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)08/740682，1996年11月1日申請(qǐng)和W098/20133，其公開內(nèi)容均以引用形式并于本文。其它蛋白質(zhì)包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，例如來(lái)自向日葵種子(Lilley等，(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedst.uffs,Applewhite編車骨(AmericanOilChemistsSociety,Champaign,Illinois)，497-502頁(yè)；以引用考形式并于本文)、玉米(Pedersen等，(1986)J.Biol.Chem.261:6279;Kirihara等，(1988)Gene71:359;二者均以引用形式并于本文);和稻(Musumura，等，(1989)PlantMol.Biol.12:123,以引用形式并于本文)。其它農(nóng)業(yè)上重要的基因編碼乳膠、Floury2、生長(zhǎng)因子、種子貯藏因子和轉(zhuǎn)錄因子。昆蟲抗性基因可編碼對(duì)嚴(yán)重影響產(chǎn)量的害蟲的抗性，例如食根蟲(rootw翻)、切根蟲(cutworm)、歐洲玉米螟(EuropeanCornBorer)等。該類基因包括，例如，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白基因(美國(guó)專利第5366892號(hào)、574745()號(hào)、5736514號(hào)、57237S6號(hào)、55938S1號(hào)以及Geiser等，(1986)Gene48:109);等等。編碼疾病抗性性狀的基因包括脫毒基因，例如對(duì)抗fumonosin(美國(guó)專利第5792931號(hào));無(wú)毒力(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones等，(1994)Science266:789;Martin等，(1993)Science262:1432;andMindrinos等(1994)Ce:ll78:1089);等等。除草劑抗性性狀可包括編碼用于抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草劑抗性的基因，尤其是磺酰脲類除草劑(例如，包含引起該抗性的突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，尤其是S4和Z或Hra突變)、編碼用于抑制谷氨酰胺合酶作用的除草劑抗性的基因，例如膦絲菌素或basta(例如，bar基因)或其它本領(lǐng)域已知基因。bar基因編碼除草劑basta抗性，nptll基因編碼對(duì)抗生素卡那霉素和遺傳霉素的抗性，ALS-基因突變體編碼對(duì)除草劑氯磺隆的抗性。也可在表達(dá)盒中編碼不育基因并提供物理去雄的另一選擇。用于該方法的基因的實(shí)例包括雄株組織-優(yōu)選基因和具有雄柱不育表型的基因如QM，闡述于美國(guó)專利第5583210號(hào)。其它基因包括激酶和編碼對(duì)雄株或雌株配子體發(fā)育具有毒性的化合物的基因。谷粒的質(zhì)量反映在性狀中，例如飽和和不飽和油的水平和類型、必需氨基酸的質(zhì)量和數(shù)量以及纖維素的水平。在玉米中，改良hordothionin蛋白闡述于美國(guó)專利第5703049號(hào)、5885801號(hào)、5885802號(hào)禾口5990389號(hào)。商業(yè)性狀也可在一個(gè)或復(fù)數(shù)個(gè)可增加例如乙醇產(chǎn)生用淀粉或提供蛋白表達(dá)的基因上編碼。轉(zhuǎn)化植物的另一個(gè)重要的商業(yè)用途為生產(chǎn)聚合物和bioplastics,例如美國(guó)專利第5602321號(hào)中所述?；蚶?3-酮硫解酶、PHB酶(多羥基丁酸合酶)和乙酰乙酰CoA還原酶(參見(jiàn)，Schubert等，(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847)可促進(jìn)聚羥基鏈烷酸酯(PHAs)的表達(dá)。外源產(chǎn)物包括植物酶和產(chǎn)物以及來(lái)自于包括原核細(xì)胞和其它真核細(xì)胞在內(nèi)的其它來(lái)源的酶和產(chǎn)物。這些產(chǎn)物包括酶、輔因子、激素等?？稍黾拥鞍踪|(zhì)的水平尤其是具有改良的氨基酸分布以提高植物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的改良蛋白質(zhì)。這可通過(guò)表達(dá)該類氨基酸含量提高的蛋白完成?？赏ㄟ^(guò)參考以下非限制性實(shí)施例更好的理解本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可在不偏離如本文所公開和要求的本發(fā)明精神和范圍的前提下實(shí)施本發(fā)明的其它實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例l.分離SCW序列在為涉及玉米中植物細(xì)胞壁形成而由此鑒定的基因中，纖維素合酶(CesA)基因，CesAlO，CesAll和CesA12以及另一基因，脆莖_2(Bk2)，是特別令人感興趣的，因?yàn)樗鼈兩婕按紊?xì)胞壁形成(Appenzeller，etal.，(2004)"Cellulosesynthesisinmaize:isolationandexpressionanalysisofthecellulosesynthase(CesA)genefamily";Cellulose11:287-299;Ching，etal.，(2006)"Brittlestalk2encodesaputativeglycosylphosphat.idylinositol-anchoredproteinthatfectsmechanicalstrengthofmaizetissuesbyalteringthecompositionandstructureofsecondarycellwalls";Planta224:1174-1184)。因此，我們使用這四種基因作為參考組，以鑒定表達(dá)模式與這些參考基因的表達(dá)模式強(qiáng)相關(guān)的其它基因。用這種方法鑒定的基因被認(rèn)為在次生細(xì)胞壁形成中起重要作用。圖3顯示了這四種參考基因橫跨12種關(guān)鍵玉米組織類型的表達(dá)模式的概要。注意在莖組織中的特征性表達(dá)，其是玉米中次生細(xì)胞壁形成的關(guān)鍵位置。實(shí)施例2.具有與參考某因強(qiáng)相關(guān)表達(dá):的某因的鑒定這些基因的管理(curation)依賴于它們的表達(dá)模式與橫跨MPSS數(shù)據(jù)集中大量文庫(kù)的參考組的表達(dá)模式的相似性。Pioneer-DuPont具有覆蓋寬范圍的植物結(jié)構(gòu)和生物學(xué)的227種玉米組織/處理MPSSTM樣品的廣泛的專有集合。MPSS樣品的數(shù)據(jù)排列在一張大表中，針對(duì)其可進(jìn)行相關(guān)性分析。皮爾遜相關(guān)系數(shù)橫跨227種樣品而計(jì)算，所述227種樣品用于以使得每對(duì)由來(lái)自參考的一個(gè)成員和來(lái)自剩余標(biāo)簽的第二成員組成的方式的配對(duì)。這樣產(chǎn)生了每個(gè)受試標(biāo)簽命中(hit.)的四個(gè)R和R2值的列表，四種參考基因中的每種一個(gè)(特別是對(duì)于用于那些基因的標(biāo)簽)。這四個(gè)值然后被平均，并以降序排列。那些在列表頂端的將具有橫跨玉米MPSS樣品組的最類似于該四種參考基因的表達(dá)模式。為了本研究的目的，建立了大約().7的最小截?cái)嗥骄鵕值。存在具有低于它的相關(guān)性的另外的標(biāo)簽，但是超過(guò)該閾值的那些被選擇用于繼續(xù)分析。實(shí)施例3.關(guān)于相關(guān)基因的信息的管理(curation)利用專有和公共基因組和轉(zhuǎn)錄物序列資源將高得分MPSS標(biāo)簽作圖到它們的相應(yīng)基因或起源。一些MPSS標(biāo)簽證明是參考基因的替代標(biāo)簽,并且因此被排除。當(dāng)存在模糊的標(biāo)簽與基因的匹配時(shí)，通過(guò)參考其它表達(dá)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)感興趣的基因，所述其它表達(dá)數(shù)據(jù)例如來(lái)自ESTs的,其中莖組織的表達(dá)特別被認(rèn)為是正確基因的證據(jù)。由此獲得該基因和它的基因產(chǎn)物，鑒定啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄物區(qū)域,()RFs，和概念上的翻譯的最佳描述。這通常需要手動(dòng)管理(curation)。然后，該基因的圖譜位置也被確定，主要利用專有的PHDvl.2m鄰。該基因的概念--匕的翻譯被重新分析以識(shí)別它們相應(yīng)的可能的功能。為本目的可使用Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)和各種計(jì)算機(jī)工具和其它資源。實(shí)施例4.利用反求遺傳學(xué)確證棊岡發(fā)現(xiàn)候詵物次生壁形成基因(SCW)數(shù)據(jù)表還顯示了通過(guò)選擇的敲除(knock-out)誘變產(chǎn)生的用于驗(yàn)證的當(dāng)前的優(yōu)先化(prioritization)(反求遺傳學(xué))。反求遺傳學(xué)資源保證了已測(cè)序的基因候選物的功能分析。Pioneer的TUSC系統(tǒng)是利用玉米可轉(zhuǎn)座元件家族，增變基因(Mutator),M:eeleyandBriggs(1995)<<;Reversegeneticsformaize"MaizeGenet.Coop.Newsl.69:67-82，產(chǎn)生的插入突變體的文庫(kù)。這是一種利用來(lái)鑒定用于選擇的基因序列的轉(zhuǎn)座子插入突變體的已有專利的方法(BriggsandMeeley，US專利號(hào)5，962，764)。為了表征候選基因，通過(guò)利用從公共和專有序列數(shù)據(jù)庫(kù)可獲得的玉米基因組數(shù)據(jù)，將用于每種優(yōu)先化scw候選物的工作基因模型翻譯為最佳的可獲得的基因組序列模型。然后對(duì)于要進(jìn)行TUSC篩選過(guò)程的每種候選序列設(shè)計(jì)基因特異性PCR引物。這些引物成對(duì)地對(duì)非突變基因組DNA進(jìn)行驗(yàn)證，并且在針對(duì)來(lái)自TUSC群體的DNA的重復(fù)(iterative)插入篩選中，每種引物然后與通用的增變基因特異的引物配對(duì)。在來(lái)自選擇的TUSC系的F2子代之間確認(rèn)在本程序中鑒定的各個(gè)插入等位基因的遺傳率，并且為了田間繁殖回收來(lái)自每種陽(yáng)性系的種子。田間材料限定了分離的玉米家族，其中對(duì)于SCW基因的插入(無(wú)效)等位基因是遺傳分離的。增變基因插入位置然后通過(guò)PCR和DNA測(cè)序而確定。遺傳上，每種突變等位基因進(jìn)行幾輪的回交以清除背景突變，并且接下來(lái)自交來(lái)產(chǎn)生在規(guī)定的遺傳背景中的分離的突變體家族和純合SCW基因突變體儲(chǔ)庫(kù)。也可進(jìn)行等位基因間雜交，只要有可能幫助增加選擇的突變基因座的表型分析的速度。SCW成分的表型分析通過(guò)將無(wú)效突變體與它們的適當(dāng)對(duì)照比較來(lái)進(jìn)行，并且頂端的候選物對(duì)于每種候選基因?qū)CW形成/沉積的貢獻(xiàn)的更詳細(xì)的研究是先進(jìn)的?？衫脦追N測(cè)試,例如節(jié)間機(jī)械強(qiáng)度,莖壁中的纖維素濃度，和或許掃描電子顯微鏡術(shù),來(lái)確定次生壁的完整性是否已經(jīng)受影響(Appenze:l.ler，etal.，(2004)"Cellulosesynthesisinmaize:isolat.ionandexpressionanalysisofthecellulosesynthase(CesA)genefamily，，；Cellulose11:287-299;Ching，et.al.，(2006)"Brittlestalk2encodesaputativeglycosylphosphatidylinositol-anchoredproteinthataffectsraechanicalstrengthofmaizetissuesbyalteringthecompositionandstructureofsecondarycellwalls";Plante224:1174-1184)。實(shí)施例5.轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化和再生用含有與干旱誘導(dǎo)啟動(dòng)子MB17啟動(dòng)子(Vilardell等，(1990)PlantMolBiol14:42廠432)可操作地連接的ZmSCW序列和選擇標(biāo)記基因PAT(可賦予對(duì)除草劑雙丙氨磷(Bialaphos)的抗性)的質(zhì)粒轟擊來(lái)自溫室供體植物的未成熟玉米胚?；蛘呖稍诜蛛x的質(zhì)粒中提供該選擇標(biāo)記基因。根據(jù)如下步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)基配方如下所示。靶組織的制備:將穗去殼并用30%Clorox漂白劑加0.5%Micro去污劑表面滅菌20分鐘，并用無(wú)菌水沖洗兩遍。將未成熟的胚切開并將胚軸面朝下放置(盾片面朝上)，每個(gè)平板放置25個(gè)胚,于560Y培養(yǎng)基中放置4小時(shí)然后排列在2.5-cm耙區(qū)域內(nèi)用于轟擊。DNA的制備制備包含與泛素啟動(dòng)子可操作地連接的SCW序列的質(zhì)粒載體。使用如下所示的氯化鈣沉淀方法將該質(zhì)粒DNA和含有PAT選擇標(biāo)記的質(zhì)粒DNA—起沉淀至1.1um(平均直徑)鎢顆粒上100u1在水中的制備的鎢顆粒TrisEDTA緩沖液中含有10u1(1iig)DNA(1ug總DNA)100u12.5MCaCl210y10.1M亞精胺按順序?qū)⒏髟噭┘尤腈u顆?；鞈乙翰⑼瑫r(shí)置于多管漩渦混懸儀上。將最終混合物簡(jiǎn)略超聲處理并在持續(xù)漩渦混懸下溫育10分鐘。在沉淀階段后，將試管簡(jiǎn)單離心、移除液體，用500ml100%乙醇洗滌并離心30秒。再次移除液體，向終鎢顆粒沉淀加入105u1100%乙醇。對(duì)于粒子槍轟擊而言，將鴇/DM顆粒簡(jiǎn)略超聲處理并將101點(diǎn)樣于各大載體(raacrocarrier)中央并在轟擊之前干燥約2分鐘。粒子m處理在粒子槍#HE34_1或#HE34_2中以#4水平轟擊樣品板。所有樣品均接受650PSI的單次轟擊，總計(jì)從各已制備的顆粒/DM試管中取10個(gè)等分試樣。后續(xù)處理轟擊后將胚置于560Y培養(yǎng)基中2天，然后轉(zhuǎn)移至含有3mg/L雙丙氨磷的560R篩選培養(yǎng)基中，然后每2周傳代培養(yǎng)。約篩選10周后，將篩選-抗性愈傷組織克隆轉(zhuǎn)移至288J培養(yǎng)基中開始植物再生。體細(xì)胞胚成熟后(2-4周)將發(fā)育好的體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至發(fā)芽培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室。約7-1()天后，將正在發(fā)育的小植株轉(zhuǎn)移至272V無(wú)激素的培養(yǎng)基試管中培養(yǎng)7-10天直至小植株良好建立。然后將植株轉(zhuǎn)移至含有罐栽土的平面中插口(insertsinflats)(相當(dāng)于2.5"罐)中并在生長(zhǎng)室里生長(zhǎng)1周，接著在溫室中繼續(xù)生長(zhǎng)卜2周，然后轉(zhuǎn)移至傳統(tǒng)的600罐(1.6加侖)并生長(zhǎng)至成熟。監(jiān)測(cè)植物并對(duì)于植物干旱抗性的增強(qiáng)計(jì)分。檢測(cè)干旱抗性增強(qiáng)的測(cè)定法為本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的并包括，例如，與相同環(huán)境條件下的對(duì)照玉米植物相比在干旱條件下核-抽穗容量產(chǎn)量(kernel-earringcapacityyields)的增加。或者，可監(jiān)測(cè)被轉(zhuǎn)化植物分生組織發(fā)育的調(diào)節(jié)(即穗--匕小穗的形成減少)。參見(jiàn)，例如，Bruce等，(2002)JournalofExperimentalBotany53:1-13。轟擊和培養(yǎng)基轟擊培養(yǎng)基(560Y)包含4.0g/lN6基礎(chǔ)鹽(basalsalt)(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson'sVitaminMix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2,4-D和2.88g/lL-脯氨酸(用KOH調(diào)至pH5.8后用D-1H20定容);2.Og/lGelrite(用H:2()定容后加入)以及8.5mg/l硝酸銀(將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后加入)。選擇培養(yǎng)基(560R)包含4.0g/lN6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、1.Oml,ZlEriksson'sVitaminMix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺素、30.0g/l蔗糖、2.0mg/l2，4-D(用KOH調(diào)至pH5.8后用D-1H20定容)；3.Og/lGelrite(用D-1H20定容后加入)以及520.85mg,Zl硝酸銀和3.0mg,Zl雙丙氨磷(兩者均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后加入)。植物再生培養(yǎng)基(288J)包含4.3g/lMS鹽(GIBCO11117-074)、5.Oml/1MS維生素貯備液(0.100g煙酸、0.02g/l鹽酸硫胺素、0.10g/l鹽酸吡哆醇、0.40g/l甘氨酸(用精制的(polished)D-1H2()定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15:473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/1蔗糖和1.Oml,Zl0.ImM脫落酸(調(diào)至pH5.6之后用精制的D-IH20定容)；3.Og/1Gelrit.e(用D_IH20定容后加入)以及1.Omg/1吲哚乙酸和3.Omg/1雙丙氨磷(將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至6(TC后加入)。無(wú)激素培養(yǎng)基(272V)包含4.3g/lMS鹽(GIBCO11117-074)、5.Onil/lMS維生素儲(chǔ)備液(0.l()0g/l煙酸、0.02g/:[鹽酸硫胺素、0.10g,Zl鹽酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸，用精制的D-IH20定容)、0.lg,Zl肌醇、40.Og/1蔗糖(調(diào)至pH5.6之后用精制的D-IH20定容)和6g/l細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(用精制的D-1H20定容后加入)，滅菌并冷卻至60°C。實(shí)施例6.農(nóng)桿茼介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化對(duì)于用本發(fā)明ZmSCW序列的反義序列的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米而言，優(yōu)選使用Zhao描述的方法(美國(guó)專利第5981840號(hào)和PCT專利公開W098/32326;其內(nèi)容以引用形式并于本文)。簡(jiǎn)略而言,從玉米中分離未成熟的胚并使其與農(nóng)桿菌的混懸液接觸，其中該細(xì)菌可將SCW序列轉(zhuǎn)化至至少一個(gè)未成熟胚的至少一個(gè)細(xì)胞中(步驟l:感染步驟)。在該步驟中優(yōu)選將未成熟胚浸漬于農(nóng)桿菌的混懸液中以起始接種。將胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)--段時(shí)間(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。在感染步驟之后優(yōu)選將未成熟胚培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上。在共培養(yǎng)階段之后可考慮任選進(jìn)行"靜息"步驟。在該靜息步驟中，在至少存在一種已知可抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素并且不加入植物轉(zhuǎn)化體篩選試劑的條件下溫育胚(步驟3:靜息步驟)。優(yōu)選在含有抗生素(但不含篩選試劑)的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟胚以消除農(nóng)桿菌并提供被感染細(xì)胞的靜息階段。接下來(lái)在含有篩選試劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)接種胚并回收生長(zhǎng)中的已轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4:篩選步驟)。優(yōu)選在含有篩選試劑的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟胚以得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)。然后將愈傷組織再生至植物中(步驟5:再生步驟)，優(yōu)選將生長(zhǎng)于篩選培養(yǎng)基中的愈傷組織培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基中以再生植物。監(jiān)控植物并對(duì)分生組織發(fā)育的調(diào)節(jié)評(píng)分。例如枝條和花分生組織的大小和外觀的變化和/或葉、花和/或果實(shí)的產(chǎn)量增加。實(shí)施例7.表達(dá)模式下面的表3顯示了橫跨227種玉米MPSS文庫(kù)的根據(jù)它們與表達(dá)模式參考基因的平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)的降序的次生細(xì)胞壁形成基因的列表。另外，對(duì)于每種基因的可能的功能和它在次生細(xì)胞壁形成中的作用有概述。許多這些基因涉及碳水化合物或木質(zhì)素代謝,次生細(xì)胞壁的兩種主要亞成分。然而,該列表也包含了新的基因以及與碳水化合物或木質(zhì)素合成或修飾目前沒(méi)有直接關(guān)系的基因。表3次生細(xì)胞壁形成基因表達(dá)相關(guān)性和功能53表3.次生壁形成基因-表達(dá)相關(guān)性，描迷和可能的功能<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>圖3顯示了參考次生細(xì)胞壁形成基因以及在本研究中發(fā)現(xiàn)的新的次生細(xì)胞壁基因的橫跨12種關(guān)鍵玉米組織的表達(dá)模式。注意與莖表達(dá)的顯著相關(guān)，次生細(xì)胞壁形成的關(guān)鍵位置,而且更小程度地與根和葉表達(dá)相關(guān),那里也形成次生細(xì)胞壁。令人感興趣的是,在基本上只有初生細(xì)胞壁的頂部分生組織處，幾乎沒(méi)有這些基因的表達(dá)。實(shí)施例8.纖維素在機(jī)械強(qiáng)度卜.的作用纖維素是植物生物量的最大單個(gè)化學(xué)組分(圖2)。它平均占據(jù)了玉米秸稈干質(zhì)量的5()%。作為最大的組分，對(duì)它沉積的任何限制都可能限制生長(zhǎng)進(jìn)而限制生物量累積。玉米中的谷物產(chǎn)量是總生物量的函數(shù)，因?yàn)槭斋@指數(shù)(谷物與地上總生物量的比例)在上世紀(jì)已經(jīng)保持在50%左右。生物量的任何提高將導(dǎo)致提高的谷物產(chǎn)量。特異地影響纖維素形成的基因?qū)椭岣呱锪康奶妓衔锍煞郑沟闷涓m于青貯飼料以及乙醇生產(chǎn)。另外，具有提高的纖維素濃度的莖將具有提高的機(jī)械強(qiáng)度，其將使其更不可能倒伏并因此間接有助于谷物產(chǎn)量的提高。木質(zhì)素形成和細(xì)胞壁交聯(lián)基因也可能幫助提高莖強(qiáng)度。木質(zhì)素,其為疏水性的，通過(guò)從纖維素周圍排除水提高纖維素的強(qiáng)度。千纖維素已知比潮濕的纖維素更強(qiáng)。具有提高的纖維素濃度的葉，由于它們是機(jī)械上更強(qiáng)的，因此將能夠保持更直立的表型，其將通過(guò)降低遮蔽(shading)提高每單位土地面積光合成能力。輔你l9.舊料柳鏡,肝TO雜'性細(xì)細(xì),鍵貢M圖l所示數(shù)據(jù)獲自2001年以三種密度(27,43和59K每英畝)生長(zhǎng)的七種雜種，每種一式三份。從每個(gè)復(fù)本采樣兩個(gè)莖。穗下的節(jié)間3和4利用:l:nstron進(jìn)行3點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。在測(cè)量引起節(jié)間斷裂的負(fù)重之后，將第3節(jié)間分離為外皮和內(nèi)部組織。利用外皮和內(nèi)部組織作為自變量(分別為Xi和X2)并且總莖作為因變量(Y)進(jìn)行Path系數(shù)分析。多重回歸方程可看作Y=a+bA+b^^e，其中a是截距,b是回歸系數(shù)，以及e是誤差。Path系數(shù)計(jì)算如下:pYXn=bn*sXn/sY，其中n是1或2，p是path系數(shù)，以及s是標(biāo)準(zhǔn)偏差。每個(gè)自變量對(duì)總莖(Y)的貢獻(xiàn)計(jì)算如下SY^rYxn，其中sYXn為Y和Xn的協(xié)方差，并且r是這兩個(gè)變量之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。直徑的未解釋的變異可歸因于玉米莖不是理想地圓的和由此與精確地確定橫截面積相關(guān)的困難。一些其它變量,例如維管束的大小和數(shù)量以及它們的密度，可解釋強(qiáng)度上其余的變化。通過(guò)除去其編碼用于催化的酶的特定步驟的限制,選擇期望的等位基因或過(guò)表達(dá)其基因，可導(dǎo)致特定多糖(組成改變)或總細(xì)胞壁(組成未變)的百分比的提高。在后一情況中，另外的干物質(zhì)可容納于擴(kuò)大的維管束中，所述擴(kuò)大的維管束接著導(dǎo)致了提高的直徑。實(shí)施例10大豆胚轉(zhuǎn)化如下用含有與泛素啟動(dòng)子可操作地連接的SCW序列的質(zhì)粒轟擊大豆胚。為了誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，將從表面滅菌的大豆栽培品種A2872的未成熟種子切割的長(zhǎng)度為3-5mm的子葉在適當(dāng)?shù)沫傊囵B(yǎng)基上于26。C光照或黑暗條件下培養(yǎng)六至十周。然后將產(chǎn)生次生胚的體細(xì)胞胚切斷并置于適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基中。在重復(fù)篩選繁殖為早期球形期胚的體細(xì)胞胚集簇之后，按照如下所述保存該混懸液。可在旋轉(zhuǎn)振蕩器(150rpm)上在35ml液體培養(yǎng)基中于26°C(熒光燈(florescentlight)，16:8小時(shí)日/夜時(shí)間表)保持大豆胚發(fā)生混懸培養(yǎng)物。通過(guò)約35mg組織接種入35ml液體培養(yǎng)基中每?jī)芍軅鞔囵B(yǎng)該培養(yǎng)物。然后通過(guò)粒子槍轟擊方法轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生的混懸培養(yǎng)物(Klein等，(1987)Nature(London)327:70-73，美國(guó)專利第4945050號(hào))。這些轉(zhuǎn)化中可使用DuPont.BiolisticPDS1000/HE儀器(heliumretrofit)。57可用于促進(jìn)大豆轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因是由來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(0dell等，(1985)Nature313:810-812)、來(lái)自質(zhì)粒pJR225的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(來(lái)自大腸桿菌;Gritz等，(1983)Gene25:179-188)以及來(lái)自根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA的胭脂堿合酶的3'區(qū)域組成的轉(zhuǎn)基因。含有與泛素啟動(dòng)子可操作地連接的SCW有義序列的表達(dá)盒可作為限制性片段被分離。可將該片段插入攜帶該標(biāo)記基因的載體的泛素限制酶切位點(diǎn)中。向50y160mg/ml1um金顆粒混懸液中加入(按順序):5ii1DNA(1yg/y1)、20u1亞精胺(()1M)和50111CaCl2(2.5M)。然后將該顆粒制劑攪拌三分鐘，在微型離心機(jī)上旋轉(zhuǎn)IO秒中并去除上清。然后用飾l70X乙醇將DNA-包裹的顆粒洗滌一次并重懸于40ul的無(wú)水乙醇中。將DNA/顆粒混懸液超聲處理三次，每次1秒鐘。之后將5微升的DNA-包裹金顆粒載樣于各大載體盤上。將約3(K)-4()(Mg生長(zhǎng)了兩周的混懸培養(yǎng)物置于空的60xl5mra培養(yǎng)皿中并用移液管將殘余液體從組織中除去。對(duì)于每一個(gè)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，常規(guī)轟擊約5-10板組織。將膜破裂壓力設(shè)置為1100psi并將室抽真空至28英寸汞柱。將組織置于距阻滯篩(retainingscreen)約3.5英寸遠(yuǎn)的地方并轟擊三次。轟擊后可將組織平均分成兩份，放回至液體中并按照如上所述培養(yǎng)。轟擊后五至七天，用新鮮培養(yǎng)基替換液體培養(yǎng)基，轟擊后十-至十二天用含有50mg/ml潮霉素的新鮮培養(yǎng)基替換。該篩選培養(yǎng)基可每周更新。轟擊后七至八周可觀察到綠色的轉(zhuǎn)化組織從未轉(zhuǎn)化的壞死胚發(fā)生的集簇中生長(zhǎng)出來(lái)。移除已分離的綠色組織并接種入單獨(dú)的燒瓶中以生成新的、克隆繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生混懸培養(yǎng)物。每一新系可認(rèn)為是獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件。然后將這些混懸液傳代培養(yǎng)并保持為未成熟胚集簇或通過(guò)單個(gè)體細(xì)胞胚的成熟和萌芽再生為完整的植物。實(shí)施例ll.向日葵分生組織轉(zhuǎn)化如下用含有與泛素啟動(dòng)子可操作地連接的SCW序列的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化向日葵分生組織(也可參見(jiàn)，歐洲專利號(hào)EP0486233，以引用形式并于本文，及Malone-Schoneberg.，(1994)PlantScience103:199-207)。使用單一麥穗脫粒機(jī)將成熟向日葵種子(HelianthusannuusL.)脫殼。將種子表面用20%Clorox漂白劑溶液(每50ml溶液中加入兩滴吐溫2())滅菌3()分鐘。用無(wú)菌蒸餾水洗滌種子兩遍。按照Schra咖eijer等(Schra騰ijer等.，(1990)PlantCellR印.9:55-60)所述法的變體制備分裂胚軸外植體。將種子于蒸餾水中吸脹60分鐘然后進(jìn)行表面滅菌歩驟。將各種子的子葉折斷，在胚軸平面形成整齊的裂痕。在切除根尖之后將外植體在初葉之間縱向?qū)η?。將兩半切面朝上放置于組成為Murashige和Skoog礦物元素(Murashige.,(1962)Physiol.Plant.，15:473-497)、Sh印ard's維生素添力口劑(Sh印ard(1980)，EmergentTechniquesfortheGeneticImprovementofCrops(UniversityofMinnesotaPress,St.Paul,Minnesota)、40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/1蔗糖、0.5mg/l6-芐基-氨基嘌呤(BAP)、()25mg/l噴哚-3-乙酸(]:AA)、().lmg/1赤霉酸(GA3)，pH5.6和8g/lPhytagar的GBA培養(yǎng)基中。在用農(nóng)桿菌處理前用微粒槍轟擊該外植體(Bidney等，(1992)PlantMol.Biol.18:301-313)。在該處理中將三十至四十株外植體在60X20mm平板的中心擺放成圓58形。將約4.7mg1.8mm的鴇微粒重懸于25ml的無(wú)菌TE緩沖液(10mlTrisHCl，lmMEDTA，pH8.0)中，每次轟擊使用1.5ml等分試樣。穿過(guò)150mmnytex篩(放置于PDS1000(g)顆粒加速裝置中的樣品上方2cm)將各板轟擊兩次。"解除武裝的"(Disarmed)根癌農(nóng)桿菌株EHA105被用于所有的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。將含有表達(dá)盒(包含與泛素啟動(dòng)子可操作地連接的SCW基因)的二元質(zhì)粒載體通過(guò)如Holsters等.，(1978)Mol.Gen.Genet.163:181-187描述的凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌株EHA105。該質(zhì)粒進(jìn)一步包含卡那霉素選擇標(biāo)記基因(即nptll)。用于植物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的細(xì)菌在含有維持細(xì)菌株和二元質(zhì)粒的適當(dāng)抗生素的液體YEP培養(yǎng)基(10gm/:[酵母提取物、l()gm/1細(xì)菌用蛋白胨和5gm/lNaCl，pH7.0)中生長(zhǎng)過(guò)夜(28°C，100RPM持續(xù)攪動(dòng))。當(dāng)其0D600達(dá)到約0.4至0.8時(shí)使用該混懸液。將農(nóng)桿菌細(xì)胞沉淀并重懸于含有12.5mMMESpH5.7、lgm/lNH4Cl和0.3gm/lMgS04的接種培養(yǎng)基中至終0D6Q。為0.5。將剛轟擊的外植體放置于農(nóng)桿菌混懸液中、混合并靜置30分鐘。然后將該外植體轉(zhuǎn)移至GBA培養(yǎng)基，切面朝下,于26°C、每天18小時(shí)的條件下共培養(yǎng)。共培養(yǎng)三天后將該外植體轉(zhuǎn)移至添加了250mg/l頭孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素的374B中(不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)并且蔗糖水平降至1%的GBA培養(yǎng)基)。將外植體在選擇條件下培養(yǎng)二至五周，然后轉(zhuǎn)移至不含卡那霉素的新鮮374B培養(yǎng)基中繼續(xù)發(fā)育一至兩周。將還未產(chǎn)生適合切割的枝條的具有分化中的和抗生素抗性生長(zhǎng)區(qū)域的外植體轉(zhuǎn)移至含有250mg/l頭孢噻肟的GBA培養(yǎng)基中進(jìn)行第二個(gè)為期三天的植物激素處理。通過(guò)ELISA測(cè)定來(lái)自綠色、卡那霉素抗性枝條的葉樣品中是否存在NPTII以及通過(guò)檢測(cè)分生組織發(fā)育的調(diào)節(jié)(即枝條和花分生組織大小和外觀的改變)測(cè)定是否存在轉(zhuǎn)基因表達(dá)。將NPTII-陽(yáng)性枝條嫁接至Pioneer雜種6440體外-生長(zhǎng)的向日葵幼苗根狀莖(rootstock)。表面已滅菌的種子在48-0培養(yǎng)基(半強(qiáng)度的Murashige和Skoog鹽、().5X蔗糖、0.3^gelrite，pH5.6)中萌芽，并在對(duì)外植體培養(yǎng)所述的條件下生長(zhǎng)。去除幼苗的上面部分，在下胚軸處做-個(gè)1cm的垂直切口，將已轉(zhuǎn)化的枝條插入該切口。用石蠟?zāi)?parafilm)包裹整個(gè)部位以固定枝條。體外培養(yǎng)一周后的已嫁接植物可轉(zhuǎn)移至土壤中。土壤中的嫁接植物應(yīng)在高濕度條件下維持，然后緩慢適應(yīng)溫室環(huán)境。通過(guò)NPTIIELISA和/或通過(guò)分析葉提取物的SCW活性鑒定在溫室中成熟的T。植物(親代)的已轉(zhuǎn)化部分，同時(shí)通過(guò)分析干種子子葉一小部分的SCW活性鑒定從NPTII-陽(yáng)性T。植物收獲的轉(zhuǎn)基因種子。另一種向日葵轉(zhuǎn)化方案可回收轉(zhuǎn)基因子代而不需使用化學(xué)選擇壓力。將種子去殼并在20%Clorox漂白溶液(每100ml溶液加中入兩至三滴吐溫20)中表面滅菌20分鐘，然后用蒸餾水沖洗三遍。將已滅菌的種子在用水濕潤(rùn)的濾紙上于26。C在黑暗中吸脹20小時(shí)。去除子葉和根基(rootradical),將分生組織外植體于374E(由MS鹽、Sh印ard維生素、40mg/1硫酸腺嘌呤、3%蔗糖、0.5mg/l6_BAP、0.25mg/lIAA、0.lmg/1GA和O.8%Phytagar組成的GBA培養(yǎng)基,pH5.6)中在黑暗條件下培養(yǎng)24小時(shí)。去除初生葉以暴露頂端分生組織，將約40株外植體頂端頂面向上放置于374M(含有1.2%Phytagar的GBA培養(yǎng)基)中央的2cm圓形中然后于該培養(yǎng)基上黑暗中培養(yǎng)24小時(shí)。將約18.8mg1.8um的鎢顆粒重懸于150u1無(wú)水乙醇中。超聲處理后將8u1滴至大載體表面中央。在第一架中以26mm汞柱氦槍真空(Hgheliumgunvacuum)用650psi破裂盤(65()psirupturediscs)對(duì)每板轟擊兩次。通過(guò)之前所述的凍融法將相關(guān)質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿茵株EHA105。將28t:在液體YEP培養(yǎng)基(10g/l酵母提取物、10g/1細(xì)菌用蛋白胨和5g/lNaCl，pH7.0)中在50ug/1卡那霉素存在下的細(xì)菌過(guò)夜生長(zhǎng)的沉淀重懸于接種培養(yǎng)基(12.5mM2mM2(N-嗎啉代)乙磺酸，MES，Ig/1NH4C:[和0.3g/lMgS()4，pH5.7)至終濃度為()D600=4.0。將經(jīng)顆粒轟擊的外植體轉(zhuǎn)移至GBA培養(yǎng)基(374E)并將細(xì)菌混懸液小滴直接置于分生組織的頂部。在該培養(yǎng)基中將外植體共培養(yǎng)4天，之后將該外植體轉(zhuǎn)移至374C培養(yǎng)基(含有1%蔗糖并不含BAP、IAA、GA3，并添加了250yg/ml頭孢噻后的GBA)。將小植株在該培養(yǎng)基上在每天16小時(shí)和26。C溫育條件下培養(yǎng)約兩周。篩選在374C培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周的外植體(約2cm長(zhǎng))的分生組織發(fā)育的調(diào)節(jié)(即枝條和花分生組織大小和外觀的變化)。鑒定出陽(yáng)性(即scw表達(dá)改變)外植體后，丟棄未呈現(xiàn)scw活性變化的枝條并將各陽(yáng)性外植體細(xì)分為結(jié)節(jié)外植體。一個(gè)結(jié)節(jié)外植體含有至少一個(gè)潛在的結(jié)節(jié)。將結(jié)節(jié)片段在G:BA培養(yǎng)基上培養(yǎng)三至四天以促進(jìn)各結(jié)節(jié)腋芽(auxiliarybud)的形成。然后將其轉(zhuǎn)移至374C培養(yǎng)基并繼續(xù)發(fā)育四周。分離正在發(fā)育的芽并于374C培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)四周。通過(guò)適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)活性測(cè)定再次篩選來(lái)自各新回收枝條的已匯集(pooled)的葉樣品。這時(shí)，回收自單個(gè)結(jié)節(jié)的陽(yáng)性枝條通常會(huì)富集于結(jié)節(jié)培養(yǎng)前初始分析中所檢測(cè)到的轉(zhuǎn)基因部分中。將所回收的具有陽(yáng)性SCW表達(dá)改變的枝條嫁接至Pioneer雜種6440體外生長(zhǎng)的向日葵幼苗根狀莖(seedlingrootstock)。按照F列方式制備根狀莖。將種子去殼并用20%Clorox漂白溶液(每100ml溶液加入兩至三滴吐溫20)表面滅菌20分鐘，用蒸餾水沖洗三遍。將已滅菌的種子在用水濕潤(rùn)的濾器上發(fā)芽三天，然后轉(zhuǎn)移至48培養(yǎng)基(半強(qiáng)度的MS鹽、0.5%蔗糖、0.3%gelrite，pH5.0)并于26。C黑暗中生長(zhǎng)三天，然后在每天16小時(shí)的培養(yǎng)條件下溫育。去除所篩選幼苗的上部，在各下胚軸做一個(gè)垂直切口，將已轉(zhuǎn)化的枝條插入該V-切口中。用石蠟?zāi)ぐ懈顓^(qū)域。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周后將嫁接植物轉(zhuǎn)移至土壤。在開始的兩周內(nèi)使其在高濕度條件下維持以適應(yīng)溫室環(huán)境。實(shí)施例12.SCW序列變體A.不改變被編碼氨基酸序列的SCW變異體核苷酸序列SCW核苷酸序列用于產(chǎn)生含有與對(duì)應(yīng)SEQIDNO的起始未改變的0RF核苷酸序列相比具有約70%、75%、80%、85%、90%和95%核苷酸序列同一性的開放閱讀框的核苷酸序列的變異體核苷酸序列。使用標(biāo)準(zhǔn)的密碼子表產(chǎn)生這些功能變異體。雖然這些變異體的核苷酸序列被改變但是由該開放閱讀框編碼的氨基酸序列沒(méi)有變化。這些變異體與決定生物量產(chǎn)量和質(zhì)量的成分性狀相關(guān)。然后將顯示相關(guān)性的那些用做選擇每種成分性狀的標(biāo)記物。B.非編碼區(qū)中的SCW變異體核苷酸序列SCW核苷酸序列用于產(chǎn)生變異體核苷酸序列，所述變異體核苷酸序列具有5'-非翻譯區(qū)，3'-非翻譯區(qū)，或啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列，其與對(duì)應(yīng)的SEQIDN0的原始核苷酸序列具有大約70%，75%,80%，85%，9()%和95%的同一性。隨后，這些變異體與種質(zhì)中用于生物量產(chǎn)量和質(zhì)量相關(guān)的成分性狀的天然變異關(guān)聯(lián)。相關(guān)的變異體用做標(biāo)記物單倍體以選擇期望的性狀。C.SCW多肽的變異體氨基酸序列產(chǎn)生SCW多肽的變異體氨基酸序列。在該實(shí)施例中改變了一個(gè)氨基酸。具體而言，檢查該開放閱讀框以確定適當(dāng)?shù)陌被岣淖?。通過(guò)參考蛋白質(zhì)比對(duì)(與其它直系同源體和來(lái)自多個(gè)物種的其它基因家族成員)篩選需要改變的氨基酸。篩選一個(gè)被認(rèn)為不處于高篩選壓力(不高度保守)下的氨基酸，其可被具有相似化學(xué)特性(即相似的功能側(cè)鏈)的氨基酸輕易取代。使用蛋白質(zhì)比對(duì)可改變一個(gè)適當(dāng)?shù)陌被?。一旦確定了目標(biāo)氨基酸，按照以下部分C列出的步驟進(jìn)行。使用該方法可產(chǎn)生具有約70%、75%、80%、85%、90%和95%核酸序列同一性的變異體。隨后,這些變異體與種質(zhì)中用于生物量產(chǎn)量和質(zhì)量相關(guān)的成分性狀的天然變異相關(guān)。相關(guān)的變異體用做標(biāo)記物單倍體以選擇期望的性狀。D.SCW多肽其它的變異體氨基酸序列在該實(shí)施例中，可產(chǎn)生與參比蛋白質(zhì)序列相比具有80%、85%、90%和95%同一性的人工蛋白質(zhì)序列。后一項(xiàng)工作需要從比對(duì)中鑒定出保守和可變區(qū)域，然后慎重應(yīng)用氨基酸替換表。以下更加詳細(xì)地討論這些部分。整體而言，確定哪些氨基酸序列被改變是基于SCW蛋白質(zhì)之間或其它SCW多肽之間的保守區(qū)域。基于序列比對(duì)，有可能被改變的scw多肽的多個(gè)區(qū)域以小寫字母表示，而保守區(qū)域由大些字母表示。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到可在以下保守區(qū)域進(jìn)行保守替換而不改變其功能。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明的scw序列的功能變異體可在保守結(jié)構(gòu)域中具有少數(shù)不保守氨基酸改變。然后產(chǎn)生人工蛋白序列，其與原始序列以80-85%、85-90%、90_95%和95-100%同一性區(qū)間而不同。將這些區(qū)間的中點(diǎn)作為目標(biāo)，例如自由度為加減l^。通過(guò)customPerlscript完成氨基酸替換。替換表見(jiàn)表4。表4替換表<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>首先，鑒定蛋白質(zhì)中不應(yīng)改變的任何保守氨基酸并"劃清界限"不被替換。起始甲硫氨酸當(dāng)然被自動(dòng)加入這一行列。接下來(lái)再進(jìn)行改變。在任何情況下都不改變II、C和P。變化首先發(fā)生在異亮氨酸,從N-末端直至C-末端。然后是亮氨酸，并按照列表一直向下直至達(dá)到期望的目標(biāo)?？蛇M(jìn)行中間數(shù)字替換以不引起逆轉(zhuǎn)變化。該列表的順序?yàn)?-17，因此在亮氨酸之前進(jìn)行如所需--樣多的異亮氨酸變化，然后直到甲硫氨酸。很明顯以這種方式很多氨基酸不必變化。L、I和V涉及兩個(gè)可替代最佳替換的50:50替換。寫出變異體氨基酸序列作為結(jié)果。使用Perlscript計(jì)算同一性百分比。使用該程序，產(chǎn)生具有與SEQIDN0:1、3、5和40-71的起始未改變的0RF核苷酸序列具有約80X、85%、90%和95%氨基酸同一性的SCW多肽變異體。該說(shuō)明書中的所有出版物和專利申請(qǐng)指明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平。所有出版物和專利申請(qǐng)均以引用形式并于本文，與通過(guò)引用方式明確和單獨(dú)指明各單獨(dú)出版物或?qū)＠暾?qǐng)的程度相同。己通過(guò)參考多種具體和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)闡述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng)理解的是可進(jìn)行多種變化和改變但是仍屬于本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求分離的多核苷酸，選自a.由GAP算法在缺省參數(shù)條件下測(cè)定，與選自SEQIDNOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，77-114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276，278，280，282，284，286，288，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386，388，390，392，394，396，398，400，402，404，406，408和410-424的多核苷酸的全長(zhǎng)序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸；其中該多核苷酸編碼用作次生細(xì)胞壁發(fā)育調(diào)節(jié)物的多肽；b.編碼選自SEQIDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，211，213，215，217，219，221，223，225，227，229，231，233，235，237，239，241，243，245，247，249，251，253，255，257，259，261，263，265，267，269，271，273，275，277，279，281，283，285，287，289，291，293，295，297，299，301，303，305，307，309，311，313，315，317，319，321，323，325，327，329，331，333，335，337，339，341，343，345，347，349，351，353，355，357，359，361，363，365，367，369，371，373，375，377，379，381，383，385，387，389，391，393，395，397，399，401，403，405，407和409的多肽的多核苷酸；及c.選自SEQIDNOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，77-114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276，278，280，282，284，286，288，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386，388，390，392，394，396，398，400，402，404，406，408和410-424的多核苷酸；及d.與(a)、(b)或(c)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。2.重組表達(dá)盒，其包含權(quán)利要求l的多核苷酸，其中該多核苷酸與啟動(dòng)子以有義或反義方向可操作地連接。3.包含權(quán)利要求2的表達(dá)盒的宿主細(xì)胞。4.包含權(quán)利要求2的重組表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物。5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為單子葉植物。6.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為雙子葉植物。7.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、黍、花生和可可。8.來(lái)自權(quán)利要求4轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。9.-種調(diào)節(jié)植物次生細(xì)胞壁發(fā)育的方法,其包括a.向植物細(xì)胞中導(dǎo)入含有與啟動(dòng)子可操作地連接的權(quán)利要求l的多核苷酸的重組表達(dá)盒；b.在植物細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)該植物；其中所述植物細(xì)胞的次生細(xì)胞壁發(fā)育被調(diào)節(jié)。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自選自玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、黍、花生和可可的植物。11.一種調(diào)節(jié)整個(gè)植物或植物中次生細(xì)胞壁發(fā)育的方法,包括a.向植物細(xì)胞中導(dǎo)入含有與啟動(dòng)子可操作地連接的權(quán)利要求1的多核苷酸的重組表達(dá)盒；b.在植物細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞；及c.從所述植物細(xì)胞再生植物；其中所述植物的次生細(xì)胞壁發(fā)育被調(diào)節(jié)。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、黍、花生和可可。13.來(lái)源于加工處理表達(dá)編碼SCW基因的分離的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物組織的方法的產(chǎn)物，該方法包括a.用含有與選自SEQIDNO:1，3，S，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，77-114，116，118，120，122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,150,152,154,156,158,160，162,164，166,168，170,172，174,176，178,180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276,278，280,282，284,286，288，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386，388，390，392，394，396，398，400，402，404，406，408和410-424的多核苷酸全長(zhǎng)序列具有至少90%序列同一性并與啟動(dòng)子可操作地連接的多核苷酸的重組表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞;及b.在植物細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)該已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；其中所述已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的生長(zhǎng)被調(diào)節(jié)；c.使所述植物細(xì)胞在植物形成的條件下生長(zhǎng)，以在所述植物組織中表達(dá)該多核苷酸；及d.加工處理所述植物組織得到產(chǎn)物。14.根據(jù)權(quán)利要求13的產(chǎn)物，其中所述多核苷酸進(jìn)--步編碼選自SEQIDNO:2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52,54，56，58，60，62，64，66,68,70，72，74，76，115,117，119,121，123,125，127，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>和409的多月太。15.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為單子葉植物。16.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥和黍。17.根據(jù)權(quán)利要求13的產(chǎn)物，其可通過(guò)過(guò)度表達(dá)所述多核苷酸提高植物的莖強(qiáng)度。18.根據(jù)權(quán)利要求13的產(chǎn)物，其可通過(guò)增加生物量增加產(chǎn)量。19.根據(jù)權(quán)利要求13的產(chǎn)物，其是乙醇的構(gòu)成物。20.權(quán)利要求9的方法,其中所述植物具有改善的株冠形狀。21.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物具有提高的葉組織中光合成能力。22.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物具有改善的莖強(qiáng)度。23.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物具有改善的植物站立性。24.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物具有改變的維管束結(jié)構(gòu)或數(shù)量。25.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物具有提高的根生物量。26.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物具有增強(qiáng)的根生長(zhǎng)。27.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物具有調(diào)節(jié)的枝條發(fā)育。28.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物具有調(diào)節(jié)的葉發(fā)育。29.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物具有改善的青貯飼料質(zhì)量和可消化性。全文摘要本發(fā)明提供了涉及玉米次生壁(ZmSCW)形成的基因種類的多核苷酸和相關(guān)多肽。本發(fā)明提供了ZmSCW基因的基因組序列。ZmSCW負(fù)責(zé)控制植物生長(zhǎng)、次生細(xì)胞壁發(fā)育和作物植物的產(chǎn)量。文檔編號(hào)C07K14/415GK101784667SQ200880103729公開日2010年7月21日申請(qǐng)日期2008年6月13日優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日發(fā)明者C·R·西蒙斯,K·S·杜加,R·B·米利申請(qǐng)人:先鋒高級(jí)育種國(guó)際公司